CN109896986A

CN109896986A - 木脂素类天然产物4-o-甲基三白草醇的结构简化物，其制法和其药物组合物与用途

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Publication number: CN109896986A
Application number: CN201711282043.3A
Authority: CN
Inventors: 李燕; 谢平; 刘晓宇; 焦晓臻; 杜倩倩; 李晓宇; 杨飞龙
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2017-12-07
Filing date: 2017-12-07
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2037-12-07
Also published as: CN109896986B

Abstract

本发明公开了木脂素类天然产物4‑O‑甲基三白草醇的结构简化物，其制法和其药物组合物与用途。具体涉及式(I)化合物或其异构体及其药学上可接受的盐，这类化合物的制备方法。一种新的药物组合物，包括有效剂量的式(I)化合物和药效学上可接受的载体。本发明还公开这类化合物用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。所述的肿瘤包括神经胶质母细胞瘤、黑色素瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、口腔表皮癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠腺癌。

Description

木脂素类天然产物4-O-甲基三白草醇的结构简化物，其制法和其药物组合物与用途

技术领域

本发明涉及新的4-O-甲基三白草醇结构简化物，其制备方法，含它们的药物组合物，及其作为药物，尤其作为抗肿瘤药物的用途，属于医药技术领域。

背景技术

缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible fac-tor-1,HIF-1)是由缺氧、CoCl₂、去铁胺等诱导细胞产生的一种具有转录活性的核蛋白，由α和β亚基组成。HIF-1普遍存在于人和哺乳动物细胞内，虽然其在常氧下也有表达，但在常氧条件下合成的HIF-1蛋白很快即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解；只有在缺氧条件下HIF-1才可稳定表达，引起一系列细胞对缺氧的反应，可促进红细胞生成，血管生成，调节血管舒缩及促进糖酵解，具有重要的病理生理学意义(Cancer Research.,2000；60(17):4693.)。

现代医学研究表明大多数实体瘤的血管存在结构与功能方面的异常，无法满足肿瘤细胞快速增殖对养分和氧气的需求，致使瘤体周围产生特殊的低氧、微酸环境(CancerResearch.,2002；62(17):5089.)。而HIF-1促进红细胞生成、促进血管生成、促进糖酵解的生理作用无疑有利于肿瘤细胞的缺氧适应过程。因此，HIF-1 的过度表达是肿瘤恶化和对化疗药物耐药的原因之一，亟需开发高效的HIF-1抑制剂。

木脂素类化合物是由苯丙素双分子聚合而成的一类天然产物，这类化合物具有广泛的生物活性,如抗肿瘤、消炎以及治疗免疫系统疾病、抗病毒等。4-O-甲基三白草醇是从三白草中分离得到的一类含有四氢呋喃环的木脂素类天然产物， Zhou等发现该化合物具有特异抑制HIF-1α的活性，IC₅₀在20nmol/L(Antiviral Research,2010,85,425-428.)。4-O-甲基三白草醇结构特点是分子中含有6个手性中心，其中包括具有(7’R,8’R,7S,8R)绝对构型的手性四氢呋喃环，以及一个手性苯丙醇侧链。结构如下。但提取分离困难，因而来源有限。另外天然产物结构复杂，通过合成的方法制备困难。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供具有优良疗效且毒性低的具有HIF-1α抑制作用的一类新化合物。

本发明要解决的另一技术问题是提供这类化合物的制备方法。

本发明要解决的又一技术问题是提供含有这类化合物的药物组合物。

本发明要解决的再一技术问题是提供这类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：

1.式(I)化合物或其异构体及其药学上可接受的盐

R₁选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，卤素；

R₂,R₃选自氢，C_1-4直链或支链烷基；

R₄选自氢，羟基，O＝；

R₅,R₆,R₇独立的选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环。

A环选自环戊烷，噻吩，呋喃，咪唑，吡咯，四氢吡咯，2-吡咯烷酮；

Y选自独立的氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基，以及取代的苯基，噻吩基，呋喃基，咪唑基，吡咯基，四氢吡咯基；

上述取代基选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；优选的R₁选自氢，C_1-2直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-2直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，卤素；

优选的R₂,R₃选自氢，C_1-2直链或支链烷基；

优选的R₄选自氢，羟基，O＝；

优选的R₅,R₆,R₇独立的选自氢，C_1-2直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-2直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-2直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；

