CN101948381A - 一类新的用于抗肿瘤的化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类新的用于抗肿瘤的化合物及其在抗肿瘤中的应用,本发明还涉及上述化合物的制备方法。所说的化合物具有通式1所示结构，该化合物体外抗肿瘤实验表明，这些化合物对所测试肿瘤细胞株有明显的抑制作用，可诱导肿瘤细胞凋亡，但其胃肠道副作用小于传统型非甾体抗炎药。本发明还涉及含有至少一种上述化合物或其与生理上可接受的无机酸或有机酸形成的盐或，如果合适，可药用赋形剂和/或稀释剂或赋形剂；本发明还涉及含有至少一种该结构式化合物或其盐的上式化合物给药剂型，其剂型为片剂、胶囊、输注用溶液或安瓿、栓剂、贴剂、可吸入的粉末制剂、混悬剂、乳膏或软膏。因此，化合物1可能具有良好的应用前景。

Description

一类新的用于抗肿瘤的化合物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一类含有苯乙烯结构的化合物，它们可用来治疗各种因素导致的肿瘤或癌症疾病。

背景技术

癌症是严重威胁人类生命的常见病和多发病，目前，全世界每年新发生的癌症患者大约1000万，死于癌症的人数近600万，在我国每年新发病患者大约180万，死亡130万，而且发病率逐年上升。我国癌症死亡占各类疾病死因的第2位，在城市已占据首位。癌症不仅给患者造成生理上的巨大伤害，同时在心理上、精神上也给患者带来严重创伤，给无数人的生活带来了磨难，无情地夺去了无数人的生命，破坏了无数人的美满幸福生活，造成了家庭和社会的沉重负担。但癌症的治疗一直是一个世界性的难题，多年来世界各国都在寻找和探索各种有效手段来预防或治疗癌症。值得注意的事，近年来，NSAIDs的抗肿瘤活性逐渐成为人们关注的焦点。

NSAIDs是一类具有解热、镇痛、抗炎作用的药物，临床应用广泛，是目前仅次于抗生素的临床第二大用药。NSAIDs按化学结构的不同，大致可以分为水杨酸类、苯胺类、吡唑酮类及其他有机酸4大类，其作用机制主要是通过阻断环氧合酶的合成而阻断或减少前列腺素(prostaglandins，PGs)的释放，从而实现解热、止痛、抗炎的作用(司文秀.中国药房，2007，18：19-20.)。近年流行病学、动物模型及临床应用的研究均表明NSAIDs能够通过诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤的侵袭和转移或其他途经而发挥抗肿瘤的作用。

早期的研究表明类风湿患者在服用NSAIDs后实体肿瘤的发病率有所降低。最近的一项调查表明，有规律地服用阿司匹林或其他NSAIDs，可使结肠癌的发生率降低40％-50％。另外，在对肿瘤患者的检测中也发现，NSAIDs的作用靶点-环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)在许多肿瘤如结肠癌、前列腺癌、肺癌以及乳腺癌等均有稳定表达，但COX-2在大多数正常组织并不存在。大量研究表明，NSAIDs的抗肿瘤作用与环氧合酶-2密切相关。(Zahner等人.JBiol Chem，2002，277(12)：9763-71；Nzeako等人.Hepatology，2002，35(3)：552-9.)

Smith等用4种结肠癌细胞系作为研究对象，观察NS398(COX-2选择性抑制剂)和吲哚美辛、阿司匹林(COX的非选择性抑制剂)对这四种细胞系的抑制作用。结果发现，NS398可以完全抑制肿瘤细胞的增殖，对COX-2表达阴性的细胞也具有抗增殖活性。它能够促进细胞的G1期停滞，促进COX-2表达阳性的细胞凋亡。吲哚美辛对COX-2阴性和COX-2阳性表达细胞均有抑制作用，并能使每一种细胞的p层粘蛋白表达降低，说明吲哚美辛具有促进结肠癌细胞凋亡的活性。阿司匹林对4种细胞的增殖均有抑制作用，但不诱导凋亡。(Smith等人.Eur JCancer，2000；36(5)：664-74；Hara等人.Jpn J Cancer Res，1997，88：600-4.)

