CN101600452B - 用于预防肝功能障碍的包含蜘蛛酶的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防肝功能障碍的以蜘蛛酶作为活性成分的药物组合物，更确切地涉及一种用于预防肝功能障碍的包含由Aranicola proteolyticus中得到的蜘蛛酶的药物组合物。本发明的蜘蛛酶可抑制受损肝细胞中的细胞凋亡，增加SMP30表达、抑制P-smad3表达，并通过抑制中央静脉区域周围的肝损伤保护肝脏。因此，本发明的蜘蛛酶可被有效地用作预防肝功能障碍的药物组合物。

Description

用于预防肝功能障碍的包含蜘蛛酶的药物组合物
本申请要求2006年12月28日提交的PTC/KR2006/005835的权益，其内容通过引用的方式全文并入于此。
技术领域
本发明涉及一种用于预防肝功能障碍的包含蜘蛛酶(arazyme)作为活性成分的药物组合物，更确切地涉及一种用于预防肝功能障碍的包含由Aranicola proteolyticus中得到的蜘蛛酶的药物组合物。
背景技术
在韩国，慢性肝病是当今死亡和成人病的一个主要原因。肝具有较大的缓冲能力，但是肝病一旦发生，直到它得到显著地发展才能被发现，因为在该病的早期几乎没有能自我检测到的症状。更糟糕地是，尚未确定有效的治疗试剂或者诊断方法。肝病的诱因是酒精、药物、化学物质、病毒性肝炎、代谢性疾病例如胆道疾病，以及自身免疫病，然而仍然有更多的未知诱因。同时，作为解毒、血液存储和循环以及血量调节的中心，肝脏似乎工作过度，因为现代人更多地与要求更大解毒能力的有害工业材料接触，以及受到过大的压力、过度饮酒、抽烟的影响，导致肝损伤、并进一步导致免疫系统的功能障碍且成为其他疾病的诱因。
当肝损伤发展为肝纤维化和肝硬化时，大多数慢性肝病中都可检测到影响预后的并发症及肝细胞瘤。因此，理解肝纤维化的发展以及开发抑制该发展的治疗剂是非常重要的。临床试验中，肝病的治疗剂是由德国Madaus有限公司于19世纪70年代生产的水飞蓟素(Silymarin)、美国Park Davis有限公司生产的Ara-AMP、意大利Selvi有限公司提供的Carbaica以及中国的中国科学院药物所于19世纪80年代提供的DDB，然而这些药带来了严重的副作用并且疗效低。因此，人们迫切需要更经济、安全和有效的治疗剂。
人们已经知道肝纤维化和肝硬化是由细胞因子及细胞外基质(ECM)之间的相互作用引起的。受损的肝细胞通过枯否细胞(kupffercells)引起噬菌作用，因此被活化的枯否细胞分泌各种细胞因子活化肝星状细胞，这已经被认为是肝脏中的一般机制，但最近的报道补充说，受损的肝细胞直接活化肝星状细胞，即所谓的自分泌。也就是说，一旦由任何原因引起肝细胞损伤导致细胞凋亡发生，TGF-1被表达以活化肝星状细胞，然后该被活化的肝星状细胞再次诱导导致细胞凋亡的TGF-1表达，这种恶性循环大概是严重肝病的一个原因(Sun F等，Biochim Biophys Acta 2001年2月14日；1535(2)：186-191；Jeong WI等，Liver Int.2004年12月；24(6)：248-254；Marcin Stopa等，J.Biol.Chem.2000年9月；29308-29317；Jeong W.I等，Anticancer Res.2002年3-4月；22(2A)：869-877；Ishak kg等，Alcohol Clin Exp Res.1991年；15：45-66；韩国专利申请号2001-0036463)。
为了筛选用于预防肝功能障碍的药物组合物，已经使用微生物、植物和合成的化学品进行了研究，但离工业化仍然有很长的路要走，遗留的问题包括难以获得目标材料。
本发明人试图找到一种新的蛋白酶，最终发明人从棒络新妇(Nephila clavata)中分离了一种新型微生物Aranicola proteolyticusHY-3菌株(strain)(保藏号(Accession No)：KCTC 0268BP；WO01/57222)。接着本发明人从所述新型菌株中分离了一种新型蛋白酶-蜘蛛酶(Arazyme)。该蜘蛛酶不仅在低温和高盐浓度下表现出出色的蛋白质降解活性，而且在37℃的人体温度下可被高度活化并在宽pH范围内表现出非常稳定的活性。本发明人进一步鉴别了这种新型蛋白酶的基因(WO 01/57222)。
本发明人研究了来自于Aranicola proteolyticus的蜘蛛酶的作用，并通过确认该蜘蛛酶能够保护肝免受损伤从而能够有效地用作预防肝功能障碍的药物组合物完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种来自于Aranicola proteolyticus的蜘蛛酶的新用途，其作为药物组合物用于预防肝功能障碍。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种用于预防肝功能障碍的包含蜘蛛酶作为活性成分的药物组合物。
本发明还提供一种肝病的治疗方法，包括给予肝病患者有效剂量的所述药物组合物。
本发明还提供一种用于预防肝功能障碍的保健食品，包含Aranicola proteolyticus培养液或者从该培养液中分离得到的活性成分-蜘蛛酶。
本发明还提供一种包含蜘蛛酶作为活性成分的细胞凋亡抑制剂。
本发明还提供一种包含蜘蛛酶作为活性成分的P-smad3表达抑制剂。
本发明还提供一种靶向肝脏中央静脉的肝细胞损伤抑制剂，该抑制剂包含蜘蛛酶作为活性成分。
本发明详述如下：。
本发明提供一种β-连环蛋白结合RNA适体。
