CN101928787B - 检测甲型h1n1流感病毒抗药性突变的引物和探针及方法 - Google Patents
检测甲型h1n1流感病毒抗药性突变的引物和探针及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一组检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和荧光探针及其应用，以及检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的方法。采用本发明方法，操作方法简单，结果直观明了；引物和探针敏感性强，特异性好；在流感检测与监测中可快速的对是否是抗药株作出鉴定，大大减少了人力、物力的耗费。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一组检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和荧光探针及其应用，以及检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的方法。
(二)背景技术
流感(流行性感冒)是由流感病毒引起的一种人、禽、畜共患的急性传染病，其发病率、死亡率和造成的经济损失位居各传染病之首。奥司他韦(商品名：达菲)被广泛用来作为流感的预防和治疗，但流感病毒由于神经氨酸酶274位的组氨酸突变为酪氨酸而出现了显著的奥司他韦耐药性。目前建立了多种利用分子生物学方法检测具有奥司他韦耐药性基因型流感病毒的方法，如单核苷酸多态性分析、滚环扩增技术以及Sanger测序等，但这些方法不仅费时、费力、比较昂贵，而且还会由于实验室、工作人员、操作方法和标本的不同而影响其敏感性和特异性。
(三)发明内容
本发明目的是提供一组检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和荧光探针及其应用，以及检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和荧光探针，所述特异性扩增引物序列如下：
PN1H274Y-F：5’-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’
PN1H274Y-R：5’-AAGACACCCACGGTCGATTC-3’
该引物与甲型流感病毒神经氨酸酶274位点编码序列两端互补，其扩增片段的长度为168bp；
所述荧光探针序列如下：
PN1H274-Pb1：5’-HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3’
PN1H274Y-Pb2：5’-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3
探针的5’端标记荧光基团HEX或FAM，3’端标记MGB，NFQ为荧光淬灭基团，突变位点位于探针的中部。基因扩增产物以临床呼吸道分泌物总RNA为模板，通过实时逆转录PCR进行扩增。
所述的特异性扩增引物和荧光探针可用于制备检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的荧光PCR检测试剂盒。所述试剂盒主要包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、脱氧三磷酸核苷混合物、特异性扩增引物和荧光探针。
所述试剂盒中还包括ROXTM均一化参比染料。
本发明还涉及一种检测检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的方法，所述方法包括：
(1)提取样品RNA；
(2)荧光PCR扩增检测：取PCR缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、脱氧三磷酸核苷混合物、ROX均一化参比染料、特异性扩增引物和荧光探针配成反应液，加入样品RNA为模板进行扩增反应，反应条件为：42℃逆转录30min；95℃预变性2min；95℃，5s变性，55℃复性与延伸40s，收集FAM和HEX荧光，共40个循环；
所述特异性扩增引物序列如下：
PN1H274Y-F：5’-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’
PN1H274Y-R：5’-AAGACACCCACGGTCGATTC-3’
所述荧光探针序列如下：
PN1H274-Pb1：5’-HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3’
PN1H274Y-Pb2：
5’-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3’；
(3)结果分析：如果仅有HEX荧光积累而没有FAM荧光积累，则表示样品中存在H274基因型的甲型H1N1流感病毒，且未发生H274Y突变，为对奥司他韦敏感的病毒；如果有FAM荧光积累，则表示样品中存在甲型H1N1流感病毒，且已发生H274Y突变，为对奥司他韦不敏感的病毒；如果没有荧光出现，则表示样品中不存在甲型H1N1流感病毒。
所述步骤(2)中PCR反应液(以TaKaRa一步法荧光定量RT-PCR试剂盒为例)每25μL组成如下：
2×One Step RT-PCR Buffer 12.5μL
引物PN1H274Y-F 0.4μM
引物PN1H274Y-R 0.4μM
探针PN1H274-Pb1 0.2μM
探针PN1H274Y-Pb2 0.2μM
ROXTM均一化参比染料 0.5μL
TaKaRa Ex TaqTM HS 0.5μL
PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5μL
样品RNA 5μL
DEPC水补足至25μL。