有研究发现吲哚美辛和双氯酚酸钠可诱导培养的胃粘膜细胞和HT-29结肠癌细胞凋亡，阿司匹林和吲哚美辛能上调bax和bak的表达，诱发胃癌细胞系AGS的凋亡。(Kim等人.IntJ Colorect Dis，2000，15(2)：105；Ar ango等人.Obstet Gynecol，2001，97(3)：423.)Yip-Schneider等研究发现，消炎痛和NS-398对COX-2表达阳性和阴性的胰腺癌细胞的生长均有抑制作用，但是对COX-2表达阳性的胰腺癌细胞生长的抑制作用更强。(Yip-Schneider.J Pharmacol Exp Ther，2001；298(3)：976-85.)

Chiu等发现舒林酸能抑制95％小鼠肿瘤生长，但不影响肠粘膜的PGE₂水平。甲氨磺酰对HT-29和S/KS细胞系的抗增殖作用有剂量依赖性，它不影响细胞的周期，即使没有COX-2蛋白的表达也能够诱导细胞的凋亡。(Chiu等人，Cancer Res，1997；57(19)：4267-73；Pazza等人.Cancer Res，1997，57：1909-15；Ding等人；Anticancer Res，2000，20：2625-32.)

塞来昔布是1999年推向市场的非甾体抗炎药，临床主要用于治疗急慢性骨关节炎和类风湿性关节炎。目前的国内外研究表明，塞来昔布还具有预防和抑制肿瘤的作用，具有抗胃癌、肺癌、肝癌、子宫内膜腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、食管癌等癌细胞增殖活性，亦有诱导癌细胞凋亡的作用。(董晓春等人.药物流行病学杂志，2006，15(5)：283-284；陈新谦等人.新编药物学北京：人民卫生出版社，2004.195-196；张伟等人.中国药师，2007，10(10)：1031-1033；易芳等人.临床肿瘤学杂志，2007，12(4)：316-318)

总的来说，NSAIDs对10种人类恶性肿瘤的作用结果显示，剂量-效应曲线呈指数性衰减，在7～10种恶性肿瘤中，每日服用NSAIDs可使结肠癌的患病风险降低63％，乳腺癌降低39％，肺癌降低36％，前列腺癌降低39％，食道癌降低73％，胃癌降低62％，卵巢癌降低47％，但NSAIDs用药时间要达到一定的长度，且用药时间越长效果越好。另外NSAIDs对食道癌、胃癌及结肠癌的效果较好，对胰腺癌、膀胱癌和肾癌的效果报道结果有差异，对恶性黑色素瘤、霍奇金病及成人白血病也有保护作用。部分研究发现，布洛芬抗乳腺癌和肺癌的效果优于阿司匹林。(Harris等人Oncol Rep，2005，13(4)：55；Wechter等人.Cancer Res，1997，57：4316-24.)

虽然NSAIDs的抗肿瘤作用基本认可，但其确切的抗肿瘤机理还不十分清楚，不过，按作用靶点基本可分为两大类，即COX-2依赖性和非COX依赖性途径。其中依赖性途径主要与COX-2的以下作用或功能有关：COX-2的过表达可导致PG的增加；COX-2可促进细胞增殖和抑制细胞凋亡；COX-2具有过氧化酶活性，可激活癌基因或引起p53等抑癌基因突变；COX-2能通过促进内皮细胞迁移和管腔的形成而刺激血管形成，为肿瘤生长和转移提供必需的营养；COX-2具有促进血行性传播的作用。非依赖性途径即非经COX-2途径，主要包括：抑制核因子NF-κB途径；半胱天冬酶活性的途径；影响其他凋亡相关因子表达的途径；磷酸戊糖和活性氧途径；诱导RECK基因的途径等。(Sawaoka等人.Am J Physiol，1998，274(1)：G1061-7；Joki等人.Caneer Res，2000，60：4926-31；Grossman等人.Carcinogenesis，2000，21(7)：1403-9.)

综上所述，NSAIDs具有明确的抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制是多层次、多途径的，有望成为肿瘤化学防治的有效药物。然而，传统NSAIDs选择性差，对胃肠道有抑制作用，长期大量服用该类药物可导致胃肠道溃疡、出血甚至穿孔等不良反应，从而限制了其在临床上的广泛应用。另外，由于NSAIDs本身具有解热镇痛作用，可用来缓解早期的轻度疼痛。因此，寻找既安全镇痛又能抗肿瘤的NSAIDs是今后相关研究的一个重点方向。