本发明提供一种用于预防肝功能障碍的包含蜘蛛酶作为活性成分的药物组合物。
该发明的蜘蛛酶是一种从Aranicola proteolyticus中生产的酶，可以通过以下步骤制备：1)培养Aranicola proteolyticus制备其培养液；2)过滤该培养液获得上清液；以及3)使用树脂(WO 01/57222)纯化上清液中的蜘蛛酶。生产蜘蛛酶的优选的菌株是Aranicolaproteolyticus，更优选的菌株是Aranicola proteolyticus HY-3，本发明人已经于1996年7月29日将其在韩国生命工学研究院韩国菌种保藏中心保存，保藏号为KCTC0268BP，但并不总是限于此。Aranicolaproteolyticus HY-3是一种从蜘蛛的肠中分离的的革兰氏阴性(Gram-negative)好氧菌，大小为0.5～0.8mm，圆形，能够自己移动。Aranicola proteolyticus HY-3对过氧化氢酶表现出阳性反应但对氧化酶(韩国专利号0220091)表现出阴性反应。在本发明中，使用了下述方法获得的蜘蛛酶。
该发明的蜘蛛酶为下述多肽中的一种(a)含有序列号1所示氨基酸序列的多肽；
(b)与序列号1所示的序列具有至少70％的同源性且与(a)中的多肽具有相同生物学功能的多肽；以及
(c)与包含序列号1所示氨基酸序列的多肽在生物学上相同，但是通过替换、删除、增加和/或插入一种或多种氨基酸修饰的多肽。
已知维生素C(L-抗坏血酸)具有抗氧化作用。当由碳-四氯化物(CCl4)引发急性肝损伤时，肝中维生素C的水平下降，同时由碳-四氯化物导致的氧化应激传递至各个肝细胞，导致肝细胞的凋亡和坏死。
SMP30(衰老标记蛋白30)是一种在肝细胞、肾小管以及上皮细胞中被大量表达的体内衰老标记蛋白。大鼠出生后12周内，肝脏中的SMP30逐渐增加，其表达在第12周时达最高。此后，随着大鼠变老，SMP30水平逐渐降低。据推测，衰老期间SMP30的减少与性激素无关，而是独立地发生。该蛋白质的主要功能是预防细胞凋亡，通过在维生素C生物合成中起类似葡糖酸内酯酶的作用提高维生素C的水平，以及增加体内维生素C的合成。通过SMP30增加的维生素C在受损细胞中用作抗氧化剂，并由此减少细胞凋亡和坏死。SMP30也参与在细胞凋亡期间流入细胞质的钙的细胞外消除，这最终有利于预防细胞凋亡。
SMP30敲除老鼠被用于比较在缺少SMP30的情况下维生素C与蜘蛛酶对肝的保护作用。将维生素C和蜘蛛酶给予野生型C57BL/6(WT)鼠和SMP30敲除C57BL/6(KO)鼠，以诱发急性肝损伤。组织学观察中，观察到了对肝细胞的细胞凋亡的抑制，表明肝脏没有严重受损(参见图1和2)。
在SMP30敲除小鼠肝细胞中，没有观察到SMP30免疫反应，然而在野生型小鼠肝细胞中观察到了特异性的SMP30免疫反应。同时，SMP30在用维生素C和蜘蛛酶处理过的小鼠中比在未用维生素C和蜘蛛酶处理的小鼠中表达更强(参见图3、4、5和6)。根据细胞损伤和抗氧化活性，SMP30对细胞内钙的积聚具有抑制作用，因此在用蜘蛛酶处理后的小鼠中，SMP30表达有助于抑制细胞凋亡和坏死。
当肝细胞损伤发展成炎症和纤维化时，P-smad3被高度表达。一旦肝细胞受损，在肝细胞、淋巴细胞、肥大细胞和巨噬细胞中会合成TGF-1。接着，TGF-1结合到肝脏中的TGF-1受体II上，以激活它。激活的TGF-1受体II使TGF-1受体I磷酸化，导致TGF-1受体I活化。磷酸化的TGF-1受体I引起Smad2和Smad3的连续磷酸化，然后被磷酸化的Smad2和Smad3(P-smad2/3)形成异寡聚体(heterooligomer)和Smad4。该异寡聚体迁移到该肝细胞的细胞核中，并激发目标基因的转录。因此，P-smad3的强表达表明肝细胞严重损伤。
在野生型鼠组中，与用维生素C和蜘蛛酶处理的组(G3，G4)相比，在用CCl4处理的组(G2)中明显地检测到P-smad3介导的免疫反应。在SMP30敲除鼠组中，与用蜘蛛酶处理的组(G8)相比，在用CCl4单独处理或用维生素C一起处理的组(G6，G7)中明显地检测到P-smad3介导的免疫反应(参见图7、8、9和10)。此结果表明，SMP30敲除鼠甚至比在相同的CCl4刺激下表现出更严重的肝细胞损伤。用蜘蛛酶处理的小鼠组中的P-smad3水平比用维生素C处理的组更低。此结果支持了该发现，即蜘蛛酶通过TGF-1抑制慢性炎症，并具有出色的肝细胞保护作用。同时，在野生型小鼠组和SMP30敲除小鼠组中，肝细胞中的Smad水平没有区别(参见图11、12和13)。
CYP2E1表达仅在蜘蛛酶处理过的小鼠肝细胞中被提高了(参见图14和15)。即，在没有用蜘蛛酶处理的组中，细胞凋亡和坏死在中央静脉区域周围的肝细胞中已经发生了，因此CYP2E1不再被表达。另一方面，在用蜘蛛酶处理的组中，由于蜘蛛酶的保护作用，在中央静脉区域周围的肝细胞中仅仅观察到了轻微的损伤，导致了CYP2E1的中度表达。
CCl4的新陈代谢从C-C1键的电子通过细胞色素P450(CYP)形成自由基这一步骤开始。三氯甲基自由基可被氧化或减少。CYP2E1和2B1/2B2使CCl4失活，由此CYP2E1水平降低，并因此连续诱导CYP2E1表达。