或者优选的R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环。

优选的A环选自环戊烷，噻吩，呋喃，咪唑，吡咯，四氢吡咯，2-吡咯烷酮；

优选的Y选自独立的氢，C_1-2直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-2直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-2直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基，以及取代的苯基，噻吩基，呋喃基，咪唑基，吡咯基，四氢吡咯基；

上述取代基选自氢，C_1-2直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-2直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-2直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；优选的式(I)化合物，包括但不限定于式(Ia)所示

其中四氢吡咯环上3位取代基可分别为R或S构型，7位，8位手性中心的构型可分别为R或S构型；

R₂,R₃选自氢，C_1-4直链或支链烷基；

R₄选自氢，羟基，O＝；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

优选的R₂,R₃选自氢，C_1-2直链或支链烷基；

优选的R₄选自氢，羟基，O＝；

或者优选的R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

上述取代基选自氢，C_1-2直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-2直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-2直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；

优选的式(I)化合物，包括但不限定于式(Ib)所示

其中四氢吡咯环上3位取代基为S构型，7位，8位手性中心的构型可分别为R 或S构型；

R₂,R₃选自氢，C_1-4直链或支链烷基；

R₄选自氢，羟基，O＝；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

R₅’,R₆’,R₇’独立的选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基。

优选的R₁选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，卤素；

优选的R₂,R₃选自氢，C_1-4直链或支链烷基；

优选的R₄选自氢，羟基，O＝；

优选的R₅,R₆,R₇独立的选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；

或者优选的R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

优选的R₅’,R₆’,R₇’独立的选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基。

优选的化合物，包括但不限定于

在本发明中，术语“卤素"是指氟、氯、溴、碘。

根据本发明，式(I)化合物可以异构体的形式存在，式(I)化合物A部分与芳环连接产生的构型可为R或S构型，A部分与Y基团连接产生的构型可为R或 S构型；7位，8位手性中心的构型可分别为R或S构型；

本发明包括所有可能的立体异构体以及两种或多种异构体的混合物。

如果存在顺/反异构体，本发明涉及顺式形式和反式形式以及这些形式的混合物，如果需要单一异物体可根据常规方法分离或通过立体选择合成制备。

根据本发明，本发明式(XIX)化合物与式(Ia)化合物可通过如下反应路线制备：

1)母环式(VIII)化合物与式(IX)化合物的合成

反应路线II：

i:酰化ii:取代iii：烷基化iv：水解v：磺酰化vi：取代vii：水解viii：酰化ix：偶联x：氢化xi：还原

其中R₁，Y如上所定义；

A.式(VII)化合物氯化亚砜反应成酰氯之后连接Evans辅基得到化合物18；

B.化合物18在NHMDS条件下通过烷基化反应得到化合物19；

C.化合物19在碱性条件下水解得到化合物20；

D.化合物20先与甲磺酰氯反应生成醚，之后与叠氮化钠反应，再水解得到化合物21；

E.化合物21在酸性条件下水解后合环得到化合物22；

F.化合物22在Pd条件下偶联得到化合物23；

G.化合物23氢化得到式(VIII)化合物；

H.化合物23经还原以及氢化得到式(IX)化合物；

2)母环与侧链的连接

母环式(VIII)化合物与式(IX)化合物与上述式(XII)化合物或式(XIII)化合物通过烷基化或烷基化，还原反应得到式(XIX)化合物与式(Ib)化合物；

其中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，Y如上所定义；

根据本发明，本发明式(L)化合物可通过如下反应路线制备：

1)母环式(XI)化合物的合成

i:偶联ii:偶联iii：硅解离

I.2,5-二溴噻吩与式(X)化合物经Suzuki偶联，得化合物25；

J.化合物25再与一分子化合物26反应得到化合物27；

K.经TBAF脱除保护得到式(XI)化合物；

2)母环与侧链的连接

母环式(XI)化合物与上述式(XII)化合物或式(XIII)化合物通过烷基化或烷基化，还原反应得到式(L)化合物；

i：烷基化ii：还原

其中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，Y如上所定义；R₅’，R₆’，R₇’独立的选自氢， C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COOC_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环。

本发明再一方面还涉及一种药物组合物，包括有效剂量的本发明化合物和药效学上可接受的载体。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95 重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

根据本发明，式(I)化合物及其异构体在抗肿瘤中显示出优良效果。因而可作为抗肿瘤药用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。本发明的化合物可用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。优选的肿瘤选自乳腺癌。优选的乳腺癌选自耐紫杉醇乳腺癌。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为 0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明的优点