发明内容

本发明应用药物设计的基本理论，结合计算机辅助药物设计手段，设计并合成了一系列含有苯乙烯结构的衍生物，其化学结构式如通式1所示。

通式1

其中R₁＝氢、4-甲基、4-氟、2-氯、4-氯、4-硝基、4-氨基；R₂＝氢或氯；R₃＝R₅＝甲氧基或羟基；R₄＝H。

体外抗肿瘤活性检测和胃肠道(GI)不良反应观察发现，上述化合物具有意想不到的抗肿瘤活性，而且GI副作用小，可用于治疗肿瘤疾病尤其是结肠、肝、胰腺、乳腺、前列腺癌等。

通式1化合物及其盐均具有生物活性，通式1化合物可以是以盐形式给药，也可以是以与生理上可接受的酸形成的盐形式给药，给药方式可以是口服、胃肠外、静脉内、皮下或吸入方式给药。

本发明还涉及药物制剂，所述药物制剂含有至少一种上述化合物(包括盐)或其与生理上可接受的无机酸或有机酸形成的盐，如果合适，所述药物制剂还含有可药用赋形剂和/或稀释剂或辅料。

合适的给药剂型为例如片剂、胶囊、输注用溶液或安瓿、栓剂、贴剂、可吸入的粉末制剂、混悬剂、乳膏或软膏。

本发明还提供了治疗肿瘤相关疾病的方法，该方法包括向肿瘤患者给予有效量的根据通式1的化合物。此外，也提供药物组合物，该组合物包括治疗有效量的一种或多种根据通式1的化合物以及一种制药或生理可接受的载体。

本发明的化合物不仅具有良好的抗肿瘤作用，在试验剂量和给药周期内还未观察到明显的胃肠道副作用，具备使用安全、毒副作用小的特点。

附图说明

图1II对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用；

图2VII对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用；

图3VII和II对肿瘤细胞形态学的影响(A：VII  B：对照  C：II)；

图4VII和II对肿瘤细胞的诱导凋亡作用。

具体实施方式

如下给出实施例以进一步说明本发明，一方面说明化合物的制备方法，另一方面还列举了相关试验说明其活性，但并不希望以任何方式限制本发明。

实施例1：

E-2-(苯基)-3-(3，5-二甲氧基苯基)-丙烯酸(I)的合成

3，5-二甲氧基苯甲醛(1.66g，0.01mol)，苯乙酸(1.50g，0.011mol)，重蒸乙酸酐(5ml，0.053mol)和无水K₂CO₃(0.7g，0.005mol)，搅拌回流5h。稍冷，加水至混浊，放置，析出棕红色油状物，倾去水层，加入2NNaOH溶液6ml，室温搅拌1h，过滤。滤液酸化，析出固体，过滤，滤饼用80％乙醇重结晶，干燥得到白色晶体1.52g，收率53.6％，mp198～200℃。

IR(KBr，cm^-1)：3300～2700(OH)，2945(CH₃)，1671(C＝O)，1624，1588，1465，1426(C＝C)，679(C＝C-H)；

¹HNMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：3.52(s，6H，CH₃)，6.24(s，2H，ArH)，6.34(s，1H，ArH)，7.35(s，1H，ArH)，7.38(d，2H，J＝7.6Hz，ArH)，7.42(d，2H，J＝6.4Hz，ArH)，7.87(s，1H，＝CH)；

HR-MS(FAB)：Calcd.for C₁₇H₁₆O₄：284.1049，Found：284.1039.

实施例2：

E-2-(4-甲基苯基)-3-(3，5-二甲氧基苯基)-丙烯酸(II)的合成

参照I的制备方法由4-甲基苯乙酸制得，为白色针状晶体，收率59.5％，mp：183～184℃。

IR(KBr，cm^-1)：3200～2500(OH)，2955(CH3)，1672(C＝O)，1588，1465，1425，1426(C＝C)，679(C＝C-H)；

¹HMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：2.36(s，3H，CH3)，3.53(s，6H，CH3)，6.24(s，2H，ArH)，6.34(s，1H，ArH)，7.15(d，2H，J＝7.6Hz，ArH)，7.21(d，2H，J＝8.8Hz，ArH)，7.83(s，1H，＝CH)；

HR-MS(FAB)：Calcd.for C₁₈H₁₈O₄：298.1205，Found：298.1196.

