CN101935335A - 一类克洛皂苷及其制法与抗高致病h5n1流感病毒的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类克洛皂苷及其制法与抗高致病H5N1流感病毒的应用。本发明以天然产物薯蓣苷元为原料，通过结构修饰首先在C-6位引入羟基，得到克洛皂苷元，然后在C-3位引入糖基，得到系列克洛皂苷，最后在C-6羟基引入不同酰基得到系列化合物。药理实验表明，它们对H5N1高致病流感病毒的侵入宿主细胞过程有明显的抑制作用，可以用作预防或治疗抗流感病毒的药物。本发明还涉及本发明化合物与其它抗病毒药的联合用药以及包含它们的药物组合物。

Description

一类克洛皂苷及其制法与抗高致病H5N1流感病毒的应用

技术领域

本发明涉及一类新的克洛皂苷，制备这类克洛皂苷的方法，含有这类克洛皂苷的药物组合物，以及这类克洛皂苷在制备抗流感病毒药物，尤其是抗高致病H5N1流感病毒的药物中的应用；属于化学药物技术领域。

背景技术

甲型流感病毒属于正粘病毒科，基因组由8个单链节段式的负链RNA组成，编码至少10种蛋白：血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)、聚合酶(Polymerase basic protein 1，PB1；Polymerase basic protein 1，PB2；Polymerase acidic protein，PA)、核蛋白(Nucleoprotein，NP)、基质蛋白(Matrix protein 1，M1；Matrixprotein 2，M2)、非结构蛋白(Non-structural protein1，NS1；Non-structuralprotein 2，NS2)。野生水禽是甲型流感病毒的原生宿主，当经过变异，甲型流感病毒会感染其它物种(包括人类)。H5N1高致病流感病毒即是如此，1997年在中国香港首次证实了H5N1高致病流感病毒感染人类的病例，说明该病毒已具备以人为宿主的跨种属传播的能力。WHO的数据显示，截止至2008年2月22日，全世界共有368人感染H5N1高致病流感病毒，其中的234人死亡(死亡率63.6％)(http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2008_02_26/en/index.html，2008.)，并且传播速度和范围未见下降趋势。

目前，临床上针对甲型流感病毒的药物主要有两个靶点：M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂。前者包括有Amantadine和Rimantadine，后者包括Oseltamivir和Zanamivir等(J.Clin.Virol.30，(2004)：115-133)。但由于流感病毒的高变异性，目前已经对所有M2离子通道抑制剂产生耐药性(自2007年起，美国FDA已经禁止这类药物用作流感治疗药物)；因而神经氨酸酶抑制剂几乎是唯一一类临床用药，但自2006年起，在泰国和越南出现了对该类药物耐药的H5N1高致病流感病毒株(Nippon Rinsho.64，(2006)：1845-1852；Antiviral Res.73(2007)：228-231)。同时，还是由于流感病毒的高变异性，目前尚无一劳永逸的针对流感病毒的疫苗。

血凝素蛋白(HA)是流感病毒表面的糖蛋白，其主要功能是与宿主细胞表面的受体(唾液酸)相互识别、结合，并介导病毒进入宿主细胞，即病毒感染的第一步。因此，若能在这个环节上阻断流感病毒的入侵，则可以有效地进行预防和治疗。

甾体皂苷在自然界中分布广泛，主要集中在单子叶植物的百合科(Liliaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)和龙舌兰科(Agavaceae)等植物中；在双子叶植物的豆科(Fabaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、蒺藜科(Zygophyllaceae)、苦木科(Simaroubiaeae)和茄科(Solanaceae)的少数植物中也有分布。自上世纪七十年代以来，在海洋动物中也发现了许多甾体皂苷迹。甾体皂苷具有广泛的药理活性，主要有抗真菌、抗细菌、抗病毒、细胞毒性、抗肿瘤、心血管活性、抗炎、护肝、抑制血小板凝聚等药理活性，是一类颇有前景的药物。一些研究结果表明皂苷中的糖链与其生物活性有着密切的关系，因而皂苷研究日益引起国内外学者的极大兴趣。

薯蓣皂苷Dioscin(diosgenin 3-O- -chacotrioside)是最具代表性的螺旋甾烷类皂苷，它广泛存在于蔬菜和传统药用植物中，对肿瘤细胞具有抑制作用，而且该活性与3-O-糖链结构密切相关。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一类新的克洛皂苷化合物；

本发明要解决的另一个技术问题是提供这类克洛皂苷化合物的制备方法；

本发明要解决的又一个技术问题是提供含有这类克洛皂苷化合物的药物组合物；

本发明要解决的再一个技术问题是提供这类克洛皂苷化合物在制备抗流感病毒药物，尤其是抗高致病H5N1流感病毒药物中的应用。

具体而言，为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明涉及的克洛皂苷化合物如通式(I)所示

其中，R1、R2独立的选自氢、葡萄糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基、半乳糖基、木糖基、核糖基、甘露糖基、2-氨基葡萄糖基、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、山梨糖基、阿洛糖基、阿洛酮糖基，或由这些单糖2-3个组成的直链或支链寡糖基；

R3选自H、C1-C18直链或支链的烷酰基。

C_1-18直链或支链的烷基选自甲烷酰、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丙酰基、异丁酰基、叔丁烷酰基、仲丁烷酰基、戊烷基、己烷酰基、庚烷酰基、辛烷酰基、壬烷酰基、葵烷酰基、十一烷酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、十七烷酰基、十八烷酰基。

优选的R1、R2独立的选自葡萄糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基、半乳糖基、木糖基、核糖基、甘露糖基、山梨糖基、阿洛糖基、阿洛酮糖基；

R3选自H、C1-C8直链或支链的烷酰基。

更优选的R1、R2独立的选自葡萄糖基、鼠李糖基；

R3选自H、C1-C4直链或支链的烷酰基。

更优选(I)化合物，包括但不限定于(IA)所示的化合物

其中，R1、R2独立的选自氢、葡萄糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基、半乳糖基、木糖基、核糖基、甘露糖基、2-氨基葡萄糖基、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、山梨糖基、阿洛糖基、阿洛酮糖基，或由这些单糖2-3个组成的直链或支链寡糖基；

R3选自C1-C18直链或支链的烷酰基。

更优选(I)化合物，包括但不限定于(IB)所示的化合物

其中，R1、R2独立的选自氢、葡萄糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基、半乳糖基、木糖基、核糖基、甘露糖基、2-氨基葡萄糖基、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、山梨糖基、阿洛糖基、阿洛酮糖基，或由这些单糖2-3个组成的直链或支链寡糖基；

本发明还提供了制备通式(I)所示化合物的方法，包括如下步骤：将薯蓣苷元的5，6-双键转化为6-OH，即得克洛皂苷元，在其C3-OH引入马铃薯三糖(-Chacotriose)、将6-OH酰化即得到系列克洛皂苷。

