CN101945665A - 一种用于预防和治疗关节炎的含有蜘蛛酶的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于预防和治疗关节炎的含有蜘蛛酶(arazyme)作为活性成分的组合物。更具体地，本发明的由Aranicola proteolyticus生产的蜘蛛酶通过抑制炎症诱导因子TNF-α的表达、防止蛋白多糖和胶原蛋白从关节软骨流失来抑制关节炎的进展和保护关节，可有效用作预防和治疗关节炎的组合物。

Description

一种用于预防和治疗关节炎的含有蜘蛛酶的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于预防和治疗关节炎的含有蜘蛛酶(arazyme)作为活性成分的组合物。

背景技术

关节炎是指一种关节疾病。关节炎可以是从轻微到严重各种形式的损害，可能并不总是恶化。关节炎有关的疾病是最常见的难治性退行性疾病，全球12％的人口罹患该疾病。韩国约有200多万人患有这种疾病。关节炎是显示肌肉骨骼和结缔组织炎症变化所造成的所有肌肉骨骼系统症状的统称。这种疾病的特点是慢性炎症引起组织永久性损害，畸形和退化，及其产生关节、骨、软骨或脊髓的问题(Hofbause，L.C.，et.al.，Arthritis and Rheumatism 44：253-259，2001)。

关节炎分为退行性关节炎(骨关节炎)、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮、多发性肌炎、风湿性多肌痛等。

骨性关节炎或磨损又撕裂的关节炎，也称为退行性关节炎，是最常见的所有关节炎有关的疾病，通常发生在中年和老年人群。骨关节炎是一种影响脊椎和下肢关节(髋关节、膝盖和脚关节)的关节炎，超过60％的人在他们60岁或70岁时患上这种病。骨关节炎是影响老年人的一种常见疾病。虽然这种疾病在60岁以上的人群中比较常见，但在45岁以下的人群中，男性比女性更常见，而55岁以上的人群中，女性比男性更普遍。骨关节炎根据病因主要分为原发性和继发性两大类。显示原因不明的磨破关节软骨的症状，即显示退行性改变的骨关节炎被称为原发性骨关节炎，通常在女性中发生。原发性骨关节炎的确切原因和病因还不清楚。继发性骨关节炎的原因大致可分为关节损伤、软骨基质异常、软骨下骨畸形等。

退行性关节炎是一种随着年龄增长发病越来越频繁的慢性关节炎，尤其是膝骨关节炎，是一种具有高发病率的疾病。有报告指出，通常习惯久坐生活方式的韩国人，膝盖弯曲成O型，这会使膝盖内部的压力异常增加，到中年时会增加患骨关节炎的可能性。当此炎症继续下去，周围肌肉萎缩可能会导致关节变形，造成各种社会损失，诸如医疗费用，降低了老人的社会生活质量等。

类风湿性关节炎是炎症性关节炎的最常见类型，1％至2％的人口罹患此疾病。类风湿性关节炎由滑膜关节炎症导致，10岁以上的任何人都可能发生。但是，这种疾病在女性中最常见，常发生在30至50岁之间。

强直性脊柱炎是一种能引起脊柱和骨盆之间的关节发炎的疾病。有时发生在髋关节。这种疾病更容易影响男性，男女患病比例约为3∶1，通常在20至40岁之间出现。兄弟姐妹或父母患有强直性脊柱炎的人罹患该疾病的概率是普通人的20倍。

系统性红斑狼疮是几种已知的结缔组织疾病之一。系统性红斑狼疮是类似于类风湿性关节炎的一种自身免疫性疾病。然而，这种疾病的发生频率较低，其症状没有类风湿性关节炎严重。90％患有这种疾病的人是处于20-30和40-50岁年龄段的年轻女性。

药物治疗、运动疗法、手术疗法等都可用于关节炎的治疗。其中，诸如止痛药、肾上腺皮质激素制剂、非甾体抗炎药等药物，通常可以减少炎症和减轻疼痛，可用作药物治疗，但并没有专门的治疗药物可用。虽然市售有一种构成关节软骨的成分，其作为保健补品来发挥功效，但因其治疗效果不能持久，因此需要更多的研究。

虽然止痛药能缓解疼痛，但它们没有抗炎作用。除泰诺(Tylenol)外，止痛药大都可能引起嗜睡和便秘等。因此，对关节僵硬或水肿来说效果不大。

虽然抗炎药物中的非甾体抗炎药可以像类固醇一样减少炎症，但就药理作用模式或潜在的副作用而言，这类药物与类固醇完全不同。非甾体抗炎药物尤其有助于消除由疼痛以及炎症导致的僵硬和水肿。然而，当内服过量的非甾体抗炎药物或长期使用，会出现如胃壁出血、胃溃疡、消化不良等副作用。

因此，本发明人对由Aranicola proteolyticus菌株产生的蜘蛛酶的效果进行了研究，结果显示，对已知与人退行性关节疾病的诱导病变相似的新西兰白兔动物模型诱导骨关节炎，并采用蜘蛛酶治疗，能抑制TNF-α的表达，并防止蛋白多糖和胶原蛋白从关节软骨流失，抑制关节炎的进展和保护关节，本发明人因此作出了本发明。

