CN101932592B - 抗肿瘤化合物 - Google Patents
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Abstract
用作抗肿瘤剂的通式(I)的抗肿瘤化合物及其药物可接受的盐、衍生物、互变异构体、前药或立体异构体。
Description
发明领域
本发明涉及新的抗肿瘤化合物、包含抗肿瘤化合物的药物组合物以及它们用作抗肿瘤剂的用途。
发明背景
在WO 95/27730中,Perez Baz等公开了来自海洋生物小单孢菌属(Micromonospora sp.)的新的抗肿瘤剂Thiocoraline A的分离和二维结构鉴定。
在1999年,Erba等报道了该化合物在抑制细胞周期进程和克隆形成的浓度下作为DNAα聚合酶抑制剂的活性(Erba,E.;Bergamaschi,D.;Ronzoni,S.;Faretta,M.;Taverna,S.;Bonfanti,M.;Catapano,C.V.;Faircloth,G.;Jimeno,J.;D’Incalci,M.British J.Cancer 1999,80,971-980)。
在WO 02/49577中,Boger和Lewis公开了Thiocoraline A和BE-22179的全合成。该全合成允许阐明Thiocoraline A相对立体化学和绝对立体化学。他们还报道了Thiocoraline A类似物的制备,其中2-羟基喹啉基被其它喹啉或喹喔啉代替。
Z=CH,R1=R2=H
Z=N,R1=R2=H
Z=CH,R1=OMe,R2=OH
他们还报道了通过具有很少或没有明显序列选择性的高亲和性双插入(bisintercalation)使thiocoraline A、BE-2179及其类似物与DNA结合。
最近,Gago等公开了Thiocoraline A的X-射线结构及其DNA结合特性(Negri,A.;Marco,E.;García-Hernández,V.;Domingo,A.;Llamas-Saiz,A. L.;Porto-Sandá,S.;Riguera,R.;Laine,W.;David-Cordonnier,M-H.;Bailly,C.;García-Fernandez,L.F.;Vaquero,J.J.;and Gago,F.J.Med.Chem.2007,50,3322-3333)。
Thiocoraline A与抗肿瘤肽抗生素家族共享一些共同的部分(motive),所述抗肿瘤肽抗生素家族包括三骨菌素(Triostin)A(Shoji,J.,et al.J.Antibiot.1961,14,335-339)、BE-22179(Okada,H.,et al.J.Antibiot.1994,47,129-135)和棘霉素(Corbaz,R.,et al.Helv.Chim.Acta 1957,40,199-204)。
三骨菌素:X=O;Y=-SCH2-;R1=i-Pr;R2=Me;HTC=2-喹喔啉基;BE-22179:X=S;Y=-SCH2-;R1=CH2=;R2=H;HTC=3-羟基-2-喹啉基;
棘霉素:X=O;Y=CH(SMe);R1=i-Pr;R2=Me;HTC=2-喹喔啉基;
双重对称或伪对称二环八肽的这种基团表现出复杂的结构,包含:a)由反向平行模式的两条肽链形成的二环结构;b)处于肽链末端部分的酯键或硫酯键;c)处于肽链中间的二硫键或类似的桥接;d)处于N-末端部分的插入生色团部分;e)若干N-甲基氨基酸的存在;以及f)D构型的非天然氨基酸。
Boger和Lee于2000年报道了Azatriostin A的合成和对白血病细胞系L1210的细胞毒活性(Boger,D.L.;Lee,J.K.J.Org.Chem.2000,65(19),5996-6000)。Azatriostin A为三骨菌素A的类似物,其中肽链末端部分的酯键被酰胺键代替。Azatriostin A对该细胞系的活性比三骨菌素A低两个数量级。
现有技术中公开的其它Thiocoraline A类似物为Oxathiocoraline,其表现出对GI50值为3.0E-7M至4.62E-7M的三种细胞系的细胞毒活性(Tulla-Puche,J.;Bayó-Puxan,N.;Moreno,J.A.;Francesch,A.M.;Cuevas,C.;M.;and Albericio,F.J.Am.Chem.Soc.2007,129,5322-5323);和Azathiocoraline,其表现出对GI50值为5.67E-6M至2.58E-7M的一组细胞系的细胞毒活性(Bayó-Puxan,N.;Fernández,A.;Tulla-Puche J.;Riego,E.;Cuevas,C.;M.;and Albericio,F.Chem.Eur.J.2006,12,9001-9009;Bayó-Puxan,N.Ph.D.Thesis,University of Barcelona,2006);以及Azathiocoraline类似物,其中将位于Thiocoraline A的N-末端部分的插入生色团部分和/或环状氨基酸进行修饰(Bayó-Puxan,N.;Fernández,A.;Tulla-Puche J.;Riego,E.;.M.;and Albericio,F.Int.J.of Peptide Research andTherapeutics.2007,13,295-306)。
还将化合物[NMe-Leu4,NMe-Leu8]Azathiocoraline、[2QXA,NMe-Ala4]Azathiocoraline和[2QXA,NMe-Ala4]Azathiocoraline针对GI50值大于9.99E-6M的这些细胞组进行测试(Bayó-Puxan,N.Ph.D.Thesis,University of Barcelona,2006)。
在动物和人类中,癌症是死亡的主要原因。已经尽极大努力并仍在努力以获得有效且安全地向患有癌症的患者给予的抗肿瘤剂。本发明要解决的问题是提供在癌症治疗中有用的化合物。
发明概述
一方面,本发明涉及通式I的化合物或其药物可接受的盐、衍生物、互变异构体、前药或立体异构体,
通式I
其中R1、R4、R6和R9各自独立地选自氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基和取代或未取代的C2-C12炔基;
R3和R8各自独立地为取代或未取代的C1-C12巯基烷基,其中可以将巯基任选地保护;或使R3和R8形成基团-CH2-S-S-CH2-;
R2为氢;
R7为氢;或
R1-R2对和/或R6-R7对独立地形成取代或未取代的C1-C12亚烷基,或者与它们所连接的相应C原子一起形成取代或未取代的C3-C12环烷基;
R5和R10各自独立地选自氨基保护基团和-(C=O)R”,其中每一R”独立地选自取代或未取代的杂环基和取代或未取代的杂环基烷基;
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地选自氢和取代或未取代的C1-C12烷基;
Y选自S、O和NRi;
Rh选自取代或未取代的C1-C12烷基、n为1至25的-(CH2-CH2O)n-CH3基团、取代或未取代的C2-C12烯基和取代或未取代的C2-C12炔基;
并且
Ri为选自以下基团的基团:氢、取代或未取代的C1-C12烷基、n为1至25的-(CH2-CH2O)n-CH3基团、取代或未取代的C2-C12烯基和取代或未取代的C2-C12炔基。
另一方面,本发明涉及将通式I的化合物或其药物可接受的盐、衍生物、互变异构体、前药或立体异构体作为药品,特别是用于治疗癌症的药品的用途。
另一方面,本发明还涉及通式I的化合物或其药物可接受的盐、衍生物、互变异构体、前药或立体异构体在治疗癌症或制备优选治疗癌症的药品中的用途。本发明的其它方面是治疗方法和用于这些方法的化合物。因此,本发明还提供治疗患有癌症的任何哺乳动物,特别是人的方法,所述方法包括向患病的个体给予治疗有效量的如上文所定义的化合物。
另一方面,本发明还涉及将通式I的化合物或其药物可接受的盐、衍生物、互变异构体、前药或立体异构体作为抗癌剂的用途。
另一方面,本发明涉及包含通式I的化合物或其药物可接受的盐、衍生物、互变异构体、前药或立体异构体以及药物可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
本发明还涉及获得通式I化合物和由这些化合物形成的衍生物的方法。
优选实施方案详述
本发明涉及如上文所定义的通式I的化合物。
在这些化合物中,能够根据以下指导选择来基团:
烷基可以是支链或非支链的,并且优选具有1至约12个碳原子。更优选的一类烷基具有1至约6个碳原子。甚至更优选的烷基具有1、2、3或4个碳原子。在本发明的化合物中,特别优选的烷基是甲基,乙基,丙基,异丙基和包括叔丁基、仲丁基及异丁基在内的丁基。优选的另一类烷基具有6至约10个碳原子;并且甚至更优选7、8或9个碳原子。这一类最优选的烷基是庚基、辛基和壬基。
本发明化合物中优选的烯基和炔基可以是支链或非支链的,具有一个或多个不饱和键,并具有2至约12个碳原子。更优选的一类烯基和炔基具有2至约6个碳原子。甚至更优选的烯基和炔基具有2、3或4个碳原子。优选的另一类烯基和炔基具有4至约10个碳原子,仍然更优选6至约10个碳原子;并且甚至更优选7、8或9个碳原子。
亚烷基可以是支链或非支链的,并优选具有1至约12个碳原子。更优选的一类亚烷基具有1至约6个碳原子。甚至更优选的亚烷基具有1、2、3或4个碳原子。在本发明的化合物中,特别优选的亚烷基是亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基和包括仲亚丁基及异亚丁基在内的亚丁基。优选的另一类亚烷基具有6至约10个碳原子;并且甚至更优选7、8或9个碳原子。这一类最优选的亚烷基是亚庚基、亚辛基和亚壬基。
本发明化合物中优选的环烷基具有3至约12个碳原子。更优选的一类环烷基具有3至约6个碳原子。甚至更优选的环烷基具有3、4或5个碳原子。
本发明化合物中适当的芳基包括单环和多环化合物,该多环化合物包括包含分离的芳基和/或稠合的芳基的多环化合物。通常的芳基包含1至3个分离的或稠合的环,并具有6至约18个碳环原子。优选的芳基具有6至约10个碳环原子。特别优选的芳基包括取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的联苯基、取代或未取代的菲基和取代或未取代的蒽基。
