CN101926771A - 一种酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体及其冻干制剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物药领域，公开了一种酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体及其冻干制剂，该脂质体配方含有以下重量份的原料：卡介菌多糖核酸1份，酰化支链淀粉1-10份，磷脂10-50份，胆固醇1-10份。该脂质体及其冻干制剂安全性好，稳定性显著提高，包封效果好，提高了对动物使用的顺应性和安全性。

Description

一种酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体及其冻干制剂

技术领域

本发明属于动物药领域，涉及一种酰化支链淀粉修饰口服兽用卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)脂质体及其冻干制剂，以及制备方法。

背景技术

使用高分子材料包裹脂质体后可以使得载体更稳定、结构更完整，来提高在其在口服或外周给药后复杂生理环境中的稳定性。支链淀粉从结构上来讲，是一个具有树枝形分支结构的多糖。相对分子质量较大，一般由1000-300,000个左右葡萄糖单位组成，分子量约为100万，有些可达600万。D-吡喃葡萄糖单位通过α-1，4-苷键连接成一直链，此直链上又可通过α-1，6-苷键形成侧链，在侧链上又会出现另一个分支侧链。主链中每隔6-9个葡萄糖残基就有一个分支，每一个支链平均含有约15-18个葡萄糖残基，平均每24-30个葡萄糖残基中就有一个非还原尾基。因此支链淀粉的结构为高支化聚合物，十分复杂。但由于考虑到支链淀粉本身有一定的亲水性，所以要将其结合到脂质体的脂质双分子层中，需要在其结构中加入亲脂性基团。本专利旨在使支链淀粉在催化剂条件下与棕榈酰氯等反应，合成酰化支链淀粉，并用该酰化支链淀粉修饰含有多糖和核酸的脂质体，由于多糖和核酸在胃酸和肠液中暴露会失效，所以考虑将其制备成脂质体，使用脂质体中的磷脂双分子层保护药物，但在实际使用中发现保护效果不佳，不能达到有效给药，所以使用合成的酰化支链淀粉修饰多糖和核酸脂质体，使含多糖和核酸的脂质体口服成为可能，试验取得了很好的实际效果。

以棕榈酰化支链淀粉的合成说明合成方法和取代度测定方法，合成过程如下

取代度的测定：精确称取棕榈酸甲酯用50％乙醇溶液配制为3mg/mL的溶液(相当于棕榈酰基的2.656mg/mL)。取此溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL至试管中，分别补足50％乙醇溶液至1mL，接着分别加入1mL碱性盐酸羟胺溶液，混匀，沸水浴中加热1～2min，取出立即冷却。加稀HCl溶液1mL，加FeCl₃溶液5mL，另取50％乙醇溶液1mL按上法同样操作为试剂空白，在530nm处测定吸收度值，以棕榈酰基计算标准曲线为：A₅₃₀＝0.2555C(mg/mL)+0.0011，相关系数r＝0.9999，将合成样品测得的吸收值带入曲线即可求得取代度。以棕榈酸甲酯为标准，建立了显色后530nm吸光度值与棕榈酰基团质量的对应线性关系，结果线性良好，方法学研究合格，证明此方法可以用来测定样品中棕榈酰基的含量。

卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG)是一种弱化的牛型分支杆菌，广泛应用于预防结核病，也是目前预防结核病最为有效的疫苗。BCG的主要成分包括脂类、多糖、蛋白质和核酸，而其中的多糖和核酸组分具有重要的生理功能，如BCG及其相应成分对免疫系统的非特异刺激功能常有助于治疗变态反应性疾病、肿瘤等，因而BCG也显示出临床治疗相关疾病的潜在应用价值。但由于BCG的成分复杂，其引发副作用的几率也比较高。因此，如何分离、纯化BCG，提取其中的有效成分而去除引发副作用的组份将有助于减少其副作用的发生，真正发挥其在其他相关疾病治疗中的效用。