发明内容

本发明的目的之一是提供用于预防和治疗关节炎的均含有由Aranicola proteolyticus产生的蜘蛛酶作为活性成分的组合物和功能保健食品。

为了实现上述目的，本发明提供一种含有蜘蛛酶作为活性成分的预防和治疗关节炎的药物。

本发明还提供一种用于预防和改善关节炎的含有蜘蛛酶作为活性成分的功能保健食品。

本发明还提供一种治疗关节炎的方法，包括对罹患关节炎的个体施予药学上有效量的蜘蛛酶。

本发明还提供一种预防关节炎的方法，包括给予个体药学上有效量的蜘蛛酶。

本发明还提供蜘蛛酶在制备预防和治疗关节炎的药物中的应用。

此外，本发明还提供蜘蛛酶在制备预防和改善关节炎的功能保健食品中的应用。

附图说明

结合附图和以下具体描述，将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征及其它优势，其中：

图1为示出TNF-α在血浆中表达水平的测量结果图；

图2为示出目视观察到的股骨髁变化的一组图片：

M：内侧；和

红色箭头：侵蚀部分，

图3为示出目视观察到的股骨胫骨变化的一组图片；

图4为示出目视观察到的股骨髁和胫骨变化的各级评价结果的一组图；

图5为示出观察到的用苏木精-曙红对组织样本染色的组织变化的一组图片；

图6为示出通过甲苯胺蓝染色给予蜘蛛酶对骨关节炎的影响的组织病理结果的一组图片；

图7为示出通过偶氮卡红染色给予蜘蛛酶对骨关节炎的影响的组织病理结果的一组图片；

图8为示出给予蜘蛛酶对关节炎的影响的组织病理变化分数的一组图。

具体实施方式

通过参考附图，对本发明优选的实施方案进行如下具体描述，有助于更清楚地理解本发明的特征和优势。首先应注意基于发明人可以适当定义术语的概念以最佳描述其发明的原则，本文中使用的术语和词汇应解释为与本发明技术精髓相应的意思或含义。另外，应该认识到，省略有关本发明的熟知的功能和结构的详细描述，以免不必要地掩盖本发明的重点。

下面将给出本发明所用术语的定义。

本文的术语“关节炎”表示各种细菌诸如结核杆菌等进入关节导致关节炎症的所有症状。

本文的术语“预防”表示通过给予本发明的组合物抑制关节炎的形成或延迟关节炎的进展的所有行为。

本文的术语“治疗”和“改善”表示通过给予本发明的组合物改善或有助于改变关节炎的症状的所有行为。

本文的术语“给予”表示通过任何适当的方法将本发明预定的组合物引入到个体中。

本文的术语“个体”表示所有动物，诸如人、猴子、犬、山羊、猪、大鼠等，其罹患关节炎，其症状可以通过给予本发明的组合物得到改善。

本文的术语“药学上有效量”表示应用于医疗时，足以在合理的收益或风险比率下治疗疾病的量，所述比率可以根据多种因素来确定，这些因素包括疾病的种类和严重程度、药物活性、敏感性、给药时间、排泄率、给药周期、联用药物和药学领域熟知的其它因素。

以下将对本发明进行具体描述。

本发明提供含有蜘蛛酶作为活性成分的预防和治疗关节炎的药物。

本发明的蜘蛛酶可以优选地按照包括如下步骤的方法来制备，但不限于此：

1)培养Aranicola proteolyticus菌株以得到培养液；

2)过滤所述培养液以得到上清液；和

3)采用树脂从上清液中纯化蜘蛛酶。

在制备方法中，优选以Aranicola proteolyticus菌株作为产蜘蛛酶的微生物，更优选使用1996年7月29日保藏在KRIBB(韩国生物技术资源研究所)的KCTC(韩国典型培养物保藏中心)的Aranicola proteolyticus HY-3(保藏号：KCTC 0268BP)，但不限于此。

Aranicola proteolyticus HY-3是从棒络新妇(Nephila clavata)的小肠中分离的需氧型革兰氏阴性菌，0.5-0.8mm大小，圆形，可移动，对过氧化氢酶呈阳性，但对氧化酶呈阴性(WO 01/57222)。

优选使用由上述方法得到的蜘蛛酶，更优选使用由下面的方法得到的蜘蛛酶。优选药品级的培养Aranicola proteolyticus的基本材料，当只进行纯化操作时，更易于得到具有更高纯度的产品。培养后，进行硫酸铵沉淀(或丙酮沉淀)，然后离心和过滤回收蜘蛛酶。大部分由微生物产生的其它蛋白质与蜘蛛酶具有不同的沉淀浓度。回收蜘蛛酶后，通过膜过滤进行首次纯化以除去杂质，使用超过滤系统进行最终纯化，以获得纯蜘蛛酶。所得到的高浓度蜘蛛酶溶液用冻干机冻干，得到可用的蜘蛛酶粉末。

本发明的蜘蛛酶可以通过下面的方法来制备，但不限于此：

1)将含有蜘蛛酶编码区的核苷酸序列的DNA克隆到表达载体中；

2)将步骤1)克隆的表达载体引入到宿主细胞；

3)对步骤2)转化的宿主细胞进行筛选；和

4)从步骤3)筛选的宿主细胞中获得表达的蜘蛛酶。

在该方法中，步骤1)含有蜘蛛酶编码区的核苷酸序列优选SEQ ID No：2所示的DNA，或者在严格条件下与含有SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。该严格条件在杂交后的洗涤过程中确定。例如，该严格条件是指室温下用6×SSC和0.5％SDS洗涤15分钟，在45℃下用2×SSC和0.5％SDS洗涤30分钟，在50℃下用0.2×SSC和0.5％SDS洗涤30分钟，重复洗涤两次。更优选地，该严格条件是指在较高温度下洗涤。具体地，除最后两次在60℃下用0.1×SSC和0.1％洗涤外，其它与上述条件相同。本领域技术人员可以确定或调整这种严格条件。此处的表达载体优选本领域技术人员熟知的常规革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。也可以使用市售的载体，更优选地，该载体包含用于更好筛查的药物抗性基因。只要不影响蜘蛛酶基因的任何载体都可以使用。