如上文所释，蜘蛛酶处理通过预防尤其是中央静脉区域中的由化学物质导致的肝细胞损伤来抑制该受损肝细胞的坏死、提高SMP30表达，降低P-smad3表达并诱导CYP2E1表达。因此，可以理解，本发明的蜘蛛酶具有肝保护作用。并且将蜘蛛酶对Wistar鼠口服给药，以研究毒性。结果，在0，1250，2500和5000mg/kg的浓度下通过肉眼病理学观察均没有观察到异常症状。因此，在此次实验中使用的蜘蛛酶被评价为安全物质，对于大鼠而言，其估计的LD50值比5000mg/kg大得多。因此，本发明的蜘蛛酶可以被用作预防肝功能障碍的药物组合物，且还可以被用于预防及治疗肝病，例如急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝昏迷，酒精性肝病及肝癌。
除了蜘蛛酶以外，本发明的组合物还可以包括一种或多种与本发明的蜘蛛酶具有相同或类似功能的活性成分。为了给药，本发明的合成物还可以包括一种或多种药学上可接受的的载体。可以通过将选自盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽葡萄糖(maltodextrose)溶液、甘油和乙醇中的多种成分混合来选择或制备该药学上可接受的的载体。也可添加其它的常规添加物，例如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等。为制备注射液，例如水溶液，悬浮液和乳液、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂，粘合剂和润滑剂。本发明的组合物还可以各种疾病或者根据成分按照在Remington’s Pharmaceutical Science(Mack出版公司，Easton PA，1990年18日)中所述的方法进一步制成合适的剂型。
本发明还提供一种肝病的治疗方法，包括给予肝病患者有效剂量的药物组合物的步骤。其中所述肝病包括急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝昏迷，酒精性肝病和肝癌。
本发明的预防肝功能障碍的药物组合物可口服或注射(例如，静脉注射，皮下注射，局部或腹腔注射)给药。所述组合物的有效剂量可以根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法，排泄和疾病的严重性来确定。本发明的蜘蛛酶的剂量为每天0.01～5000mg/kg，优选每天0.01～10mg/kg。给药频率是一天一次或者优选一天几次，但并不限于此，并可遵医嘱进行改变。
本发明还提供一种包含一种用于预防肝功能障碍的保健食品，包含Aranicola proteolyticus培养液或者从该培养液中分离得到的活性成分-蜘蛛酶。Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶可以被用来作为食物添加剂。此时，根据常规方法，可将Aranicolaproteolyticus培养液或者从其中分离的活性成分蜘蛛酶直接被添加或者与其它食物或成分混合之后添加。活性成分的混合比率根据使用目的(预防、健康或治疗)确定。如果生产食品或饮料，Aranicolaproteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶优选以0.01～10重量份(weight part)，更优选以0.05～1重量份添加到原材料中。然而，当被用于长期给药以改善健康状况时该含量可以少于上述，但是由于本发明的培养液或蜘蛛酶非常安全，因此有效剂量可以多于上述量。
对可适用的食品没有限制，示例有肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、饼干、比萨饼、拉面(ramyun)、面条、包括冰淇淋，汤、饮料、茶叶、饮品、酒类饮品及维生素复合物等的乳制品，事实上，一般生产的各种保健食品都被包括在内。
包含本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶的健康饮料还可以包含各种香料或天然碳水化合物等，如其它饮料。上述天然碳水化合物可以是单糖，如葡萄糖和果糖，双糖如麦芽糖和蔗糖，多糖如糊精和环糊精，以及带糖的酒精制品，如xilytole，山梨醇和赤藓糖醇。作为甜味剂，天然甜味剂如沙马汀和甜叶菊提取物或人工甜味剂如糖精和阿斯巴甜都可以使用。天然碳水化合物与本发明的组成物的比率优选为每100ml 0.01～0.04g，更优选为每100ml 0.02～0.03g。
除了以上所述的成分以外，本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶可以包括于各种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、精氨酸(arginic)及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH值调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精，用于被添加到苏打中的碳酸盐等。本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶也可以包括水果汁，水果饮料和/或可添加到蔬菜饮料中的果肉。所有提到的成分可以单独或一起添加。事实上那些成分的混合比率并不重要，但是一般来说，每100重量份的本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶中，可以添加每种成分0.01～0.1重量份。
本发明也提供一种包含蜘蛛酶作为活性成分的细胞凋亡抑制剂。
本发明还提供一种包含蜘蛛酶作为活性成分的P-smad3表达抑制剂。
本发明还提供一种靶向肝脏中央静脉的以蜘蛛酶作为活性成分的肝细胞损伤抑制剂。
附图说明