发明人发现以1，3-芳基取代的四氢吡咯环取代天然产物中的四氢呋喃环合成的结构简化物化合物8较天然产物4-O-甲基三白草醇的HIF-1α抑制活性明显增强，而且对特定靶点具有较高的选择性。

化合物8对人乳腺癌T47D细胞中HIF-1α抑制活性的IC₅₀为2.28nmol，其活性较天然产物4-O-甲基三白草醇强10多倍。且其对不同细胞株具有选择的抑制活性。

本专利所设计合成的4-O-甲基三白草醇结构简化物较其原始天然产物活性更好并且更加易于制备，成分更低。

附图说明

图1 4-O-甲基三白草醇衍生物化合物8对肿瘤增殖的影响

具体实施方式

下面的实施例及药物活性实验用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

下面的实施例用来解释本发明，但对本发明无任何限制。

使用的原料为已知化合物或按已知方法制备。

实施例1：

500mL圆底瓶中装有(25g,0.137mol)高香草酸，150ml DMF溶解，(66g,0.477 mol)无水K₂CO₃加入，室温下滴入BnBr(34mL,0.286mol),5h后TLC显示完全， 500mL EA、500mL水加入反应液中，分液，取有机相，水相用EA(100ml*2) 提取，合并EA相，依次用200mL水、饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(PE:EA＝20:1)得产品42g，收率85％。

(34g,90mmol)上述产品于无水甲醇中，悬浊液搅拌5min后加入(30g,540mmo l)KOH，反应液澄清，室温下搅拌4h TLC完全。浓缩反应液，除去甲醇，向反应液中加入300mL水、200mL乙醚，分液取水相，再用100ml乙醚提取水相中有机杂质，6N HCl中和水相至PH＝4左右，大量固体析出，300mL EA加入，提取2次(或者直接过滤，水洗，烘干产品)，合并EA相，100ml水洗、100ml 饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用(PE：EA)重结晶，即适量的 EA加热回流溶解后，滴加PE至出现沉淀，搅拌溶解后静置过滤得23.3g产品，收率91.4％。

实施例2：

步骤A200ml圆底瓶中装有(9.6g,35.3mmol)上述产品，20mLSOCl₂加入，55℃下反应1.5h，浓缩，待用-I。

250mL二口瓶中加入(6.43g,36.4mmol)(S)-苄基恶唑烷酮，100mL无水THF溶解，-78℃氩气保护下滴入(2.5M，14.5mL,36.4mmol)n-BuLi，滴约15min，于此温度下反应0.5h，之后滴入制好的I的10mL无水THF溶液，升温到室温反应3h 反应完全。20mL饱和氯化铵缓慢滴入反应液，浓缩出去大部分THF，加入300mL EA，50mL水，水相100mL EA提取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(PE:EA＝5:1)得产品15.7g，收率99％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.83-7.45(m,13H),5.16(s,2H),4.66-4.69(m,1H),4.26-4.29(m, 1H),3.89-4.22(m,3H),3.89(s,3H),3.25(d,J＝12.8Hz,1H),2.73-2.78(m,1H)；¹³C NMR(100 MHz,CDCl₃)δ171.3,153.3,149.5,147.3,137.1,135.0,129.4,128.9,128.5,127.7,127.3,127.2, 126.4,121.9,113.8,113.4,70.9,66.0,55.9,55.2,40.9,37.6；HR-MS(ESI)calcd for C₂₆H₂₆O₅N (M+H)⁺:432.18055,found 432.17960.

实施例3：

步骤B

(2.23g,5mmol)化合物18于50mL THF中，-78℃氩气保护下滴入(2.0M,3mL,6mmol)NaHMDS，-78℃1.5h后，滴入(0.9mL,6mmol)溴代叔丁酯，此温度下 2h TLC显示完全，10mL饱和氯化铵滴入，200mLEA提取，50mL饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(PE:EA＝15:1)得产品2.3g，收率 85％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.79-7.43(m,13H),5.42(dd,J＝4.4Hz,11.2Hz,1H),5.12(s,2H),4.55-4.60(m,1H),4.02-4.11(m,2H),3.88(s,3H),3.24-3.39(m,2H), 2.78-2.81(m,1H),2.60(dd,J＝4.4Hz,16.8Hz,1H),1.43(s,9H)；¹³C NMR(100MHz, CDCl₃)δ173.5,171.0,152.8,149.6,147.7,137.1,135.7,129.9,129.5,128.9,128.6, 127.8,127.3,120.7,113.9,112.2,80.9,71.0,65.7,56.0,55.8,44.2,40.2,37.6,28.1； HR-MS(ESI)calcd for C₃₂H₃₅O₇NNa(M+Na)⁺:568.23057,found 568.22961.