实施例3：

E-2-(4-氟苯基)-3-(3，5-二甲氧基苯基)-丙烯酸(III)的合成

参照I的制备方法由4-氟苯乙酸制得，为白色针状晶体，收率68.4％，mp：198～199℃。

IR(KBr，cm^-1)：3200～2400(OH)，2955(CH3)，1670(C＝O)，1625，1589，1511，1426(C＝C)，652(C＝C-H)；

¹HMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：3.57(s，6H，CH3)，6.23(s，2H，ArH)，6.36(s，1H，ArH)，7.11(d，2H，J＝8.4Hz，ArH)，7.24(d，2H，J＝7.6Hz，ArH)，7.88(s，1H，＝CH)；

HR-MS(FAB)：Cal cd.for C₁₇H₁₅O₄F：302.0954，Found：302.0943.

实施例4：

E-2-(2-氯苯基)-3-(3，5-二甲氧基苯基)-丙烯酸(IV)的合成

参照I的制备方法由2-氯苯乙酸制得，为淡黄色晶体，收率63.2％，mp：151～152℃。

IR(KBr，cm^-1)：3300～2500(OH)，2836(CH₃)，1678(C＝O)，1589，1461，1424，1426(C＝C)，679(C＝C-H)，649(C＝C-H)；

¹HMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：3.54(s，6H，CH3)，6.23(s，2H，ArH)，6.37(s，H，ArH)，7.21(d，1H，J＝7.4Hz，ArH)，7.38(m，2H，ArH)，7.49(d，H，J＝8.0Hz，ArH)，7.94(s，1H，＝CH)；

HR-MS(FAB)：Calcd.for C₁₇H₁₅ClO₄：318.0659，Found：318.0638.

实施例5：

E-2-(4-氯苯基)-3-(3，5-二甲氧基苯基)-丙烯酸(V)的合成

参照I的制备方法由4-氯苯乙酸制得，为淡黄色针状晶体，收率66.3％，mp：202～203℃。

IR(KBr，cm^-1)：3200～2600(OH)，2951(CH₃)，1670(C＝O)，1624，1588，1457，1426(C＝C)，677(C＝C-H)；

¹HMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：3.57(d，6H，CH3)，6.22(s，2H，ArH)，6.35(s，1H，ArH)，7.21(d，2H，J＝8.0Hz，ArH)，7.38(d，2H，J＝8.0Hz，ArH)，7.88(s，1H，＝CH)；

HR-MS(FAB)：Calcd.for C₁₇H₁₅ClO₄：318.0659，Found：318.0578；

实施例6：

E-2-(4-硝基苯基)-3-(3，5-二甲氧基苯基)-丙烯酸(VI)的合成

参照I的制备方法由4-硝基苯乙酸制得，为黄色固体，收率72.2％，mp：179～180℃。

IR(KBr，cm^-1)：3225～2500(OH)，2967(CH₃)，1671(C＝O)，1589，1521，1426(C＝C)，698(C＝C-H)；

¹HMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：3.57(s，6H，CH₃)，6.18(s，2H，ArH)，6.38(s，1H，ArH)，7.46(d，2H，J＝8.4Hz，ArH)，7.99(s，1H，＝CH)，8.26(d，2H，J＝8.4Hz，ArH)；

HR-MS(FAB)：Calcd.for C₁₇H₁₅NO₆：329.0899，Found：329.0813.

实施例7：

E-2-(2，4-二氯苯基)-3-(3，5-二甲氧基苯基)-丙烯酸(VII)的合成

参照I的制备方法由2，4-二氯苯乙酸制得，为白色晶体，收率50.0％，mp：170～171℃。

IR(KBr，cm^-1)：3200～2800(OH)，3003(CH₃)，1674(C＝O)，1623，1604，1583，1455，1426(C＝C)，677(C＝C-H)；

¹HMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：3.59(s，6H，CH₃)，6.22(s，2H，ArH)，6.40(s，H，ArH)，7.14(d，1H，J＝8.0Hz，ArH)，7.28(d，1H，J＝8.0Hz，ArH)，7.52(s，1H，ArH)，7.96(s，1H，＝CH)；

HR-MS：Calcd.for C₁₇H₁₄Cl₂O₄：352.0269，Found：352.0258.

