CN116687003A - 一种用于老年消化道肿瘤切除术后患者的营养组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于老年消化道肿瘤切除术后患者快速促进伤口愈合并持续抑制体重丢失的营养组合物，具体来说，所述组合物是由酪蛋白、乳清蛋白与大豆蛋白按照特定比例配伍而成。该组合物经口服或管饲肠内营养补充，提供胃肠耐受性良好的可消化优质蛋白，一方面通过加速创伤组织再生，促进老年消化道肿瘤切除术后患者伤口愈合；另一方面通过持续增强肌肉蛋白质的合成，显著抑制肿瘤以及术后低蛋白血症所致营养不良引起的渐进性体重丢失，全面改善临床结局。该组合物可用于制备老年消化道肿瘤切除术后患者快速促进伤口愈合、持续抑制体重丢失的特殊医学用途配方食品、保健食品或肠内营养功能食品。

Description

一种用于老年消化道肿瘤切除术后患者的营养组合物
技术领域
本发明涉及一种营养组合物，特别是一种胃肠耐受性良好、通过加速创伤组织再生、持续增强肌肉蛋白合成的作用，达到促进老年消化道肿瘤切除术后患者伤口愈合并抑制体重丢失的营养治疗用途的蛋白质组合物。
背景技术
消化道肿瘤是老年人常见的恶性肿瘤。老年人消化道肿瘤疾病随着年龄的增长发生率日益增加。手术切除是消化道肿瘤治疗的常见手段，即对发病部位行全器官或部分器官切除术，其中占比较高的手术部位为胃、食管、结肠、直肠等，具有较高的临床应用价值。然而，因消化道解剖结构的特殊性，可致患者出现不同程度的胃肠道受损与消化吸收功能障碍，术后常见伤口愈合迟缓、体重渐进性丢失等营养不良表现，直接影响临床预后。采取合适的营养治疗方式缩短切除术后伤口愈合时间、持续抑制体重丢失无疑成为临床医生与营养师关注的重点。有鉴于此，我们也必须注意到，一方面，老年患者体质弱，受不同部位消化道肿瘤等疾病因素影响，消化吸收功能障碍在老年患者表现更为明显，加之术后患者对肠内营养的耐受性不同，诱发腹胀、腹泻、腹痛、胃瘫等胃肠道不耐受的风险加重，更加突显进食不足而能量-蛋白质却处于高代谢状态的矛盾，故临床筛查NRS 2002总分≥3分营养不良患者较为普遍，瘦肌肉与瘦体重的丢失速度较快；另一方面，手术创伤使蛋白分解加快，蛋白质营养不良加重，更易出现感染、吻合口瘘等并发症，尤其是术后组织创伤休复的严重迟缓，导致长期卧床并发褥疮的风险较高，严重影响治疗及预后效果。上述问题互为因果，形成一种不良循环，导致疾病问题难以充分解决，病情迁延反复。为此，对老年消化道肿瘤切除术后患者早期肠内营养加快康复、缩短治愈时间、减少患者痛苦尤显重要。
充足的营养供给至关重要。我们认为，适用于老年消化道肿瘤切除术后患者的肠内营养治疗方案应同时满足三个属性，第一是胃肠耐受性要好，这对保证营养治疗持续实施的患者顺应性具有重要意义；第二是要加快伤口组织修复，满足术后患者伤口愈合的紧迫性，降低感染、吻合口瘘等并发症的发生率；第三是要对抗肌肉分解的高代谢作用，满足肿瘤患者增强肌肉蛋白的持续合成、维持体重不减轻的刚性需求，避免肿瘤恶病质的发生与发展。遗憾的是，同时满足以上三个属性的蛋白质组合物目前还较少。
目前商业化或研究中的肠内营养制剂一定程度有益于癌症或手术患者，但难以完全适配老年消化道肿瘤切除术后患者的临床预后。产品蛋白质来源主要有三种，具体分析如下：
其一是整蛋白型。①蛋白质主要来源为酪蛋白：酪蛋白常被归属为胃凝结蛋白，存在胃肠不耐受风险，例如用于癌症病人肠内营养的瑞能(费森尤斯卡比华瑞制药有限公司)，酪蛋白为唯一蛋白质来源，故不难理解该药品说明书对禁忌症的明确定义有“胃肠道张力下降、急性胰腺炎以及以及有严重消化和吸收障碍的疾病禁用本品”，但该产品对无禁忌症的恶病质肿瘤患者增强机体蛋白质(特别是肌肉组织生长)持续合成的优势明显，可显著抑制肿瘤患者的体重丢失。市场上也有以牛奶蛋白(酪蛋白占比80％)为氮源的全营养配方食品对癌症患者有益。例如，Abbott Laboratories公司销售的PROSURE与Novartis公司销售的RESOURCE SUPPORT，蛋白质由分离牛奶蛋白(酪蛋白：乳清蛋白＝8:2)提供，能够帮助肌肉持续生长，有助于维持体重，用于放化疗患者对抗肌肉分解代谢、恶病质或厌食，保证了对患者能量和活力的良好支持。②蛋白质来源为乳清蛋白：乳清蛋白常被归属为非胃凝结蛋白，胃肠耐受性好，例如Nestle公司销售的IMPACT，蛋白质由乳清蛋白提供，用于外科手术患者的营养治疗。以上例举是对以酪蛋白为主要氮源产品对持续维持肌肉生长优势的肯定，也是对以乳清蛋白为主要氮源产品对术后创伤修复优势的肯定；然而，本发明人在实施例3中试验观察到，酪蛋白在胃pH值下形成蛋白质凝结物，因此显示出降低的消化性，无疑用于快速增加血浆必需氨基酸水平、促进伤口愈合的用途受到限制；而乳清蛋白在胃pH值下未见蛋白质凝结物，胃排空速率较高，显示出高消化性，进而血浆必需氨基酸水平的体内代谢速率也较快，不能较长时间维持血浆必需氨基酸在较高水平，无疑用于持续增强肌肉组织的生长用途受到限制，需要较长时间的干预才能奏效。
其二是水解蛋白型。例如短肽型肠内营养混悬液百普力(纽迪希亚制药有限公司)，蛋白质来源为水解乳清蛋白，适用于有胃肠道功能或部分胃肠道功能而不能或不愿吃足够数量的常规食物以满足机体营养需求的肠内营养治疗的病人，主要用于代谢性胃肠道功能障碍(包括胰腺炎、肠道炎性疾病、放射性肠炎和化疗、肠瘘、短肠综合征等)，也适用于创伤、大手术后等危重疾病的恢复期；未见相关消化吸收障碍患者禁忌症，仅在该药品说明书的不良反应有“使用本品可能会出现腹泻、腹痛等胃肠道不适反应”的提示，说明水解乳清蛋白较整蛋白型氮源已在很大程度上解决了胃肠耐受问题。说到这里，有必要进一步评估与比较水解乳清蛋白与完整乳清蛋白对术后组织修复的效能。一般认为，水解乳清蛋白较完整乳清蛋白的分子量小，体内消化吸收速率快，对创伤组织修复的能力应优于乳清蛋白。然而，事实上乳清蛋白对术后组织修复的能力可能优于水解乳清蛋白，正如本发明人意外发现，分离乳清蛋白促进断尾术后斑马鱼伤口愈合的能力明显优于水解乳清蛋白(详见实施例5)，这一点完全颠覆了传统认知。可能的机制在于，完整乳清蛋白含有α-乳白蛋白(15g/100g)、β-乳球蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白，是组织的形成与生长的主要营养素，而水解乳清蛋白在酶解制备工艺过程中，可能有部分功能性基团被酶解切断，促进伤口愈合的蛋白质活性结构单元可能被破坏，构成和修复组织的能力不如完整乳清蛋白。可见，胃肠耐受相对较好的水解乳清蛋白对伤口愈合的效能不如乳清蛋白，同等条件下应优选胃肠耐受性同样可接受的完整乳清蛋白为主要氮源的治疗方案。以上例举是对以水解乳清蛋白为主要氮源产品对胃肠耐受性以及促进伤口愈合临床优势的相对肯定；然而，同理类似于乳清蛋白，本发明人注意到，水解乳清蛋白的胃排空速率较高，高消化性所致血浆必需氨基酸水平的体内代谢速率也较快，不能较长时间维持血浆必需氨基酸在较高水平，无疑用于持续维持肌肉组织的生长用途也受到限制。这一点在解放军总医院第一医学中心营养科 (张新胜，等.补充水解乳清蛋白对胃切除术后患者低蛋白血症及体成分影响的多中心随机对照研究.中国食物与营养.2021,27(11):57-64)的临床研究中得以证实。结果显示，胃切除术后患者口服补充水解乳清蛋白和分离乳清蛋白的胃肠耐受性均较好，干预7天均可观察到术后胃肠腹泻和便秘的症状的发生率降低以及血清低蛋白水平的改善，但瘦体重和瘦体重百分比的增加却需要干预至21天才能观察到与对照组有显著性差异，提示水解乳清蛋白和分离乳清蛋白增强肌肉组织蛋白质持续合成的效能相对较低，需要干预较长的时间才能奏效。