实施例4：

步骤C

200mL圆底瓶中装有(2.4g,4.4mmol)化合物19，乙醚50mL,5mL THF溶解，加入0.5mL水，0℃滴入(4M,2.42mL,9.7mmol)LiBH₄，室温反应2h，TLC显示完全，滴入10mL1NNaOH,100mL乙醚、50mL EA提取，50mL饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶抽滤除盐浓缩得产品1.6g，收率99％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.69-7.43(m,8H),5.13(s,2H),3.88(s,3H),3.72(m,2H),3.21-3.25(m,1H),2.67(dd,J＝7.2Hz,15.2Hz,1H),2.52(dd,J＝7.2Hz,15.2 Hz,1H),1.34(s,9H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ171.8,149.7,147.1,137.2,134.2, 128.5,127.8,127.2,119.6,114.2,111.7,80.6,77.2,77.0,76.8,71.0,67.0,56.0,44.3, 38.8,27.9.

；HR-MS(ESI)calcd for C₂₂H₂₈O₅Na(M+Na)⁺:395.18290,found 395.18173.

实施例5：

步骤D

100mL圆底烧瓶中装有(1.64g,4.41mmol)20,40mL无水CH₂Cl₂溶解,(0.9mL，6.62mmol)NEt₃加入,0℃滴入(0.4mL,4.85mmol)甲磺酰氯，升至室温反应1h， TLC显示完全，50mL CH₂Cl₂稀释，50mL水洗，50mL饱和氯化钠洗，有机相干燥，过滤，浓缩得产品1.96g，收率99％。

25mL圆底烧瓶中装有(0.6g,1.33mmol)上述产品,5mL无水DMF溶解,Ar气保护下加入NaN₃(0.26g，4mmol)NaN₃加入,氩气下于65℃反应，5h后，TLC显示完全，50mL乙酸乙酯加入，40mL水加入，分液取有机相，干燥，过滤，浓缩， PE:EA＝20:1得产品0.45g，收率85％。

25mL圆底烧瓶中装有(0.1g,0.25mmol)上述产品,5mL无水THF溶解,Ar气保护 0℃下加入(86mg，0.33mmol)PPh₃，0℃-室温反应24h后，TLC显示完全，1mL 水加入搅拌6h后浓缩，加入50mL乙酸乙酯提取，分液，取有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(PE:EA＝1:1—DCM:MeOH＝20:1)得纯品90mg，收率96.8％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.67-7.44(m,8H),5.13(s,2H),3.88(s,3H),3.02-3.05(m,1H),2.80-2.93(m,2H),2.59(dd,J＝7.2Hz,14.8Hz,1H),2.51(dd,J＝7.2Hz, 14.8Hz,1H),1.31(s,9H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ171.6,149.7,147.0,137.3, 135.2,128.6,128.5,127.8,127.3,119.8,114.3,111.7,80.4,77.2,77.0,76.8,71.1,56.0, 47.7,45.7,40.2,28.0；HR-MS(ESI)calcd for C₂₂H₃₀O₄N(M+H)⁺:372.21693,found 372.21686.

实施例6：

步骤E

25mL圆底烧瓶中装有(70mg,0.19mmol)21,5mL无水DCM溶解,Ar气保护0℃下加入(0.5mL，6.7mmol)CF₃COOH，0℃-室温反应2h后，TLC显示完全，浓缩得粗品65mg，柱层析(DCM:MeOH＝10:1)得纯品58mg，收率98％。 200mL圆底烧瓶中装有(180mg,0.57mmol)上述产品,(142mg,0.74mmol)EDCI, (154mg,1.14mmol)HOBT,30mL无水DCM溶解,Ar气保护0℃下加入(0.25mL， 1.43mmol)DIPEA，0℃-室温反应16h后，TLC显示完全，15mL水加入，分液后，有机相用15mL 5％NaHCO₃洗涤，15mL饱和NaCl洗，有机相干燥，过滤，浓缩，柱层析(DCM:MeOH＝2mL:2滴)得纯品140mg，收率82.5％。