适当的杂环基包括包含1至3个分离的或稠合的环并具有5至约18个环原子的杂芳基和杂脂环基。优选地,杂芳基和杂脂环基具有5至约10个环原子。本发明化合物中适当的杂芳基具有选自N、O或S原子的一个、两个或三个杂原子,并且包括例如,包括8-香豆素基的香豆素基、包括8-喹啉基的喹啉基、异喹啉基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、中氮茚基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基(furazanyl)、哒嗪基、三嗪基、噌啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基(benzofurazanyl)、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基(naphthyridinyl)和呋喃并吡啶基(furopyridyl)。本发明化合物中适当的杂脂环基具有选自N、O或S原子的一个、两个或三个杂原子,并且包括例如,吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、噻噁烷基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基(thietanyl)、高哌啶基(homopiperidyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮杂卓基(oxazepinyl)、二氮杂卓基(diazepinyl)、噻氮杂卓基(thiazepinyl)、1,2,3,6-四氢吡啶基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂二环[3.1.0]己基、3-氮杂二环[4.1.0]庚基、3H-吲哚基和喹嗪基。
杂环基烷基为由杂环基取代的烷基,其中烷基和杂环基为如上文所定义的。
可以使上述基团在一个或多个有效的位置被一个或多个适当的基团取代,所述适当的基团例如,OR’、=O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、N(R’)2、=N-R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(=NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCON(R’)2、受保护的OH、受保护的氨基、受保护的SH、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂环基,其中每一R’基团独立地选自氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、CO2H、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂环基。当这样的基团自身被取代时,取代基可以选自以上所列。
本发明化合物中适当的卤素取代基包括F、Cl、Br和I。
适当的保护基团为本领域技术人员所熟知。Wuts,P.G.M.和GreeneT.W.在Protecting groups in Organic Synthesis,4th Ed.(有机合成的保护基团,第四版)Wiley-Interscience中以及由Kocienski P.J.在ProtectingGroups,3rd Ed.(保护基团,第三版)Georg Thieme Verlag中提供了有机化学中保护基团的概述。这些参考文献提供了OH、氨基和SH基团的保护基团的章节。所有这些参考文献以引用的方式整体并入本文。这样的受保护的OH的实例包括:醚、甲硅烷基醚、酯、磺酸酯、次磺酸酯和亚磺酸酯、碳酸酯和氨基甲酸酯。在醚的情况下,OH的保护基团能够选自甲基、甲氧基甲基、甲硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基、苄氧基甲基、对甲氧基苄氧基甲基、[(3,4-二甲氧基苄基)氧基]甲基、对硝基苄氧基甲基、邻硝基苄氧基甲基、[(R)-1-(2-硝基苯基)乙氧基]甲基、(4-甲氧基苯氧基)甲基、愈创木酚甲基(guaiacolmethyl)、[(对苯基苯基)氧基]甲基、叔丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2-氰乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、薄荷氧基甲基、邻双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基、四氢吡喃基、氟四氢吡喃基、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基、1-(4-氯苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基、1,4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢噻喃基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-羟基乙基、2-溴乙基、1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、1-甲基-1-苯氧基乙基、2,2,2-三氯乙基、1,1-联茴香基(dianisyl)-2,2,2-三氯乙基、1,1,1,3,3,3-六氟-2-苯基异丙基、1-(2-氰乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苄硫基)乙基、2-苯基硒基)乙基、叔丁基、环己基、1-甲基-1’-环丙基甲基、烯丙基、异戊二烯基、肉桂基、2-苯烯丙基(phenallyl)、炔丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、2,4-二硝基苯基、2,3,5,6-四氟-4-(三氟甲基)苯基、苄基、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、2,6-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、戊二烯基硝基苄基、戊二烯基硝基胡椒基、卤代苄基、2,6-二氯苄基、2,4-二氯苄基、2,6-二氟苄基、对氰基苄基、氟苄基、4-氟烷氧基苄基、三甲基甲硅烷基二甲苯基、对苯基苄基、2-苯基-2-丙基、对酰基氨基苄基、对叠氮苄基、4-叠氮-3-氯苄基、2-三氟甲基苄基、4-三氟甲基苄基、对(甲基亚磺酰基)苄基、对硅杂环丁烷基(siletanyl)苄基、4-乙酰氧基苄基、4-(2-三甲基甲硅烷基)乙氧基甲氧基苄基、2-萘基甲基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧桥、2-喹啉基甲基、6-甲氧基-2-(4-甲基苯基-4-喹啉甲基、1-芘基甲基、二苯基甲基、4-甲氧基二苯基甲基、4-苯基二苯基甲基、p,p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、三(4-叔丁基苯基)甲基、a-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯甲酰甲氧基)苯基二苯基甲基、4,4’,4”-三(4,5-二氯邻苯二甲酰亚氨基苯基)甲基、4,4’,4”-三(乙酰丙酰氧基(levulinoyloxy)苯基)甲基、4,4’,4”-三(苯甲酰氧基苯基)甲基、4,4’-二甲氧基-3”-[N-(咪唑基甲基)]三苯甲基、4,4’-二甲氧基-3”-[N-(咪唑基乙基)氨基甲酰基]三苯甲基、双(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、4-(17-四苯并[a,c,g,i]芴基甲基)-4,4”-二甲氧基三苯甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯硫基呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫戊环-2-基和4,5-双(乙氧基羰基)-[1,3]-二氧戊环-2-基、苯并异噻唑基S,S-二氧化物。在甲硅烷基醚的情况下,OH的保护基团能够选自三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基异丙基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、2-降冰片基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三-对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、二-叔丁基甲基甲硅烷基、双(叔丁基)-1-芘基甲氧基甲硅烷基、三(三甲基甲硅烷基)甲硅烷基、(2-羟基苯乙烯基)二甲基甲硅烷基、(2-羟基苯乙烯基)二异丙基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、叔丁氧基二苯基甲硅烷基、1,1,3,3-四异丙基-3-[2-(三苯基甲氧基)乙氧基]二硅氧烷-1-基和氟甲硅烷基。在酯的情况下,OH的保护基团能够选自甲酸酯、甲酸苯甲酰酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氯乙酰胺酯(trichloroacetamidate)、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、乙酸苯酯、乙酸二苯酯、3-丙酸苯酯、双氟链式丙酰基(bisfluorous chain type propanoyl)、4-戊烯酸酯、4-氧代戊酸酯、4,4-(乙烯二硫代)戊酸酯、5[3-双(4-甲氧基苯基)羟基甲基苯氧基]乙酰丙酸酯、新戊酸酯(pivaloate)、1-金刚酸酯(1-adamantoate)、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯、4-溴苯甲酸酯、2,5-二氟苯甲酸酯、对硝基苯甲酸酯、吡啶甲酸酯、烟酸酯、2-(叠氮甲基)苯甲酸酯、4-叠氮丁酸酯、(2-叠氮甲基)苯基乙酸酯、2-{[(三苯甲基巯基(tritylthio))氧基]甲基}苯甲酸酯、2-{[(4-甲氧基三苯甲基巯基)氧基]甲基}苯甲酸酯、2-{[甲基(三苯甲基巯基)氨基]甲基}苯甲酸酯、2-{{[(4-甲氧基三苯甲基)巯基]甲基氨基}-甲基}苯甲酸酯、2-(烯丙氧基)苯基乙酸酯、2-(异戊二烯氧基甲基)苯甲酸酯、6-(乙酰丙酰氧基甲基(levulinyloxymethyl))-3-甲氧基-2-硝基苯甲酸酯、6-(乙酰丙酰氧基甲基)-3-甲氧基-4-硝基苯甲酸酯、4-苄氧基丁酸酯、4-三烷基甲硅烷氧基丁酸酯、4-乙酰氧基-2,2-二甲基丁酸酯、2,2-二甲基-4-戊烯酸酯、2-碘苯甲酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰苯磺酸酯、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2-(氯乙酰氧基甲基)苯甲酸酯、2-[(2-氯乙酰氧基)乙基]苯甲酸酯、2-[2-(苄氧基)乙基]苯甲酸酯、2-[2-(4-甲氧基苄氧基)乙基]苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-双(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯(monosuccinoate)、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、邻(甲氧基羰基)苯甲酸酯、a-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N,N,N’,N’-四甲基二氨基磷酸酯和2-氯苯甲酸酯。