P₀，P₁，P₂，P₃为保护基

(1)对薯蓣苷元的3β-OH进行保护制备3β-O-保护基薯蓣苷元；

优选的保护基选自苄基保护基；

优选溶剂选自THF，DMF，优选是THF；

优选在碱性条件下进行，优选的碱是NaH；

反应优选在催化剂存在的条件下进行，优选的催化剂选自四丁基碘化铵；

反应的温度-10-90℃，优选是0-30℃，更优选是在室温下进行；

反应的时间1-24小时；反应的时间1.5-10小时；反应的时间2-4小时；

反应产物可以通过重结晶或硅胶柱纯化，优选进行重结晶纯化，所述重结晶纯化中的溶剂优选为三氯甲烷、C₁-C₄的烷基醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚、环己烷、二氯甲烷、水中一种或多种的混合物。优选是氯仿和甲醇。

(2)在3β-O-保护基薯蓣苷元的C-6位引入羟基制备3β-O-苄基克洛苷元

先将3β-O-苄基薯蓣苷元、NaBH₄、BF₃·Et₂O进行反应，

再破坏过量硼烷至无气体生成，

最后加入NaOH和H₂O₂；NaOH和H₂O₂的优选浓度是20-40％；NaOH和H₂O₂的优选体积比是1∶1。

反应产物可以通过重结晶或硅胶柱纯化，优选使用硅胶柱纯化，所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；优选的洗脱剂是是使用EtOAc-石油醚的混合溶剂，EtOAc-石油醚混合溶剂的优选体积比为1∶6。

(3)3β-O-保护基克洛苷元的6-羟基上引入保护基。

优选的保护基选自叔丁基二甲基氯硅烷；

反应优选在咪唑和DMAP存在的条件下进行，

反应产物可以通过重结晶或硅胶柱纯化，优选使用硅胶柱纯化，所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；优选的洗脱剂是是使用EtOAc-己烷的混合溶剂，EtOAc-己烷混合溶剂的优选体积比为1∶20。

(4)脱去3β-O-保护基-6α-O-保护基克洛苷元的3位羟基上的保护基脱除苷元上的苄基保护基使用Pd-C和H₂；

脱保护基反应的溶剂选自四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一种或多种的混合物；优选的有机溶剂是CH₂Cl₂-MeOH(1∶1)

反应在有机胺存在的条件下进行。

反应的时间是8-30小时，优选是10-24小时，更优选是12-20小时。

反应完成后经硅胶柱纯化。

(5)在克洛苷元的C-3引入β--葡萄糖基；

优选的糖基供体含有保护基，优选是酰基保护基，优选的酰基保护基选自乙酰基、苯甲酰基、叔戊酰基；最优选是苯甲酰基。

葡萄糖C-1活化基团选自三氯乙酰亚胺酯、乙硫苷、苯硫苷或对-甲苯硫苷；最优选的活化基团是三氯乙酰亚胺酯。

糖苷化反应优选在路易斯酸催化剂存在的条件下进行，优选的路易斯酸催化剂选自C₃-C₉的卤代酰胺、C₁-C₆的氟代烃基磺酸、C₂-C₈的硅基氟代烃基磺酸酯、C₁-C₆的氟代烃基磺酸银、三氟化硼-乙醚络合物或三氟化硼-乙醚混合物；更优选的是三氟甲基磺酸三甲基硅酯(trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate，TMSOTf)；

所述糖苷化反应中的有机溶剂优选为C₁-C₄的氯代烷烃、甲苯或乙醚；优选的有机溶剂是CH₃Cl、CH₂Cl₂；更优选的是CH₂Cl₂；

所述淬灭剂优选为有机胺或硫代硫酸钠；优选的有机胺是三甲胺、三乙胺；更有选的淬灭剂选自三乙胺。

所述的分子筛优选为3-5

型硅铝酸盐分子筛；更优选为4

型硅铝酸盐分子筛；

反应产物可以通过重结晶或硅胶柱纯化，优选使用硅胶柱纯化，所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；优选的洗脱剂是是使用EtOAc-石油醚的混合溶剂，EtOAc-石油醚混合溶剂的优选体积比为1∶8。

(6)脱除克洛苷元-葡萄糖苷上的酰基保护基；

脱除葡萄糖上的酰基保护基，优选使用碱，优选的碱是CH₃ONa；优选在CH₃ONa/CH₃OH存在的条件下进行。

脱保护基反应中极性溶剂优选为四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一种或多种的混合物；优选的溶剂是CH₃OH-CHCl₃(1∶1，60ml)，

反应的温度是10-40℃，优选是20-30℃，更优选是在室温下进行；

反应的时间1-4小时；反应的时间1.5-2.5小时；反应的时间2小时；

反应完成后用酸将反应液中和到中性，优选使用阳离子树脂(H⁺)中和反应液至中性

产物可以重结晶或经过经硅胶柱纯化；硅胶柱纯化的洗脱剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；更优选的洗脱剂选自体积比20∶1→8∶1的CHCl₃-MeOH梯度洗脱剂。

(7)选择性的保护克洛苷元葡萄糖上3，6-OHs；

优选利用位阻试剂1-(苯甲酰基)苯并三唑(BBTZ)选择性的保护葡萄糖上3，6-OHs得到3-β-O-(3，6-二-O-β-D-苯甲酰基葡萄糖)熊果酸酯；

有机溶剂优选为C₁-C₄的氯代烷烃、甲苯或乙醚；优选的有机溶剂是CH₃Cl、CH₂Cl₂；最优选的溶剂是CH₂Cl₂；；

反应优选在有机胺存在的条件下进行；优选的有机胺是三甲胺、三乙胺；

反应的温度反应的温度是10℃-40℃；优选20-30℃；更优选是室温；

反应的时间5-20小时；优选是10-14小时；更优选的时间是12小时；

所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；更优选的洗脱剂是乙酸乙酯-石油醚-三氯甲烷的混合溶剂，EtOAc-petroleumether-CHCl₃的优选的体积比为1∶8∶2。

(8)分别或同时在步骤(7)所得的克洛苷元的吡喃葡萄糖的2，4-OHs引入糖基；

优选的糖基上带有保护基，优选的保护基是酰基保护基，优选的酰基保护基选自乙酰基、苯甲酰基、叔戊酰基；糖基上最优选的保护基是乙酰基；

葡萄糖C-1活化基团选自三氯乙酰亚胺酯、乙硫苷、苯硫苷或对-甲苯硫苷；最优选的活化基团是三氯乙酰亚胺酯。

糖苷化反应优选在路易斯酸催化剂存在的条件下进行，优选的路易斯酸催化剂选自C₃-C₉的卤代酰胺、C₁-C₆的氟代烃基磺酸、C₂-C₈的硅基氟代烃基磺酸酯、C₁-C₆的氟代烃基磺酸银、三氟化硼-乙醚络合物或三氟化硼-乙醚混合物；更优选的是三氟甲基磺酸三甲基硅酯(trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate，TMSOTf)；