实施例7：

步骤F

50mL二颈瓶中装有(500mg,1.68mmol)22,(493mg,2.27mmol)4-溴藜芦醚,(20 mg,5％mmol)醋酸钯,(75mg,7.5％mol)Xantphos，(766mg,2.35mmol)Cs₂CO₃， Ar气保护下加入15mL排过气泡的二氧六环，此环境下100℃反应25h后，TLC 显示完全，50mL EA加入，过硅藻土，浓缩，柱层析(PE:EA＝1:1)得纯品450mg，收率62％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.30-7.51(m,6H),6.77-6.87(m,5H),5.15(s,2H), 4.11-4.14(m,1H),3.89(s,6H),3.87(s,3H),3.81-3.85(m,1H),3.63-3.65(m,1H), 2.95-2.97(m,1H),2.78-2.80(m,1H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ172.7,149.9, 148.9,147.3,146.2,137.0,134.7,132.8,128.6,127.9,127.2,118.7,111.7,110.9,,110.5, 105.1,71.1,56.4,56.1,56.0,56.0,40.4,36.9；HR-MS(ESI)calcd for C₂₆H₂₈O₅N (M+H)⁺:434.19620,found 434.19540.

实施例8：

步骤G

(18mg,0.46mmol)LiAlH₄于25mL圆底烧瓶中，加入5mL无水THF，之后Ar 气保护下加入10(80mg,0.18mmol)的5mL无水THF溶液,升至回流反应3h后， TLC显示完全，5mL饱和硫酸钠终止反应，50mL DCM提取2次，合并，饱和 NaCl洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩柱层析(PE:EA＝5:1)得纯品65mg，收率 84％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.30-7.45(m,5H),6.75-6.85(m,4H),6.08-6.21(m,2H),5.14(s,2H),3.88(s,6H),3.82(s,3H),3.64-3.68(m,1H),3.40-3.49(m,3H),3.28-3.32(m,1H),2.36(m,1H),2.05-2.14(m,1H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ150.1,149.7, 146.9,143.4,140.3,137.2,128.5,127.8,127.2,119.0,114.1,113.8,111.0,102.5,97.1, 71.1,56.9,56.1,55.8,55.4,48.2,43.9,33.5；HR-MS(ESI)calcd for C₂₆H₃₀O₄N (M+H)⁺:420.21693,found 426.21628.

实施例9：

步骤H

(60mg,0.14mmol)6于25mL圆底烧瓶中，加入DCM/MeOH(1mL/4mL)溶剂，之后Ar气保护下加入催化量的Pd-C(80mg,0.18mmol)氢气条件下室温反应4h 后，TLC显示完全，过滤浓缩柱层析(PE:EA＝5:1)得纯品40mg，收率85％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.79-6.89(m,4H),6.09-6.21(m,2H),3.88(s,6H),3.82(s,3H),3.64-3.68(m,1H),3.40-3.49(m,3H),3.27-3.31(m,1H),2.37(m,1H), 2.08-2.143(m,1H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ150.1,146.9,144.4,119.8,114.3, 113.9,119.6,102.5,97.1,57.0,56.6,55.9,55.8,48.2,44.1,33.6,29.7；HR-MS(ESI) calcd for C₁₉H₂₄O₄N(M+H)⁺:330.16998,found 330.16888.

实施例10：

(30mg,0.09mmol)24a于25mL圆底烧瓶中，加入3mL无水乙腈，Cs₂CO₃(36mg,0.11mmol),之后Ar气保护下加入侧链(40mg,0.11mmol)的1mL无水乙腈溶液, 室温反应3h后，过滤浓缩柱层析(PE:EA＝2:1)得纯品40mg，收率85％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.83(d,J＝8.0Hz,1H),7.68(s,1H),6.89-6.90(m,5H),6.19(s,1H),6.08(d,J＝8.0Hz,1H),5.40-5.43(m,1H),3.81-3.94(m,15H),3.62(t,J ＝8.0Hz,1H),3.37-3.45(m,3H),3.25(m,t,J＝8.0Hz,1H),2.34-2.35(m,1H), 2.02-2.12(m,1H),1.72(d,J＝8.0Hz,3H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ197.7, 153.6,150.1,149.8,149.0,145.6,143.4,140.3,136.8,127.3,123.6,119.2,115.7,113.8, 111.4,111.2,110.1,102.4,97.0,78.1,57.0,56.1,56.0,56.0,55.8,55.4,48.2,43.9,33.5, 29.7,19.4.