其三，胃凝结蛋白与非胃凝结蛋白的组合蛋白。诸多研究者试图提供一种以酪蛋白为主成分的蛋白质组合物，在上胃肠道中不会凝结，胃肠耐受性好，可用于促进伤口愈合。可能的思路在于酪蛋白与胃肠耐受性较好的非胃凝结蛋白按照一定比例组合。菲仕兰坎皮纳荷兰公司公开有两份专利，其中专利CN 111246872 A(治疗和/或预防肌肉质量和/或力量损失相关病症的蛋白质稠密的营养组合物)描述了由胶束酪蛋白与水解乳清蛋白按重量比在 40：60至90：10的范围内组成的液体高蛋白组合物的用途；专利CN111836555A(高度可消化的富含蛋白质的营养组合物、其用途及其制备方法)描述了相对重量比在从22∶78至70 ∶30范围内的非凝结蛋白(乳清蛋白)和凝结蛋白(酪蛋白或酪蛋白酸盐)的组合物。以上两份专利均提出，较大占比的酪蛋白与水解乳清蛋白或乳清蛋白的组合物，可用于增加血浆亮氨酸水平、增强肌肉蛋白合成，用于治疗和/或预防肌肉质量和/或力量损失相关病症，但上述专利未涉及组合物适用于加快伤口愈合的治疗用途。理论上讲，非胃凝结乳清蛋白或水解乳清蛋白的占比较小、胃凝结酪蛋白占比较大的组合物，在胃pH值下形成蛋白质凝结物的风险依然存在，由此依然存在降低的消化性，无疑用于快速增加血浆必需氨基酸水平、促进伤口愈合的用途受到限制。另有雀巢公司ZL 200480037170.1(用于创伤愈合的营养组合物)描述了以重量计的酪蛋白酸钠50％、浓缩乳蛋白45％、脯氨酸3％、精氨酸2％的营养组合物；CN102083329B(高蛋白液体肠营养组合物)描述了至少85～95重量％的乳清蛋白、10～40重量％的酪蛋白或酪蛋白酸盐与0.5～5重量％的游离氨基酸的营养组合物。以上两份专利均证明，较大占比的乳清蛋白与酪蛋白的组合物，可用于对术后伤口愈合有需要的老年患者、处于疾病状态中或正从疾病状态中恢复的营养不良患者，但上述专利未涉及组合物对肌肉蛋白质合成用途的描述。理论上讲，胃凝结酪蛋白的占比较小、非胃凝结乳清蛋白占比较大的组合物，高消化性导致不能较长时间维持血浆必需氨基酸在较高水平，无疑用于持续增强肌肉蛋白质合成增长的用途受到限制，需要干预较长的时间才能奏效。
根据以上分析，现有商业化肠内营养制剂所提供的蛋白质，尚不能同时满足胃肠耐受性良好、快速促进创伤组织修复、持续增强肌肉组织生长等三个属性要求，难以满足老年消化道肿瘤切除术后患者既要快速促进伤口愈合、又要持续抑制体重丢失的临床营养需求。鉴此，选择合适的氮源兼具以上三个属性是解决问题的关键。
发明内容
受市售产品可提供蛋白质固有的胃肠不耐受以及不同程度的营养充足性缺陷所限制，老年消化道肿瘤切除术后患者的实际蛋白质摄入量严重不足，无法满足以上特殊人群对蛋白质的营养需求。参考国内外相关指南(中华医学会肠外肠内营养学分会.成人围手术期营养支持指南.中华外科杂志.2016,54(9):641-657，McClave SA,et al.Guidelinesfor the provision and assessment of nutrition support therapy in the adultcritically ill patient:Society of Critical Care Medicine(SCCM)and AmericanSociety for Parenteral and Enteral Nutrition (ASPEN).JPEN 2016,40(2):159-211)，老年消化道肿瘤切除术后患者的蛋白质目标需求量为 1.5～2.0g/(kg·d)。鉴此，改善蛋白质的胃肠耐受性以保证持续营养治疗的顺应性、优化蛋白质的营养充足性以快速促进伤口愈合、持续抑制体重丢失，是提供以上患者人群足量足质蛋白质所亟需解决的首要目标。
越来越多的临床营养共识(韩军花.特殊医学用途组合物食品系列标准实施指南，中国质检/标准出版社，2015：149)指出，蛋白质的质量在机体蛋白质的合成中扮演着重要角色。由于不同蛋白质的可消化性和生物利用度不同，使得将蛋白质分为有“快”(fastprotein)和“慢”(slow protein)的概念被提出，近年来也定义有“中间”蛋白(mediumprotein)。“快蛋白”的特点是在消化后能较快地以氨基酸的形式出现在血液中，“慢蛋白”的特点是餐后血浆中的氨基酸升高速度较慢，而中间蛋白的特点则介于快慢蛋白之间。乳清蛋白即为典型的快蛋白；酪蛋白由于在胃中形成凝块导致其被释放到血液中的速度较慢，是典型的慢蛋白；大豆蛋白的可消化性和生物利用度介于乳清蛋白与酪蛋白之间，是典型的中间蛋白。由于肠内营养的患者顺应性、伤口组织的快速修复能力以及肌肉蛋白的持续合成能力取决于蛋白质的胃凝结特性、血浆中氨基酸升高的程度和时间(包括起效时间与维持时间)，因此，以能同时满足胃肠耐受性良好、快速促进创伤组织修复、持续增强肌肉组织生长的三个属性要求为配方设计目标，参考雀巢公司ZL 200480037170.1(用于创伤愈合的营养组合物) 以及雀巢公司批准的特殊医学用途配方食品佳膳(国食注字TY20195007)，在“酪蛋白:乳清蛋白＝50:50(重量比)的基础配方上，本发明采用中间蛋白替代部分快蛋白或慢蛋白的思路，设计了如下三种方案，试图筛选出一种特殊配伍比例，将酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白这三种不同消化性、不同释放速率的蛋白质巧妙地组合在一起，以期解决老年消化道肿瘤切除术后患者人群营养治疗的困惑。
第一种方案，设定快蛋白重量比例约为50％，用中间蛋白替代慢蛋白的部分比例，根据已有对三种蛋白可消化性与生物利用度的认知推理，原则上该组合蛋白可优化胃肠耐受性、保留伤口愈合加快的优势，但是否具备持续增强肌肉蛋白的合成能力尚不确定？
第二种方案，设定慢蛋白重量比例约为50％，用中间蛋白替代快蛋白的部分比例，根据已有对三种蛋白可消化性与生物利用度的认知推理，该组合蛋白可保留其持续增强肌肉蛋白合成的能力、控制体重减轻的优势，原则上应优于方案一，但是否具备良好胃肠耐受性、是否具备加快伤口组织再生、促进伤口愈合的能力尚不确定？