在该方法中，步骤2)的宿主细胞可以选自细菌诸如大肠杆菌(E.coli)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)以及酵母菌诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candia)和毕赤酵母(Phicia)，但不限于此。

在该方法中，优选地，步骤3)中转化的宿主细胞的筛选可通过将药物抗性基因导入载体来筛选，或者与DNA印迹(Southern blotting)或PCR结合来筛选，但不限于此。

在该方法中，步骤4)得到的蜘蛛酶可以包括由任何蛋白纯化方法获得的蜘蛛酶。例如，优选地，可以采用下述方法实现蛋白纯化：柱层析、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀法、溶剂萃取法、蒸馏法、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析或重结晶、但不限于此。可采用本领域技术人员熟知的常规的蛋白表达系统获得由DNA编码的蜘蛛酶。可以从表达蜘蛛酶的细胞培养物中回收和纯化蜘蛛酶。

优选地，本发明的蜘蛛酶选自如下蛋白组成的组中的一种，但不限于此：

(a)具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的蛋白；

(b)由含有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列编码区的DNA编码的蛋白；

(c)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列通过替换、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白与含有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能；以及

(d)由在严格条件下与含有SEQ ID No：2所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的蛋白，所述蛋白与含有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能。

在严格的条件下杂交能够提供核苷酸序列具有高同源性的DNA，表明分离的蛋白非常可能具有与蜘蛛酶功能相同的蛋白。具有高同源性的核苷酸序列表示核苷酸序列与SEQ ID No：2所示的核苷酸序列具有70％或更高的同源性，优选地为80％或更高，更优选地为90％或更高，最优选地，与SEQ ID No：2所示的核苷酸序列具有95％或更高的同源性。此外，可以使用与SEQ ID No：1所示的氨基酸序列具有70％或更高同源性的氨基酸序列，优选地为80％或更高，更优选地为90％或更高，最优选地，可以使用与SEQ ID No：1所示的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列。本领域技术人员可以选择常规算法确定同源率。可以采用本领域技术人员熟知的方法在严格的条件下通过DNA-DNA杂交进行杂交，如前所述，在杂交后洗涤过程中确定杂交中严格的条件(Hames和Higgins，Eds.Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，U.K.，1985)。

本发明提供一种含有蜘蛛酶作为活性成分的预防和治疗关节炎的药物。

关节炎包括退行性关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮、多发性肌炎或者风湿性多肌痛。

为了研究蜘蛛酶对骨关节炎的影响，采用已知与人退行性关节疾病的诱导病变相似的新西兰白兔动物模型，通过断裂右前肢的前十字韧带诱导骨关节炎，然后给予蜘蛛酶。

在本发明中，从给予蜘蛛酶的兔中采集血液，从血液中分离血清，用ELISA法(Quantikine

，研发体系)在血清中分析TNF-α。结果确定，与对照组相比，给予蜘蛛酶的试验组抑制了参与初始炎症反应过程的TNF-α的表达。因此，可以确定通过抑制炎症诱导因子TNF-α的表达，本发明的蜘蛛酶对诱导骨关节炎发病有效果。

为了研究给予蜘蛛酶的兔关节软骨的变化，从胫骨分离股骨，摘除周围肌肉，然后观察关节软骨表面。结果，观察到给予蜘蛛酶的试验组的软骨损伤小于对照组。因此，可以确定本发明的蜘蛛酶对关节炎具有疗效。

为了观察组织变化和胶原蛋白及蛋白多糖的损失程度，制备已分离的股骨和胫骨的组织切片，分别用苏木精-曙红(H&E)、偶氮卡红和甲苯胺蓝染色，随后在光学显微镜下观察。结果，与对照组相比，给予蜘蛛酶的试验组全部显示较小的关节软骨损伤或较少的蛋白多糖和胶原蛋白损失。因此，由于本发明的蜘蛛酶显示出的软骨损伤与非甾体抗炎药塞来昔布类似，以及蛋白多糖和胶原蛋白的微弱的损失，可以确定蜘蛛酶能够用于预防和治疗骨关节炎。

通过结果可以确定，给予本发明的蜘蛛酶，能够抑制已经诱导骨关节炎的动物模型中骨关节炎的进展和缓解疾病的症状。已证实，摄取蜘蛛酶能抑制炎症诱导因子TNF-α的表达，阻止蛋白多糖和胶原蛋白从关节软骨中损失。因此，本发明的蜘蛛酶可用于预防和治疗关节炎，进而抑制骨关节炎的进展和保护骨关节。

除了蜘蛛酶以外，本发明预防和治疗关节炎的药物还可以含有一种或多种具有与蜘蛛酶相同或相似功能的活性成分。对于给药而言，除活性成分外，还可以通过加入一种或多种药用载体来制备药物制剂。可用的药用载体包括生理盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、及其一种或多种混合物，以及必要时，还可加入其它常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。还可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂来制备注射剂，如溶液、悬浮液、乳液等，粉末、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂或注射用液体。此外，可针对每种疾病或根据个体，通过本领域和雷明顿的药剂学(Mack Publishing Company，Easton PA，18^th，1990)中描述的适当方法，优选地以适当的形式制备组合物。