用类似的方法以化合物10(25mg,0.07mmol)为原料得到下列化合物，30mg，76.9％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.82(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(s,1H),7.49(s,1H), 6.71-6.90(m,6H),5.43(q,J＝8.4Hz,1H),4.11(t,J＝8.8Hz,1H),3.95(s,3H), 3.92(s,3H),3.89(s,3H),3.86(s,6H),3.80(t,J＝8.0Hz,1H),3.60(t,J＝8.0 Hz,1H),2.95(dd,J₁＝8.8Hz,J₂＝17.2Hz,1H),2.72(dd,J₁＝8.8Hz,J₂＝17.2Hz, 1H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ197.5,172.7,153.7,150.0,149.1,148.9,146.2, 146.1,135.6,132.7,129.0,127.2,123.6,118.8,115.7,111.7,111.1,111.0,111.0,110.1, 105.1,78.0,77.3,77.0,76.8,56.3,56.1,56.1,56.0,56.0,56.0,40.4,36.9,19.4；HR-MS (ESI)calcd for C₃₀H₃₄O₈N(M+H)⁺:536.2279,found 536.2271.

用类似的方法以化合物22为原料(30mg,0.11mmol)得到下列化合物，40mg，收率78.4％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.08-7.83(m,11H),5.40-5.43(m,1H),3.81-3.94(m,9H),3.62(t,J＝8.0Hz,1H),3.37-3.45(m,3H),3.25(m,t,J＝8.0Hz,1H),2.34-2.35 (m,1H),2.02-2.12(m,1H),1.72(d,J＝8.0Hz,3H)；

实施例11：

(3.23g,14.66mmol)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚溶于40ml Tol中，0℃氩气保护下滴加(1.2M,14.66mmol)DIBALH。滴加完毕后，于该温度反应1.5h，随后，缓慢滴加17(in30ml Tol)，滴加完毕后反应3h，TLC显示反应完全，低温下滴加 25ml 1N HCl淬灭反应，缓慢升至室温，分出有机层，水层加乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，依次加饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机层加无水硫酸钠干燥。过滤，蒸除溶剂，柱层析(PE:EA＝2:1)，得纯品380mg。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.83-6.98(m,9H),6.22(s,1H),6.11(d,J＝8.4Hz,1H),4.64(d,J＝8.4Hz,1H),3.90-3.93(m,12H),3.83(s,3H),3.68(t,J＝8.4Hz,1H), 3.41-3.49(m,3H),3.35(t,J＝8.0Hz,1H),2.36-2.41(m,1H),2.12-2.15(m,1H),1.17 (d,J＝6.4Hz,3H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ150.9,150.2,149.0,148.9,146.5, 143.4,140.5,138.0,132.6,120.0,119.5,119.1,114.0,111.1,110.9,110.1,102.6,97.2, 84.2,78.4,57.0,55.9,55.8,55.5,48.2,44.1,33.5,17.1；HR-MS(ESI)calcd for C₃₀H₃₈O₇N(M+H)⁺:524.2643,found 524.2634.

用类似的方法以化合物22(10mg,0.04mmol)为原料得到下列化合物，10mg，5 8％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.08-7.83(m,11H),4.64(d,J＝8.4Hz,1H),3.69(m, 1H),3.81-3.94(m,9H),3.62(t,J＝8.0Hz,1H),3.37-3.45(m,3H),3.25(m,t,J＝8.0 Hz,1H),2.34-2.35(m,1H),2.02-2.12(m,1H),1.17(d,J＝6.4Hz,3H)；(two sets of peaks)

药理实验

实验例1、4-O-甲基三白草醇衍生物对HIF-1活性抑制作用

(一)方法：

瞬时共转染pGL2-TK-HRE/pRL-CMV质粒的T47D细胞模型

利用脂质体对T47D细胞进行瞬时共转染pGL2-TK-HRE质粒和pRL-CMV质粒。将T47D细胞以3×10⁵个/ml的浓度接种于96孔板，每孔100μl。培养细胞的培养基为含 10％血清，无双抗的RPIM 1640。待细胞长至约90％以上融合时，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行瞬时共转染。

瞬时转染：

a.配制溶液1和溶液2

溶液1：0.5μl lipofectamine 2000+24.5μl无血清培养基/每孔(总体积25μl)(温育5min)