本发明的有益效果主要体现在：采用本发明方法，操作方法简单，结果直观明了；引物和探针敏感性强，特异性好；在流感检测与监测中可快速的对是否是抗药株作出鉴定，大大减少了人力、物力的耗费。
(四)附图说明
图1为双重实时荧光逆转录PCR方法的特异性检测结果；曲线A代表274Y，曲线B代表274H，曲线C代表274H和274Y的混合液。
图2为双重实时荧光逆转录PCR方法的敏感性检测结果；用10倍倍比稀释的H1N1病毒RNA作为模板。A：WHO设计的实时方法检测A型流感；B：内部设计的2009流行性H1N1检测方法；C：WHO设计的2009流行性H1N1检测方法；D：本发明双重实时荧光逆转录PCR方法检测2009流行性H1N1中H274Y的突变。
图3为H274Y检测的模型图；：274H阳性样本(HEX荧光)；
：274H和274Y双阳性的样本(FAM和HEX荧光)；：阴性对照。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：引物和探针的设计
比对GenBank登录的流感NA基因序列并据此设计引物和探针。其中引物序列为：
PN1H274Y-F：5’-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’；
PN1H274Y-R：5’-AAGACACCCACGGTCGATTC-3’，
分别位于823～825突变位点的两侧，扩增片段长度为168bp。
探针序列为：
PN1H274-Pb1：5’-HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3’；
PN1H274Y-Pb2：5’-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3’。
分别与823～825位点及两端序列互补，其中荧光基团位于探针的5’端，MGB位于3’端。
实施例2：人工合成包含274野生型或突变型编码序列的RNA
用PN1H274Y-F和PN1H274Y-R引物从临床分离样本中扩增274H野生型DNA片段，用PN1H274Y-F和包含突变位点的274Rm(GCATTCCTCATAGTAATAATTAGGG)引物，包含突变位点的274Y-Fm(CCCTAATTATTACTATGAGGAATGC)和PN1H274Y-R分别扩增突变位点的5’和3’端片段，然后将纯化回收的片段混合作为模板，以PN1H274Y-F和PN1H274Y-R为引物进行扩增，获得含有274Y突变的片段。将突变型和野生型的片段克隆到pGEM-Teasy(Promega公司)载体中(pGEM-Teasy-274Y、pGEM-Teasy-274H)进行测序。
将MS2噬菌体的assembly protein和coat protein的基因片段用引物CTAGATCTCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTT和TTGGATCCGAGTTGAACTTCTTTGTTGTCTTC扩增后用BglII和BamHI酶切，酶切片段克隆到载体pET28a的BamHI位点中并测序鉴定方向，选取BamHI位点临近T7ter序列的pET28a-MS2作为进一步克隆的载体。用BamHI和HindIII从测序正确的pGEM-Teasy-274H和pGEM-Teasy-274Y质粒中切出目的片段并分别克隆到pET28a-MS2载体中构建pET28a-MS2-274H和pET28a-MS2-274Y质粒，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达，然后抽提RNase和DNase处理的菌液上清中的RNA。
实施例3：该方法的特异性检测
以季节性流感H1N1、H3N2及B型流感，人源高致病性禽流感H5N1和禽源的H9N2病毒RNA为模板，及104倍稀释的H274Y野生型和突变型RNA混合物作为模板进行特异性检测。
PCR反应液组成如下(采用TaKaRa一步法荧光定量RT-PCR试剂盒，ABI 7500荧光定量PCR仪)：
2×One Step RT-PCR Buffer 12.5μL
PN1H274Y-F 0.4μM
PN1H274Y-R 0.4μM
PN1H274-Pb1 0.2μM
PN1H274Y-Pb2 0.2μM
ROXTM均一化参比染料 0.5μL
TaKaRa Ex TaqTM HS 0.5μL
PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5μL
样品RNA 5μL
DEPC处理水补足至25μL，混匀；
反应程序为42℃逆转录30min；95℃预变性2min；95℃，5s变性，55℃复性与延伸40s，收集FAM(FAM通道)和HEX(VIC通道)荧光，共40个循环。
结果如图1所示，该方法可以特异的检测H274Y突变，与所检测的流感病毒没有交叉反应发生。季节性流感H1N1、H3N2和B型流感，人禽流感病毒H5N1以及禽源的H9N2病毒用来评价该方法是否会产生交叉反应，结果均未扩增。
实施例4：该方法的敏感性检测
将本发明方法(图2D)与WHO推荐的A型流感(图2A)及2009新型流感的检测方法(CDC protocol of real-time RT-PCR for influenza A(H1N1)，http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/CDCRealtimeRTPCR_SwineH1Assay-2009_20090430.pdf.)(图2C)、2009新型流感的检测试剂盒(上海超世生物技术公司)(图2B)进行比较。用等量的H1N1病毒RNA为模板进行PCR反应。结果如图2所示，证明该方法与WHO推荐的检测甲型流感的方法敏感性相同，明显优于WHO推荐的2009新型流感的检测方法。
实施例5：对临床样本的检测
对收集的715份H1N1阳性临床样本，以RNA作为模板进行双重实时荧光定量RT-PCR反应，对临床样本中是否存在H274Y基因型的病毒进行检测。