第三种方案，设定中间蛋白重量比例约为50％，用中间蛋白替代快蛋白与慢蛋白的部分比例，根据已有对三种蛋白可消化性与生物利用度的认知推理，该组合蛋白的胃肠耐受性、促进伤口愈合的能力可能优于方案二，持续增强肌肉蛋白合成能力可能介于方案一与方案二之间，具体需要对比研究予以求证。
以上三种方案的性能仅为预判，其准确性尚不可确定。基于已有认知与推理，我们认为同时满足本发明所有技术属性要求的方案可能在方案二或方案三。理论上推测，胃肠耐受性方面，方案二与方案三应远不如快蛋白为主的方案一，但中间蛋白为主的方案三可能要优于慢蛋白为主的方案二；加速创伤愈合的能力方面，方案三也要可能优于方案二。为此，我们需要去比较①以乳清蛋白为参考蛋白，考察方案二、方案三与方案一胃肠耐受性差异？方案三是否优于方案二？②以酪蛋白为参考蛋白，考察方案三、方案一与方案二持续增强肌肉蛋白合成的能力差异，方案三是否优于方案一？③以术后蛋白质需求增加模型为对照，考察方案二、方案三与方案一加速组织再生能力的差异，方案三是否优于方案二？
本发明令人惊讶地发现，第二种方案保留酪蛋白较大占比的优势，以大豆蛋白替代部分乳清蛋白，设计由酪蛋白、乳清蛋白与大豆蛋白按照特定比例配伍组成的营养组合物，此比例使最大限度地利用这三种不同蛋白质来源各自的优势成为可能，达到了兼具胃肠耐受性好、加速创伤组织修复、持续增强肌肉组织生长的三个属性要求，能够满足老年消化道肿瘤切除术后患者既要快速促进伤口愈合、又要持续抑制体重丢失的临床营养需求。可以说，本发明按照方案二设计的组合物所提供的氮源是一种特殊比例的营养组合物，意外发现并被证实比方案一、方案三思路下设计的组合物显示出更为优异的效果，从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供一种胃肠耐受性良好的可消化优质蛋白，一方面通过加速创伤组织再生，加快老年消化道肿瘤切除术后患者的伤口愈合；另一方面通过持续增强肌肉蛋白质的合成，显著抑制肿瘤以及术后低蛋白血症所致营养不良引起的渐进性体重丢失，全面改善临床结局。
本发明提供的营养组合物由酪蛋白48重量份、乳清蛋白28重量份、大豆蛋白24重量份组成，其中所述酪蛋白选自酪蛋白游离形式(如胶束酪蛋白)或酪蛋白酸盐形式(如酪蛋白酸钾、酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙、酪蛋白酸镁)及其任意混合物；所述乳清蛋白选自浓缩乳清蛋白、分离乳清蛋白及其任意混合物；所述大豆蛋白选自大豆分离蛋白。
本发明提供的营养组合物蛋白质含量(以湿基计)不低于83.0％，其中所述酪蛋白的蛋白质含量(以湿基计)不得低于83.5％；所述乳清蛋白的蛋白质含量(以湿基计)不得低于 75.0％；所述大豆分离蛋白的蛋白质含量(以湿基计)不得低于85.0％。
在本发明的一个实施方案中，所述营养组合物由胶束酪蛋白48重量份、分离乳清蛋白 28重量份、大豆分离蛋白24重量份组成，组合物的蛋白质含量(以湿基计)为87.7％；其中胶束酪蛋白的蛋白质含量(以湿基计)为84.5％，分离乳清蛋白的蛋白质含量(以湿基计) 为93.0％；大豆分离蛋白的蛋白质含量(以湿基计)为88.0％。
在本发明的一个实施方案中，所述营养组合物由酪蛋白酸钙48重量份、浓缩乳清蛋白 28重量份、大豆分离蛋白24重量份组成，组合物的蛋白质含量(以湿基计)为86.9％；其中酪蛋白酸钙的蛋白质含量(以湿基计)为92.2％，浓缩乳清蛋白的蛋白质含量(以湿基计) 为77.0％；大豆分离蛋白的蛋白质含量(以湿基计)为88.0％。
在本发明的一个实施方案中，所述营养组合物由胶束酪蛋白24重量份、酪蛋白酸钙24 重量份、分离乳清蛋白14重量份、浓缩乳清蛋白14重量份、大豆分离蛋白24重量份组成，组合物的蛋白质含量(以湿基计)为87.4％；其中胶束酪蛋白与酪蛋白酸钙的蛋白质含量(以湿基计)分别为84.5％、92.2％，分离乳清蛋白与浓缩乳清蛋白的蛋白质含量(以湿基计) 分别为93.0％、77.0％；大豆分离蛋白的蛋白质含量(以湿基计)为88.0％。
在本发明的一个实施方案中，所述营养组合物由酪蛋白酸钙40重量份、酪蛋白酸钠8 重量份、浓缩乳清蛋白20重量份、分离乳清蛋白8重量份、大豆分离蛋白24重量份组成，组合物的蛋白质含量(以湿基计)为88.2％；其中酪蛋白酸钙与酪蛋白酸钠的蛋白质含量(以湿基计)分别为92.2％、90.6％，分离乳清蛋白与浓缩乳清蛋白的蛋白质含量(以湿基计) 分别为93.0％、77.0％；大豆分离蛋白的蛋白质含量(以湿基计)为88.0％。
在本发明的一个实施方案中，所述营养组合物由胶束酪蛋白20重量份、酪蛋白酸钙20 重量份、酪蛋白酸钾8重量份、分离乳清蛋白28重量份、大豆分离蛋白24重量份组成，组合物的蛋白质含量(以湿基计)为89.9％；其中胶束酪蛋白、酪蛋白酸钙与酪蛋白酸钾的蛋白质含量(以湿基计)分别为84.5％、92.2％、91.8％，分离乳清蛋白的蛋白质含量(以湿基计)为93.0％；大豆分离蛋白的蛋白质含量(以湿基计)为88.0％。
在本发明的一个实施方案中，所述营养组合物由胶束酪蛋白12重量份、酪蛋白酸钙12 重量份、酪蛋白酸镁24重量份、浓缩乳清蛋白28重量份、大豆分离蛋白24重量份组成，组合物的蛋白质含量(以湿基计)为85.5％；其中胶束酪蛋白、酪蛋白酸钙与酪蛋白酸镁的蛋白质含量(以湿基计)分别为84.5％、92.2％、90.3％，浓缩乳清蛋白的蛋白质含量(以湿基计)为77.0％；大豆分离蛋白的蛋白质含量(以湿基计)为88.0％。
本发明组合物使用的酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白均可从商业来源获得，如酪蛋白或酪蛋白酸盐可从菲仕兰(Friesland Campina)、恒天然(Nzmp)等公司商购获得；浓缩乳清蛋白或分离乳清蛋白可从包括阿拉(Arla Foods Ingredients S.A.)、哥兰比亚(GlanbiaNutritionals)、 Hilmar、安格普(Agropur)和大拓(Tatua)等公司商购获得；大豆分离蛋白可从杜邦(Dupout) 及其国内生产商等公司商购获得。
本发明的另一目的是提供了组合物的产品形式为口服制剂，它可以是粉剂、颗粒剂、混悬乳液中的任意一种。所述组合物口服制剂的制备方法如下：