在磺酸酯、次磺酸酯和亚磺酸酯的情况下,OH的保护基团能够选自硫酸酯、烯丙基磺酸酯、甲磺酸酯、苄基磺酸酯、甲苯磺酸酯、2-[(4-硝基苯基)乙基]磺酸酯、2-三氟甲基苯磺酸酯、4-单甲氧基三苯甲基次磺酸酯、烷基2,4-二硝基苯基次磺酸酯、2,2,5,5-四甲基吡咯烷-3-酮-1-亚磺酸酯、硼酸酯和二甲基硫膦基(dimethylphosphinothiolyl)。在碳酸酯的情况下,OH的保护基团能够选自甲基碳酸酯、甲氧基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯、乙基碳酸酯、溴乙基碳酸酯、2-(甲硫基甲氧基)乙基碳酸酯、2,2,2-三氯乙基碳酸酯、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基碳酸酯、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯、2-[二甲基(2-萘基甲基)甲硅烷基]乙基碳酸酯、2-(苯基磺酰基)乙基碳酸酯、2-(三苯基磷鎓基)乙基碳酸酯、顺式-[4-[[(甲氧基三苯甲基)亚磺酰]氧基]四氢呋喃-3-基]氧基碳酸酯、异丁基碳酸酯、叔丁基碳酸酯、乙烯基碳酸酯、烯丙基碳酸酯、肉桂基碳酸酯、炔丙基碳酸酯、对氯苯基碳酸酯、对硝基苯基碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、6-溴-7-羟基香豆素-4-基甲基碳酸酯、苄基碳酸酯、邻硝基苄基碳酸酯、对硝基苄基碳酸酯、对甲氧基苄基碳酸酯、3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、蒽醌-2-基甲基碳酸酯、2-丹酰乙基碳酸酯、2-(4-硝基苯基)乙基碳酸酯、2-(2,4-二硝基苯基)乙基碳酸酯、2-(2-硝基苯基)丙基碳酸酯、烷基2-(3,4-亚甲基二氧基-6-硝基苯基)丙基碳酸酯、2-氰基-1-苯基乙基碳酸酯、2-(2-吡啶基)氨基-1-苯基乙基碳酸酯、2-[N-甲基-N-(2-吡啶基)]氨基-1-苯基乙基碳酸酯、苯甲酰甲基碳酸酯、3’,5’-二甲氧基苯偶姻碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯和S-苄基硫代碳酸酯。在氨基甲酸酯的情况下,OH的保护基团能够选自二甲硫基氨基甲酸酯、N-苯基氨基甲酸酯、N-甲基-N-(邻硝基苯基)氨基甲酸酯。
受保护的氨基的实例包括氨基甲酸酯、脲、酰胺、杂环体系、N-烷基胺、N-烯基胺、N-炔基胺、N-芳基胺、亚胺、烯胺、N-金属衍生物、N-N衍生物、N-P衍生物、N-Si衍生物和N-S衍生物。在氨基甲酸酯的情况下,氨基的保护基团能够选自氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴基甲基氨基甲酸酯、2,6-二-叔丁基-9-芴基甲基氨基甲酸酯、2,7-双(三甲基甲硅烷基)芴基甲基氨基甲酸酯、9-(2-磺基)芴基甲基氨基甲酸酯、9-(2,7-二溴)芴基甲基氨基甲酸酯、17-四苯并[a,c,g,i]芴基甲基氨基甲酸酯、2-氯-3-茚基甲基氨基甲酸酯、苯并[f]茚-3-基甲基氨基甲酸酯、1,1-二氧代苯并[b]噻吩-2-基甲基氨基甲酸酯、2-甲基磺酰基-3-苯基-1-丙-2-烯氧基氨基甲酸酯、2,7-二-叔丁基-[9,(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻吨基(thioxanthyl))]甲基氨基甲酸酯、2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯、(2-苯基-2-三甲基甲硅烷基)乙基氨基甲酸酯、2-苯基乙基氨基甲酸酯、2-氯乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-2-卤乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯、2-(2’-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、2-(4’-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、2,2-双(4’-硝基苯基)乙基氨基甲酸酯、2-[(2-硝基苯基)二硫代]-1-苯基乙基氨基甲酸酯、2-(N,N-二环己基甲酰胺基)乙基氨基甲酸酯、叔丁基氨基甲酸酯、C8F19CH2CH2C(CH3)2-氨基甲酸酯、1-金刚烷基氨基甲酸酯、2-金刚烷基氨基甲酸酯、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4-联苯基(byphenylyl))乙基氨基甲酸酯、1-(3,5-二-叔丁基苯基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯、三异丙基甲硅烷氧基氨基甲酸酯、氨基甲酸乙烯酯、氨基甲酸烯丙酯、氨基甲酸异戊二烯酯、1-异丙基烯丙基氨基甲酸酯、氨基甲酸肉桂酯、4-硝基肉桂基氨基甲酸酯、3-(3’-吡啶基)丙-2-烯基氨基甲酸酯、己二烯氧基氨基甲酸酯(hexadienyloxycarbamate)、炔丙氧基氨基甲酸酯、丁-2-炔双氧基氨基甲酸酯、8-喹啉基氨基甲酸酯、N-羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫代氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯、3,5-二-叔丁基苄基氨基甲酸酯、对甲氧基苄基氨基甲酸酯、对硝基苄基氨基甲酸酯、对溴苄基氨基甲酸酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2,4-二氯苄基氨基甲酸酯、4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯、4-三氟甲基苄基氨基甲酸酯、C8F17CH2CH2-氨基甲酸酯、(C8F17CH2CH2)3Si-氨基甲酸酯、2-萘基甲基氨基甲酸酯、9-蒽基甲基氨基甲酸酯、二苯基甲基氨基甲酸酯、4-苯基乙酰氧基苄基氨基甲酸酯、4-叠氮苄基氨基甲酸酯、4-叠氮甲氧基苄基氨基甲酸酯、间氯-对酰氧基苄基氨基甲酸酯、对(二羟基硼基)苄基氨基甲酸酯、5-苯并异噁唑基甲基氨基甲酸酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基氨基甲酸酯、2-甲硫基乙基氨基甲酸酯、2-甲基磺酰基乙基氨基甲酸酯、2-(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、2-(4-硝基苯基磺酰基)乙基氨基甲酸酯、2-(2,4-二硝基苯基磺酰基)乙氧基氨基甲酸酯、2-(4-三氟甲基苯基磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2-(1,3-二噻烷基)]甲基氨基甲酸酯、2-磷鎓基乙基氨基甲酸酯、2-[苯基(甲基)锍基]乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(三苯基磷鎓基)乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-2-氰乙基氨基甲酸酯、2-丹酰乙基氨基甲酸酯、2-(4-硝基苯基)乙基氨基甲酸酯、4-甲基-苯硫基氨基甲酸酯、2,4-二甲硫基苯基氨基甲酸酯、间硝基苯基氨基甲酸酯、3,5-二甲氧基苄基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、a-甲基硝基胡椒基氨基甲酸酯、邻硝基苄基氨基甲酸酯、3,4-二甲氧基-6-硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻硝基苯基)甲基氨基甲酸酯、2-硝基苯基乙基氨基甲酸酯、6-硝基藜芦基氨基甲酸酯、4-甲氧基苯甲酰甲基氨基甲酸酯、3’,5’-二甲氧基苯偶姻氨基甲酸酯、9-呫吨基甲基氨基甲酸酯、N-甲基-N-(邻硝基苯基)氨基甲酸酯、N-(2-乙酰氧基乙基)氨基甲酸酯、叔戊基氨基甲酸酯、1-甲基环丁基氨基甲酸酯、1-甲基环己基氨基甲酸酯、1-甲基-1-环丙基甲基氨基甲酸酯、环丁基氨基甲酸酯、环戊基氨基甲酸酯、环己基氨基甲酸酯、异丁基氨基甲酸酯、异冰片基氨基甲酸酯、环丙基甲基氨基甲酸酯、对癸氧基苄基氨基甲酸酯、二异丙基甲基氨基甲酸酯、2,2-二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、邻(N,N-二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、丁炔基氨基甲酸酯、1,1-二甲基丙炔基氨基甲酸酯、2-碘乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4’-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(对苯基苯偶氮基)乙基氨基甲酸酯、对(p’-甲氧基苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、对(苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三甲基苄基氨基甲酸酯、异烟酰基氨基甲酸酯、4-(三甲基-铵)苄基氨基甲酸酯、对氰基苄基氨基甲酸酯、二(2-吡啶基)甲基氨基甲酸酯、2-呋喃基甲基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、2,4,6-三-叔丁基苯基氨基甲酸酯、1-甲基-1-苯基乙基氨基甲酸酯和S-苄基硫代氨基甲酸酯。在脲的情况下,氨基的保护基团能够选自吩噻嗪基-(10)-羰基、N’-对甲苯磺酰基氨基羰基、N’-苯基胺基硫代-羰基、4-羟基苯基氨基羰基、3-羟基色胺基羰基(hydroxytryptaminocarbonyl)和N’-苯基-氨基硫代羰基。