所述糖苷化反应中的有机溶剂优选为C₁-C₄的氯代烷烃、甲苯或乙醚；优选的有机溶剂是CH₃Cl、CH₂Cl₂；最优选的溶剂是CH₂Cl₂；

在-40℃--20℃反应0.5h，再在-5℃-5℃反应1h；优选在-30℃反应0.5h，再在0℃反应1h。

所述淬灭剂优选为有机胺或硫代硫酸钠；优选的有机胺是三甲胺、三乙胺；更有选的淬灭剂选自三乙胺。

所述的分子筛优选为3

-5型硅铝酸盐分子筛；更优选为4

型硅铝酸盐分子筛；优选的分子筛为4分子筛；

可以使用重结晶或硅胶柱纯化，优选进行硅胶柱纯化，所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；更优选的洗脱剂是乙酸乙酯-石油醚，优选进行梯度洗脱，梯度洗脱剂为的体积比1∶5→1∶2.5的乙酸乙酯-石油醚。

(9)脱除新引入的糖基上的保护基；

脱酰基保护基反应优选在极性溶剂中进行，优选的溶剂选自四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一种或多种的混合物；优选的溶剂选自CH₃OH-CHCl₃；优选的CH₃OH-CHCl₃混合溶剂的体积比1∶1。

脱去保护基优选在碱性条件下进行，优选的碱选自NaOMe。

反应温度是10-40℃；优选的反应温度是20-30℃；更优选的反应温度是室温。

反应的时间是8-16小时；优选的反应时间是10-14小时；更优选的反应时间是12小时。

使用酸中和反应液；最优选是的使用阳离子树脂。

可以使用重结晶或硅胶柱纯化，优选进行硅胶柱纯化，所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；优选的体积洗脱剂是CHCl₃-MeOH；优选进行梯度洗脱，梯度洗脱剂的为体积比10∶1→3∶1的CHCl₃-MeOH。

(10)将糖基上的所有羟基进行保护；

优选使用苄基进行保护；

反应的优选在碱存在的条件下进行，优选的碱选自NaH；

反应的优选在催化剂存在的条件下进行，优选的催化剂选自四丁基碘化铵；

溶剂选自四氢呋喃，N，N-二甲基甲酰胺。

反应完成后优选经硅胶柱纯化；洗脱剂是选自石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；优选的洗脱剂选自乙酸乙酯-石油醚；优选的乙酸乙酯-石油醚体积比为1∶15→1∶10。

(11)脱除克洛苷元6α-羟基上的保护基；

优选在TBAF存在的条件下进行；

溶剂选自四氢呋喃，N，N-二甲基甲酰胺；

反应的温度在10℃～40℃之间，优选的温度是20℃～30℃，更优选的温度是室温。

反应的时间是8-30小时，优选是10-24小时，更优选是12-20小时。

反应完成后优选经硅胶柱纯化；洗脱剂是选自石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；优选的洗脱剂选自乙酸乙酯-石油醚；优选的乙酸乙酯-石油醚体积比为1∶8→1∶5。

(12)脱除糖基上的所有保护基；

脱除苷元上的苄基保护基使用Pd-C和H₂；

脱保护基反应的溶剂选自四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一种或多种的混合物；优选的有机溶剂是CH₂Cl₂-MeOH(1∶1)

反应在有机胺存在的条件下进行。

反应的时间是8-30小时，优选是10-24小时，更优选是12-20小时。

反应完成后经硅胶柱纯化。

(13)将步骤(11)获得的化合物的6α-羟基进行酯化反应；

酯化反应优选在偶合剂和/或催化剂存在的条件下进行。优选的缩合试剂是包括1，3二环己基碳二亚胺(DCC)、二吡啶碳酸酯(2-DPC)、1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳酰亚胺盐酸盐(EDCI)、1，3-二异丙基碳酰亚胺(DIPC)、4-吡咯烷基吡啶。更优选的缩合剂是1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳酰亚胺盐酸盐(EDCI)。

优选的催化剂是三级胺。优选的三级胺选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)，4-吡咯烷基吡啶。更优选的三级胺选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)。

反应的温度在0℃～120℃之间，优选的温度是20℃～30℃，更优选的温度是室温。

反应在适宜的溶剂下进行，优选的溶剂是无水的非质子性溶剂，更优选的是卤代烷、四氢呋喃(THF)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等。最优选的是二氯甲烷，DMF。

(14)将步骤(13)获得的化合物的糖基上的所有保护基脱除。

脱除苷元上的苄基保护基使用Pd-C和H₂；

脱保护基反应的溶剂选自四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一种或多种的混合物；优选的有机溶剂是CH₂Cl₂-MeOH(1∶1)

反应在有机胺存在的条件下进行。

反应的时间是8-30小时，优选是10-24小时，更优选是12-20小时。

反应完成后经硅胶柱纯化。

反应产物可以通过重结晶或硅胶柱纯化，优选使用硅胶柱纯化，硅胶柱纯化时使用的洗脱剂是优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物。

本发明即针对此环节，发现克洛皂苷有抑制H5N1高致病流感病毒的感染宿主细胞的作用。

反应的产物还可以使用重结晶纯化，所述重结晶纯化中的溶剂优选为三氯甲烷、C₁-C₄的烷基醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚、环己烷、二氯甲烷、水中一种或多种的混合物。

本发明再一方面还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

本发明的发明人发现克洛皂苷衍生物能特异性的抑制H5N1高致病流感病毒侵入宿主细胞。

克洛皂苷衍生物还可以和其他的抗病毒药物进行联合用药，其他的抗病毒药物包括但不限定于，M2离子通道抑制剂、神经氨酸酶抑制剂。优选的M2离子通道抑制剂选自Amantadine或Rimantadine，优选的神经氨酸酶抑制剂选自Oseltamivir或Zanamivir。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

具体实施方式

下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1.3β-O-苄基薯蓣苷元：

于THF(70mL)中加入diosgenin(10.5g，25.3mmol)，室温下搅拌溶解后，冰浴下加入NaH(60％，2.75g，68.7mmol)。0.5h后依次加入Bu₄N⁺I^-(催化量)和BnBr(5mL，41.7mmol)。室温下反应1.5h后，加热回流至反应完全。旋蒸除去溶剂和多余BnBr，加入Et₂O(400mL)溶解。依次用水、5％盐酸(80mL×3)、饱和碳酸氢钠水溶液(80mL×2)和饱和氯化钠水溶液(80mL)洗涤，无水硫酸钠干燥、浓缩，所得油状物用氯仿-甲醇重结晶得白色固体(12.1g，94.4％)；R_f0.56(1∶5EtOAc-etroleum ether)；[α]_D ²⁰ -97.4(c 0.9，CHCl₃)，lit.-94.4(c 0.9，CHCl₃)；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.37-7.36(m，5H，Ar-H)，5.34(d，1H，J＝5.5Hz，H-6)，4.56(d，2H，J＝4.0Hz，CHPh)，4.41(q，1H，J＝7.3Hz，H-16)，3.46(ddd，1H，J＝1.7，4.0，11.0Hz，H-26)，3.38(t，1H，J＝10.6Hz，H-26)，3.29-3.26(m，1H，H-3)，2.42(ddd，1H，J＝2.6，4.7，13.2Hz)，2.30-2.26(m，1H)，1.03(s，3H)，0.97(d，3H，J＝7.0Hz)，0.79-0.78(m，6H)。