在本发明的一个实施方案中，所述组合物口服粉剂的制备方法为：符合蛋白质含量质量要求的酪蛋白、乳清蛋白与大豆蛋白三种原料经验收、检验合格后，按照实施例1所示配方用量备料、称量、过筛，依次加入二维运动混合机，加入适量二氧化硅或其他抗结剂，混合10～30min，转速为10～20转/分钟，定量包装即可。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物口服颗粒剂的制备方法为：符合蛋白质含量质量要求的酪蛋白、乳清蛋白与大豆蛋白三种原料经验收、检验合格后，按照实施例1所示配方用量备料、称量、过筛，依次加入流化床制粒机，混匀，喷入适量水为粘合剂湿法制粒，干燥，过筛，整粒，定量包装即可。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物口服混悬乳液的制备方法为：符合蛋白质含量质量要求的酪蛋白、乳清蛋白与大豆蛋白三种原料经验收、检验合格后，按照实施例1 所示配方用量备料、称量、过筛，依次加入盛有适量纯化水的配液罐，搅拌混匀，加入适量乳化增稠剂，经剪切、均质、定容、灌装等工序后，121℃、15min灭菌即可。
在本发明组合物的一个实施方案中(实施例3)，根据国家药品监督管理总局发布的《普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则》，采用桨法溶出试验仪，以pH 1.2为溶出介质，建立体外模拟消化实验，用于评估受试蛋白的胃肠耐受性。以单一整蛋白为对照组，重点对标2个参考蛋白(非胃凝结蛋白乳清蛋白、胃凝结蛋白酪蛋白酸钙)，以“筛网截留凝块湿重”以及经筛网过滤后“溶出介质的蛋白质含量”分别表征胃凝结蛋白的发生风险与模拟胃排空速度，设定“筛网截留未见明显或较少凝块、溶出介质的蛋白质含量越高”判定该组合蛋白的胃凝结风险较小、胃排空速度较大，分别比较三种蛋白分别按照不同的比例构成的组合蛋白，即酪蛋白酸钙、浓缩乳清蛋白、大豆分离蛋白的重量比例分别为48∶28∶24(组合物2)、23∶53∶24(对照例1)、24∶27∶49(对照例2)所呈现的模拟胃凝结状态与模拟胃排空速度，由此筛选出胃肠耐受良好的混合蛋白最佳配伍比例。对比研究证实，与2个参考蛋白比较，本发明人意外发现，组合物2(方案二思路)与对照例1(方案一思路)两组配伍比例均呈现出良好的胃肠耐受性，与非胃凝结蛋白乳清蛋白相似，优于对照例2(方案三思路)，明显优于胃凝结蛋白酪蛋白酸钙，达到了意想不到的良好胃肠耐受性。结果提示，配方中保留酪蛋白较大占比的优势，以特定比例的大豆蛋白(中间蛋白)替代部分乳清蛋白(方案二思路)，表现出的胃肠耐受性可与乳清蛋白占比较大配方(方案一思路)相似；反之，大豆蛋白(中间蛋白)占比较大配方(方案三思路)，却表现出较方案二配方略为增加的模拟胃凝结现象，随之模拟胃排空速度呈减缓趋势，其结果与理论推理不完全一致，可能与不同来源蛋白质三维空间结构的亲水性差异有关。事实上，本发明组合物按特定比例配伍组成的组合物，该比例使最大限度地利用这三种不同蛋白来源各自的优势成为可能，由此满足本发明用途达成的第一属性，保证本发明所述组合物用于老年消化道肿瘤切除术后患者肠内营养支持的顺应性，降低本身因增龄、肿瘤、消化道切除术创伤所致不同程度的胃肠功能受损与消化吸收障碍引起的蛋白质摄入不足风险。
在本发明组合物的一个实施方案中(实施例4)，通过建立斑马鱼28天进食受限致能量-蛋白质营养不良模型，模拟临床患者“管饲”喂养，以酪蛋白酸钙为参考蛋白，考察试验终点斑马鱼的体重变化、肌肉蛋白总量、肌肉胆固醇含量、肌肉水分含量、肌肉ATP等指标，设定“体重下降值较小、肌肉蛋白总量较大”为良好营养充足性判定的主要原则，比较三种蛋白原料按照不同比例构成的组合蛋白，即酪蛋白酸钙、浓缩乳清蛋白、大豆分离蛋白的重量比例分别为48∶28∶24(本发明组合物2)、23∶53∶24(对照例1)、24∶27∶49(对照例2) 对肌肉蛋白的持续合成、减缓体重丢失等能力的影响，由此筛选出组合蛋白的最佳配伍比例。对比研究证实，本发明组合物2(方案二思路)终点体重变化最小、肌肉粗蛋白含量最高、肌肉胆固醇含量较高、动员机体产生ATP供能较少，但肌肉水分含量无组间差异，表明慢蛋白占比较大的方案二组合物持续促进斑马鱼肌肉蛋白合成的能力较强，由此显著抑制营养不良所致的体重渐进性丢失，具有更高的营养充足性，故动员机体脂肪供能较少，且动员机体产生ATP供能较少，明显性能优于参考蛋白酪蛋白酸钙以及对照例1～2，其次是中间蛋白占比较大的方案三组合物，而快蛋白占比较大的方案一组合物持续促进肌肉蛋白合成、维持肌肉蛋白总量的能力较弱，故减缓体重下降的幅度较小。以上试验结论与理论推理一致，即配方保留酪蛋白较大占比的优势，以特定比例的大豆蛋白替代部分乳清蛋白，其持续促进肌肉蛋白合成的能力维持并超越了酪蛋白单一蛋白的优势，明显优于乳清蛋白占比较大的配方或大豆蛋白占比较大的配方，故本发明组合物按照特定比例配伍组成的营养组合物，此比例使最大限度地利用这三种不同蛋白质来源各自的优势成为可能，由此满足本发明用途达成的第二属性，保证本发明所述组合物用于老年消化道肿瘤切除术后患者持续补足需要量蛋白，降低本身因增龄、肿瘤、进食受限、消化吸收障碍引起的渐进式体重减轻、骨骼肌萎缩、无力、乏力等风险。
在本发明组合物的一个实施方案中(实施例5)，通过建立斑马鱼断尾术后蛋白质需求增加模型，在鱼饲料投喂基础上补充受试蛋白，模拟临床“管饲”喂养，以投喂鱼饲料的断尾术模型组为对照，以术后灌胃3天后尾鳍再生面积变化为考察指标，设定“尾鳍面积较大者”判定该组合蛋白营养充足性越高，能够加速机体蛋白质合成、修复受损组织并促进再生，分别比较快蛋白分离乳清蛋白、水解乳清蛋白、以及按照不同的比例构成的组合蛋白，即酪蛋白酸钙、浓缩乳清蛋白、大豆分离蛋白的重量比例分别为48∶28∶24(本发明组合物2)、 23∶53∶24(对照例1)、24∶27∶49(对照例2)的营养充足性，由此筛选出加速伤口愈合较强的最佳配伍比例。对比研究证实，本发明意外发现，组合物2在断尾术后灌胃3天能够明显增加斑马鱼尾鳍再生面积，明显优于投喂鱼饲料的模型组、分离乳清蛋白以及对照例1，满足术后增加的蛋白质营养需求，呈现出良好的营养充足性；反之，对照例2与水解分离乳清蛋白在本试验条件下未表现出明显的组织再生作用。提示：配方保留酪蛋白较大占比的优势，以特定比例的大豆蛋白替代部分乳清蛋白(不选择水解乳清蛋白)，在基础营养的基础上增加蛋白质摄入，其快速并持续促进受损组织蛋白合成的能力较强，故本发明组合物按照特定比例配伍组成的营养组合物，该比例使最大限度地利用这三种不同蛋白质来源各自的优势成为可能，由此满足本发明用途达成的第三属性，保证本发明所述组合物用于老年消化道肿瘤切除术后患者持续补足需要量蛋白，降低本身因增龄、手术创伤、术后高血糖应激状态、术后低蛋白血症等因素引起的伤口愈合迟缓风险。
根据实施例3～5的研究数据，本发明人意外发现，所述组合物按照酪蛋白酸钙、浓缩乳清蛋白、大豆分离蛋白的重量比为48∶28∶24的特定比例，同时满足胃肠耐受性良好、快速促进创伤组织修复、持续增强肌肉组织生长的三个属性要求，被证明比参考蛋白(胃凝结蛋白酪蛋白酸钙、非胃凝结蛋白)、对比例1、对比例2的组合蛋白显示出更优异的效果。接下来的工作，是进一步阐明本发明组合物的蛋白质可利用度、治疗用途及其临床使用效果、作用机制等。具体说明如下：