在酰胺的情况下,氨基的保护基团能够选自甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、戊-4-烯基酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基氨甲酰胺(pyridylcarboxamide)、N-苯甲酰苯丙氨酰基、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、2,2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、邻硝基苯甲酰胺、3-(4-叔丁基-2,6-二硝基苯基)-2,2-二甲基丙酰胺、邻苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺、2-(乙酰氧基甲基)苯甲酰胺、2-[(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)甲基]苯甲酰胺、3-(3’,6’-二氧代-2’,4’,5’-三甲基环己-1’,4’-二烯)-3,3-二甲基丙酰胺、邻羟基-反式-肉桂酰胺、2-甲基-2-(邻苯偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、乙酰乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、(N’-二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰胺和N-乙酰基蛋氨酰胺。在杂环体系的情况下,氨基的保护基团能够选自4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-苯邻二甲酰亚胺、N-二氯苯邻二甲酰亚胺、N-四氯苯邻二甲酰亚胺、N-4-硝基苯邻二甲酰亚胺、N-硫二甘醇基、N-二硫杂琥珀酰亚胺、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,3-二甲基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-2,5-双(三异丙基甲硅烷氧基)吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物、N-1,1,3,3-四甲基-1,3-二硅杂异吲哚啉(disilaisoindoline)、N-二苯基甲硅烷基二乙烯、N-5-取代的-1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、N-5-取代的-1,3-苄基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮和1,3,5-二噁嗪。在N-烷基胺、N-烯基胺、N-炔基胺或N-芳基胺的情况下,氨基的保护基团能够选自N-甲基、N-叔丁基、N-烯丙基、N-异戊二烯基、N-肉桂基、N-苯基烯丙基、N-炔丙基、N-甲氧基甲基、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基、N-3-乙酰氧基丙基、N-氰基甲基、2-氮杂降冰片烯、N-苄基、N-4-甲氧基苄基、N-2,4-二甲氧基苄基、N-2-羟基苄基、N-二茂铁基甲基、N-2,4-二硝基苯基、邻甲氧基苯基、对甲氧基苯基、N-9-苯基芴基、N-芴基、N-2-吡啶甲基胺N’-氧化物、N-7-甲氧基香豆-4-基甲基、N-二苯基甲基、N-双(4-甲氧基苯基)甲基、N-5-二苯并环庚基、N-三苯基甲基、N-(4-甲基苯基)二苯基甲基和N-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基。在亚胺的情况下,氨基的保护基团能够选自N-1,1-二甲硫基亚甲基、N-苯亚甲基、N-对甲氧基苯亚甲基、N-二苯基亚甲基、N-[2-吡啶基)-2,4,6-三甲苯基(mesityl)]亚甲基、N-(N’,N’-二甲基氨基亚甲基)、N-(N’,N’-二苄基氨基亚甲基)、N-(N’-叔丁基氨基亚甲基)、N,N’-异亚丙基、N-对硝基苯亚甲基、N-亚水杨基、N-5-氯亚水杨基、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基、N-亚环己基和N-叔亚丁基。在烯胺的情况下,氨基的保护基团能够选自N-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)、N-2,7-二氯-9-芴基亚甲基、N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基、N-(1,3-二甲基-2,4,6-(1H,3H,5H)-三氧代嘧啶-5-基亚基)甲基、N-4,4,4-三氟-3-氧代-1-丁烯基和N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)。在N-金属衍生物的情况下,氨基的保护基团能够选自N-二苯基二取代硼酸(borinic acid)、N-二乙基二取代硼酸、N-9-硼二环壬烷、N-二氟二取代硼酸和3,5-双(三氟甲基)苯基硼酸;并且还包括N-[苯基(五羰基铬)]卡宾基、N-[苯基(五羰基钨)]卡宾基、N-[甲基(五羰基铬)]卡宾基、N-[甲基(五羰基钨)]-卡宾基、N-铜螯合物、N-锌螯合物和18-冠-6-衍生物。在N-N衍生物的情况下,氨基的保护基团能够选自N-硝基、N-亚硝基、N-氧化物、叠氮化物、三氮烯和N-三甲基甲硅烷基甲基-N-苄基肼。在N-P衍生物的情况下,氨基的保护基团能够选自N-二苯基次膦酰胺(phosphinamide)、二甲硫基次膦酰胺、二苯硫基次膦酰胺、二烷基氨基磷酸酯(phosphoramidate)、二苄基氨基磷酸酯、二苯基氨基磷酸酯和亚氨基三苯基正膦。在N-Si衍生物的情况下,NH2的保护基团能够选自叔丁基二苯基甲硅烷基和三苯基甲硅烷基。在N-S衍生物的情况下,氨基的保护基团能够选自N-亚磺酰基衍生物或N-磺酰基衍生物。N-亚磺酰基衍生物能够选自苯亚磺酰胺、2-硝基苯亚磺酰胺、2,4-二硝基苯亚磺酰胺、五氯苯亚磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯亚磺酰胺(sulfanamide)、三苯基甲基亚磺酰胺、1-(2,2,2)-三氟-1,1-二苯基)乙基亚磺酰胺和N-3-硝基-2-吡啶亚磺酰胺。N-磺酰基衍生物能够选自甲烷磺酰胺、三氟甲烷磺酰胺、叔丁基磺酰胺、苄基磺酰胺、2-(三甲基甲硅烷基)乙烷磺酰胺、对甲苯磺酰胺、苯磺酰胺、茴香基磺酰胺、2-硝基苯磺酰胺、4-硝基苯磺酰胺、2,4-二硝基苯磺酰胺、2-萘磺酰胺、4-(4’,8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺、2-(4-甲基苯基)-6-甲氧基-4-甲基磺酰胺、9-蒽磺酰胺、吡啶-2-磺酰胺、苯并噻唑-2-磺酰胺、苯甲酰甲基磺酰胺、2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺、五甲基苯磺酰胺、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺、4-甲氧基苯磺酰胺、2,4,6-三甲基苯磺酰胺、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺、3-甲氧基-4-叔丁基苯磺酰胺和2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰胺。这样的受保护的SH的实例包括硫醚、二硫化物、甲硅烷基硫醚、硫酯、硫代碳酸酯和硫代氨基甲酸酯。在硫醚的情况下,SH的保护基团能够选自S-烷基、S-苄基、S-乙酰氨基甲基(Acm)、S-对甲氧基苄基、S-邻羟基苄基、S-对羟基苄基、S-邻甲氧基苄基、S-对甲氧基苄基、S-对硝基苄基、S-邻硝基苄基、S-2,4,6-三甲氧基苄基、S-4-吡啶甲基、S-2-吡啶甲基-N-氧化物、S-2-喹啉基甲基、S-9-蒽基甲基、S-9-芴基甲基、S-呫吨基、S-二茂铁基甲基、S-二苯基甲基、S-双(4-甲氧基苯基)甲基、S-5-二苯并环庚基、S-三苯基甲基、4-甲氧基三苯甲基、S-二苯基-4-吡啶基甲基、S-2,4-二硝基苯基、S-2-喹啉基、S-叔丁基、S-1-金刚烷基、S-甲氧基甲基单缩硫醛、S-异丁氧基甲基单缩硫醛、S-苄氧基甲基、S-1-乙氧基乙基、S-四氢吡喃基单缩硫醛、S-苄硫基甲基二硫缩醛、噻唑烷衍生物、S-乙酰氨基甲基氨基硫缩醛、S-三甲基乙酰氨基甲基氨基硫缩醛、S-苯甲酰氨基甲基氨基硫缩醛、S-烯丙氧基羰基氨基甲基、S-N-[2,3,5,6-四氟-4-(N’-哌啶子基)-苯基-N-烯丙氧基羰基氨基甲基、S-邻苯二甲酰亚氨基甲基、S-苯基乙酰氨基甲基、S-(2-硝基-1-苯基)乙基、S-2-(2,4-二硝基苯基)乙基、S-2-(4’-吡啶基)乙基、S-2-氰基乙基、S-2-(三甲基甲硅烷基)乙基、S-2,2-双(乙氧甲酰)乙基、S-(1-间硝基苯基-2-苯甲酰基)乙基、S-2-苯基磺酰基乙基、S-1-(4-甲基苯基磺酰基)-2-甲基丙-2-基和S-对羟基苯甲酰甲基。在二硫化物的情况下,SH的保护基团能够选自S-S-tBu[S-(叔丁基硫烷基)半胱氨酸、S-S-叔丁基)和S-Npys(S-3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)。在甲硅烷基硫醚的情况下,SH的保护基团能够选自上述列出的用于保护OH的甲硅烷基醚的基团。在硫酯的情况下,SH的保护基团能够选自S-乙酰基、S-苯甲酰基、S-2-甲氧基异丁酰基、S-三氟乙酰基、S-N-[[对联苯基)异丙氧基]羰基]-N-甲基-γ-氨基硫代丁酸酯和S-N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-γ-氨基硫代丁酸酯。在硫代碳酸酯的情况下,SH的保护基团能够选自S-2,2,2-三氯乙氧基羰基、S-叔丁氧基羰基、S-苄氧基羰基、S-对甲氧基苄氧基羰基和S-芴基甲基羰基。在硫代氨基甲酸酯的情况下,SH的保护基团能够选自S-(N-乙基氨基甲酸酯)和S-(N-甲氧基甲基氨基甲酸酯)。不应当将提及的这些基团理解为对本发明范围的限制,因为它们仅例示OH、氨基和SH基团的保护基团,但具有所述官能的基团其它基团可以为本领域技术人员所熟知,并且它们也被认为包括在本发明内。
术语“药物可接受的盐”、“衍生物”和“前药”是指任何药物可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物或在施用于患者时能够(直接地或间接地)提供本文所述化合物的任何其它化合物。然而,应当理解非药物可接受的盐也在本发明的范围内,因为那些非药物可接受的盐可以用于制备药物可接受的盐。能够通过本领域已知的方法来制备盐、前药和衍生物。