实施例2.3β-O-苄基克洛苷元：

在500mL三口瓶中加入3β-O-苄基薯蓣苷元(11.0g，21.8mmol)、NaBH₄(4.14g，109.0mmol)和THF(100mL)，冰盐浴下搅拌30min后缓慢滴加BF₃·Et₂O(3.10mL，24.0mmol)，0℃反应1h后缓慢升至室温，反应过夜。冰浴下用水小心破坏过量硼烷至无气体生成，加入NaOH(30％)-H₂O₂(30％)(1∶1，300mL)，室温下反应过夜。将反应液用浓盐酸中和至pH中性，用Et₂O反复萃取反应相。合并Et₂O层，依次用FeSO₄水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱纯化(1∶6 EtOAc-petroleum ether)得白色固体(8.12g，71.3％)；R_f0.26(1∶3 EtOAc-petroleum ether)；[α]_D ²⁰ -51.9(c 0.80，CHCl₃)；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.35-7.26(m，5H，Ar-H)，4.61(d，1H，J＝11.7Hz，CHPh)，4.55(d，1H，J＝11.7Hz，CH′Ph)，4.40(q，1H，J＝7.3Hz，H-16)，3.48-3.30(m，4H，H-26×2，H-6，H-3)，2.37-2.34(m，1H)，0.96(d，3H，J＝7.0Hz)，0.84(s，3H)，0.79(d，3H，J＝6.2Hz)，0.76(s，3H)；ESIMS(m/z)：523.231[M+H]⁺(calcd 523.379).

实施例3.3β-O-苄基-6α-O-叔丁基二甲基硅基克洛苷元：

将实施例2所得化合物(3.39g)、咪唑(1.19g，17.5mmol)和DMAP(催化量)溶于CH₂Cl₂(120mL)中，缓慢滴加叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl，1.32g，8.74mmol)。反应液室温过夜后，蒸除溶剂，经硅胶柱纯化(1∶20 EtOAc-hexane)得浅黄色固体(3.91g，94.5％)，R_f0.35(1∶20 EtOAc-petroleum ether)；[α]_D ²⁰ -33.6(c 0.4，CHCl₃)；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.34-7.26(m，5H，Ar-H)，4.59(d，1H，J＝11.9Hz，CHPh)，4.53(d，1H，J＝11.9Hz，CH′Ph)，4.40(q，1H，J＝7.3Hz，H-16)，3.48-3.25(m，4H，H-26×2，H-6，H-3)，2.38-2.36(m，1H)，0.96(d，3H，J＝6.8Hz)，0.89(s，9H)，0.83(s，3H)，0.79(d，3H，J＝6.4Hz)，0.76(s，3H)，0.05(s，3H)，0.02(s，3H)；ESIMS(m/z)：637.287[M+H]⁺(calcd 637.465).

实施例4.6α-O-叔丁基二甲基硅基克洛苷元：

将实施例3所得化合物(4.07g，6.39mmol)溶于CH₂Cl₂-EtOH(1∶3，32mL)中，加入2滴三乙胺，氩气保护下加入适量Pd-C(10％)，氢气氛围下室温反应过夜。滤除Pd-C(硅藻土助滤)，蒸除溶剂，CHCl₃-MeOH重结晶得浅黄色固体(3.16g，90.4％)；R_f 0.4(1∶3EtOAc-petroleum ether)；[α]_D ²⁰-24.5(c 0.2，CHCl₃)；¹H NMR(CDCl₃)：δ4.40(q，1H，J＝7.4Hz，H-16)，3.58-3.53(m，1H，H-3)，3.47(ddd，1H，J＝2.3，4.1，10.5Hz，H-26)，3.40-3.34(m，2H，H-6，H-26)，1.59(s，6H，-CH₃×2)，0.96(d，3H，J＝6.9Hz)，0.88(s，9H，-CH₃×3)，0.82(s，3H)，0.79(d，3H，J＝6.4Hz)，0.76(s，3H)，0.03(s，3H)，0.02(s，3H)；ESIMS(m/z)：547.270[M+H]⁺(calcd 547.418).

实施例5.6α-O-叔丁基二甲基硅基-克洛苷元-3β-O-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷：

将实施例4所得化合物(2.64g，5.0mmol)、2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-葡萄糖三氯亚胺酯(4.87g，6.6mmol)、4

分子筛和CH₂Cl₂(100mL)混合，0℃下搅拌0.5h后加入TMSOTf(142μL，0.82mmol)。0℃反应0.5h后，室温继续反应0.5h，用Et₃N终止反应。滤除分子筛，滤液浓缩后经硅胶柱纯化(1∶8 EtOAc-petroleum ether)得化合物浅黄色固体(5.40g，99.4％)；R_f 0.32(1∶4 EtOAc-petroleum ether)；[α]_D ²⁰ -3.2(c 0.5，CHCl₃)；¹H NMR(CDCl₃)：δ8.03-7.26(m，20H，Ar-H)，5.88(t，1H，J＝9.6，H-3′)，5.62(t，1H，J＝10.1Hz)，5.51(dd，1H，J＝8.2，10.1Hz)，4.92(d，1H，J＝7.8Hz，H-1′)，4.58(dd，1H，J＝3.7，12.4Hz，H-6′)，4.53(dd，1H，J＝5.9，12.4Hz，H-6′)，4.39(q，1H，J＝7.3Hz，H-16)，4.12-4.10(m，1H，H-5′)，3.57-3.52(m，1H)，3.46(ddd，1H，J＝1.9，3.7，12.6Hz)，3.36(t，1H，J＝11.0Hz)，3.28(td，1H，J＝4.6，10.6Hz)，0.96(d，3H，J＝7.3Hz)，0.78(m，12H)，0.74(s，3H)，0.72(s，3H)，-0.10(s，3H)，-0.17(s，3H).