参考附图，本发明的优选实施方案的应用可以被很好地理解，其中：
图1是具有急性肝损伤的野生型小鼠(WT)和SMP30敲除小鼠(WO)的肝脏的一组病理照片(H&E染色，A：放大率×33，B：放大率×132)，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；红线：中央静脉(CV)区域周围的坏死区域；以及箭头：受损肝细胞；
图2示出了通过病理组织学方法观察的表现肝损伤的数值，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；肝损伤程度0：根据形态学观察没有损伤的证据；肝损伤程度1：在中央静脉区域周围的5个肝细胞中的突发性坏死；肝损伤程度2：在中央静脉区域周围的5个受损肝细胞中以及未损伤区域中的平坦的坏死；以及肝损伤程度3：肝脏中包括在中央静脉区域周围和中央部分的5个肝细胞的全坏死；
图3是具有急性肝损伤的野生型和SMP30敲除鼠的肝脏的一组免疫组织学照片(放大率×13.2及×66)，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图4是示出了通过免疫组织学方法检测的SMP30表达的图表；
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图5是一组示出利用具有急性肝损伤的野生型和SMP30敲除鼠进行免疫印迹的结果的照片，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图6示出了通过免疫印迹检测的SMP30表达的图表，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图7是一组示出具有急性肝损伤的野生型和SMP30敲除鼠中的P-smad3的免疫组织学照片，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图8是示出了通过免疫组织化学方法检测的P-smad3表达的图表，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图9是一组示出利用具有急性肝损伤的野生型和SMP30敲除鼠中的P-smad3进行免疫印迹的结果的照片；
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图10是示出了通过免疫印迹检测的P-smad3表达的图表，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图11是一组示出具有急性肝损伤的野生型和SMP30敲除鼠中的Smad3表达的免疫组织学照片(放大率：×66)，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图12是示出了通过免疫组织学方法进行检测的Smad3表达的图表，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图13是示出了通过免疫印迹进行检测的Smad3表达的图表，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图14是一组示出具有急性肝损伤的野生型和SMP30敲除鼠中的CYP2E1表达的免疫组织学照片(放大率：×66)，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；
图15是示出了通过免疫组织学方法检测的CYP2E1表达的图表，
G1：野生型鼠，橄榄处理的；G2：野生型鼠，CCl4处理的；G3：野生型鼠，维生素C和CCl4处理的；G4：野生型鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的；G5：SMP30敲除鼠，橄榄处理的；G6：SMP30敲除鼠，CCl4处理的；G7：SMP30敲除鼠，维生素C和CCl4处理的；G8：SMP30敲除鼠，蜘蛛酶和CCl4处理的。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明实用的和目前优选的实施方案进行详细说明。
然而，本领域的技术人员应能理解，在本发明公开内容的基础上，可以在本发明的精神和范围内对之进行修改和改进。
实施例1：蜘蛛酶的制备
为了制备活性成分‘蜘蛛酶’，将Aranicola proteolyticus HY-3(KCTC 0268BP)在培养基(细菌用胰蛋白胨0.5％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.1％，氯化钾0.05％，氯化钙0.02％，硫酸镁0.02％)中，于22℃下培养18个小时。使用2μm的薄膜过滤器对培养液进行薄膜过滤，从中分离出上清液和细胞。用10KDA的膜过滤浓缩分离出的上清液。本发明的蜘蛛酶基本呈现阴离子的特性。因此，通过使用经50mM三(羟基)氨基甲烷盐酸盐(tris-HCl)缓冲液(pH 7.6)预处理的二乙氨基乙基(DEAE)纤维素的离子交换树脂和使用经20mM三(羟基)氨基甲烷盐酸盐(tris-HCl)缓冲液(pH 7.6)预处理的葡聚糖G-75的凝胶过滤交换树脂对蜘蛛酶进行纯化。将纯化的酶溶液进行10％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶)电泳。结果，确认本发明的蜘蛛酶是一种不具有亚基的单体，并显示了51.5kDa条带。为了制备蜘蛛酶，可将Aranicola proteolyticus HY-3菌株(KCTC0268BP)在各种工业媒体中进行培养，且它的培养液可以通过各种已知的不同方法进行分离和纯化。本发明的蜘蛛酶具有以序列ID号：1表示的多肽序列以及以序列ID号：2表示的多核苷酸序列。