例如,通过常规的化学方法,从包含碱性或酸性部分的母体化合物来合成本文提供的化合物的药物可接受的盐。通常,例如在水中或在有机溶剂中或在水与有机溶剂的混合物中,通过使游离酸形式或游离碱形式的这些化合物与化学计算量的适当碱或酸反应来制备这样的盐。通常,优选如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈的非水介质。酸加成盐的实例包括无机酸加成盐,例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐;以及有机酸加成盐,例如乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐的实例包括无机盐,例如钠盐、钾盐、钙盐和铵盐;以及有机碱盐,例如诸如乙二胺、乙醇胺、N,N-二烯基乙醇胺、三乙醇胺和碱性氨基酸盐。
本发明的化合物可以为游离化合物或溶剂合物(例如水合物)的结晶形式,并且两种形式均在本发明范围内。在本领域内,溶剂化的方法通常是已知的。
通式I化合物前药的任何化合物在本发明的范围和精神内。术语“前药”以其最广泛的含义的使用,并包括在体内被转化为本发明化合物的那些衍生物。这样的衍生物容易被本领域技术人员所想起,并且包括例如游离羟基被转化为酯的化合物。
本文提及的任何化合物旨在表示这样的特殊化合物以及某些变化或形式。特别地,本文提及的化合物可以具有不对称中心,并因此存在不同的对映异构体形式。本文提及的化合物的所有旋光异构体和立体异构体及它们的混合物被认为在本发明范围内。因此本文提及的任何给定的化合物旨在表示任一外消旋体、一种或多种对映异构体形式、一种或多种非对映异构形式、一种或多种阻转异构形式以及它们的混合物。特别地,由上述通式I表示的本发明的化合物可以包括取决于它们的不对称性的对映异构体或非对映异构体。双键的立体异构也是可以的,因此在某些情况下,分子可以存在(E)-异构体或(Z)-异构体。如果分子含有若干双键,则每一双键会具有与该分子其它双键立体异构相同或不同的自身立体异构。单一的异构体和异构体的混合物在本发明范围内。
而且,本文提及的化合物可以作为几何异构体(即,顺式和反式异构体)、互变异构体或阻转异构体(atropoisomer)存在。特别地,术语互变异构体是指化合物的两种或更多种结构异构体中的一种,该结构异构体以平衡状态存在,并易于从一种异构形式转化为另一种异构形式。常见的互变异构对为胺-亚胺、酰胺-酰亚胺、酮-烯醇、内酰胺-内酰亚胺等。此外,本文提及的任何化合物旨在表示水合物、溶剂合物和多晶型物及它们的混合物,当这样的形式存在于介质中时。另外,本文提及的化合物可以以同位素标记的形式存在。本文提及的化合物的所有几何异构体、互变异构体、阻转异构体、水合物、溶剂合物、多晶型物和同位素标记形式以及它们的混合物被认为在本发明的范围内。
为了提供更简明的描述,本文给出的某些定量表述未用术语“约”来修饰。应当理解,不论是否明确使用术语“约”,本文给出的每一个量意图指实际的给定值,并且还意图指基于本领域普通技术而合理地推断的这样的给定值的近似值,由于这样的给定值的实验和/或测量条件,所述给定值的近似值包括当量和近似值。
在通式I的化合物中,特别优选的R1和R6各自独立地为氢或者取代或未取代的C1-C12烷基,并且更优选的R1和R6各自独立地为氢或者取代或未取代的烷基,所述烷基选自甲基,乙基,丙基,异丙基和包括异丁基、仲丁基和叔丁基在内的丁基。特别优选的R1和R6各自独立地为甲基、甲硫基甲基或异丙基,最优选的R1和R6为甲硫基甲基。
特别优选的R4和R9各自独立地为氢或者取代或未取代的C1-C12烷基;并且更优选的R4和R9各自独立地为氢或者取代或未取代的烷基,所述烷基选自甲基,乙基,丙基,异丙基和包括异丁基、仲丁基和叔丁基在内的丁基,最优选的R4和R9为氢。
特别优选的R3和R8各自独立地为巯基烷基,其中巯基是受保护的,或者R3和R8形成基团-CH2-S-S-CH2-。优选地,R3和R8形成基团-CH2-S-S-CH2-。
特别优选的R2和R7为氢。
特别优选的R5和R10各自独立地为氨基保护基团或-(C=O)R”,其中每一R”独立地为取代或未取代的杂芳基。更优选的R5和R10各自独立地为-(C=O)R”,其中每一R”独立地为杂芳基,所述杂芳基选自取代或未取代的噌啉基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的萘啶基、取代或未取代的喹喔啉基以及取代或未取代的喹唑啉基;并且甚至更优选的R5和R10各自独立地为取代或未取代的喹啉基和取代或未取代的喹喔啉基。最优选的R”为取代或未取代的喹啉基。所述基团的优选取代基为OR’、=O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、N(R’)2、=N-R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(=NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCON(R’)2、受保护的OH、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂环基,其中每一R’基团独立地选自氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、COOH、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂环基。当这样的基团自身被取代时,取代基可以选自以上所列。上述基团的甚至更优选的取代基为OH,SCH3,SH,NH2,NHC(=NH)NH2,CONH2,COOH,苯基,对、间或邻羟基苯基,包括1-、2-和3-吲哚基在内的吲哚基以及包括4-和5-咪唑基在内的咪唑基。
特别优选的Ra、Rb和Rc各自独立地为氢或者取代或未取代的C1-C12烷基。更优选的Ra、Rb和Rc各自独立地为氢或者取代或未取代的C1-C6烷基;并且甚至更优选的Ra、Rb和Rc各自独立地为氢或甲基。特别地,最优选的Ra为甲基,Rb为甲基并且Rc为氢。
特别优选的Rd、Re和Rf各自独立地为氢或者取代或未取代的C1-C12烷基。更优选的Rd、Re和Rf各自独立地为氢或者取代或未取代的C1-C6烷基;并且甚至更优选的Rd、Re和Rf各自独立地为氢或甲基。特别地,最优选的Rd为甲基、Re为甲基并且Rf为氢。
特别优选的Rh为取代或未取代的C1-C12烷基或者n为1至25的-(CH2-CH2O)n-CH3基团。更优选的Rh为取代或未取代的C1-C6烷基或者n为1至15的-(CH2-CH2O)n-CH3基团。甚至更优选Rh为甲基、乙基、丙基或异丙基。最优选的Rh为甲基。
特别优选的Y为S或NRi,并且最优选的Y为NRi。
特别优选的Ri为氢或者取代或未取代的C1-C12烷基或者n为1至25的-(CH2-CH2O)n-CH3基团。更优选的Ri为取代或未取代的C1-C6烷基或者n为1至15的-(CH2-CH2O)n-CH3基团。甚至更优选的Ri为甲基、乙基、丙基或异丙基。最优选的Ri为甲基。
在本发明另一实施方案中,还优选的是,R1-R2对和/或R6-R7对独立地形成取代或未取代的C1-C12亚烷基,或者与它们所连接的相应C原子一起形成取代或未取代的C3-C12环烷基。更优选的R1-R2对和/或R6-R7对独立地形成C1-C6亚烷基,或者与它们所连接的相应C原子一起形成C3-C6环烷基。甚至更优选的R1-R2对和/或R6-R7对独立地形成C1-C4亚烷基,或者与它们所连接的相应C原子一起形成C3-C5环烷基。最优选的R1-R2对和/或R6-R7对独立地形成亚甲基,或者与它们所连接的相应C原子一起形成C3-环烷基。
本发明优选的化合物是通式II的那些化合物或其药物可接受的盐、衍生物、互变异构体、前药或立体异构体,
通式II
其中R1、R2、R5、R6、R7、R10、Y和Rh基团具有以上给定的相同含义。
在通式II的化合物中,特别优选的R1和R6各自独立地为氢或者取代或未取代的C1-C12烷基;并且更优选的R1和R6各自独立地为氢或者取代或未取代的烷基,所述烷基选自甲基,乙基,丙基,异丙基和包括异丁基、仲丁基和叔丁基在内的丁基。特别优选的R1和R6各自独立地为甲基、甲硫基甲基或异丙基,最优选R1和R6为甲硫基甲基。
特别优选的R2和R7为氢。
特别优选的R5和R10各自独立地为氨基保护基团或-(C=O)R”,其中每一R”独立地为取代或未取代的杂芳基。更优选的R5和R10各自独立地为-(C=O)R”,其中每一R”独立地为杂芳基,所述杂芳基选自取代或未取代的噌啉基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的萘啶基、取代或未取代的喹喔啉基以及取代或未取代的喹唑啉基;并且甚至更优选的R5和R10各自独立地为取代或未取代的喹啉基和取代或未取代的喹喔啉基。最优选的R”为取代或未取代的喹啉基。所述基团的优选取代基为OR’、=O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、N(R’)2、=N-R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(=NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCON(R’)2、受保护的OH、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂环基,其中每一R’基团独立地选自氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、COOH、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂环基。当这样的基团自身被取代时,取代基可以选自以上所列。上述基团的甚至更优选的取代基为OH,SCH3,SH,NH2,NHC(=NH)NH2,CONH2,COOH,苯基,对、间或邻羟基苯基,包括1-、2-和3-吲哚基在内的吲哚基以及包括4-和5-咪唑基在内的咪唑基。
特别优选的Rh为取代或未取代的C1-C12烷基或者n为1至25的-(CH2-CH2O)n-CH3基团。更优选的Rh为取代或未取代的C1-C6烷基或者n为1至15的-(CH2-CH2O)nCH3基团。甚至更优选的Rh为甲基、乙基、丙基或异丙基。最优选的Rh为甲基。
特别优选的Y为S或NRi,并且最优选的Y为NRi。
特别优选的Ri为氢或者取代或未取代的C1-C12烷基或者n为1至25的-(CH2-CH2O)n-CH3基团。更优选的Ri为取代或未取代的C1-C6烷基或者n为1至15的-(CH2-CH2O)n-CH3基团。甚至更优选的Ri为甲基、乙基、丙基或异丙基。最优选的Ri为甲基。
在本发明另一实施方案中,还优选的是,R1-R2对和/或R6-R7对独立地形成取代或未取代的C1-C12亚烷基,或者与它们所连接的相应C原子一起形成取代或未取代的C3-C12环烷基;更优选的是,R1-R2对和/或R6-R7对独立地形成C1-C6亚烷基,或者与它们所连接的相应C原子一起形成C3-C6环烷基。甚至更优选的是,R1-R2对和/或R6-R7对独立地形成C1-C4亚烷基,或与它们所连接的相应C原子一起形成C3-C5环烷基。最优选的是,R1-R2对和/或R6-R7对独立地形成亚甲基,或者与它们所连接的相应C原子一起形成C3-环烷基。