本发明预防和治疗关节炎的组合物可以根据所需的方法口服或胃肠外(例如，静脉、皮下、腹腔或局部注射)给药。组合物的有效剂量可以根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病的严重程度来确定。蜘蛛酶的剂量为每天0.01-5000mg/kg，优选每天0.01-10mg/kg，每天给药一次，优选每天给药数次。

本发明还提供一种治疗关节炎的方法，包括对罹患关节炎的个体给予药学上有效量的蜘蛛酶。

本发明进一步提供一种预防关节炎的方法，包括对个体给予药学上有效量的蜘蛛酶。

可以确定，由于本发明的蜘蛛酶能抑制炎症诱导因子TNF-α的表达和防止关节软骨蛋白多糖和胶原蛋白的损失，从而抑制关节炎的进展和保护关节，因此通过给予个体含有所述蜘蛛酶的组合物，可有益于预防和治疗关节炎。

除了本发明的蜘蛛酶外，给药还包括给予与蜘蛛酶相同或相似功能的一种或多种活性成分。

给药可能通过口服或胃肠外起作用，并可以通常的药物制剂形式给予。

给药单位可以包含个体剂量的1、2、3或4倍，或者1/2、1/3或1/4倍。个体剂量优选地包含给药一次的有效药物的量，相当于每天常规给药剂量的1、1/2、1/3或1/4倍。本发明组合物的有效剂量为0.01-5000mg/kg，优选0.01-10mg/kg，优选一天给药1-6次。

本发明提供蜘蛛酶在制备预防和治疗关节炎的药物中的应用。

可以确定，由于本发明的蜘蛛酶能抑制炎症诱导因子TNF-α的表达和防止关节软骨蛋白多糖和胶原蛋白的损失，从而抑制关节炎的进展和保护关节，因此其可用作预防和治疗关节炎的药物的活性成分。

本发明还提供含有蜘蛛酶作为活性成分的用于预防和改善关节炎的功能保健食品。

此外，本发明提供蜘蛛酶在制备预防和改善关节炎的功能保健食品中的应用。

当本发明的Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶用作食品添加剂时，Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶可以按照常规方法单独或与其它食品成分混合添加。采用上述相同的方式获得和使用蜘蛛酶。可以根据使用目的(预防、保健或治疗)适当确定活性成分的混合量。一般来说，在制作食品或饮料时，Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶优选地以0.01-10重量份添加，更优选地，以0.05-1重量份添加。然而，为了健康和卫生，或为了保持健康长期摄取，用量可等于或小于上述范围，但活性成分的用量可以相当于或高于上述范围，因为就安全问题而言，上述范围都是无碍的。

对食物的种类没有特定的限制。可以添加原料的食品示例包括肉类、香肠、面包、面包、巧克力、糖果、点心、甜点、比萨饼、面条、面粉制品、果糕、包括冰淇淋的乳制品、汤、饮料、茶、饮料、酒精饮料和复合维生素等，一般意义的各类保健食品也包括在内。

像其它传统的饮料一样，本发明组合物的保健饮料还可以包括各种风味调料或天然的碳水化合物等＝。上述天然碳水化合物可以是单糖诸如葡萄糖和果糖，二糖诸如麦芽糖和蔗糖，多糖诸如糊精和环糊精，以及糖醇诸如木糖醇、山梨醇和赤藓糖醇。作为甜味剂，可以使用天然甜味剂如奇异果甜蛋白和甜菊提取物，合成甜味剂如糖精和阿斯巴甜。一般来说，每100ml本发明的饮料中，天然碳水化合物的含量一般约为0.01-0.04g，优选地为0.02-0.03g。

除上述成分外，可向本发明的Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶加入各种营养物质、维生素、矿物质、香料、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH值调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、常被加入到苏打中的二氧化碳(carbonators)等。本发明的Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶也可加入天然果汁、水果饮料、和可加入到蔬菜饮料的新鲜果肉。这些成份可以单独使用或结合使用。这些成分的混合比例其实并不重要，但以本发明的Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶的重量为100份计，通常选择按重量计0.01-0.1份之间的范围。

以下将参考下面的实施例、实验例和制备例具体描述本发明。

然而，下面的实施例、实验例和制备例仅作说明之用，不应以任何方式限制本发明的范围。

<实施例1>蜘蛛酶的制备

为了制备本发明的活性成分蜘蛛酶，在22℃在培养基中培养Aranicola proteolyticus HY-3(KCTC 0268BP)(胰蛋白胨0.5％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.1％，氯化钾0.05％，氯化钙0.02％，硫酸镁0.02％)18小时。通过膜过滤过滤培养液(2μm过滤器，Satorius，美国)从细胞中分离上清液。通过膜过滤(10kDa的膜过滤器，Pall sept，PALL公司，USA)浓缩该上清液。由于本发明的蜘蛛酶基本上具有负离子特性，因此通过经50mM tris-HCl缓冲液(pH值7.6)预处理的使用DEAE-纤维素(美国Sigma公司)的离子交换树脂(美国Sigma公司)和经20mM tris-HCl缓冲液(pH值7.6)预处理的使用Sephadex G-75(美国Sigma公司)的凝胶过滤交换树脂来纯化浓缩液。纯化的酶液在10％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶)上电泳，并验证条带谱图。结果，本发明的蜘蛛酶被鉴定为不含亚单位的单体且在约51.5kDa处显示条带。然而，Aranicola proteolyticus HY-3菌株(KCTC0268BP)可在各种市售培养基中培养，以生产蜘蛛酶，可以通过各种方法分离和纯化其培养液。本发明蜘蛛酶具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，和编码所述氨基酸序列的如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。