实施例8：

对于R₃＝R₅＝羟基的化合物，只要通过BBr3_反应将R₃＝R₅＝甲氧基的化合物的甲氧基脱去甲基，就可以得到目标化合物，本说明书仅以VIII的合成为例来说明反应过程，其他化合物的合成可通过类似反应得到。

E-2-(2，4-二氯苯基)-3-(3，5-二羟基苯基)-丙烯酸(VIII)的合成

在50ml的圆底烧瓶中，将VII(1mmol)溶于8ml无水二氯甲烷中，冰盐浴冷却到0℃以下，搅拌下缓慢滴加BBr₃(2g，6mmol)的二氯甲烷溶液6ml，在0℃以下搅拌0.5h，然后在室温下搅拌3h。将反应混合物倾入冰水中，用乙酸乙酯萃取，浓缩，得白色固体，收率71％，mp：109～110℃。

IR(KBr，cm^-1)：3600～2500(OH)，3388(OH)，1681(C＝O)，1626，1585，1473，1420(C＝C)，673(C＝C-H)；

¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：5.94(s，2H，ArH)，6.18(s，1H，ArH)，7.19(d，1H，J＝8.1Hz，ArH)，7.41(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.64(s，1H，ArH)，7.68(s，1H，＝CH)；

HR-MS(FAB)：Calcd.for C₁₅H₁₀Cl₂O₄：323.9956，Found：323.9955.

实施例9：

E-2-(4-氨基苯基)-3-(3，5-二甲氧基苯基)-丙烯酸(IX)的合成

将氯化铵(0.08g，0.0015mol)溶于水5ml中，搅拌，加热至95℃，加入铁粉(0.55g，0.010mol)，保温0.5h后，加入I₇(1.07g，0.0033mol)，搅拌，95℃反应2h，冷却，加入20％Na₂CO₃溶液，调PH＝9，过滤，滤液用6N盐酸调PH＝7，析出沉淀，抽滤，滤饼真空干燥，得到棕红色粉末，收率62.7％，mp：178～179℃。

IR(KBr，cm^-1)：3414(NH)，3200～2700(OH)，3003(CH₃)，1672(C＝O)，1590，1518，1518，1455，1426(C＝C)，682(C＝C-H)；

¹HNMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：3.57(s，6H，CH₃)，6.20(s，2H，ArH)，6.40(s，H，ArH)，7.34(d，2H，J＝8.0Hz，ArH)，7.56(d，2H，J＝8.0Hz，ArH)，7.74(s，1H，＝CH)。

HR-MS：Calcd.for C₁₇H₁₇O₄：299.1158，Found：299.1146；

实施例10本发明化合物对体外培养HT-29肿瘤细胞的抑制作用

取对数生长期的HT-29细胞，按传代方法制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为10⁵个/ml。将上述细胞悬液接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100μl(相当于1×10⁴个)，取不含细胞培养液的孔作为空白调零。将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中贴壁培养24小时后，各孔分别加入含终浓度为1mmol/L的化合物，以含DMSO(1％)培养液作为阴性对照组，每组设6个复孔。分别培养72小时后每孔加MTT(终浓度5mg/ml)10μl，继续培养4小时后，每孔加SDS-HCl 100μl，孵育过夜，使结晶物充分溶解，置全自动酶标仪上测定每孔吸光度(OD)值，选取波长570nm。实验重复三次。按以下公式计算肿瘤细胞生长抑制率：：

肿瘤细胞生长抑制率＝[(对照组OD值一实验组OD值)/对照组OD]×100％

结果显示：受试化合物在测试浓度对HT-29均有一定的抑制作用，最高抑制率＞80％，，最低抑制率＞40％(表1)。

表1受试化合物对人结肠癌细胞HT 29的抑制活性

R1	R2	R3	R4	R5	抑制率(％)
						H	H	OCH3	H	OCH3	50
4C-H3	H	OCH3	H	OCH3	60
						4-F	H	OCH3	H	OCH3	53

2-Cl	H	OCH3	H	OCH3	64
						4-Cl	H	OCH3	H	OCH3	53
4-NO2	H	OCH3	H	OCH3	68
						4-NH2	H	OCH3	H	OCH3	48
2-Cl	4Cl	OCH3	H	OCH3	56
						H	H	OH	H	OH	56
4-CH3	H	OH	H	OH	68
						4-F	H	OH	H	OH	68
2-Cl	H	OH	H	OH	69
						4-Cl	H	OH	H	OH	54
4-NO2	H	OH	H	OH	48
						4-NH2	H	OH	H	OH	52
2-Cl	4Cl	OH	H	OH	58