实施例6.6α-O-叔丁基二甲基硅基-克洛苷元-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖苷：

将实施例5所得化合物(5.48g，4.87mmol)溶于CH₃OH-CH₂Cl₂(1∶1，60mL)，加入NaOMe适量。室温搅拌2h后，用阳离子树脂(H⁺)中和反应液至中性，滤除固体颗粒，浓缩后经硅胶柱纯化(15∶1CHCl₃-MeOH→10∶1 CHCl₃-MeOH)得白色固体(3.22g，93.3％)；R_f 0.31(8∶1CHCl₃-MeOH)；[α]_D ²⁰ -38.9(c 0.4，MeOH)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ4.92(d，1H，J＝4.4Hz，-OH)，4.87-4.86(m，2H，-OH×2)，4.44(t，1H，J＝5.9Hz，6′-OH)，4.28(dd，1H，J＝7.3，13.9Hz，H-16)，4.20(d，1H，J＝7.7Hz，H-1′)，3.63(ddd，1H，J＝1.9，5.9，11.7Hz，H-5′)，3.56-3.51(m，1H，H-3)，3.43-3.40(m，3H，H-26×2，H-6)，3.19(t，1H，J＝11.0Hz)，3.07-2.88(m，4H)，0.90(d，3H，J＝9.0Hz)，0.86(s，9H，-CH₃×3)，0.78(s，3H)，0.73(d，3H，J＝6.4Hz)，0.71(s，3H)，0.03(s，3H)，0.02(s，3H)；ESIMS(m/z)：731.252[M+Na]⁺(calcd 731.453).

实施例7.6α-O-叔丁基二甲基硅基-克洛苷元-3β-O-3，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷：

将实施例6所得化合物(3.22g，4.54mmol)和1-(苯甲酰基)苯并三唑(BBTZ，2.73g，11.35mmol)溶于CH₂Cl₂(60mL)中，加入三乙胺(1.70mL，12.26mmol)后室温反应过夜。浓缩后经硅胶柱纯化(1∶8∶2 EtOAc-petroleum ether-CHCl₃)得白色固体(2.92g，70.1％)；R_f0.28(1∶3 EtOAc-petroleum ether)；[α]_D ²⁰ -11.5(c 0.2，CHCl₃)；¹H NMR(CDCl₃)：δ8.10-7.44(m，10H，Ar-H)，5.18(t，1H，J＝9.2，H-3′)，4.69(dd，1H，J＝5.5，12.1Hz，H-6′)，4.62(dd，1H，J＝2.5，12.1Hz，H-6′)，4.54(d，1H，J＝7.7Hz，H-1′)，4.41(dd，1H，J＝7.3，14.6Hz，H-16)，3.75(t，1H，J＝9.5Hz，H-4′)，3.70-3.64(m，3H，H-2′，H-5′，H-6)，3.49-3.46(m，1H，H-26)，3.40-3.35(m，2H，H-26，H-3)，0.97(d，3H，J＝7.0Hz)，0.88(s，9H，-CH₃×3)，0.80(s，3H)，0.79(d，3H，J＝6.4Hz)，0.76(s，3H)，0.03(s，3H)，0.02(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ167.9，166.8，133.5，133.2，130.0，129.9，129.8，129.4，128.4(2C)，109.2，100.9，80.6，78.9，78.7，74.4，72.1，70.1，69.8，66.8，63.8，62.2，55.9，53.7，51.5，42.1，41.6，40.6，39.8，37.2，36.5，33.9，31.8，31.4，30.3，29.2，28.9，28.8，25.9，20.9，18.2，17.1，16.4，14.5，13.5，-4.2，-4.6；ESIMS(m/z)：939.380[M+Na]⁺(calcd 939.506).

实施例8.6α-O-叔丁基二甲基硅基-克洛苷元-3β-O-2，4-二-O-(2，3，4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-3，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷：

将实施例7所得化合物(1.477g，1.61mmol)和4

分子筛加入干燥的CH₂Cl₂(60mL)中，于-40℃搅拌20min后，加入BF₃·Et₂O(250μL，1.93mmol)，5min后，加入2，3，4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖三氯亚胺酯(3.5g，8.05mmol)的CH₂Cl₂(20mL)溶液。-40℃反应15min，室温搅拌20min后，用Et₃N终止反应。滤除分子筛，滤液浓缩后经硅胶柱纯化(1∶5bEtOAc-petroleum ether→1∶2.5 EtOAc-petroleum ether)得化合物1.98g；R_f 0.27(1∶2 EtOAc-petroleum ether)。该化合物的结构可由C-6TBDMS保护基产物A的谱图数据确证：

[α]_D ²⁰ -42.8(c 0.2，CHCl₃)；¹H NMR(CDCl₃)：δ8.07-7.42(m，10H，Ar-H)，5.60(t，1H，J＝8.7Hz，H-3′)，5.33(dd，1H，J＝3.7，10.1Hz，Rha-H-3)，5.16(dd，1H，J＝3.2，10.1Hz，Rha-H-3)，5.12-5.11(m，1H，Rha-H-2)，4.99(dd，1H，J＝1.9，3.7Hz，Rha-H-2)，4.94(t，1H，J＝10.1Hz，Rha-H-4)，4.87(t，1H，J＝10.1Hz，Rha-H-4)，4.86(d，1H，J＝1.8Hz，Rha-H-1)，4.81(dd，1H，J＝2.3，12.4Hz，H-6′)，4.79(d，1H，J＝1.4Hz，Rha-H-1)，4.70(d，1H，J＝7.8Hz，H-1′)，4.51(dd，1H，J＝5.5，12.4Hz，H-6′)，4.46-4.40(m，2H，Rha-H-5，H-16)，4.00(t，1H，J＝9.2Hz，H-4′)，3.86-3.83(m，2H，H-5′，H-2′)，3.74-3.69(m，1H，Rha-H-5)，3.62-3.57(m，1H，H-3)，3.49-3.47(m，1H，H-26)，3.41-3.36(m，2H，H-26，H-6)，2.00，1.97，1.95，1.93，1.92，1.79(s，3H×6，-OAc×6)，1.17(d，3H，J＝6.4Hz，Rha-CH₃)，0.97(d，3H，J＝6.9Hz)，0.79(d，3H，J＝5.9Hz)，0.78(s，3H)，0.75(s，3H)，0.68(d，3H，J＝5.9Hz，Rha-CH₃)；ESIMS(m/z)：1369.414[M+Na]⁺(calcd 1369.598).