实验例1：实验组和给药的构成
SMP30是一种重要的衰老标记蛋白，其参与维生素C的生物合成，这表明SMP30通过增加维生素C的合成充当抗氧化剂。在本发明中，12周的雄性野生型C57BL/6(WT)和SMP30敲除C57BL/6(KO)鼠被用于通过CCl4引发肝损伤，然后对SMP30与蜘蛛酶之间的关系进行了研究。10只雄性和20只雌性SMP30敲除C57BL/6鼠来自于东京都老年病学研究院，然后在韩国庆北大学兽医学院病理系动物实验室进行饲养。在通过培育产生的F1鼠中，通过聚合酶链反应进行尾部DNA定型来选择敲除鼠。
将野生型鼠在动物实验室中隔离和适应了7天。在适应期间，对每种症状进行了检查，且仅选择健康的动物。野生型和SMP30敲除鼠均为12周龄，排除了年龄的差异。
将大鼠在温度被调节到22±3℃、湿度被调整为55±10％，且光线也被调节到12L/12D(08:00开灯，20:00关灯)的动物设施中适应和饲养。定期检查环境条件(每三个月)。在环境评估之后，没有发现重要条件的改变。在整个实验期间，将大鼠在聚碳酸酯笼中[240W×390L×175H(mm)]中饲养，每笼5只。通过使用油性魔术笔和个体身份证的皮肤标记进行区分。实验动物(美国，印第安纳47374，里士满北四街505，PMI国际营养组织)的饲料经过照射(13.2kGy)消毒之后在任何时间均可提供。自来水经过碳过滤器纯化之后可在任何时间使用水瓶进行供给。将四氯化碳在橄榄油中稀释至0.4ml/kg的浓度，并将其施予大鼠以诱导肝损伤。在注射之后24小时，进行尸体解剖。
将野生型鼠和SMP30敲除鼠，按照每种5只，分成阴性实验组(G1，G5)、阳性实验组(G2，G6)、实验组1中的两组(G3，G7)以及实验组2中的两组(G4，G8)(表1)。对阴性实验组鼠(G1，G5)腔腹注射橄榄油一次，而对阳性实验组鼠(G2，G6)腔腹注射CCl4(0.4ml/kg)一次。同时，在实施CCl4(0.4ml/kg)腔腹注射的前一天将溶解在自来水中的100mg/kg的维生素C对实验组1的鼠(G3，G7)口服给药。在给予CCl4 24小时之后，对每只鼠进行尸体解剖，且从每只鼠中提取样本用于进行组织病理学检验。
实验组的构成如表1所示。
【表1】
实验组的构成
  组   条件   鼠的数量   处理方法
  G1   野生型+自来水   5   橄榄油
  G2   野生型+自来水   5   CCl4
  G3   野生型+自来水   5   维生素C，CCl4
  G4   野生型+自来水   5   蜘蛛酶，CCl4
  G5   SMP30敲除+自来水   5   橄榄油
  G6   SMP30敲除+自来水   5   CCl4
  G7   SMP30敲除+自来水   5   维生素C，CCl4
  G8   SMP30敲除+自来水   5   蜘蛛酶，CCl4
动物：12周龄，雄性，野生型C57BL/6鼠和SMP30敲除(KO)C57BL/6鼠
蜘蛛酶的处理：在给予CCl4之前口服给药(100mg/kg)
维生素C的处理：在给予CCl4之前口服给药(100mg/kg)
CCl4的处理：腹腔给药(0.4ml/kg＝10％CCl44ml/kg)
实验例2：对肝细胞的组织病理学观察
为了根据组织病理学检验，检查蜘蛛酶对CCl4所致肝损伤的作用，将从尸体解剖获取的各个肝脏样本固定在10％中性福尔马林中，通过自动组织处理器对被固定的组织进行处理。将处理过的肝细胞用石蜡包埋，并切成4μm厚的小段。干燥这些小段，并用苏木精-曙红(H&E着色)着色，然后在光学显微镜下观察。
结果，与野生型鼠(G1，G4)相比，在SMP30敲除鼠(G5，G8)中观察到了小叶中心坏死和发炎。并且肝细胞中的坏死在用维生素C和蜘蛛酶处理过的野生型鼠(G1，G4)和SMP30敲除鼠(G5，G8)中均被显著地抑制了。
从组织病理学观察中获得的肝损伤的数值如表2所示。
【表2】
通过组织病理学观察获得的肝损伤的数值
  等级  肝损伤的程度
  0  未检测到肝损伤的形态学证据
  1  在中央静脉区域周围的5个肝细胞中检测到平坦的(even)但为散发性的坏死
  2  在中央静脉区域及未损伤区域周围的5个肝细胞中检测到平坦的坏死
  3  在包括中央部分以及中央静脉区域周围的5个肝细胞在内的所有肝细胞中观察到大范围坏死
实验例3：肝细胞中的SMP30表达
<3-1>肝细胞中SMP30的免疫组织学观察
为了对肝细胞中的SMP30进行免疫组织学观察，将用福尔马林固定的石蜡包埋的组织切成44μm厚的小段，然后除去石蜡。为了抑制内源性过氧化物酶的活性，将这些小段用3％的H2O2处理30分钟，并用0.01M PBS冲洗。为了提高该组织的抗原表达，将这些小段用0.01M柠檬酸盐缓冲液处理，然后使用微波进行热处理。为了抑制非特异性反应，将这些小段在37℃用20g/ml的朊酶K处理10分钟，并用PBS进行冲洗，然后封闭(blocking)1小时。接着，将一抗SMP30(日本，Akihito Ishigami，1∶5000)在4℃处理过夜，然后用PBS冲洗三遍，共5分钟。将该一抗与生物素结合。将生物素标记的一抗用缓冲液冲洗，将其与HRP(辣根过氧化物酶)偶合的抗生蛋白链菌素结合，用缓冲液再次清洗，然后使用Histostantin-plus bulk kit试剂盒(美国ZymedLaboratories公司)在30℃下反应30分钟。在完全冲洗之后，用3，3-二氨基联苯胺四水氯化物(3，3-diaminobenzidine tetrahydrochloried)(DAB，美国Zymed Laboratories公司)溶液着色该样品，用蒸馏水冲洗，并用Meyer的苏木精(美国遗传学研究公司(Research genetics，USA))进行反着色，然后在光学显微镜下观察。