<实施例2>实验动物的安排

<2-1>实验动物的饲养

在本实验中，本发明人采用新西兰白兔(Orient Co.，Ltd.，Seoul，Korea)。购买时，实验动物为9周龄，它们的体重范围为1.2-1.5kg。动物15周龄时，开始进行实验给药，它们当时的体重范围在2.1-2.7kg。购买后，目视检查动物，在动物实验室适应7天。在适应期间，观察一般症状，只选择健康的动物进行实验。

这些动物在庆北国立大学兽医学院病理部的动物实验室进行适应和饲养，该实验室配备自动温度/湿度调节器，其中温度为22±2℃，相对湿度调节为55±10％，光照间隔设定为12小时(09:00开灯和21:00关灯)。未检出任何影响实验的饲养环境变化。在整个实验期间，动物实验室的温度/湿度由自动温度/湿度调节器调节，定期检查(每3个月1次)环境条件。从环境检查中，未检出任何可能影响试验的变化。在整个实验期间，一只动物安置在地板上一个带有钢网的养殖箱中，该养殖箱安装有光亮的铝合金和一个可移动的粪便托盘(宽度：480，长度：610，高度：450mm)。对于个体识别，同时使用油标签的皮肤标记和每只养殖箱的组区分卡。固体兔饲料(Agribrands Purina Korea，Inc.)自由饲喂，瓶装的自来水和测试材料混合的饮用水自由饮用。

<2-2>在实验动物中诱导关节炎

已知，不仅需要诱导重复的关节损伤，而且还需在兔模型中摘除膝半月板诱导与人退行性关节炎类似的病变。通过撕裂前十字韧带的方法诱导兔骨关节炎(Hulth A.等，Acta Orthp Scand.41：522-530，1970)。在本实验中，撕裂兔的前十字韧带以诱导关节不稳，同时摘除内侧半月板以诱导骨关节炎。

撕裂所有实验动物的右膝前十字韧带以诱导关节不稳，同时摘除内侧半月板以诱导骨关节炎。对左膝进行Sharm-手术，用作给予受试材料的对照。按下述方法撕裂前十字韧带和摘除内侧半月板。手术前动物禁食6-12小时，只供应饮用水。随后，肌肉注射1.25ml/6mg/kg甲苯噻嗪麻醉剂(Rompun，Bayer Korea Ltd.)和0.2ml/10mg/kg舒泰50(Zoletil 50)(Virbac)以麻醉动物。兔被麻醉后，从兔膝内侧撕裂皮肤和肌肉筋膜，由于断开了皮肤和膝盖破裂，因此撕裂暴露的关节囊，部分股骨和胫骨暴露出来。暴露后，切断股骨关节面和胫骨关节面之间的前十字韧带，摘除内侧半月板。手术后，缝合撕裂的肌肉筋膜和皮肤。手术后，按0.1ml/10mg/kg注射抗生素庆大霉素(SamU Median Co.，Ltd.)3天，以防止周围组织因手术而发生感染。为了有效地诱导骨关节炎，实验组的所有动物均使用跑步机经受强迫运动任务，每天5分钟。

<2-3>实验动物的组织

将实验组分为3组，每组使用4-5只体重在2.1-2.7kg的实验动物。阳性对照组每日供给塞来昔布(辉瑞制药韩国有限公司)，浓度为每250-300ml自来水10mg/kg/天，试验组每天饲喂本发明的组合物，用250-300ml自来水稀释至250mg/kg。用于阳性对照组的塞来昔布(辉瑞)是非甾体抗炎药，通常指定给予骨关节炎的患者。与传统的非甾体抗炎药相比，虽然用塞来昔布对骨关节炎的患者显示出较好的治疗效果，但其治疗骨关节炎，是由于其较少诱发消化性溃疡(Loewen PS.focus on clinical aspects.4：268-75，2002)。阴性对照组的所有动物每天供应等体积的250-300ml自来水。每天采用相同的给药途径和给药方法饲喂所有动物等体积的受试材料和250-300ml自来水。

[表1]

试验组的组织

组别	动物数	关节炎手术	给予药物
				阴性对照组	4	右膝	自来水
阳性对照组	5	右膝	塞来昔布
				治疗组	5	右膝	蜘蛛酶

为了有效诱导骨关节炎，所有实验组动物均经受强迫运动任务，从骨关节炎诱导手术后第4天开始，每天使用跑步机5分钟，给予受试材料4周、8周、12周后，对双膝关节进行关节照相，测量关节面的变化。给予受试材料12周后进行尸体解剖，通过采集血液对血样进行血清学试验，通过组织病理学试验评估受试材料对骨关节炎的控制效果。