实施例9.6α-O-叔丁基二甲基硅基-克洛苷元-3β-O-2，4-二-O-(α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷：

将实施例8所得的样品(1.66g)溶于CH₃OH-CH₂Cl₂(1∶1，50mL)，加入NaOMe适量。室温搅拌36h后，用阳离子树脂(H⁺)中和反应液至中性，滤除固体颗粒，浓缩后经硅胶柱纯化(10∶1 CHCl₃-MeOH→3∶1CHCl₃-MeOH)得白色固体(682mg，两步收率50.5％)，R_f 0.16(5∶1CHCl₃-MeOH)；[α]_D ²⁰ -64.8(c 0.2，MeOH)；¹H NMR(CD₃OD)：δ5.18(d，1H，J＝1.4Hz，Rha-H-1)，4.83(d，1H，J＝1.5Hz，Rha-H-1)，4.49(d，1H，J＝7.7Hz，H-1′)，4.39(dd，1H，J＝7.3，14.3Hz)，4.15-4.11(m，1H)，3.94-3.89(m，2H)，3.83(dd，1H，J＝1.5，2.9Hz)，3.79(dd，1H，J＝1.9，12.1Hz)，3.74-3.61(m，4H)，3.55-3.31(m，8H)，3.20-3.17(m，1H)，1.25(d，3H，J＝6.2Hz)，1.22(d，3H，J＝6.2Hz)，0.95(d，3H，J＝7.3Hz)，0.91(s，9H，-CH₃×3)，0.86(s，3H)，0.79-0.78(m，6H)，0.10(s，3H)，0.07(s，3H)；¹³C NMR(CD₃OD)：δ110.5，103.0，102.4，98.9，82.1，79.9，79.0，78.2，77.0，76.9，73.6，73.7，72.4，72.2，71.6，70.7，69.8，67.9，63.8，61.9，57.3，55.3，52.9，43.5，42.9，41.0，38.7，37.8，35.2，32.6，32.4，31.4，30.3，29.9，29.2，26.5，22.1，19.1，18.0，17.9，17.5，16.9，14.9，13.9；ESIMS(m/z)：1023.434[M+Na]⁺(calcd 1023.569).

实施例10.6α-O-叔丁基二甲基硅基-克洛苷元-3β-O-[2，4-二-O-(2，3，4三-O-苄基-α-L-鼠李糖基)-3，6-二-O-苄基-β-D-葡萄吡喃糖苷]：

于DMF(10mL)中加入实施例9所得化合物(460mg，0.46mmol)，冰浴搅拌30min后加入NaH(60％，250mg，6.25mmol)，0℃反应30min.氩气保护下加入四丁基碘化铵(催化量)后，缓慢加入苄溴(0.70mL，5.9mmol)，0℃反应1h后，室温下反应过夜。将反应液用乙酸乙酯(400mL)稀释，依次用水、5％盐酸(1mol/L，30mL×3)、饱和碳酸氢钠(30mL×2)、饱和氯化钠(30mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，经硅胶柱纯化(1∶15 EtOAc-petroleum ether→1∶10EtOAc-petroleum ether)得浅黄色泡沫状固体(595mg，75.8％)；R_f 0.31(1∶5 EtOAc-petroleum ether)；[α]_D ²⁰ -32.8(c 0.2，CHCl₃)；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.33-7.03(m，40H，Ar-H)，5.20(d，1H，J＝1.4Hz，Rha-H-1)，5.00(d，1H，J＝1.5Hz，Rha-H-1)，4.92(d，1H，J＝11.0Hz，-CH-Ph)，4.82(dd，2H，J＝2.6，11.3Hz)，4.75(d，1H，J＝11.0Hz)，4.62-4.39(m，12H)，4.28-4.23(m，1H)，4.16(d，1H，J＝12.5Hz)，4.11(d，1H，J＝12.5Hz)，3.81-3.64(m，8H)，3.56-3.41(m，6H)，3.37(t，1H，J＝11.0Hz)，3.27(td，1H，J＝4.4，10.3Hz)，3.23-3.20(m，1H)，1.29(d，3H，J＝6.2Hz)，0.97(d，3H，J＝7.0Hz)，0.93(d，3H，J＝6.5Hz)，0.87(s，9H)，0.79(d，3H，J＝6.6Hz)，0.77(s，3H)，0.61(s，3H)，0.02(s，3H)，-0.02(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ139.2，138.8，138.6，138.5，138.3，138.1，128.3-127.2，127.1，126.2，109.2，98.5，98.3，97.8，84.1，80.6，80.5，80.4，79.5，77.4，75.7，75.3，75.0，74.9，73.9，73.4，72.5，72.0，71.9，70.3，68.7，67.9，66.8，62.2，55.9，53.6，51.3，42.1，41.7，40.6，39.8，37.4，36.5，33.8，31.8，31.4，30.3，29.5，28.8，28.7，27.5，26.0，20.8，18.2，17.9，17.8，17.1，16.4，14.5，13.1，-4.2，-4.3；ESIMS(m/z)：1759.652[M+K]⁺(calcd 1759.918).

实施例11.克洛苷元-3β-O-[2，4-二-O-(2，3，4-三-O-苄基-α-L-鼠李吡喃糖基)-3，6-二-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷]：

氩气保护下将实施例10所得化合物(840mg，0.487mmol)，TBAF(1.0mol/L in THF，5.5mL)溶于THF(5mL)中，室温下搅拌过夜，浓缩后经硅胶柱纯化(1∶8 EtOAc-petroleum ether→1∶5 EtOAc-petroleum ether)得浅黄色固体(792mg，quant.)；R_f 0.38(1∶3 EtOAc-petroleum ether)；[α]_D ²⁰ -34.2(c 0.2，CHCl₃)；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.33-7.03(m，40H，Ar-H)，5.25(d，1H，J＝1.5Hz，Rha-H-1)，4.97(d，1H，J＝1.5Hz，Rha-H-1)，4.89(d，1H，J＝10.6Hz，-CHPh)，4.81(dd，2H，J＝4.7，11.3Hz)，4.68(d，1H，J＝12.1Hz)，4.62-4.48(m，10H)，4.42-4.31(m，3H)，4.19(d，1H，J＝12.4Hz)，4.12(d，1H，J＝12.1Hz)，3.81(dd，1H，J＝2.9，9.2Hz)，3.78-3.70(m，5H)，3.63-3.43(m，8H)，3.38(t，1H，J＝11.0Hz)，3.31-3.29(m，1H)，2.99-2.94(m，1H)，1.30(d，3H，J＝6.2Hz)，0.97(d，3H，J＝7.0Hz)，0.92(d，3H，J＝5.8Hz)，0.80(d，3H，J＝6.6Hz)，0.77(s，3H)，0.58(s，3H)；¹³CNMR(CDCl₃)：δ138.8，138.6，138.4，138.3，138.1，137.9，128.5，127.1，126.2，109.2，100.3，98.5，97.7，84.2，80.7，80.6，80.5，80.1，79.5，78.6，75.5，75.3，75.2，74.8，73.7，73.5，74.5，72.1，72.0，71.9，69.0，68.7，67.6，66.9，62.1，55.9，53.6，51.3，41.6，41.3，40.5，39.8，37.1，36.3，33.8，31.8，31.4，30.3，29.1，28.8，28.6，20.8，17.8，17.1，16.4，14.5，13.1；ESIMS(m/z)：1629.877[M+Na]⁺(calcd 1629.858).