本发明特别优选的化合物如下:
化合物1
并且所述化合物的优选立体异构体如下:
化合物2
能够通过采用已知的合成相关化合物的过程的合成来获得本发明的化合物(Albericio et al.Int.J.of Peptide Research and Therapeutics,2007,13,295-306;Albericio et al.Chem.Eur.J.2006,12,9001-9009;Albericio et al.J.Am.Chem.Soc.2007,129,5322-5323;Boger andLewis,WO 02/49577;Boger and Lee,J. Org. Chem. 2000,65,5996-6000;Boger et al.J.Am.Chem.Soc.2001,123,561-568;Lorentzand Diederichsen,J.Org.Chem.2000,65,5996-6000;Dietrich andDiederichsen,Eur.J.Org.Chem.2005,147-153;Hae kim et al.Bioorganic Med.Chem.Lett.2004,14,541-544;Malkinson et al.J.Org.Chem.2005,70,7654-7661;Olsen et al.Tetrahedron,1982,38,57-61;Olsen and Dhaon,J.Org.Chem.1981,46,3436-3440;Olsen andChakravarty,Pept.Struct.Biol.Funct.Proc.Am.Pept.Symp.,6th,1979,559-562;Olsen,J.Am.Chem.Soc.1978,100,7684-7690;Chakravartyand Olsen,Tetrahedron Lett.1978,19,1613-1616;Olsen and Ciardelli,J.Am.Chem.Soc.1977,99,2806-1807;Olsen et al.J.Org.Chem.1975,40,3110-3112;Shin et al.Bull.Chem.Soc.Japan,1984,57,2203-2210;Shinet al.Bull.Chem.Soc.Japan,1984,57,2211-2215;Shin et al.Bull.Chem.Soc.Japan,1978,51,1501-1506;Bayó-Puxan,N.Ph.D.Thesis,University of Barcelona,2006)。
例如,能够采用两种不同的策略来合成化合物2。
两种策略都从制备连接至树脂的四肽开始,这如方案1中所示地获得。
(a)Fmoc-Gly-OH,DIEA,CH2Cl2;(b)MeOH;(c)哌啶/DMF(1∶4);(d)Boc-D-Dap(Fmoc)-OH,HATU,HOAt,DIEA,DMF;(e)哌啶/DMF(1∶4),哌啶/DBU/甲苯/DMF(1∶1∶4∶14);(f)2-NBSCl,DIEA,CH2Cl2;(g)PPh3,DIAD,MeOH,THF;(h)HO-CH2CH2-SH,DBU;(i)Alloc-NMeCys(Me)-OH,HATU,HOAt,DIEA,DMF;(l)Pd(PPh3)4,PhSiH3,CH2Cl2;(m)Alloc-NMeCys(Acm)-OH,HATU,HOAt,DIEA,DMF.
方案1
策略I
在该策略中,在四肽树脂的末端氨基上存在四肽树脂的选择性脱保护,并且独立地,根据方案2,脱保护后,使四肽从树脂断裂,随后使两个片段偶联以提供直链八肽。
(a)Pd(PPh3)4,PhSiH3,CH2Cl2;(b)TFA/CH2Cl2(2∶98);(c)PyAOP,DIEA,DMF;(d)Pd(Ph3)4,PhSiH3,CH2Cl2
方案2
根据方案3,通过形成-S-S-桥随后断裂使直链八肽进行固相环化以提供单环八肽。
方案3
根据方案4,使单环八肽溶液环化,随后脱保护并与3-羟基喹啉-2-羧酸偶联以提供化合物2。
(a)EDC·HCl,HOAt,DIEA,CH2Cl2,DMF;(b)TFA/CH2Cl21∶1;(c)EDCl,HOSu,3-羟基喹啉-2-羧酸,DIEA,CH2Cl2
方案4
策略II
在该策略中,除去末端保护基团后,根据方案5,使四肽树脂中的两条四肽链通过形成-S-S-桥而进行一锅环化,随后从树脂端断裂以提供直链四肽二聚体。
方案5
根据方案6,使该直链二聚体经由形成两酰胺键进行双环化,随后脱保护并与3-氨基-2-喹啉羧酸偶联以提供化合物2。
(a)PyBOP,HOAt,DIEA,CH2Cl2,DMF;(b)TFA/CH2Cl21∶1;
(c)EDC·HCl,HOSu,3-羟基喹啉-2-羧酸,DIEA,CH2Cl2
方案6
能够通过对化合物2所述的等效工艺,通过在每一种情况下选择中间体化合物的适当取代基来合成化合物1和2的类似物。
在必要时,能够将适当保护基团用在取代基上以确保反应基团不受影响。能够设计合成以采用前体取代基,所述前体取代基能够在适当的阶段转化为期望的取代基。能够将环结构中的饱和或不饱和作为合成的一部分引入或除去。能够将原材料和试剂如所期望地修饰以确保预期化合物的合成。此外,还能够通过本领域技术人员已知的合成有机化学中的常见方法由化合物1和2来合成类似物。
能够将上述合成路线如期望地修饰以提供立体定向化合物以及立体异构体的混合物。可以在合成期间,通过包括使用立体定向试剂的各种方法或者通过将手性中心引入化合物来合成特定的立体异构体或特定的混合物。可以在合成期间引入一个或多个立构中心,并且还可以转化存在的立构中心。此外,一旦通过本领域技术人员已知的标准解决技术合成化合物,则可以将立体异构体分离。
上述通式I和II化合物的重要特征在于它们的生物活性,特别是它们的细胞毒活性。在这点上,我们惊讶地发现本发明的化合物表现出比实例5所示的母体化合物Azathiocoraline增强的抗肿瘤活性。因此,根据本发明,我们提供具有细胞毒活性的通式I和II化合物的新药物组合物,及它们作为抗肿瘤剂的用途。因此本发明还提供包含本发明化合物或其药物可接受的盐、衍生物、互变异构体、前药或立体异构体以及药物可接受的载体的药物组合物。
药物组合物的实例包括适合配制为用于口服、局部或胃肠外给药的任何固体(片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等)或液体(溶液、悬浮液或乳液)组合物。
可以通过任何适当的方法给予本发明化合物或组合物,例如静脉内输注、口服制剂和腹腔内给药及静脉内给药。我们优选使用的输注时间高达24小时,更优选1小时至12小时,最优选1小时至6小时。特别期望允许进行治疗而不用在医院过夜的短时间输注。然而,如果需要,输注可以为12小时至24小时或者甚至更长的时间。可以以适当间隔来进行输注,例如1周至4周。可以以缓释制剂或通过其它标准递送装置,通过脂质体或纳米球封装来递送包含本发明化合物的药物组合物。
化合物的适当剂量根据具体的制剂、应用的方式和治疗的具体部位、宿主和肿瘤来改变。应当考虑其它因素,如年龄、体重、性别、饮食、给药时间、排泄速率、宿主条件、联合用药、反应灵敏度和疾病严重性。能够在最大耐受剂量内连续地或周期地进行给药。
可以将本发明的化合物和组合物与其它药物一起使用以提供联合疗法。其它药物可以形成相同组合物的一部分,或提供为同时或不同时给药的单独组合物,即单独、同时或连续给药。
本发明化合物的抗肿瘤活性包括但不限于肺癌、结肠癌和乳腺癌。
实施例
总则
受保护的氨基酸衍生物PyBOP由Applied Biosystems(Framingham,MA)、Bachem(Bubendorf,Switzerland)、Albatross(Montreal,Canada)和NovaBiochemSwitzerland)获得。2-氯三苯甲基树脂由Iris Biotech(Marktredwitz,Germany)获得。DIEA、DIPCDI、哌啶、TFA、氨、碘代甲烷、氯甲酸烯丙酯和氯甲酸对硝基苄酯由Aldrich(Milwaukee,WI)获得,并且EDC·HCl和HOAt来自Luxembourg Industries(Tel Aviv,Israel)。DMF、CH2Cl2、乙腈(HPLC级)、甲醇(HPLC级)、二噁烷、Et2O、TBME(叔丁基甲基醚)和EtOAc(乙酸乙酯)由SDS(Peypin,France)获得。(R)(-)-噻唑烷-4-羧酸、三氟甲烷磺酸、N-羟基乙酰胺甲基(N-hidroxyacetamide methyl)和N-羟基琥珀酰亚胺由Fluka(Buchs,Switzerland)获得。除了DMF和CH2Cl2及THF以外,所有市售的试剂和溶剂按收到的原样使用,将DMF和CH2Cl2用氮气鼓泡以除去挥发性污染物(DMF)并在活化的分子筛(Merck,Darmstadt,Germany)上储存,并且将THF从钠/二苯甲酮中蒸馏。
在圆底烧瓶中进行溶液反应。将有机溶剂萃取物通过无水MgSO4干燥,随后在低于40℃的温度下减压除去溶剂。
在配备聚乙烯多孔盘的聚丙烯注射器(2,5mL)中进行固相合成。通过抽吸来除去溶剂和可溶性试剂。用哌啶-DMF(1∶4,v/v)(1×1min,2×5min)来除去Fmoc基团。
对于每一次洗涤,使用5mL溶剂.g-1树脂,以DMF(5×1min)和CH2Cl2(5×1min)进行脱保护、偶联和最终脱保护之间的洗涤。在25℃下进行肽合成转化和洗涤。
HPLC柱(C18反相分析柱,5.0μm×4.6mm×150mm和C18反相半制备柱,5.0μm×7.8mm×100mm)由Waters(Ireland)获得。在Waters仪器上进行分析HPLC,所述Waters仪器包括分离模块(Waters 2695)、自动进样器、光电二极管阵列检测器(Waters996)和系统控制器(Millenium login)。在220nm和254nm处进行UV检测,并且以1.0mL×min-1的流速,将CH3CN(+0.036%TFA)在H2O(+0.045%TFA)中的线性梯度运行15min。在Waters仪器上进行半制备HPLC,所述Waters仪器包括分离模块(Waters 1525二元泵)、自动进样器和双波长吸收检测器(Waters 2487)。在220nm和254nm处进行UV检测,并且在每一情况的具体条件下以3.0mL×min-1的流速运行CH3CN(+0.036%TFA)在H2O(+0.045%TFA)中的线性梯度。
利用ACH基质,在Applied Biosystems VoyagerDE RP上,并在Waters Micromass ZQ分光计和Agilent离子阱(Agilent Ion Trap)1100系列LC/MSDTrap中进行肽样品的MALDI-TOF和ES(+)-MS分析。
实施例1
Boc-D-Dap(Me)-Gly-O-CTC-PS.