溶液2：25μl无血清培养基+0.2μg pGL3-TK-HRE质粒和0.01μg pRL-CMV 质粒/每孔(总体积25μl)。

b.将溶液1与溶液2混合，室温下放置20min。

c.与此同时，将96孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入 100μl无血清培养基。

d.将溶液1与溶液2的混合液加入孔中，轻轻混匀。在37℃，5％的CO₂中培养6h。

e.6h后，更换含有10％血清的完全培养基，在37℃，5％的CO₂中继续培养18h。

应用T47D-HRE细胞模型对待测物的HIF-1抑制活性筛选

a.在已瞬时共转染pPGL2-TK-HRE与pRL-CMV质粒的T47D-HRE细胞内加入待测化合物，每个浓度三个平行孔，继续培养0.5h，转入低氧(1％O₂、5％CO₂)或常氧条件(21％O₂、5％CO₂)培养继续20h。

b.弃去上清，PBS洗2遍，加入70μl的Dual-Glo荧光素酶底物液，2min后将液体转入96孔Costar白板，检测萤火虫荧光素酶相对荧光强度，后加入70μl 的Stop-Glo底物液，检测海肾荧光素酶相对荧光强度，得出归一化值，并计算抑制率，并计算IC₅₀值。

(二)结果：

应用T47D-HRE细胞模型对4-O-甲基三白草醇衍生物，进行HIF-1抑制活性进行检测，结果显示衍生物在10^-8mol/L水平的有2个，分别为8，9其IC₅₀，分别为 2.28和5.37nmol/L，其余化合物均大于10nmol/L。

表1.对HIF-1抑制活性检测

4-O-甲基三白草醇IC₅₀ 20(10^-9mol/L)

实验例2、4-O-甲基三白草醇衍生物MTT法测定肿瘤细胞存活率

(一)方法

MTT法测定肿瘤细胞存活率

将对数生长期的细胞用胰酶消化后，配制成一定浓度的单细胞悬液，根据细胞生长速度的差异，按1500-3000个/孔接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100μl。次日加入含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100μl(DMSO终浓度<0.1％)，每种受试化合物设4个剂量组(0.05，0.5，5，50μmol/L)每组设三个平行孔。于37℃，5％CO₂继续培养96h后弃上清，每孔加入200μL新鲜配制的含 0.5mg/mL MTT的无血清培养基。继续培养4h，弃上清，每孔加入200μL DMSO 溶解MTT甲簪沉淀，微型振荡器振荡混匀后，酶标仪在检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，按下列公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC₅₀：

体外抗肿瘤筛选结果见表

SW1990，Capan2，Mia-PaCa2：人胰腺癌细胞株；

MDA-MB-231：人乳腺癌细胞株。

SVGP12：人脑胶质细胞(为正常细胞)；U-87MG：人胶质母细胞瘤细胞株；Hs683：人视神经母细胞瘤细胞株；U251：人胶质母细胞瘤细胞株；T98G：人胶质母细胞瘤细胞株；Daoy：人髓母细胞瘤细胞株；SH-SY5Y：人神经母细胞瘤细胞株；SK-N-SH：人神经母细胞瘤细胞株。

实验例3、4-O-甲基三白草醇衍生物8对裸鼠瘤的生长抑制作用

(一)方法

实验步骤

无菌条件下收集肿瘤细胞(Daoy)，用灭菌生理盐水调整细胞密度至1×10⁷个/ml，取0.2ml接种于裸鼠腋窝皮下，待肿瘤生长至直径1cm大小，无菌条件下取出，切成2.0mm×2.0mm大小的瘤块，均匀接种于裸鼠腋窝皮下。当肿瘤体积达到 200mm³左右时分组给药(接种后第6天)，剔除肿瘤生长不良的动物，每组6只。对照组及化合物8 100.0mg/kg剂量组，化合物8每日口服灌胃给一次，共给药10 次。每周称量体重2次，并用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，按照公式V＝a×b²/2 计算出肿瘤的体积，其中a为肿瘤的长度，b为肿瘤的宽度。于接种第16天，将裸鼠脱臼处死并拍照，然后剥离肿瘤，称重。计算肿瘤RTV(相对肿瘤体积)及抑制率。

(二)结果

化合物8在100mg/kg剂量下对肿瘤的生长显示出显著的抑制作用，按相对肿瘤体积计算T/C为40.57％，肿瘤抑制率为55.14％。

化合物8对裸鼠移植瘤的生长抑制作用(肿瘤重量)

化合物8对裸鼠移植瘤的生长抑制作用(肿瘤体积)