有资料报道，卡介菌多糖核酸(Polysaccharide nucleic acid fraction of BacillusCalmette Guerin，BCG-PSN)是一种去除了BCG中菌体蛋白后而得到的活性成分，主要成分为脂多糖和核酸，其副作用显著减小，但依然保留了其发挥菌苗的作用活性。BCG-PSN具有促进单核-巨噬细胞系统增生，增强巨噬细胞的吞噬与消化能力，激活T淋巴细胞，诱生白细胞介素、干扰素，发挥双向免疫调节NF-κB等作用。在临床上用于防治感冒、哮喘、慢支、抗炎和抗过敏作用等。卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)是由我国医药工作者首创的人用新型免疫调节剂，它是由卡介菌经过热酚法除去菌体蛋白后的生物活性物质，其中多糖含量≥70％，核酸含量≥5％，蛋白质≤1％。研究显示，BCG-PSN能够促进细胞免疫，刺激单核-巨噬细胞增生，增强巨噬细胞的吞噬与消化能力，激活T淋巴细胞，直接调节外周血、外周免疫器官(脾脏)和中枢免疫器官(胸腺)CD₄ ⁺T、CD₈ ⁺T细胞的成熟与分化，进而维持CD₄ ⁺、CD₈ ⁺T细胞两亚群间的平衡，诱生白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)，发挥双向免疫调节NF-κB等作用。因其具有多重免疫增强功能，目前BCG-PSN早已获准在人医临床上进行应用，用于慢性支气管炎、哮喘、肿瘤和抗炎、抗过敏等的预防和治疗。但作为一种效果获得肯定的免疫增强剂而言，BCG-PSN在畜牧养殖业中得到深入研究的报道则极为少见。以鸡为例，鸡传染性性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal diseasevirus，IBDV)引起的鸡和火鸡的急性、高度接触性传染病，是危害养鸡业的主要疫病之一。该病在国内外目前均采用免疫防御为主的防制措施，尽管受到环境、机体、病原等多种因素的影响，但IBD疫苗免疫效果的好坏是降低该病发生的重要因素之一，BCG-PSN具有效果良好的增强机体特异性和非特异性免疫的能力。

由于卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)主要成分为脂多糖和核酸，所以其体内外稳定性一直是限制其使用的重要因素，将其包封于脂质体中后，显著提高了其体内外稳定性，但使用卡介菌多糖核酸脂质体口服给药时，动物胃中的胃酸和肠液会破坏脂质体，并进一步破坏脂质体中的卡介菌多糖核酸。目前市场上尚没有采用酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体。

发明内容

本发明主要解决的技术问题在于提供一种适合动物使用的酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸口服脂质体及其冻干制剂。

本发明的另一个目的是提供上述脂质体及其冻干制剂的制备方法。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体，该脂质体的配方含有以下重量份的原料：

卡介菌多糖核酸    1份

酰化支链淀粉      1-10份

磷脂              10-50份

胆固醇            1-10份。

所述的卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体，该脂质体的配方含有以下重量份的原料：

卡介菌多糖核酸    1份

酰化支链淀粉      3-4份

磷脂              20-25份

胆固醇            2-3份。

所述的卡介菌多糖核酸脂质体，其中酰化支链淀粉为碳链中碳原子数目从6到20的酰化支链淀粉；优选为正己酸酰化支链淀粉、月桂酸酰化支链淀粉或棕榈酸酰化支链淀粉；磷脂为天然磷脂和/或合成磷脂，其中天然磷脂为卵磷脂或大豆磷脂，合成磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱。

所述的卡介菌多糖核酸脂质体，其中酰化支链淀粉为取代度为0.1-1的酰化支链淀粉。

一种酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体冻干制剂，在上述酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体的原料中再加入赋形剂，卡介菌多糖核酸与赋形剂的重量比为1∶30～100，通过冷冻干燥制备成冻干制剂。

所述的修饰卡介菌多糖核酸脂质体冻干制剂，其中赋形剂选自甘露醇、蔗糖、右旋糖甘、山梨醇、葡萄糖和海藻糖中的一种或几种。

所述的卡介菌多糖核酸脂质体的制备方法，包括以下步骤：

a.酰化支链淀粉修饰前的卡介菌多糖核酸脂质体的制备：采用薄膜分散法、乙醇注入法、逆相蒸发法、乙醚注入法或机械法等常规方法制备脂质体混悬液；其中机械法可以使用均质机、超声仪、超临界流体仪及挤出仪器等机器设备；

b.制备得到脂质体混悬液后，将脂质体混悬液冲入氮气在室温下缓慢搅拌，将酰化支链淀粉溶液以恒定速度滴入脂质体混悬液中，滴加完毕后在室温下孵化1～3小时，得到混悬液备用；

c.使用pH7～8的磷酸盐缓冲液加入到混悬液中混合，调节混悬液的pH到7.4，得到酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体；

d.为了得到更小粒径的酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸脂质体，可将步骤c得到的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体进行二次均质和/或挤压，得到所需脂质体；也可以不进行二次均质和/或挤压(均质采用Niro Soavi Ns1001L均质机，在一级阀1100～1250bar和二级阀200～250bar的压力下均质3～5次；挤压可采用200nm的滤膜通过挤出仪挤压出来)。