实施例6为本发明所述组合物的体内消化率与蛋白质功效比(PER)测定。结果显示，本发明组合物的表观消化率为(91.24±0.56)％，真消化率为(96.09±0.56)％；参考蛋白酪蛋白酸钙的表观消化率为(91.96±0.62)％，真消化率为(97.03±0.62)％；本发明组合物与酪蛋白酸钙的体内消化率比较无显著性差异。本发明组合物的PER为3.85，酪蛋白酸钙的 PER为3.76，两组蛋白质功效比无统计学差异；校正后本发明组合物的校正后PER为2.56。特别值得注意的是，本发明人意外观察到，在PER试验第3周，本发明组合物明显促进大鼠体重增加，提示该组合物持续增强肌肉蛋白的合成能力优于酪蛋白酸钙组，可较长时间持续维持血浆中氨基酸的浓度在一个较高的水平，由此持续促进体重增长，显示出特殊比例的优势。可见，本发明所述组合物为可消化优质蛋白，能够较好地被机体所消化吸收所利用。
实施例7为本发明所述组合物对存在营养不良风险的老年消化道肿瘤切除术后患者的治疗用途以及临床使用效果评定。切除术后老年患者因消化道肿瘤疾病和手术的原因造成消化道解剖结构改变，胃肠道功能受损，消化吸收面积减少，导致患者进食受限或消化吸收功能下降，极易出现营养不良(NRS 2002≥3分)症状。一方面，机体蛋白合成能力不足；另一方面，分解消耗增加，机体处于高分解代谢状态，故临床常见术后低蛋白血症(血清白蛋白水平低于35g/L)，所致伤口愈合缓慢、体重丢失增加，直接影响患者临床结局。临床观察结果显示，与干预前比较，本发明组合物在术后口服干预5天后，其一，胃肠耐受性良好，未发生恶心、呕吐、腹痛、腹泻、便秘等胃肠不耐受现象，食用安全性好，保证了患者持续实施营养支持的顺应性；其二，本发明组合物可明显改善受试者术后低蛋白血症的营养状态，显著增加血清总蛋白、白蛋白水平，且在干预第3天即可观察到患者伤口部位有组织再生现象，红肿、渗出液等异常现象明显减轻，试验终点(干预第5天)明显促进患者伤口愈合趋好；其三，与干预前比较，本发明组合物干预后体重略有增加(4％)，虽无统计学意义，但可减缓肿瘤、手术创伤等营养不良所致的渐进性体重减轻，持续维持肌蛋白生长。最终显示，本发明组合物特定配伍比例所提供的蛋白质，能够同时满足胃肠耐受性良好、加速创伤组织修复、持续增强肌肉组织生长的三个属性要求，能满足老年消化道肿瘤切除术后患者对伤口愈合、抑制体重丢失的营养治疗需求。
延迟或减弱的创伤愈合是困扰老年消化道肿瘤切除术后患者的一个难题。本发明人相信，可消化优质蛋白质的补充，有助于成纤维细胞在创伤处增殖并积聚，产生胶原以帮助创伤闭合。也就是说，在伤口愈合的这个阶段，新的结缔组织被合成，超过80％的该组织由胶原蛋白组成；如果没有足质足量的氮源提供氨基酸，则胶原蛋白不能有效的形成。以上临床研究结果证明了本发明组合物能够快速促进老年消化道肿瘤切除术后患者的伤口愈合，我们从实施例5也了解到该组合物可在断尾术后3天快速有效促进组织再生，但尚不明确其对伤口组织蛋白快速合成的影响力。鉴此，以伤口部位新生血管的形成来表征伤口组织蛋白合成的能力，研究本发明组合物加速伤口愈合的作用机制。如实施例8所述，本发明组合物在干预2天后，通过伤口部位71％的新生血管生成，促进斑马鱼伤口组织的快速愈合，提示本发明组合物促进组织蛋白合成能力较强，加快创伤组织的修复与再生，进一步证明本发明组合物特殊比例的配方优势，决定了特殊的氨基酸组成与含量，因而可较好满足伤口结缔组织蛋白质合成的氨基酸需求。
综上所述，本发明组合物提供的是一种可消化的优质蛋白，因其特殊的配方比例，可充分发挥三种不同蛋白质来源各自的优势，使其兼具良好胃肠耐受性、伤口愈合促进作用、持续增强肌肉蛋白合成等临床使用优势成为可能，因而可用于老年消化道肿瘤切除术后患者促进伤口愈合、抑制体重下降的营养治疗，全面改善患者营养状况，这可能是使得蛋白质补充对老年消化道肿瘤切除术后患者在疾病缓解方面充分发挥优势的关键点之一，无疑是一个令人振奋的消息。
附图说明
附图1本发明组合物抑制伤口部位色素募集表型图
附图2本发明组合物对血管新生影响的表型图
具体实施方式
实施例1组合物的复配比例与蛋白质含量
1)各组分原料来源以及蛋白质组成
本发明及对照例1～2组合物所含蛋白质来源均由酪蛋白、乳清蛋白和大豆蛋白构成。如表1所示，采用的酪蛋白可选自任何合适的酪蛋白源，包括胶束酪蛋白、酪蛋白酸盐及其任意混合物，所述酪蛋白酸盐是指失去胶束结构的酪蛋白，可以是酪蛋白酸钾、酪蛋白酸钙、酪蛋白酸镁或酪蛋白酸钠，蛋白质含量(以湿基计)不低于83.5％，可从菲仕兰(Friesland Campina)商购获得；采用的乳清蛋白可选自任何合适的乳清蛋白源，包括浓缩乳清蛋白、分离乳清蛋白及其任意混合物，蛋白质含量(以湿基计)不得低于75.0％，可从阿拉(Arla Foods Ingredients S.A.)商购获得；采用的大豆蛋白可选自任何合适的大豆蛋白源，包括大豆分离蛋白，蛋白质含量(以湿基计)不得低于85.0％，可从杜邦(Dupout)商购获得。
表1本发明及对照例组合物可选择蛋白质原料来源及其蛋白质含量
2)组合物的复配比例
本发明组合物与对照例1～2的三种蛋白复配比例见表2。以表1所列组合物1～6的蛋白质来源、组成、各组分重量比为例，按照表2所示重量比例复配，得本发明组合物1～6的蛋白质含量见表2；以表1所列组合物2的蛋白质来源、组成、各组分重量比为例，按照表 2所示重量比例复配，得对照例1～2组合物的蛋白质含量见表2。
表2本发明及对照例1～2组合物的复配比例与蛋白质含量
3)组合物的氨基酸评分
以WHO/FAO 2013评分模式为基准，计算蛋白质的氨基酸评分。如表3所示，三种组合物的氨基酸评分均在100以上，必需氨基酸种类齐全、比例适当，均为优质蛋白质。
表3本发明及对照例组合物的氨基酸评分
实施例2组合物口服制剂的制备方法
粉剂：环境湿度控制在60％以下、温度<30℃，符合蛋白质含量质量要求的酪蛋白、乳清蛋白与大豆蛋白三种原料经验收、检验合格后，按实施例1所示本发明组合物(表2)计算配方用量，备料，称重，过20目筛，依次加入二维运动混合机，加入适量二氧化硅，混合时间为10～30min，转速为10～20rpm，混粉定量包装(规格：10g/袋)。成品蛋白质含量(以湿基计)不低于8.3g/袋，水分＜5％，微生物限度符合规定。
颗粒剂：环境湿度控制在60％以下、温度<30℃，符合蛋白质含量质量要求的酪蛋白、乳清蛋白与大豆蛋白三种原料经验收、检验合格后，按照实施例1所示本发明组合物的复配重量比例(表2)计算配方用量，备料，称量，过20目筛，依次加入流化床制粒机，混匀，喷入适量水为粘合剂湿法制粒，50～60℃干燥，过14目筛，整粒，定量包装(规格： 10g/袋)。成品蛋白质含量(以湿基计)不低于8.3g/袋，水分＜5％，微生物限度符合规定。