所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用Qiagen RNeasy MiniKit或其它试剂盒所提取。
本发明中，所述样品RNA的提取步骤可为：
1)离心管中加入500μl RLT和6μL β-巯基乙醇；
2)向上述溶液中加入200μL样本(包括含漱液、咽拭子、呼吸道吸出物等)，振荡混匀1min；
3)加入等体积的70％乙醇混匀；
4)取700μl混合液加入收集管内的离心柱中，12000rpm离心15s；
5)重复步骤4一次；
6)加入700μl RW1缓冲液于离心柱中，12000rpm离心15s；
7)加入500μl RPE缓冲液于离心柱中，12000rpm离心15s；
8)重复步骤7一次；
9)倒尽收集管中液体，空离一次；
10)加入适量无RNA酶的水溶解RNA并离心收集，置于-70℃保存。
所述双重实时荧光定量RT-PCR反应试剂组成(以TaKaRa一步法荧光定量RT-PCR试剂盒为例)和反应程序(以ABI 7500荧光定量PCR仪为例)为：
2×One Step RT-PCR Buffer 12.5μl
PN1H274Y-F 0.4μM
PN1H274Y-R 0.4μM
PN1H274-Pb1 0.2μM
PN1H274Y-Pb2 0.2μM
ROX参比染料 0.5μL
TaKaRa Ex TaqTM HS 0.5μL
PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5μL
病毒RNA 5μL
DEPC处理水补足至25μL，混匀；
反应程序为42℃逆转录30min；95℃预变性2min；95℃，5s变性，55℃复性与延伸40s，收集FAM(FAM通道)和HEX(VIC通道)荧光，共40个循环。
结果证明715份样本中，有一份出现了HEX和FAM两种荧光的累积，说明该份样本中的病毒为奥司他韦耐药型与敏感型混合病毒，且从扩增曲线中的Ct值可以看出，耐药型病毒明显多于敏感型病毒，通过设计一对引物扩增NA基因的ORF，并克隆到pGEM-Teasy载体进行蓝白斑筛选，随机挑取100个分离良好的白色菌落培养并测序，结果证明NA确为Y274与H274基因型的混合物，且其比例约为3.5∶1。该H274Y突变的神经氨酸酶基因序列已经登录美国GenBank数据库，登录号为HM145748。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省疾病预防控制中心
<120> 检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的引物和探针及方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
aggcctcata caagatcttc agaata 26
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
aagacaccca cggtcgattc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
atgcccctaa ttatcacta 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
aatgccccta attattacta 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
gcattcctca tagtaataat taggg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
ccctaattat tactatgagg aatgc 25
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
ctagatctcc tttcggggtc ctgctcaact t 31
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
ttggatccga gttgaacttc tttgttgtct tc 32
Claims (4)
1.一种检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和荧光探针，其特征在于：
所述特异性扩增引物序列如下：
PN1H274Y-F：5’-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’
PN1H274Y-R：5’-AAGACACCCACGGTCGATTC-3’
所述荧光探针序列如下：
PN1H274-Pb1：5’-HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3’
PN1H274Y-Pb2：5’-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3’。
2.如权利要求1所述的特异性扩增引物和荧光探针在制备检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的荧光PCR检测试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述试剂盒主要包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、脱氧三磷酸核苷混合物、特异性扩增引物和荧光探针。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述试剂盒中还包括ROXTM均一化参比染料。
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2010
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