<实验例1>测量抑制TNF-α表达的效果

用甲苯噻嗪和舒泰注射和麻醉实验动物，然后剖腹手术，采集隐静脉血液样本，然后以3000rpm离心15分钟分离血清。采用ELISA(Quantikine

R&D system)测定血清中的TNF-α。

测量结果表明，在阴性对照组的基础上，未显示出统计显著性。然而，观察到在初始炎症反应过程中TNF-α的表达水平低于阳性对照组和试验材料组。试验材料组的TNF-α的表达水平显示比阴性对照组更低。因此，可以确定本发明的蜘蛛酶能抑制炎症诱导因子TNF-α的表达，从而抑制骨关节炎发病(见图1)。

<实验例2>关节软骨变化的目视观察

在进行尸体解剖时，本发明人目视观察是否所有的内部脏器都有异常，然后通过从胫骨分离股骨和摘除周围的肌肉，目视观察关节软骨表面的变化。在关节软骨变化的目视观察中，对病变的判断标准列于下面的表2中(Shimizu C.等，Long-term effects of hyaluronan on experimental osteoarthritis in the rabbit knee.6：1-9，1998)。

[表2]

诱导关节炎的关节软骨的目视观察所得的评价级别

级别	相关标准
		G0	正常的关节面
G1	关节面弱纤维化或弱变色
		G2	内侧髁弱侵蚀和外侧髁纤维化
G3	中度坏死和股骨髁纤维化
		G4	过度侵蚀，明显纤维化和形成骨刺

解剖时将股骨和胫骨分离，摘除周围组织，对关节面变化进行初步目视检查。观察结果表明，正常的左膝关节面有光滑的关节面，并很容易从周围组织中摘除。相反，观察到诱导骨关节炎的右膝的关节面遭到破坏和有薄层剥落，有时发现深凹陷迹象。阴性对照组中可目视观察到股骨软骨，能观察到最严重的病变，软骨脱落产生深槽，或者观察到中度纤维化和软骨部分侵蚀。虽然给予对照药和受试材料的各组之间从目视观察上看没有明显的差异，但一般都比阴性对照组显示减少的软骨损伤。左胫骨没有进行手术，在胫骨关节面具有正常的平滑关节面，但诱导骨关节炎的右胫骨关节面受到很大破坏，其也不易从周围组织中分离(见图2)。

虽然在观察胫骨关节面过程中，在阴性对照组中观察到软骨的中度纤维化和部分侵蚀，但很难确定阳性对照组和受试材料组之间的差异，因为在各组中也观察到了大致类似的病变。然而，当股骨和胫骨关节面的损伤程度有区别时，除阴性对照组外，很难确定各组间的差异，但从阳性对照组和治疗组中均观察到类似的损害程度(见图3)。

<实验例3>关节软骨的组织病理学观察

每个分离的股骨和胫骨都固定在10％中性福尔马林缓冲液中。为了通过常规样品制备方法切取组织，将分离的骨浸在含有EDTA的脱钙溶液中脱钙3个月，采用常规组织处理方法，石蜡包埋，然后制备约4μm的组织样本。该组织样本用苏木精-曙红(H&E)染色，观察组织变化，用偶氮卡红染色，观察胶原蛋白纤维的损失程度，以及通过甲苯胺蓝染色，用光学显微镜观察蛋白多糖的损失程度(Prizker KP，等，Osteoarthritis Cartilage，14：13-29，2006)。

当观察关节软骨的组织病理学变化时，对病变的判断标准如下。根据关节软骨损伤程度(见表3)和损伤范围(见表4)，获得级别和阶段，二者相乘得到分数(见表5)，用于给软骨的损伤程度评分。

试验的所有数据均以各组的平均值和标准误差表示。采用t-检验进行统计分析。当p值小于0.05时，评估为具有显著性差异。

[表3]

诱导骨关节炎的软骨的组织病理学级别的评价

级别：关节软骨损害的深度

[表4]

诱导骨关节炎的软骨的组织病理学阶段的评价

阶段	受累率％(表面，网纹(sites)，体积)
		第0阶段	未观察到损伤
第1阶段	＜10％
		第2阶段	10-25％
第3阶段	25-50％
		第4阶段	＞50％

阶段＝关节软骨的损伤范围

[表5]

诱导关节炎的软骨的病理学分数的评价

分数＝级别×阶段(用级别乘以阶段的分数来计算)

在正常的左膝关节中，关节面光滑，软骨细胞和基质的排列均衡。观察结果表明，3层关节软骨(表层区，中层区和深层区)分化和排列良好，且未观察到软骨细胞的软骨子肥大(包括细胞外基质的软骨细胞)和增殖性变化。除软骨细胞外，大多数关节软骨(98-99％)都是由软骨基质组成的，其中的主要成分为II型胶原蛋白、蛋白多糖、水、其它蛋白质，糖蛋白等。在阴性对照组中，观察到软骨裂到中层区，有时裂到深层区，形成一个纵向裂缝，或者软骨脱落露出软骨下的骨头。还观察到在损坏、裂缝或脱落的软骨周围软骨子肥大和软骨细胞过度增殖，造成关节表面纤维化并伴随关节面褶皱。一般而言，在阳性对照组和治疗组也显示类似的损害程度。虽然在一些深层区观察到纵向裂缝的形成，但大多数纵向裂缝形成与从表面到中层区相对应的网纹，还能观察到伴随不连续的软骨表面的软骨子肥大和软骨细胞增殖(见图5)。