(a)将CTC树脂(400mg,1.6mmol/g)置于配备了2个聚乙烯滤片的10mL聚丙烯注射器中。将树脂用DMF(5×1min)和CH2Cl2(3×1min)洗涤,并添加Fmoc-Gly-OH(118.8mg,0.4mmol)和DIEA(474μL,2.66mmol,6.6eq.)的CH2Cl2溶液。10min后,添加更多的DIEA(237μL,1.33mmol,3.3eq),并在室温下将混合物搅拌50min。
(b)通过添加MeOH(320μL)将反应淬灭,并将混合物再搅拌10min。
(c)过滤后,将肽树脂用CH2Cl2(3×1min)、DMF(3×1min)、哌啶-DMF(1∶4;2×1min,2×5min)洗涤。通过在290nm处测量吸光度而计算的装载为0.93mmol/g。
(d)接着将Boc-D-Dap(Fmoc)-OH(682mg,1.6mmol,4eq)与作为偶联剂的HATU(456mg,1.6mmol,4eq)、HOAt(218mg,1.6mmol,4eq)和DIEA(570μL,3.2mmol,8eq)引入DMF中。
(e)搅拌35min并过滤后,将肽树脂用DMF(3×0.5min)、CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)、哌啶-DMF(1∶4;1×1min;3×5min;1×10min)、哌啶-DBU-甲苯-DMF(1∶1∶4∶14;2×5min)洗涤,并再次用DMF(5×0.5min)和CH2Cl2(3×0.5min)洗涤。
(f)添加2-NBS-Cl(354mg,1.6mmol,4eq.)和DIEA(0.726μL,4mmol,10eq)的CH2Cl2溶液,并将混合物搅拌90min。
(g)过滤并用CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)、CH2Cl2(3×0.5min)和THF(3×0.5min)洗涤后,将PPh3(524mg,2mmol,5eq)和MeOH(160μL,4mmol,10eq)的THF溶液与DIAD(404μL,2mmol,5eq)的THF溶液混合,并添加至肽树脂中。搅拌1h并过滤后,将肽树脂用THF(3×0.5min)、CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)洗涤。
使一等份的树脂断裂以提供Boc-D-Dap(Me)(o-NBS)-Gly-OH:
HPLC条件:tR=10.0min(梯度:15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O));纯度90%。
HPLC-ES条件:tR=10.0min(梯度:15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O))。C17H24N4O9Sm/z计算值:460.13;[M+H]+实测值:460.10。
(h)在DMF中用DBU(300μL,2mmol,5eq.)和2-巯基乙醇(280μL,4mmol,10eq)处理(2×15min)后,将树脂用DMF(3×0.5min)、CH2Cl2(3×0.5min)和DMF(3×0.5min)洗涤。
使一等份的树脂断裂以提供Boc-D-Dap(Me)-Gly-OH:
HPLC条件:tR=4.23min(梯度:15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O))。
HPLC-ES条件:tR=3.87min(梯度:15min内,从5∶100至100∶0(ACN/H2O))。C11H21N3O5m/z计算值:275.15;[M+H]+实测值:276.73。
被{[Alloc-NMeCys(Acm)-NMeCys(Me)&][Boc-D-Dap(Me&)-Gly-O-CTC-PS]}-保护的四肽
(i)在DMF中,在HATU(456mg,1.6mmol,4eq)、HOAt(218mg,1.6mmol,4eq)和DIEA(570μL,3.2mmol,8eq)的存在下,通过添加Alloc-NMeCys(Me)-OH(373mg,1.6mmol,4eq)使肽链延长35min,并在过滤后用DMF(3×0.5min)和CH2Cl2(3×0.5min)进行洗涤。将De Clercq测试用于指示偶联的完成。
(1)接着,在CH2Cl2中将肽树脂用Pd(PPh3)4(46mg,0.04mmol,0.1eq.)和PhSiH3(292μL,4mmol,10eq.)处理(3×15min),并用CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)、CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)洗涤。
(m)Alloc-NMeCys(Acm)-OH(464mg,1.6mmol,4eq)的引入需要在与步骤(i)中所提供的那些条件相同的条件下重复进行偶联。
将肽树脂分为2部分:将3/4用于4+4策略;将1/4保留为二聚体策略。
实施例2:4+4方法
被{[Boc-D-Dap(Me&1)-Gly-NMeCys(Acm)-NMeCys(Me)&2][Alloc-NMeCys(Acm)-NMe-Cys(Me)&1][Boc-D-Dap(Me&2)-Gly-O-CTC-PS]}-直链保护的八肽
将用于4+4方法的肽树脂进一步分裂成2部分:
如在实施例1中所述,在CH2Cl2中将1/3的树脂用Pd(PPh3)4和PhSiH3处理(HPLC条件:6.7min(主),6.9min(次);从0∶100至100∶0(ACN/H2O));
将2/3的树脂用TFA/CH2Cl2溶液(2∶98,5×1min)处理,并在H2O(12mL,60mL/g树脂)的存在下将滤液收集、干燥并冻干。
HPLC条件:tR=9.3min(次),9.7min(主);15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
HPLC-ES条件:tR=9.7min;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
C27H46N6O10S2m/z计算值:678.27;[M]+实测值:677.91。
将冻干的四肽添加至DMF中的具有PyAOP(基于装载的肽计算为94mg,0.18mmol,2eq)和DIEA(94μL,0.54mmol,6eq)的肽树脂部分。用DIEA将pH调节为8。在室温下将混合物搅拌过夜。不过滤,将De Clercq测试用于指示反应的完成。测试阳性后,添加相同量的PyAOP和DIEA,并将混合物再搅拌3小时。测试阳性后,添加更多的PyAOP和DIEA。2小时后,当测试显示阴性时,过滤后,将树脂用DMF(3×0.5min)、CH2Cl2(3×0.5min)和DMF(3×0.5min)洗涤。
HPLC-ES条件:tR=10.3min;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
C50H86N12O17S4 m/z计算值:1254.5;[M]+实测值:1254.32。
{[Boc-D-Dap(Me&1)-Gly-NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&3][NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&1][Boc-D-Dap(Me&3)-Gly-OH]}-二硫桥键的形成
通过在CH2Cl2中用Pd(PPh3)4(46mg,0.04mmol,0.1eq.)和PhSiH3(292μL,4mmol,10eq.)处理(3×15min)来使Alloc基团断裂,并用CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)、CH2Cl2(3×0.5min)和DMF(3×0.5min)洗涤。为了形成二硫桥键,将I2(127mg,0.5mmol,5eq,2.5eq×Acm)的DMF溶液(0.01M)添加至肽树脂中。于室温下将混合物搅拌10min,并在过滤后,重复处理。随后,将树脂用DMF(3×0.5min)、CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)和CH2Cl2(3×0.5min)洗涤。断裂的肽等份的HPLC-MS分析指示反应的完成。通过用TFA/CH2Cl2溶液(2∶98,5×1min)处理来实现肽断裂,并在H2O(6mL,60mL/g树脂)的存在下将滤液收集,干燥并冻干。
HPLC条件:tR=9.0;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
HPLC-ES条件:tR=7.5min;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
C40H70N10O13S4 m/z计算值:1026.40;[M]+实测值:1026.45。
{[Boc-D-Dap(Me&1)-Gly-NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&3][Boc-D-Dap(Me&3)-Gly-NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&1]-溶液中的环化
将溶于CH2Cl2/DMF(9∶1,100mL,1mM)中的环肽(0.1mmol)添加至HOAt(54mg,0.4mmol,4eq.)在尽可能少的DMF中的溶液。添加DIEA直至pH为中性,并且当添加EDC·HCl(77mg,0.2mmol,2eq.)时,环化反应开始。将混合物搅拌5小时,并且HPLC-MS分析指示反应的完成。将有机层用饱和NH4Cl水溶液(2×50mL)和盐水(2×50mL)洗涤,用MgSO4干燥,过滤并在真空下蒸发。
HPLC条件:tR=12.3;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
HPLC-ES条件:tR=12.2min;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
C40H68N10O12S4 m/z计算值:1008.4;[M+H-Boc]+实测值:908.49,[M+H-2Boc]+实测值:807.45。
{[3-HQA-D-Dap(Me&1)-Gly-NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&3][3-HQA-D-Dap(Me&3)-Gly-NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&1]-化合物2
将双环肽溶于TFA-CH2Cl2(1∶1,2mL)中,并在室温下将混合物搅拌1小时。在减压下将溶剂蒸发,并通过与甲苯的共蒸发而除去残留的酸。添加H2O,并将产物冻干。将产物溶于HCl(0.001M)中并再次冻干。