口服混悬乳液：环境湿度控制在60％以下、温度<30℃，符合蛋白质含量质量要求的酪蛋白、乳清蛋白与大豆蛋白三种原料经验收、检验合格后，按照实施例1所示本发明组合物的复配重量比例(表2)计算配方用量，备料，称量，过20目筛，依次加入盛有适量纯化水的配液罐，搅拌混匀，加入适量复配乳化增稠剂(单，双甘油脂肪酸酯、结冷胶)，经剪切、均质、定容、灌装(20mL/瓶)等工序后，121℃、15min灭菌。成品蛋白质不低于8.3g/瓶，商业无菌。
实施例3组合物的胃肠耐受性评估
根据国家药品监督管理总局发布的《普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则》，采用桨法溶出试验仪，取9.0mL盐酸，用水稀释至1000mL，摇匀，配制pH 1.2的溶出介质，建立体外模拟消化实验(50rpm，30min)，用于评估受试蛋白的胃肠耐受性。基于老年消化道肿瘤切除术后患者的胃肠功能受损，直接影响胃肠道消化酶的分泌与释放，胃肠蠕动普遍减缓，故体外模拟消化试验中不考虑胃肠消化酶对消化的影响，体外溶出设置在较低转速(50rpm)下模拟患者在特定医学状况下的胃肠消化功能受损状态。试验中如受试蛋白与模拟胃液介质接触不易发生凝结，则蛋白凝块堆积几率较小，胃耐受性良好，从而能够较好地被胃所排空，表现出经筛网过滤溶出介质的蛋白质含量较高，则模拟胃排空速度较快，由此证明胃排空延迟或胃残余量增加的发生风险降低，从而可能有效地避免上消化道的不耐受风险。这一点，对于有消化吸收功能障碍的患者尤显重要。
以单一整蛋白为对照组，重点对标2个参考蛋白(乳清蛋白、酪蛋白酸钙)，以“筛网截留凝块湿重”以及经筛网过滤后“溶出介质的蛋白质含量”分别表征胃凝结蛋白的发生风险与模拟胃排空速度，设定“筛网截留未见明显或较少凝块、溶出介质的蛋白质含量越高”判定该组合蛋白的胃凝结风险较小、胃排空速度较大，分别比较三种蛋白分别按照不同的比例构成的组合蛋白，即酪蛋白酸钙、浓缩乳清蛋白、大豆分离蛋白的重量比例分别为48∶28∶24 (本发明组合物2，方案二思路)、23∶53∶24(对照例1，方案一思路)、24∶27∶49(对照例2，方案三思路)在等蛋白量下所呈现的模拟胃凝结状态与胃排空速度(结果见表4)，由此筛选出胃肠耐受良好的混合蛋白最佳配伍比例。
表4体外模拟胃消化蛋白质胃凝结状态与溶出介质蛋白量比较(n＝3)
如表3所示，体外模拟胃消化试验条件下，乳清蛋白未见明显胃凝结现象，通过60目筛网溶出介质的蛋白量为95.7％；酪蛋白酸钙与大豆分离蛋白产生较大凝块，通过60目筛网溶出介质的蛋白量分别为49.4％、65.2％，提示模拟胃排空速度明显减慢，与“乳清蛋白为非胃凝结蛋白、酪蛋白为胃凝结蛋白、大豆蛋白为中间蛋白”的研究共识一致。3个混合蛋白在溶出介质中的溶解分散性较好，均较少产生胃凝结现象，说明混合蛋白不同程度地提高了胃肠耐受性，明显优于酪蛋白酸钙或大豆分离蛋白等单一蛋白。值得注意的是，本发明人意外发现，组合物2与对照例1的模拟胃凝结状态相似，几乎较少产生胃凝结现象，且通过60目筛网溶出介质的蛋白量分别为91.6％、90.8％，模拟胃排空速度较快，与乳清蛋白非常接近。结果提示，配方中保留酪蛋白较大占比的优势，以特定比例的大豆蛋白(中间蛋白)替代部分乳清蛋白(方案二思路)，表现出意想不到的良好胃肠耐受性，可与乳清蛋白占比较大配方(方案一思路)相似；可以说，本发明组合物按照特定比例配伍组成的组合物，此比例使最大限度地利用这三种不同蛋白来源各自的优势成为可能，由此满足本发明用途达成的第一属性，保证本发明所述组合物用于老年消化道肿瘤切除术后患者口服或管饲营养支持的顺应性，降低本身因增龄、肿瘤、消化道切除术创伤所致不同程度胃肠功能受损与消化吸收障碍引起的蛋白质摄入不足风险。然而，与理论推理不一致的是，中间蛋白占比较大的对照例2(方案三思路)较慢蛋白占比较大的组合物2(方案二思路)，反而表现出略为增加的模拟胃凝结现象，且通过60目筛网溶出介质的蛋白量也较低(75.9％vs 91.6％)，模拟胃排空速度减缓，提示对照例2较组合物2发生胃凝结、胃排空延迟的风险增加。
鉴此，根据体外模拟胃消化试验受试蛋白的胃凝结状态评估结果，按照“良好耐受性”原则，可优选本发明组合物2(酪蛋白∶乳清蛋白∶大豆蛋白＝48∶28∶24)与对照例1(酪蛋白∶乳清蛋白∶大豆蛋白＝23∶53∶24)的复配比例。
实施例4组合物持续增强肌肉蛋白合成、抑制体重丢失的能力评估
选取野生型AB品系成年雄性斑马鱼，随机分组，每组10尾，取消普通鱼饵料摄入，以受试蛋白质作为斑马鱼唯一的饵料来源并限制摄入量，建立28天运动状态下进食受限致斑马鱼蛋白质营养不良模型。试验以酪蛋白酸钙为参考蛋白，分别灌胃给予酪蛋白酸钙、本发明组合物2与对照例1～2，剂量均为2.481mg蛋白质/尾，每日饲喂一次，置于28℃室温培养，连续饲喂28天，分别在试验终点测算各受试组的体重变化、肌肉粗蛋白含量、肌肉水分含量、肌肉总胆固醇含量、肌肉ATP含量等指标，并采用t检验法统计分析三种组合物的营养充足性差异(结果见表5～6)，设定“体重下降较小、肌肉蛋白较大”为主要原则，由此筛选出“持续增强肌肉蛋白合成、抑制体重丢失”能力较强的混合蛋白最佳配伍比例。
表5受试蛋白对蛋白质摄入不足斑马鱼体重变化、肌肉粗蛋白含量的影响(n＝10)
注：①vs酪蛋白酸钙组，**p<0.01，***p<0.001；②vs本发明组合物2，#p<0.05，### p<0.001
表6受试蛋白对蛋白质摄入不足斑马鱼肌肉水分、总胆固醇、ATP含量的影响(n＝10)
注：①vs酪蛋白酸钙组，**p<0.01，***p<0.001；②vs本发明组合物2，#p<0.05，### p<0.001
如表4～5所示，试验前体重组间无明显差异，28天试验终点各组体重呈不同程度的下降，表明斑马鱼均处于进食受限引起的饥饿状态，提示蛋白质摄入不足引起的蛋白质缺乏模型建立成功。本发明组合物2(方案二思路)终点体重变化最小、肌肉粗蛋白含量最高、肌肉胆固醇含量较高、动员机体产生ATP供能较少，但肌肉水分含量无组间差异，表明慢蛋白占比较大的方案二组合物持续促进斑马鱼肌肉蛋白合成的能力较强，由此显著抑制营养不良所致的体重渐进性丢失，具有更高的营养充足性，故动员机体脂肪供能较少，且动员机体产生ATP供能较少，明显性能优于参考蛋白酪蛋白酸钙以及对照例1～2，其次是中间蛋白占比较大的方案三组合物，而快蛋白占比较大的方案一组合物持续促进肌肉蛋白合成、维持肌肉蛋白总量的能力较弱，故减缓体重下降的幅度较小，以上试验结论与理论推理一致。