通过对SMP30的免疫组织学观察，确认了在SMP30敲除鼠中没有观察到SMP30介导的免疫反应，然而在野生型鼠的肝细胞中明确地观察到了对SMP30呈阳性的免疫反应(图3和4)。在野生型阴性实验组(G1)中的SMP30表达水平比由CCl4引发的肝损伤组(G2)高得多。同时，用维生素C或蜘蛛酶处理的组(G3，G4)中的SMP30表达水平比仅用CCl4处理的阳性实验组中的SMP30表达水平高。
<3-2>通过免疫印迹研究肝细胞中的SMP30表达
通过免疫印迹对肝细胞中的SMP30表达进行研究。首先，将在-70℃下冷冻的肝组织在包含0.1mM原钒酸钠(Na3VO4)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂(德国，曼海姆，罗氏)的RIPA缓冲液片剂中均质化。将该被均质化的肝样本在4000rpm，4℃下离心分离10分钟，以去除脂肪，并获得上清液。将该上清液在14000rpm，4℃下再次离心分离20分钟，再次分离上清液。通过布拉德福法测量蛋白质浓度，且将每个蛋白质样本以80克/孔的浓度加到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，然后进行电泳。该凝胶上的蛋白质被电转移到PVDF薄膜上(德国，Dassel，Schleicher & Chuell)。加载同等数量的蛋白质，通过考马斯亮蓝染色来确认。用封闭液(blocking solution)(包含3％的牛血清白蛋白的PBS)封闭1个小时，然后将SMP30(日本，Akihito Ishigami，1∶5000)与β-肌动蛋白(美国，圣克鲁斯生物技术公司1∶500)进行反应。在用包含0.5％吐温(Tween)200的TBS缓冲液冲洗后，将该薄膜与抗兔酶标记抗体(anti-rabbit-HRP-antibody)(日本，Akihito Ishigami，1∶1000～1∶2000)，为二抗，在室温下反应1个小时。将该薄膜用TBS缓冲液完全冲洗，并与持久性化学发光底物(super signal West DuraExtended Duration Substrate)(美国，PIERCE)反应，在临床X-射线薄膜(日本，东京，柯达)上曝光，以研究特异性反应。
结果，在野生型鼠中检测到SMP30表达，但在SMP30敲除鼠中未检测到SMP30表达(图5和6)。
在野生型鼠组中仅用橄榄油处理过的阴性对照组中SMP30表达最高，但是仅用CCl4处理的组2(G2)中的SMP30表达被抑制。同时，与仅用CCl4处理过的组相比，用维生素C处理过的组(G3)和用蜘蛛酶处理过的组(G4)中的SMP30也高表。
实验例4：肝细胞中的P-smad3表达
<4-1>肝细胞中P-smad3表达的免疫组织学观察
为了通过免疫组织学方法研究肝细胞中的P-smad3表达，除了使用P-smad3(美国，Cell Signaling Technology Inc，1∶200)代替SMP30作为一抗之外，按照与实验例<3-1>中所述的相同的方式进行实验。
结果，与野生型鼠组中用维生素C和蜘蛛酶处理过的组(G3，G4)相比，在仅用CCl4处理过的组2(G2)中检测到针对P-smad3的强免疫反应。在SMP30敲除鼠中，与用蜘蛛酶处理过的组(G8)(图7和8)相比，在仅用CCl4或维生素C处理过的组(G6，G7)中也检测到该强免疫反应。用蜘蛛酶处理过的组(G4，G8)中的P-smad3表达低于用维生素C处理过的组(G3，G7)。
<4-2>通过免疫印迹检测肝细胞中的P-smad3表达
为了通过免疫印迹研究肝细胞中的P-smad3表达，除了使用P-smad3(美国，Cell Signaling Technology Inc，1∶200)代替SMP30和抗兔酶标记抗体(美国，Cell Signaling Technology Inc，1∶1000～1∶2000)作为一抗之外，按照与实验例<3-1>中所述的相同的方式进行实验。
在SMP30敲除鼠(G5，G6，G7，G8)中的P-smad3表达高于野生型鼠(G1，G2，G3，G4)。特别地，在仅用CCl4处理的SMP30敲除鼠组(G6)中检测到P-smad3表达最高，但是该表达在用维生素C和蜘蛛酶处理的组中均被抑制(图9和10)。
实验例5：检测肝细胞中的Smad3
<5-1>肝细胞中的Smad3表达的免疫组织学观察
为了通过免疫组织学织化学方法研究肝细胞中的Smad3表达，除了使用Smad3(美国，Santa Cruz Biotechnology Inc，1∶100)代替SMP30作为一抗之外，以与实验例<3-1>中所述相同的方式进行实验。
结果，在SMP30敲除鼠和野生型鼠中的Smad3表达没有显著的区别。也就是说，在所有实验组中的Smad3表达始终是一致的。
<5-2>通过免疫印迹检测肝细胞中的Smad3表达
为了通过免疫印迹研究肝细胞中的Smad3表达，除了使用Smad3(美国，Santa Cruz Biotechnology Inc，1∶100)代替SMP30和抗兔酶标记抗体(美国，Santa Cruz Biotechnology Inc，1∶1000～1∶2000)作为二抗之外，以与实验例<3-2>中描述的相同的方式进行实验。