将未受保护的双环肽溶于CH2Cl2(300μL)和DIEA中直至pH为中性。将3-羟基喹啉-2-羧酸(37mg,0.2mmol,2eq)在CH2Cl2(1mL)中用EDC·HCl(38mg,0.2mmol,2eq)和HOSu(22mg,0.2mmol,2eq)预活化,15min后,将该溶液添加至先前制备的肽溶液中。将混合物搅拌20h,并且HPLC-MS分析指示反应的完成。将有机层用饱和NH4Cl水溶液(2×50mL)和盐水(2×50mL)洗涤,用MgSO4干燥,过滤并在真空下蒸发。
HPLC条件:tR=13.2;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
HPLC-ES条件:tR=13.3min;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。C50H62N12O12S4 m/z计算值:1150.4;[M+H+]实测值:1151.5。
实施例3二聚体策略
{[NMeCys(&1)-NMeCys(Me)&2)][Boc-D-Dap(Me&2)-Gly-OH]}2-二聚体
如在实施例1中所述,将肽树脂在CH2Cl2中用Pd(PPh3)4和PhSiH3处理。通过用I2(126.9mg,0.5mmol,0.5eq.)的DMF溶液(10mL)处理(2×10min)来实现二聚体的形成,随后用DMF(3×0.5min)、CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)和CH2Cl2(3×0.5min)洗涤。断裂的肽等分的HPLC-MS分析指示反应的完成。随后,通过用TFA/CH2Cl2溶液(2∶98,5×1min)处理使肽从树脂解离,并在H2O(6mL,60mL/g树脂)的存在下,将滤液收集,干燥并冻干。
HPLC条件:tR=7.1;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
HPLC-ES条件:tR=6.1min;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
C40H72N10O12S4 m/z计算值:1044.4;[M+H]+实测值:1043.49,[M+H]+2实测值:522.49。
{[Boc-D-Dap(Me&1)-Gly-NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&3][Boc-D-Dap(Me&3)-Gly-NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&1]-环化反应
将肽(0.05mmol)溶于CH2Cl2/DMF(9∶1)中,并添加至HOAt(54mg,0.4mmol,8eq.)的CH2Cl2/DMF(9∶1,50mL,1mM)溶液中。添加DIEA直至pH为8并添加PyBOP(208mg,0.4mmol,8eq)以开始反应。将混合物搅拌12小时,并且HPLC-MS分析指示反应的完成。将有机层用饱和NH4Cl(2×50mL)和盐水(2×50mL)洗涤,用MgSO4干燥,并在真空下蒸发。
HPLC条件:tR=12.1;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
HPLC-ES条件:tR=12.1min;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
C40H68N10O12S4 m/z计算值:1008.40;[M]+实测值:1008.89。
{[3-HQA-D-Dap(Me&1)-Gly-NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&3][3-HQA-D-Dap(Me&3)-Gly-NMeCys(&2)-NMe-Cys(Me)&1]-化合物2
按照实施例2最后步骤中公开的相同方法来获得化合物2。
HPLC条件:tR=13.2;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
HPLC-ES条件:tR=13.3min;15min内,从0∶100至100∶0(ACN/H2O)。
C50H62N12O12S4 m/z计算值:1150.40;[M+H]+实测值:1151.53。
实施例4化合物2的纯化和表征
使由实施例2和3获得的粗化合物2通过HPLC纯化以获得纯化的化合物2(952μg,1.0%收率)。
纯化的HPLC条件:30min内,线性梯度从45∶55至60∶40(ACN/H2O);流速为3mL/min。
tR=13.6min(4+4策略)
tR=13.0min(二聚体策略)
分析HPLC条件:tR=13.0;15min内,从5∶95至100∶0(ACN/H2O)。
MALDI-TOF:C50H62N12O12S4 m/z计算值:1150.4;[M+H]+实测值:1151.5;[M+Na]+实测值:1173.8
HRMS:C50H63N12O12S4计算值:1151.3566;实测值:1151.3573
实施例5检测抗肿瘤活性的生物测定
该测定的目的是评价待测样品的体外细胞抑制活性(延迟或停滞肿瘤细胞生长的能力)或细胞毒性(杀死肿瘤细胞的能力)。
细胞系
名称 | N°ATCC | 物种 | 组织 | 特征 |
A549 | CCL-185 | 人 | 肺 | 肺癌(NSCLC) |
HT29 | HTB-38 | 人 | 结肠 | 结肠直肠腺癌 |
MDA-MB-231 | HTB-26 | 人 | 乳腺 | 乳腺癌 |
使用SBR比色测定评价细胞毒性
将利用磺酰罗丹明B(SRB)反应的比色型测定适用于细胞生长和存活力的定量测量(按照Skehan P et al.J.Natl.Cancer Inst.1990,82,1107-1112所述的技术)。
该测定形式采用SBS-标准96-孔细胞培养微板(Faircloth et al.Methods in cell science(细胞科学中的方法),1988,11(4),201-205;Mosmann et al.Joumal of.Immunological.Methods,1983,65(1-2),55-63)。源自不同类型人癌症的本研究中所用的所有细胞系从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection(ATCC))获得。
在37℃、5%CO2和98%的湿度下,将细胞保持在达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)中,所述达尔伯克改良伊格尔培养基补充了10%胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。为了实验,利用胰蛋白酶消化从亚融合性培养物(subconfluent culture)收获细胞,并在计数和平板接种之前再悬浮于新鲜的培养基中。
将150μL等份的细胞以5×103细胞/孔接种于96孔微量滴定板中,并允许细胞在无药物培养基中附着于板表面18小时。将每一细胞系的一种对照(未经处理)板固定(如下文所述),并用作时间零点的参考值。随后,将50μL等份的测试样品以10μg/mL至0.00262μg/mL添加至十个连续稀释的培养物中。48小时的暴露后,通过SRB方法评价抗肿瘤效果:简言之,将细胞用PBS洗涤两次,在1%戊二醛溶液中固定15min,在PBS中淋洗两次,并在室温下于0.4%SRB溶液中染色30min。随后将细胞用1%乙酸溶液淋洗若干次并风干。随后在10mM三羟甲基氨基甲烷碱(trizma base)溶液中提取SRB,并在自动分光光度板读取器上于490nm处测量吸光度。将细胞存活率表示为对照细胞生长的百分数。通过应用NCI算法(Boyd MR and Paull KD.Drug Dev.Res.1995,34,91-104)来评价待测样品的最终效果。
利用一式三份的培养物的平均值±SD,使用非线性回归分析自动产生剂量-反应曲线。通过自动插值计算三个参考参数(NCI算法):GI50=产生50%生长抑制的浓度;TGI=完全生长抑制(抑制细胞生长效果)以及LC50=产生50%净细胞杀伤(细胞毒性效果)的浓度。
表1示出本发明的化合物相比母体化合物Azathiocoraline的生物活性数据,其根据Bayó-Puxan,Núria:Ph.D.Thesis,University ofBarcelona,2006中公开的方法获得。
表1细胞毒测定-活性数据(摩尔)
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Dale L. Boger et al..Development of a Solution-Phase Synthesis of Minor Groove Binding Bis-Intercalators Based on Triostin A Suitable for Combinatorial Synthesis.《J. Org. Chem.》.2000,第65卷(第19期),第5996-6000页. * |
Núria Bayó-Puxan et al..Beyond Azathiocoraline: Synthesis of Analogues.《International Journal of Peptide Research and Therapeutics》.2007,第13卷(第1-2期),第295-306页. * |
Núria Bayó-Puxan et al..Total Solid-Phase Synthesis of the Azathiocoraline Class of Symmetric Bicyclic Peptides.《Chemistry - A European Journal》.2006,第12卷(第35期),第9001-9009页. |
Núria Bayó-Puxan et al..Total Solid-Phase Synthesis of the Azathiocoraline Class of Symmetric Bicyclic Peptides.《Chemistry- A European Journal》.2006,第12卷(第35期),第9001-9009页. * |
ouml * |
rn Dietrich et al.Synthesis of Cyclopeptidic Analogues of Triostin A with Quinoxalines or Nucleobases as Chromophores.《Eur. J. Org. Chem》.2005,第147-153页. * |
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