研究者普遍认为，短期饥饿需要动用肝糖原，增加糖异生、肌蛋白分解和动员脂肪；长期饥饿进一步动员脂肪、减少肌蛋白分解、增加糖异生，可见饥饿始终与糖、脂肪和蛋白质代谢相关，而三羧酸循环是三大营养物质最终的代谢通路，三羧酸循环会产生大量的ATP。因此，越是饥饿，机体越需要能量供应，产生的ATP越多；反之，摄入营养素充足性越优，则对抗饥饿的能力越强，机体就较少动员自身的能量供应，产生的ATP越少。鉴此，根据组合物对肌蛋白合成、抑制体重丢失能力的评估结果，按照“营养充足性最优”原则，基于本发明组合物2“能够显著增加肌蛋白合成、减少肌肉脂肪分解、蛋白质营养充足性较高、从而减少对抗饥饿所需ATP的能量供应、全面改善饥饿状态下的营养状况”的研究结果，可优选本发明组合物2(酪蛋白∶乳清蛋白∶大豆蛋白＝48∶28∶24)作为最佳配伍比例。该比例可使最大限度地利用这三种不同蛋白质来源各自的优势成为可能，由此满足本发明用途达成的第二属性，保证本发明所述组合物用于老年消化道肿瘤切除术后患者持续补足需要量蛋白，降低本身因增龄、肿瘤、进食受限、消化吸收障碍引起的渐进式体重减轻、骨骼肌萎缩、无力、乏力等风险。
实施例5组合物促进伤口愈合的能力评估
选取野生型AB品系雌性成年斑马鱼，随机分组，每组10尾，切除斑马鱼部分尾鳍，建立斑马鱼断尾术后组织受损的蛋白质需求增加模型。试验以投喂普通鱼饲料的断尾术组为模型对照，其余各组在普通鱼饵料投喂基础上分别灌胃给予本发明组合物2、对照例1～2、分离乳清蛋白、水解乳清蛋白，剂量均设置为111、333和1000μg/尾，每日饲喂一次，置于28℃室温培养，断尾后连续饲喂3天后，各受试组分别在解剖显微镜下采集照片，采用方差分析和Dunnett’s T-检验统计学分析，以尾鳍再生面积(A)的统计学意义综合评价受试蛋白对伤口愈合的促进作用(计算公式如下，结果见表7)，设定“尾鳍面积较大者”，筛选出“快速修复受损组织促进再生”能力较强的混合蛋白最佳配伍比例。
尾鳍再生面积促进作用(％)＝【A供试组-A模型组】/A模型组×100％
表7受试蛋白对断尾术后斑马鱼受损尾鳍再生组织的促进作用(n＝10)
注：与模型对照组比较：*p<0.05
如表7所示，与正常组比较，模型对照组在造模时出现了明显的尾鳍损伤，断尾后第3 天，模型组尾鳍仍未恢复到正常组大小，表明斑马鱼断尾术后组织受损的蛋白质需求增加模型建立成功。本发明人意外发现，在1000μg蛋白/尾剂量下，组合物2(方案二思路)对斑马鱼伤口愈合具有显著促进作用，明显优于对照例1(方案一思路)与分离乳清蛋白，而对照例2(方案三思路)与水解乳清蛋白仅有促进斑马鱼组织再生的趋势，但作用不显著。提示：一方面，类似于快蛋白配方(分离乳清蛋白与对照1组合物)，慢蛋白占比较大的方案二组合物也可在断尾术后3天即可快速促进尾鳍组织再生；另一方面，基于慢蛋白占比较大的方案二组合物还具有持续促进肌肉蛋白合成的较强能力，由此表现出较快蛋白配方 (分离乳清蛋白与对照1组合物)更为优异的组织再生能力，显著促进伤口愈合。意料之外的是，中间蛋白占比较大的方案三组合物与水解乳清蛋白在断尾术后3天未表现出显著的组织再生能力，也为本发明组合物选择完整乳清蛋白而非水解乳清蛋白提供了依据。
鉴此，根据组合物对受损组织再生能力的评估结果，按照“营养充足性最优”原则，基于本发明组合物2“能够显著促进伤口愈合的研究结果，可优选本发明组合物2(酪蛋白∶乳清蛋白∶大豆蛋白＝48∶28∶24)作为最佳配伍比例。该比例可使最大限度地利用这三种不同蛋白质来源各自的优势成为可能，由此满足本发明用途达成的第三属性，保证本发明所述组合物用于老年消化道肿瘤切除术后患者持续补足需要量蛋白，降低本身因增龄、手术创伤、术后高血糖应激状态、术后低蛋白血症等引起的伤口愈合迟缓风险。
实施例3～5证明特定比例(酪蛋白∶乳清蛋白∶大豆蛋白＝48∶28∶24)的本发明组合物兼具胃肠耐受性良好、可快速促进伤口愈合、持续抑制体重丢失等三个属性，优于对照例1～2，可满足老年消化道肿瘤切除术后患者营养需求。以下实施例6～8将进一步求证本发明组合物的蛋白质可利用度、治疗用途及其临床使用效果以及促进伤口愈合的部分作用机制。
实施例6本发明组合物的蛋白质可利用度
以酪蛋白酸钙为参考蛋白，测定本发明组合物2的可利用度，以“体内消化率”表征蛋白质被机体消化的程度，以“蛋白质功效比”来衡量蛋白质的机体利用率。
如表8所示，参考AOAC(美国分析化学协会)官方方法991.29《食物和食品配料蛋白质消化率》大鼠生物测定法(1991年第一版)，按照如下公式测算得本发明组合物2的表观消化率为91.24±0.56％，真消化率为96.09±0.56％；酪蛋白酸钙的表观消化率为 91.96±0.62％，真消化率为97.03±0.62％；本发明组合物2与酪蛋白酸钙的体内消化率比较无显著性差异，说明本发明组合物的体内消化率高，具有良好的可利用度。
表观消化率＝(食物氮-粪氮)/食物氮×100％
真消化率＝【食物氮-(粪氮-粪代谢氮)】/食物氮×100％
表8本发明组合物与参考蛋白的体内消化率检测结果(n＝10)
如表9所示，参考GB农业部2031号公告-15-2013《转基因生物及其产品食用安全检测-蛋白质功效比实验方法》的研究方法，按照如下公式测算得本发明组合物2的蛋白质功效比(PER)为3.85，酪蛋白酸钙PER为3.76，经统计分析，两组PER无统计学差异；本发明组合物2校正后PER为2.56。本发明组合物2与酪蛋白酸钙的蛋白质功效比无显著性差异，说明本发明组合物能够被机体消化、吸收与利用，具有良好的可利用度。
蛋白质功效比(PER)＝试验期内大鼠体重增加重量/试验期内蛋白质的摄入总量
校正蛋白质功效比＝(本发明组合物蛋白质功效比/酪蛋白酸钙蛋白质功效比)×2.5
表9_本发明组合物与参考蛋白的蛋白质功效比与校正蛋白质功效比(n＝10)
组别 增加体重(g) 摄食量总量(g) 蛋白质摄入(g) PER 校正后PER
酪蛋白酸钙 133.4±18.6 362.3±43.5 35.80±4.30 3.76±0.19 -
本发明组合物2 148.6±20.9 371.5±38.4 38.31±3.96 3.85±0.21 2.56
考虑到蛋白质功效比测定的营养干预周期为28天(4周)，为了进一步比较本发明组合物与参考蛋白被机体利用程度的动态差异，我们对整个试验周期4个时间点(第1～4周)的体重增重、蛋白质摄入量与蛋白质功效比分别计算与统计分析。如表10所示，本发明人意外发现，与初始体重比较，本发明组合物组大鼠在第3周的体重总增重、蛋白质功效比明显增加，与酪蛋白酸钙组相比具有显著性差异(P＜0.05和P＜0.01)，在第4周的体重总增重、蛋白质功效比与酪蛋白酸钙组相比呈现出增加趋势，但无统计学差异(P>0.05)。进一步证实，本发明保留酪蛋白为较大占比、以中间蛋白大豆蛋白替代部分乳清蛋白的方案二思路所设计的特殊比例(酪蛋白∶乳清蛋白∶大豆蛋白＝48∶28∶24)，可使最大限度地利用这三种不同蛋白质来源各自的优势成为可能，故用于老年消化道肿瘤切除术后患者可持续促进瘦体重的增加，降低本身因增龄、肿瘤、进食受限、消化吸收障碍引起的渐进式体重减轻、骨骼肌萎缩、无力、乏力等风险，明显优于参考蛋白酪蛋白酸钙。