4-O-甲基三白草醇衍生物化合物8对肿瘤增殖的影响见图1，

横坐标为接种之后的天数，纵坐标为肿瘤相对体积，图中LXY为化合物8。

Claims

1.式(I)化合物或其异构体及其药学上可接受的盐

R₂,R₃选自氢，C_1-4直链或支链烷基；

R₄选自氢，羟基，O＝；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

上述取代基选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基。

2.根据权利要求1的化合物或其异构体及其药学上可接受的盐，其特征在于，

R₁选自氢，C_1-2直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-2直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，卤素；

R₂,R₃选自氢，C_1-2直链或支链烷基；

R₄选自氢，羟基，O＝；

R₅,R₆,R₇独立的选自氢，C_1-2直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-2直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-2直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

Y选自独立的氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COOC_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基，以及取代的苯基，噻吩基，呋喃基，咪唑基，吡咯基，四氢吡咯基；

上述取代基选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COOC_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基。

3.根据权利要求1的化合物或其异构体及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物如式(Ia)所示

R₂,R₃选自氢，C_1-4直链或支链烷基；

R₄选自氢，羟基，O＝；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

4.根据权利要求3的化合物或其异构体及其药学上可接受的盐，其特征在于，

R₂,R₃选自氢，C_1-2直链或支链烷基；

R₄选自氢，羟基，O＝；

R₅,R₆,R₇独立的选自氢，C_1-2直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-2直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COOC_1-2直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

5.根据权利要求1的化合物或其异构体及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物如式(Ib)所示

其中四氢吡咯环上3位取代基为S构型，7位，8位手性中心的构型可分别为R或S构型；

R₂,R₃选自氢，C_1-4直链或支链烷基；

R₄选自氢，羟基，O＝；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

6.根据权利要求5的化合物或其异构体及其药学上可接受的盐，其特征在于，

R₂,R₃选自氢，C_1-2直链或支链烷基；

R₄选自氢，羟基，O＝；

或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环；

R₅’,R₆’,R₇’独立的选自氢，C_1-2直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-2直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COOC_1-2直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基。

7.根据权利要求1-6任一项的化合物或其异构体及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物选自

8.制备权利要求1-7中任一项A环部分为四氢吡咯的化合物式(Ia)化合物的方法，其包括以下步骤：

1)母环式(VIII)化合物与式(IX)化合物的合成

以易制备的式(VII)化合物为起始原料，首先引入手性辅基得到化合物18，在羰基α位烷基化得到化合物19，脱除Evans辅基生成化合物20，化合物20Ms保护后经两步反应得到化合物21，将化合物21脱除叔丁基后分子内缩合成酰胺得化合物22，之后在Pd条件下引入Y基团得关键中间体23。

A.中间体23经Pd-C还原后得式(VIII)化合物；

B.中间体23经LiAlH₄，以及Pd-C还原后得式(IX)化合物；

其中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，Y如权利要求1-7中任一项所定义；

2)母环与侧链的连接

母环式(VIII)化合物或式(IX)化合物与式(XII)化合物或式(XIII)化合物通过烷基化或烷基化，还原反应得到式(XIX)化合物与式(Ia)化合物；

其中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，Y如权利要求1-7中任一项所定义；Z代表卤素或者OTs基团，OMs基团。

9.制备权利要求1-7中任一项A环部分为噻吩的化合物式(L)化合物的方法，其包括以下步骤：

1)式(XI)化合物的合成

2,5-二溴噻吩与式(X)化合物经Suzuki偶联，得化合物25，之后再与一分子化合物26反应得到化合物27，经TBAF脱除保护得到式(XI)化合物。

2)母环与侧链的连接

其中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，Y如权利要求1-7中任一项所定义；R₅’，R₆’，R₇’独立的选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基；或者R₆和R₇形成-OCH_nO-(n＝1-3)相连成环。

其中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，Y如权利要求1-7中任一项所定义；R₅’，R₆’，R₇’独立的选自氢，C_1-4直链或支链烷基，三卤甲基，C_1-4直链或支链烷氧基，三卤甲氧基，羧基，COO C_1-4直链或支链烷基，C_1-5直链或支链烷酰基，卤素，羟基。

10.一种药物组合物，包括有效剂量的权利要求1-7中任一项的化合物或其异构体及其药学上可接受的盐和药效学上可接受的载体。

11.权利要求1-7中任一项的化合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

12.根据权利要求11的应用，所述的肿瘤选自神经胶质母细胞瘤、黑色素瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、口腔表皮癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠腺癌。

13.根据权利要求12的应用，所述的乳腺癌选自耐紫杉醇的乳腺癌，所述的肺癌选自非小细胞肺癌。