结果，所有实验组中的Smad3表达没有显著区别(图13)。野生型鼠(G1，G2，G3，G4)和SMP30敲除鼠(G5，G6，G7，G8)中的Smad3表达是一致的。
实验例6：肝细胞中CYP2E1表达的免疫组织学观察
为了通过免疫组织学织化学方法研究肝细胞中的CYP2E1表达，除了使用CYP2E1(美国，Santa Cruz Biotechnology Inc，1∶800)代替SMP30作为一抗之外，以与实验例<3-1>中描述的相同的方式进行实验。
结果，仅在用蜘蛛酶处理过的组中检测到CYP2E1的强表达，其它组的表达水平类似(图14和15)。也就是说，CYP2E1仅仅在用蜘蛛酶处理过的组(G4，G8)中被高度表达。
实验例7：蜘蛛酶的急性细胞毒性试验
进行以下实验以观察蜘蛛酶在鼠中是否具有急性毒性。
将9周龄的SPF(无特定病原体)威斯塔系鼠(韩国，汉城，Orient有限公司)在温度被调节到22±3℃、湿度被调整为55±10％，且光线也被调节到12L/12D的动物设施(4组，每组4只鼠)中进行饲养。在使用前将这些鼠隔离和适应一周。整个实验期间，将这些鼠在聚碳酸酯笼[240W×390L×175H(mm)]中饲养，每笼5只。通过使用石油魔术笔和个体身份证的皮肤标记进行区分。用于实验动物(美国，PMI国际营养组织)的饲料在消毒之后可在任何时间提供。自来水在通过碳过滤器纯化之后可在任何时间使用水瓶提供。
将本发明的蜘蛛酶以0、1250、2500及5000mg/kg的浓度溶解在蒸馏水中用于注射，使用针(zonde)将每份蜘蛛酶溶液按照10ml/kg对鼠口服给药一次。经过一周的适应期之后，将鼠分为4组。在10周的时对鼠给予不同浓度的蜘蛛酶，并检查一般的症状。为了评估蜘蛛酶对器官的毒性，在给药24小时后进行尸体解剖。
在对雌性鼠口服给予蜘蛛酶之后，研究基于此次给药的任何症状，并对鼠的行为、外观和生物学功能也进行观察，以评估毒性。
结果，未观察到与姿态、行走、脾气和抽搐有关的特定症状。对鼠的外观表也进行了仔细地观察，结果，在毛皮、眼周区域、耳朵、外生殖器，四肢和尾巴处未检测到改变。也对生物学功能例如呼吸，流涎，粪便和呕吐进行了观察，但没有发现异常症状。在给予蜘蛛酶24小时后进行尸体解剖。肉眼观察的尸体解剖的结果也与上述一致，表明该给予蜘蛛酶没有导致各器官中的任何异常症状或紊乱。估计蜘蛛酶的LD50远远大于5000mg/kg。通过显微镜，没有在器官例如肝、心、肺和脾中观察到病理变化。
本发明组合物的制备实施例如下文所述：
制备实施例1：药物制剂的制备
<1-1>粉末的制备
蜘蛛酶                        2g
乳糖                          1g
将上述组分混合并制成粉末，填充于密封袋内。
<1-2>片剂的制备
蜘蛛酶                        100mg
玉米淀粉                      100mg
乳糖                          100mg
硬脂酸镁                      2mg
按照常规的片剂制备方法将上述组分混合，制成片剂。
<1-3>胶囊的制备
蜘蛛酶                        100mg
玉米淀粉                      100mg
乳糖                        100mg
硬脂酸镁                    2mg
按照常规的胶囊制备方法将上述组分混合，制成胶囊。
<1-4>注射液的制备
蜘蛛酶                        10μg/ml
稀盐酸                        pH值达到7.6
氯化钠注射液                  最大1ml
注射液的制备如下：将蜘蛛酶溶解在适量可注射的NaOH BP中，用稀盐酸BP将其pH值调至7.6。该可注射的NaOH BP用于调节溶液的体积。将该溶液充分混合后填入5ml I型玻璃安瓿瓶中。玻璃嘴通过熔化密封。通过灭菌锅将安瓿瓶在120℃下消毒至少15分钟。
制备实施例2：食品的制备
本发明人已经制备了下述食品，所述食品包含Aranicolaproteolyticus培养液或者从其中分离的活性成分蜘蛛酶：
<2-1>面粉食品的制备
通过向小麦面粉中添加0.1～10.0重量份本发明的Aranicolaproteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶制备改善健康的面粉食品，然后将该面粉制作成面包、蛋糕、曲奇、饼干和面条。
<2-2>汤和肉汤的制备
向汤和肉汤中添加0.1～1.0重量份本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶制备出改善健康的肉类产品和面条的汤和肉汤。
<2-3>碎牛肉的制备
向碎牛肉中添加10重量份本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶，制备出改善健康的碎牛肉。
<2-4>乳制品的制备
向牛奶中添加0.1～1.0重量份本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶，制备乳制品，例如奶油、冰淇淋等。
<2-5>Sunsik的制备
通过常规方法将糙米，大麦，糯米和薏米(薏苡job’s tear)凝胶化，然后进行干燥。将干燥的混合物分散并粉碎，得到60目大小的谷物粉末。