实施例11本发明化合物对体外培养肿瘤细胞的抑制作用

取对数生长期的HepG₂、HT-29、MCF-7细胞，按传代方法制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为10⁵个/ml。将上述细胞悬液接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100μl(相当于1×10⁴个)，取不含细胞培养液的孔作为空白调零。将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中贴壁培养24小时后，各孔分别加入含终浓度为1mmol/L，0.5mmol/L，0.25mmol/L的VII和II，以含DMSO(1％)培养液作为阴性对照组，每组设6个复孔。分别培养72小时后每孔加MTT(终浓度5mg/ml)10μl，继续培养4小时后，每孔加SDS-HCl 100μl，孵育过夜，使结晶物充分溶解，置全自动酶标仪上测定每孔吸光度(OD)值，选取波长570nm。实验重复三次。按以下公式计算肿瘤细胞生长抑制率：：

肿瘤细胞生长抑制率＝[(对照组OD值一实验组OD值)/对照组OD]×100％

以不同药物为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标(％)，绘制不同浓度的VII和II抑制细胞生长的柱形图。

结果显示：这两种化合物在高浓度对Hep G₂、HT-29、MCF-7均有较强的抑制作用，其中II对Hep G₂抑制作用最强，高浓度＞70％(图1)，而VII对MCF-7的抑制作用最强(图2)，同时这两种药物对肿瘤细胞的抑制作用均呈现显著的剂量依赖性，即随浓度升高而作用增强。

实施例12本发明化合物对肿瘤细胞形态学的影响

取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为10⁵个/ml。将上述细胞悬液接种于6孔培养板，每孔加细胞悬液2ml(相当于1×10⁶个)。将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中贴壁培养24小时后，各孔分别加入含终浓度为0.5mmol/L的VII和II以含DMSO(1％)的培养液作为阴性对照组，继续培养48h；收集细胞，以PBS洗涤2次，800r/min，3min离心；每组加入100μl PBS重悬细胞，加入4μl混合荧光染色液：100μg/ml吖啶橙(AO)和100μg/ml嗅乙啶(EB)混匀，避光染色10min；吸取25μl悬液于载玻片上，压上盖玻片。荧光显微镜下观察凋亡细胞形态并拍照。

结果显示(如图3)：药物作用组均出现典型的细胞凋亡形态学特征，表现为细胞皱缩变圆，外形模糊，染色质凝聚，核固缩并断裂成数个大小不等的内含胞质、细胞器及核碎片的凋亡小体，而对照组细胞基本未出现上述特征。

实施例13本发明化合物对肿瘤细胞的凋亡诱导作用

取对数生长期的HepG₂细胞，以1×10⁵/ml接种于6孔板中，每孔2ml，待细胞贴壁后，分别加入含1，0.5，0.25mmol/l的VII和II的培养液同时设等体积的DMSO溶剂对照组，继续培养48h后，分别收获细胞。首先吸取培养液至各离心管；用PBS清洗2遍，洗涤液均吸取至各离心管；用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化培养细胞2-4min；用吸管吹打使细胞完全脱离瓶壁；移入各离心管，1000r/min离心3min；预冷PBS洗涤2次，1000r/min离心3min，弃上清。将细胞重悬于1ml Binding buffer，取100μl细胞置于流式细胞仪专用试管中，先加入5μl Annexin V-FITC再加入5μlPI，轻轻混匀，室温下避光孵育15分钟。加入300μl 1×Binding buffer，立即上机检测。

结果显示(如图4)：1.0mM VII的细胞凋亡百分率＞40％，0.5mM＞30％，1.0mM II的细胞凋亡百分率＞30％，0.5mM＞25％，而对照组＜10％。说明这两种物质对该测肿瘤细胞有较强的诱导凋亡作用，而且具有明显的剂量依赖性。

Claims (5)

1.通式1所示结构的化合物: 

通式1

其中R₁=氢、4-甲基、4-氟、2-氯、4-氯、4-硝基、4-氨基；R₂=氢或氯；R₃ =R₅=甲氧基或羟基；R₄=H。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于治疗肿瘤疾病尤其是结肠、肝、胰腺、乳腺、前列腺癌等。

3.权利要求1的化合物或其盐的药物制剂，其含有至少一种权利要求1的化合物或所述的与生理上可接受的无机酸或有机酸形成的盐，该制剂任选含有可药用载体和/或稀释剂或赋形剂。

4.权利要求1所述的化合物或其盐的应用形式，其含有至少一种权利要求1的化合物或所述的盐，其形式为片剂、胶囊、输注用溶液或安玻、栓剂、贴剂、可吸入的粉末制剂、混悬剂、乳膏或软膏。

5.权利1中通式1化合物或其盐的应用，用于制备抗肿瘤药。

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