正如图6所示的阴性对照组中，也被称为蛋白多糖的硫酸粘多糖由蛋白质复合体的高分子材料组成，用甲苯胺蓝染色时，以蓝色表示。因此，用甲苯胺蓝对左侧正常的膝关节染色，能观察到丰富的蛋白多糖被染成深蓝色。从阴性对照组观察到，甲苯胺蓝的可染性降低，有时蛋白多糖损失。阳性对照组和治疗组也显示出类似的情况。即使用甲苯胺蓝染色，表层区也明显表现出蛋白多糖损失，在中层区也观察到蛋白多糖损失(见图6)。

如图7所示，关节软骨基质中含有充足的胶原蛋白纤维，其被偶氮卡红染成蓝色，通过这一发现可以确定在左膝关节中正常存在足量的胶原蛋白。在阴性对照组观察到，与正常状态相比，基质中的胶原蛋白含量减少。，通过偶氮卡红染色，在阳性对照组和治疗组普遍观察到胶原蛋白的弱损失(见图7)。

如图8所示，在此基础上，作为组织学观察的级别结果，阳性对照组和治疗组给出相似的等级。在阴性对照组的基础上验证显著性，p值不在0.05或更低的范围内。然而，在阳性对照组中，阳性对照组和治疗组的p值分别为0.052和0.064(见图8)。

<实验例4>蜘蛛酶的急性毒性实验

为了解本发明蜘蛛酶的急性毒性，进行下面的实验。

4组，每组由4只Wistar无特定病原(SPF)的雌性大鼠(Orient Co.，Ltd.，Seoul，Korea)组成，大鼠在温度22℃±3℃、湿度55±10％、照明12L/12D的动物实验室饲养。购买后，对大鼠进行检疫，并在动物实验室适应1周。在整个试验期间，5只或更少的大鼠被安置在每个聚碳酸酯笼中(240W×390L×175H mm)。对于个体识别，同时使用油标签的皮肤标记和每只养殖箱的组区分卡。固体实验动物饲料(PMI Nutrition International，USA)是无菌的，瓶装的自来水自由饮用。

将实施例中的蜘蛛酶以0、1250、2500和5000mg/kg溶解于无菌注射用水中，制备10ml/kg的剂量，用胃管(zonde)给大鼠灌胃一次。适应1周后，大鼠随机分为4组，对10周龄的大鼠给予每个浓度的蜘蛛酶，观察一般症状。接下来，24小时后进行尸体解剖，以评估蜘蛛酶对实体器官的毒性。

雌性大鼠灌胃给予蜘蛛酶后，研究动物的行为、外观和功能，以根据受试材料的施予准确观察一般症状和评估毒性。

实验结果表明，给予蜘蛛酶后，观察到这些动物的活动、行走、性情和惊厥，均无异常症状。观察包括皮肤和头发、眼球面积、耳朵、生殖器、四肢、尾巴等外观，及呼吸、唾液、粪便、呕吐等功能，均无异常变化。给予蜘蛛酶后24小时进行尸检，证实蜘蛛酶没有导致任何器官的异常症状。可以确定蜘蛛酶的估计LD₅₀为至少5000mg/kg的高浓度。在实体器官如肝脏、心脏、肺和胰腺在显微镜下均未观察到病理症状的变化。

下面将举例说明本发明组合物的制备实施例。

<制备例1>药物制剂的制备

<1-1>粉剂的制备

蜘蛛酶              2g

乳糖                1g

将上述成分混合，装入密封的包装袋，得到粉剂。

<1-2>片剂的制备

蜘蛛酶              100mg

玉米淀粉            100mg

乳糖                100mg

硬脂酸镁            2mg

将上述成分混合，按照常规的片剂制备方法压片，得到片剂。

<1-3>胶囊剂的制备

蜘蛛酶              100mg

玉米淀粉            100mg

乳糖                100mg

硬脂酸镁            2mg

将上述成分混合，按照常规的胶囊制备方法装入明胶胶囊，得到胶囊剂。

<1-4>丸剂的制备

蜘蛛酶            1g

乳糖              1.5g

甘油              1g

木糖醇            0.5g

将上述成分混合，按照常规的制备方法制成丸，每丸重4g。

<1-5>颗粒剂的制备

蜘蛛酶            150mg

大豆提取物        50mg

葡萄糖            200mg

淀粉              600mg

将上述成分混合，加入100mg 30％乙醇，然后在60℃干燥。形成颗粒后，将颗粒装入包装袋中。

<1-6>注射液的制备

蜘蛛酶            10μg/ml

稀盐酸BP          调节至pH 7.6

注射用NaCl BP    至1ml

用适当体积的注射用氯化钠BP溶解蜘蛛酶，用稀盐酸BP将溶液的pH值调整到7.6，以注射用氯化钠BP调整体积。经过充分混合，将溶液装入由透明玻璃制成的5ml I型安瓿中，热熔，这样溶液被装入到上部气格(upper grid of air)下。将安瓿在120℃蒸气灭菌15分钟或更长时间，得到注射液。

<制备例2>食品的制备

制备例1中制备的粉剂、片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可用于食品。含有Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶的食品的制备方法如下。

<2-1>面粉食品的制备

按面粉重量的0.1-10份的量加入Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶。按照常规方法用面粉混合物制成促进健康的食品，如面包、蛋糕、曲奇、薄饼干和面条。

<2-2>汤和肉汁的制备

按汤和肉汁重量的0.1-10份的量加入Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶。按照常规方法用混合物制备促进健康的肉制品、面条汤和肉汁。

<2-3>牛肉糜的制备

根据常规方法，按牛肉糜重量的10份的量加入Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶，制备促进健康的牛肉糜。