表10本发明组合物与参考蛋白被机体利用程度的动态检测结果(n＝10)
注：与酪蛋白酸钙组相比，*P＜0.05；**P＜0.01
综上，本发明组合物所提供的蛋白质具有良好的可利用度，能够被机体消化、吸收与利用，可持续促进体重的增长，营养充足性好。
实施例7本发明组合物的治疗用途及其临床使用效果
为了验证本发明组合物的治疗用途及其临床使用效果，采用自身前后对照法，选择55 例老年消化道肿瘤切除术后存在营养风险(NRS 2002总分≥3分)、低蛋白血症(25<血清白蛋白ALB<35g/L)、需要增加蛋白质摄入的住院患者，年龄62±10岁，体重66.6±11.0kg，男性27例(49％)，女性28例(51％)，疾病分布为胃癌、结肠癌、直肠癌、胆囊癌等消化道肿瘤切除手术(患者基线数据见表11)；以干预前(常规营养支持)为对照，所有患者在接受临床诊疗及常规营养支持基础上，本发明组合物2肠内营养持续干预5天，30g/日 (蛋白质26.07g/日)，10g/次(蛋白质8.69g/次)，考察试验终点本发明组合物后对患者人群的食用安全性(胃肠耐受性)以及营养充足性(血清蛋白水平变化、伤口愈合情况、体重变化)的影响，其中，伤口愈合系等级指标：甲级愈合是指伤口部位明显组织再生，无红肿渗液；乙级愈合是指伤口部位有组织再生，有非脓性渗液；丙级愈合指伤口内有化脓性感染，经敞开引流后愈合。
表11本发明组合物临床研究入组老年消化道肿瘤切除术患者的基线数据
表12本发明组合物干预期间胃肠耐受症状的发生率(n＝55)
表13本发明组合物干预前后血清总蛋白与白蛋白水平的变化情况(n＝55)
项目 干预前 干预后 差值(后－前) p值 变化率(％)
血清总蛋白(g/L) 54.74±4.20 59.44±7.07 4.69±7.11*** 0.000 8.95±13.44
血清白蛋白(g/L) 31.24±2.58 33.31±4.61 2.07±5.10** 0.002 7.36±17.71
备注：与干预前对比，***p＜0.001；**p＜0.01
表14本发明组合物干预期间伤口愈合不同等级愈合率(n＝55)
项目 干预第3天 干预第5天
甲级愈合率(例/发生率) 28/50.9％ 55/100.0％
乙级愈合率(例/发生率) 27/49.1％ 0/0.0％
丙级愈合率(例/发生率) 0/0％ 0/0.0％
有效率 100.0％ 100.0％
表15本发明组合物干预前后体重变化情况(n＝55)
项目 干预前(kg) 干预后(kg) p值 变化率(％)
体重 66.6±11.0 69.3±10.1 p>0.05 4.1
如表12～15所示，本发明组合物2干预期间，55例患者均未发现恶心、呕吐、腹痛、腹胀和腹泻等胃肠道症状，提示该组合物的胃肠耐受性好。与干预前比较，本发明组合物2干预后可显著提高术后住院患者的血清总蛋白水平(P＜0.001，升高了8.95％±13.44％)及血清白蛋白水平(P＜0.01，升高了7.36％±17.71％)，提示本发明组合物可显著改善患者在特定医学状况下蛋白质缺乏的营养状态。55例患者观察到伤口愈合的时间在干预后第3天，其中28例(50.9％)患者伤口部位有明显组织再生，无红肿渗液；27例(49.1％)患者伤口部位有组织再生，有非脓性渗液，有效率为100％；所有患者在干预第5天伤口愈合情况明显趋好，伤口部位明显组织再生，无红肿或渗出液等异常发生，提示本发明组合物可快速促进组织创伤修复，伤口愈合时间缩短。干预后患者较干预前体重增加4.1％，但无统计学意义，提示本发明组合物可显著抑制特殊医学状况下的体重丢失，持续维持体重。以上数据提示，本发明组合物应用于老年消化道肿瘤切除术后患者的胃肠耐受性好、可明显改善低蛋白血症所致的蛋白质营养不良、快速促进伤口愈合并抑制体重丢失，蛋白质的食用安全性与营养充足性较好。
实施例8本发明组合物促进伤口愈合的作用机制
选取2dpf转基因血管荧光斑马鱼，在斑马鱼的躯干(脊索与泄殖孔十字交叉处)注射冰醋酸建立斑马鱼伤口愈合模型，挑选伤口损伤程度一致的斑马鱼，水浴饲喂本发明组合物2(浓度67、200和600μg/mL)设置模型对照组、正常对照组(均用养鱼用水处理斑马鱼)，每组(孔)均处理30尾斑马鱼，每组(孔)容量为3mL。供试品处理的同时，每组(孔)水溶给予0.2‰的亚甲基蓝以抑制真菌的生长。将六孔板置于28℃培养箱中培养，处理2天后，每组随机选取14尾斑马鱼在荧光显微镜下采集图片，以伤口部位的不透光度总和以及新生血管的发生率的统计学意义评价本发明组合物对伤口愈合的促进作用。
表16本发明组合物对斑马鱼伤口愈合的促进作用(n＝14)
注：与模型对照组比较：***p<0.001
如表16所示，与正常对照组比较，模型对照组斑马鱼伤口部位的不透光度明显增加，提示模型组斑马鱼出现了明显的血管损伤；2天后，模型对照组出现50％新生血管，表明斑马鱼组织受损模型建立成功。与模型组比较，本发明组合物2(200μg/mL)组斑马鱼伤口部位不透光度总和(像素)明显下降，对伤口部位抑制色素募集作用为11％(见附图1)，伤口部位的新生血管发生率为71％(见附图2)，表明本发明组合物2可通过快速促进伤口部位新生血管生成，而对斑马鱼伤口愈合具有促进作用。
上述实施例作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (3)

1.一种酪蛋白、乳清蛋白和大豆蛋白的营养组合物作为用于制备老年消化道肿瘤切除术后患者快速促进伤口愈合、持续抑制体重丢失的产品的用途，其特征在于，所述组合物含有酪蛋白48重量份、乳清蛋白28重量份、大豆蛋白24重量份，蛋白质含量(以湿基计)不低于83.0％；所述酪蛋白选自胶束酪蛋白或酪蛋白酸盐(如酪蛋白酸钾、酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙、酪蛋白酸镁)及其任意混合物，蛋白质含量(以湿基计)不得低于83.5％；所述乳清蛋白选自浓缩乳清蛋白、分离乳清蛋白及其任意混合物，蛋白质含量(以湿基计)不得低于75.0％；所述大豆蛋白选自大豆分离蛋白，蛋白质含量(以湿基计)不得低于85.0％。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物胃肠耐受性良好，通过快速促进创伤组织再生、持续增强肌肉蛋白合成的作用，达到加快老年消化道肿瘤切除术后患者伤口愈合并减缓体重减轻的营养治疗作用。
3.根据权利要求1～2任一项所述的用途，其中所述产品为用于老年消化道肿瘤切除术后患者快速促进伤口愈合并持续抑制体重丢失的特殊医学用途配方食品、保健食品或肠内营养功能食品，其特征在于将权利要求1所述的组合物，与辅料混合，制成口服制剂，它可以是粉剂、颗粒剂、混悬乳液中的任意一种。
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