实施例12.克洛苷元3β-O-(2，4-二-O-α-L-鼠李吡喃糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷：

将实施例11所得化合物溶于CH₂Cl₂-MeOH(1∶1)中，加入10％Pd-C，H₂氛围下反应过夜。滤除不溶物，滤液蒸干后经硅胶柱纯化。R_f 0.35(5∶2 CHCl₃-MeOH)；yield 60.0％；[α]_D ²⁰ -69.3(c 0.2，MeOH)；¹H NMR(CD₃OD)：δ5.18(d，1H，J＝1.4Hz，Rha-H-1)，4.83(d，1H，J＝1.4Hz，Rha-H-1)，4.52(d，1H，J＝8.2Hz，H-1′)，4.38(q，1H，J＝7.3Hz，H-16)，4.17-4.12(m，1H)，3.93-3.91(m，2H)，3.82(dd，1H，J＝1.8，3.2Hz)，3.78(dd，1H，J＝1.9，12.4Hz)，3.67-3.60(m，4H)，3.57(t，1H，J＝9.1Hz)，3.52(t，1H，J＝9.1Hz)，3.45-3.28(m，7H)，2.38-2.28(m，2H)，1.25(d，3H，J＝6.4Hz)，1.23(d，3H，J＝6.4Hz)，0.95(d，3H，J＝6.9Hz)，0.85(s，3H)，0.79-0.78(m，6H)；¹³C NMR(CD³OD)：δ110.5，103.0，102.3，100.2，82.1，80.0，79.4，78.6，78.1，76.6，74.0，73.7，72.5，72.3，72.2(2C)，70.6，69.9，69.7，67.8，63.8，61.9，57.3，55.3，52.8，42.9，42.7，41.7，41.0，38.7，37.6，35.2，32.7，32.4，31.4，30.4，29.9，29.3，22.1，18.0，17.9，17.5，16.9，14.9，13.8；ESIMS(m/z)：909.626[M+Na]⁺(calcd 909.482).

实施例13.6α-乙酰基-克洛苷元3β-O-[2，4-二-O-(2，3，4-三-O-苄基-α-L-鼠李吡喃糖基)-3，6-二-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷]：

将实施例11所得化合物(0.1mmol)、乙酸(0.5mmol)、DCC(0.7mmol)、DMAP(0.7mmol)溶于CH₂Cl₂(7mL)中，室温反应过夜后滤除不溶物，滤液蒸除溶剂，硅胶柱纯化。R_f 0.27(1∶5EtOAc-petroleum ether)；[α]_D ²⁰ -31.6(c 0.2，CHCl₃)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ7.34-6.98(m，40H，Ar-H)，5.10(s，1H，Rha-H-1)，4.99(s，1H，Rha-H-1)，4.82-4.45(m，16H，-CHPh×14，H-1′，H-16)，4.27(q，1H，J＝6.9Hz，H-16)，4.23-4.18(m，1H，Rha-H-5)，4.11(d，1H，J＝11.9Hz，-CHPh)，3.95(d，1H，J＝11.9Hz，-CHPh)，3.88(s，1H，Rha-H-2)，3.72-3.31(m，15H)，1.99(s，3H)，1.12(d，3H，J＝5.9Hz，Rha-CH₃)，0.90(d，3H，J＝6.4Hz)，0.83(d，3H，J＝5.9Hz，Rha-CH₃)，0.74(d，3H，J＝6.4Hz)，0.70(s，3H)，0.38(s，3H)；¹³C NMR(DMSO-d₆)：δ170.0，138.8，138.7，138.6，138.5，138.4，138.3，138.2，128.2-126.0，108.5，97.6(2C)，97.3，83.3，80.1，79.9，79.7，79.6，78.7，75.9，75.7，75.3，74.8，74.6，74.4，73.7(2C)，73.3，72.3，72.0，71.7，71.3，68.6，67.8，67.2，66.0，61.6，55.1，52.5，47.4，41.1，40.1-39.1(2C)，37.5，36.3，36.1，33.4，33.1，31.3，30.9，29.8，29.0，28.5，27.3，25.3，24.5，22.1，21.1，20.3，17.8，17.7，16.0，14.6，12.3；ESIMS(m/z)：1671.868[M+Na]⁺(calcd 1671.869).

实施例14.6α-乙酰基-克洛苷元3β-O-(2，4-二-O-α-L-鼠李吡喃糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷：

将实施例12所得化合物溶于CH₂Cl₂-MeOH(1∶1)中，加入10％Pd-C，H₂氛围下反应过夜。滤除不溶物，滤液蒸干后经硅胶柱纯化。R_f0.36(5∶1 CHCl₃-MeOH)；two steps 51.8％；[α]_D ²⁰ -43.1(c 0.2，MeOH)；¹HNMR(DMSO-d₆)：δ4.99(s，1H，Rha-H-1)，4.94(d，1H，J＝6.4Hz，-OH)，4.75-4.73(m，2H，-OH×2)，4.70-4.69(m，2H，-OH，Rha-H-1)，4.60(d，1H，J＝4.6Hz，-OH)，4.60(d，1H，J＝4.1Hz，-OH)，4.57(d，1H，J＝5.9Hz，-OH)，4.53(td，1H，J＝4.1，11.0Hz)，4.50(d，1H，J＝6.0Hz，-OH)，4.39(d，1H，J＝7.8Hz，H-1′)，4.26(q，1H，J＝6.8Hz)，3.89-3.83(m，2H，Rha-H-5×2)，3.69(t，1H，Rha-H-2)，3.60-3.57(m，2H，Rha-H-2，H-6′)，3.53-3.49(m，1H，H-3)，3.42-3.37(m，5H)，3.21-3.17(m，5H)，2.03(s，3H)，1.10(d，3H，J＝6.0Hz)，1.04(d，3H，J＝6.4Hz，Rha-CH₃)，0.89(d，3H，J＝6.8Hz，Rha-CH₃)，0.80(s，3H)，0.74(d，3H，J＝6.4Hz)，0.72(s，3H)；¹³C NMR(DMSO-d₆)：δ170.3，108.4，100.5(2C)，98.7，80.1，77.6，76.7，76.3，76.0，75.1，71.9(2C)，71.5，70.7(2C)，70.6，70.4，68.6，68.0，65.9，61.7，60.1，55.1，52.8，47.5，41.1，40.1，37.5，36.5，36.2，33.2，31.2，30.9，29.8，28.8，28.5，27.7，21.1，20.4，17.8(2C)，17.1，16.1，14.6，12.8；ESIMS(m/z)：948.517[2M+Ca]²⁺(calcd 948.485).