<2-4>乳制品的制备

按牛奶重量的0.1-10份的量加入Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶。按照常规方法用牛奶混合物制备各种乳制品诸如黄油和冰淇淋。

<2-5>Sun-Sik的制备

预糊化糙米、大麦、糯米、薏仁，干燥，然后根据已知的传统方法焙烤。然后用破碎机将谷物制成粉末，颗粒粒径为60目。

蒸熟黑大豆、黑芝麻和紫苏子，干燥，然后根据已知的传统方法焙烤。然后用破碎机将种子制成粉末，颗粒粒径为60目。

在真空压缩机中将Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶进行真空浓缩，用喷雾和热风烘干机干燥。然后，用破碎机将所得干燥品制成干燥粉末，颗粒粒径为60目。

将上述制备的谷物、种子和Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶的干燥粉末按照下述比例相互混合，并用已知的常规方法制备。

谷物(糙米30重量份，薏仁15重量份，大麦20重量份)，

种子(紫苏子7重量份，黑大豆8重量份，黑芝麻7重量份)，

Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的酵素的干燥粉末(1重量份)，

灵芝(0.5重量份)，

地黄(0.5重量份)。

<制备例3>饮料的制备

含有Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶的饮料按下述方法制备。

<3-1>保健饮料的制备

将Aranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶(0.5重量份)与液体果糖(0.5重量份)、寡糖(2重量份)、砂糖(2重量份)、食盐(0.5重量份)、水(75重量份)均匀混合。然后，混合后即刻对混合物灭菌，装入小容器中，如玻璃瓶、塑料瓶等制备保健饮料。

<3-2>蔬菜汁的制备

按照常规方法，向1000ml蔬菜汁如番茄或胡萝卜中加入0.5gAranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶来制备促进健康的蔬菜汁。

<3-3>果汁的制备

按照常规方法，向1000ml果汁如苹果或葡萄汁中加入0.1gAranicola proteolyticus培养液或从其中分离的蜘蛛酶来制备促进健康的果汁。

本发明的由Aranicola proteolyticus生产的蜘蛛酶通过抑制炎症诱导因子TNF-α的表达、防止蛋白多糖和胶原蛋白从关节软骨流失来抑制关节炎的进展和保护关节，可有效用作预防和治疗关节炎的组合物。

虽然本发明以示例性的目的公开了优选的实施方案，但本领域技术人员应当理解，在不背离本发明及所附权利要求公开的范围和精神下，可进行各种修改、补充和替换。

Claims (18)

1.一种预防和治疗关节炎的药物，含有蜘蛛酶(arazyme)作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的预防和治疗关节炎的药物，其中所述蜘蛛酶为下述之一：

(a)具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的蛋白；

(b)由含有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列编码区的DNA编码的蛋白；

(c)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列通过替换、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸突变得到的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白与含有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能；以及

(d)由在严格条件下与含有SEQ ID No：2所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的蛋白，所述蛋白与含有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能。

3.根据权利要求1所述的预防和治疗关节炎的药物，其中所述蜘蛛酶分离自Aranicola proteolyticus培养液。

4.根据权利要求3所述的预防和治疗关节炎的药物，其中所述Aranicola proteolyticus为Aranicola proteolyticus HY-3(保藏号：KCTC0268BP)。

5.根据权利要求1所述的预防和治疗关节炎的药物，其中所述关节炎为退行性关节炎(骨关节炎)、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮、多发性肌炎或风湿性多肌痛。

6.根据权利要求1所述的预防和治疗关节炎的药物，其中所述预防和治疗的药物抑制TNF-α的表达。

7.根据权利要求1所述的预防和治疗关节炎的药物，其中所述预防和治疗的药物抑制关节软骨的损伤。

8.根据权利要求1所述的预防和治疗关节炎的药物，其中所述预防和治疗的药物抑制蛋白多糖从关节软骨流失。

9.根据权利要求1所述的预防和治疗关节炎的药物，其中所述预防和治疗的药物抑制胶原蛋白从关节软骨流失。

10.一种治疗关节炎的方法，包括对需要治疗的对象给予药学上有效量的蜘蛛酶。

11.一种预防关节炎的方法，包括对需要治疗的对象给予药学上有效量的蜘蛛酶。

12.蜘蛛酶在制备预防和治疗关节炎的药物中的应用。

13.一种用于预防和改善关节炎的功能保健食品，含有蜘蛛酶作为有效成分。

14.根据权利要求13所述的用于预防和改善关节炎的功能保健食品，其中所述蜘蛛酶为下述之一：

(a)具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的蛋白；

(b)由含有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列编码区的DNA编码的蛋白；

(c)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列通过替换、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白与含有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能；以及

(d)由在严格条件下与含有SEQ ID No：2所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的蛋白，所述蛋白与含有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能。

15.根据权利要求13所述的用于预防和改善关节炎的功能保健食品，其中所述蜘蛛酶分离自Aranicola proteolyticus培养液。

16.根据权利要求15所述的用于预防和改善关节炎的功能保健食品，其中所述Aranicola proteolyticus为Aranicola proteolyticus HY-3(保藏号：KCTC 0268BP)。

17.根据权利要求13所述的用于预防和改善关节炎的功能保健食品，其中所述关节炎选自下组：退行性关节炎(骨关节炎)、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮、多发性肌炎和风湿性多肌痛。

18.蜘蛛酶在制备预防和改善关节炎的功能保健食品中的应用。

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