用常规方法将黑豆，黑芝麻和紫苏蒸熟和干燥。将该干燥的混合物分散并粉碎，得到60目大小的谷物粉末。
使用真空浓缩机将本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶减压真空浓缩，然后使用热风干燥器进行喷雾干燥。用研磨器将该干燥过的材料粉碎，得到60目大小的谷物粉末。
将所制备的谷物、种子，和Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶的干燥粉末按以下比率全部混合。
谷物(糙米30重量份、薏米15重量份，大麦20重量份)，
种子(紫苏7重量份、黑豆8重量份，黑芝麻7重量份)，
Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶的干燥粉末(1重量份)，
灵芝(0.5重量份)，
地黄(0.5重量份)。
制备实施例3：饮料的制备
本发明人已经制备了包含Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的活性成分蜘蛛酶的饮料如下：
<3-1>健康饮料的制备
将酸果糖(0.5％)、低聚糖(2％)、糖(2％)，盐(0.5％)和水(75％)与Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶一起均匀混合，然后进行消毒。将该混合物置于小容器例如玻璃瓶或塑料瓶(pat bottle)中，得到健康饮料。
<3-2>蔬菜汁的制备
将0.5g本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶添加到1000ml的西红柿或胡萝卜汁中，制备得到健康的蔬菜汁。
<3-3>水果汁的制备
将0.1g本发明的Aranicola proteolyticus培养液或者从其中分离的蜘蛛酶添加到1000ml的苹果或葡萄汁中，以制备得到健康的水果汁。
【工业实用性】
如上文所释，由Aranicola proteolyticus中制备的本发明的蜘蛛酶抑制受损肝脏中的肝细胞的坏死，提高SMP30表达、抑制P-smd3表达并通过抑制中央静脉周围的肝损伤保护肝脏。因此，本发明的蜘蛛酶可以被有效地用作预防肝功能障碍的药物组合物。
【序列表文本】
序列1是Aranicola proteolyticus的多肽序列，
序列2是Aranicola proteolyticus的的多核苷酸序列。
本领域的技术人员应将理解，前述说明书中公开的概念和具体的实施方案可以被轻易地用作修改或设计可实现本发明的相同目的其它实施方案的基础。本领域的技术人员也将理解，这些等同的实施方案并未背离如所附的权利要求书中所限定的本发明的精神和范围。
Figure IYZ000005964875900011
Figure IYZ000005964875900021
Figure IYZ000005964875900031
Figure IYZ000005964875900041
Figure IYZ000005964875900051
Figure IYZ000005964875900061

Claims (11)

1.蜘蛛酶在制备用于预防肝功能障碍的药物中的应用，其中，该蜘蛛酶为如序列号1所示氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，该蜘蛛酶从Aranicolaproteolyticus培养液中分离得到。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述Aranicola proteolyticus为保藏号为KCTC 0268BP的Aranicola proteolyticus HY-3。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肝功能障碍选自急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝昏迷、酒精肝及肝癌。
5.蜘蛛酶在制备用于预防肝功能障碍的保健食品中的应用，其中，该蜘蛛酶为如序列号1所示氨基酸序列的多肽。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，该蜘蛛酶从Aranicolaproteolyticus培养液中分离得到。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述Aranicolaproteolyticus为保藏号为KCTC 0268BP的Aranicola proteolyticusHY-3。
8.根据权利要求5所述的应用，其中，所述肝功能障碍选自急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝昏迷、酒精性肝病及肝癌。
9.包含活性成分蜘蛛酶的细胞凋亡抑制剂在制备预防肝功能障碍的药物中的应用，其中，该蜘蛛酶为如序列号1所示氨基酸序列的多肽。
10.包含活性成分蜘蛛酶的P-smad3表达抑制剂在制备预防肝功能障碍的药物中的应用，其中，该蜘蛛酶为如序列号1所示氨基酸序列的多肽。
11.包含活性成分蜘蛛酶的靶向中央静脉区周围肝细胞的肝细胞损伤抑制剂在制备预防肝功能障碍的药物中的应用，其中，该蜘蛛酶为如序列号1所示氨基酸序列的多肽。
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