药理实验

试验例1.化合物对H5N1高致病流感病毒感染宿主细胞的影响筛选模型的原理：

血凝素是流感病毒表面的糖蛋白，其主要作用是与宿主细胞表面受体结合和融合，在流感病毒对宿主细胞的分子识别和选择性结合起决定作用。基于血凝素特性，我们建立了以HIV为核心的流感病毒的重组病毒系统(HA/HIV)，具体方法如下。将HIV载体质粒(pNL4-3.Luc.R^-.E^-.，从NIH获得)与克隆至哺乳动物细胞表达载体pcDNA-3的HA的质粒共转染至293T细胞(人胚胎肾细胞)后，细胞可产生以HIV为核心并包裹有HA外壳蛋白的病毒颗粒(HA/HIV)。该病毒颗粒具有以下特点：1)病毒对宿主细胞的选择性取决于血凝素的特性；2)由于HIV载体上env、nef和vpr基因缺失，因此该病毒只能一次性进入宿主细胞并且不能复制，所以该病毒是安全的；3)该HIV载体上带有一个荧光素酶报告基因，因此被感染的细胞会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶活性就可标示细胞被病毒感染的程度。

另外，我们采用用水泡性口炎病毒外壳蛋白(VSV-G)包装HIV-1核心，构建VSVG/HIV-1重组病毒同时检测化合物，以排除HIV-1核心对实验的影响，即化合物可抑制HA/HIV-1的进入，而不抑制VSVG/HIV-1的进入时，认为化合物是流感病毒侵入宿主细胞的特异性抑制剂。

实验方法：

在本发明中应用了三株流感病毒对实施例进行药理活性评价：

1.H5N1，Goose/Qinghai/59/05，(简称QH)

2.H5N1，InfluenzaA/Vietnam/1203/04(简称Viet)

3.H5N2，CK/Michoacan/28159-530/95，(简称：USDA)

感染前一天，按每孔6×10⁴个细胞的密度将A549细胞接种到24孔板上。用DMSO溶解阳性对照化合物或待筛选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，以DMSO溶剂作空白对照。加入适宜稀释度的病毒液(HA/HIV-1或VSV-G/HIV-1)感染细胞。感染48小时后，被感染的细胞每孔加入50μl细胞裂解液(Promega)裂解细胞，将30μl荧光素酶底物(Promega)与20μl细胞裂解液混合后用FB15荧光检测器(Sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，其活性的强弱反映了病毒的感染的水平。结果显示，化合物可有效抑制H5N1高致病流感病毒和H5N2低致病流感病毒对宿主细胞的侵入，结果见表1。

表1化合物对HA(Viet)/HIV，HA(QH)/HIV and HA(USDA)/HIV感染作用的比较

注：两个化合物在10μM的终浓度下对VSV-G/HIV-1的抑制率均小于10％。

试验例2.细胞毒性试验

应用MTT法测定了所有涉及的化合物对A549和293ET细胞的细胞毒性，所有实施例化合物在10μM的终浓度下均无细胞毒性。

Claims (14)

1.如通式(I)所示的克洛皂苷，

其中，R1、R2独立的选自氢、葡萄糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基、半乳糖基、木糖基、核糖基、甘露糖基、2-氨基葡萄糖基、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、山梨糖基、阿洛糖基、阿洛酮糖基，或由这些单糖2-3个组成的直链或支链寡糖基；

R3选自H、C1-C18直链或支链的烷酰基。

2.制备权利要求1所述的克洛皂苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，R1、R2和R3的定义和权利要求1中的定义相同；P₀，P₁，P₂，P₃为保护基；

(1)对薯蓣苷元的3β-OH进行保护制备3β-O-保护基薯蓣苷元；

(2)在3β-O-保护基薯蓣苷元的C-6位引入羟基制备3β-O-苄基克洛苷元

(3)3β-O-保护基克洛苷元的6-羟基上引入保护基。

(4)脱去3β-O-保护基-6α-O-保护基克洛苷元的3位羟基上的保护基

(5)在克洛苷元的C-3引入β--葡萄糖基；

(6)脱除克洛苷元-葡萄糖苷上的酰基保护基；

(7)选择性的保护克洛苷元葡萄糖上3，6-OHs；

(8)分别或同时在步骤(7)所得的克洛苷元的吡喃葡萄糖的2，4-OHs引入糖基；

(9)脱除新引入的糖基上的保护基；

(10)将糖基上的所有羟基进行保护；

(11)脱除克洛苷元6α-羟基上的保护基；

(12)脱除糖基上的所有保护基；

(13)将步骤(11)获得的化合物的6α-羟基进行酯化反应；

(14)将步骤(13)获得的化合物的糖基上的所有保护基脱除。

3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，

用苄基保护时；

反应的碱选自NaH；

催化剂选自四丁基碘化铵；

溶剂选自四氢呋喃，N，N-二甲基甲酰胺。

4.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，

脱除苷元上的苄基保护基使用Pd-C和H₂；

脱保护基反应的溶剂选自四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一种或多种的混合物；

反应在有机胺存在的条件下进行。

5.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，

所述的糖基供体上的保护基选自乙酰基、苯甲酰基、叔戊酰基、苄基；所述的糖基供体的活化基团选自三氯乙酰亚胺酯、乙硫苷、苯硫苷或对-甲苯硫苷；

糖苷化反应的在路易斯酸催化剂存在的条件下进行；

所述糖苷化反应中的有机溶剂选自C₁-C₄的氯代烷烃、甲苯或乙醚；

糖苷化反应在

型硅铝酸盐分子筛存在的条件下进行；

糖苷化反应的淬灭剂选自硫代硫酸钠、有机胺。

6.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，

脱除糖基上的苯甲酰基保护基使用CH₃ONa；

脱保护基反应的溶剂选自四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一种或多种的混合物；

脱保护基反应完成后使用阳离子树脂(H⁺)中和反应液至中性。

7.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，

步骤(7)选择性的保护葡萄糖上3，6-OHs使用位阻试剂1-(苯甲酰基)苯并三唑；

有机溶剂优选为C₁-C₄的氯代烷烃、甲苯或乙醚；

反应在有机胺存在的条件下进行。

8.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，

酯化反应的缩合试剂选自1，3二环己基碳二亚胺、二吡啶碳酸酯、1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳酰亚胺盐酸盐、1，3-二异丙基碳酰亚胺、4-吡咯烷基吡啶；

催化剂选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)，4-吡咯烷基吡啶。

9.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，各步骤的产物可以通过重结晶或硅胶柱纯化。

10.根据权利要求的制备方法，其特征在于，

所述的硅胶柱纯化时使用的洗脱剂是选自石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；

所述重结晶纯化中的溶剂优选为三氯甲烷、C₁-C₄的烷基醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚、环己烷、二氯甲烷、水中一种或多种的混合物。

11.一种药物组合物，其特征在于，含有作为有效成分的通式(I)所示的克洛皂苷和药效学上可接受的载体。

12.根据权利要求11的药物组合物，其特征在于，还含有其它的抗病毒药。

13.权利要求1所述的克洛皂苷在制备预防或治疗抗流感病毒的药物中的应用。

14.根据权利要求13的应用，其特征在于，所述的流感病毒为H5N1、H5N2。