所述的卡介菌多糖核酸脂质体的制备方法，包括以下步骤：

a.酰化支链淀粉修饰前的卡介菌多糖核酸脂质体混悬液的制备：称取处方量的卡介菌多糖核酸、磷脂和胆固醇溶解于适量的90％乙醇溶液中，通入氮气后混合均匀，放入温度30～45℃的水浴中用旋转蒸发仪抽干乙醇(毒性小，不必担心有机溶剂残留)，形成均一的磷脂膜，使用pH7.4的磷酸盐缓冲液洗脱磷脂膜；将得到的脂质体混悬液进行均质或挤压(均质采用Niro Soavi Ns1001L均质机，在一级阀1100～1250bar和二级阀200～250bar的压力下均质3～5次；挤压可采用200nm的滤膜通过挤出仪挤压出来)，得到脂质体混悬液；

b.制备得到脂质体混悬液后，将脂质体混悬液冲入氮气在室温下缓慢搅拌，将酰化支链淀粉溶液以恒定速度滴入脂质体混悬液中，滴加完毕后在室温下孵化1～3小时，得到混悬液备用；

c.使用pH7～8的磷酸盐缓冲液加入到步骤b所得的混悬液中，调节混悬液的pH到7.4左右，得到酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体；

d.为了得到更小粒径的酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸脂质体，可进一步将步骤c得到的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体进行二次均质和/或挤压(均质、挤压的参数可与步骤a相同，均质、挤压可以分别采用，也可以共同采用。如均质采用Niro Soavi Ns1001L均质机，在一级阀1100～1250bar和二级阀200～250bar的压力下均质3～5次；挤压可采用200nm的滤膜通过挤出仪挤压出来)，得到所需脂质体；也可以不进行二次均质和/或挤压。

所述的卡介菌多糖核酸脂质体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

称取处方量的赋形剂溶解于适量的水中，混合均匀后，将制备得到的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体缓慢滴入到溶液中，边滴入边搅拌，得到稳定的混悬液后通过0.2μm的微孔滤膜过滤灭菌后在零下70℃下放置一天，然后放入冻干机中进行冻干，冻干完毕后冲入氮气封口。

所述的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体和冻干粉水合后的脂质体，其包封率为80％-99％，粒径为20nm-5μm。

本发明所述的卡介菌多糖核酸脂质体，其剂型为口服液或口服冻干制剂，也可以制成注射剂或冻干粉针。

本发明的有益效果：

本发明酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体稳定性高，通过在模拟血浆环境中的实验发现，酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体的释放速度比不修饰的卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体定的速度明显减慢。通过在模拟人工胃液和肠液中的实验发现普通卡介菌多糖核酸兽用脂质体中的药物在2小时内降解失效，而使用酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体修饰后的药物在6小时内药物基本不降解，所以使用酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质能够在胃液中很好的保护药物，使卡介菌多糖核酸脂质体能够给动物口服使用。

1.在模拟生物环境中的稳定性

精密量取酰化支链淀粉(取代度0.1棕榈酰化支链淀粉)修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体(A，按实施例2制备，下同)、普通卡介菌多糖核酸兽用脂质体(B，按实施例1制备，下同)、卡介菌多糖核酸注射液(C)各1mL(约含卡介菌多糖核酸1mg)用pH7.4胎牛血清(FBS)稀释1倍，放入透析袋中，外相为150mL pH7.4PBS，置于磁力搅拌器上，温度控制在37±1℃，测定各时间点外相卡介菌多糖核酸浓度，计算24小时累积释放量，结果见图1。图中可见卡介菌多糖核酸注射液很快达到释放完全，而普通卡介菌多糖核酸兽用脂质体释放缓慢，酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体释放更加缓慢。

2.在胃酸和肠液中的稳定性比较

精密量取酰化支链淀粉(取代度0.1棕榈酸酰化支链淀粉)修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体(A)、普通卡介菌多糖核酸兽用脂质体(B，按实施例1制备)、卡介菌多糖核酸注射液(C)各10mL(约含卡介菌多糖核酸10mg)，放入90ml人工胃液(取稀盐酸16.4mL，加水约800mL及胃蛋白酶10g，搅匀后加水定容至1000mL)和人工肠液(取磷酸二氢钾6.8g加水500mL。用0.4％的氢氧化钠溶液调节pH至6.8；另取胰酶10g加水适量使溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL)中，测定不同时间点的卡介菌多糖核酸含量，可以发现在胃液中(图2)卡介菌多糖核酸注射液药物0.5内药物全部降解，普通卡介菌多糖核酸兽用脂质体中药物在1.5小时内基本全部降解，而酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体在3小时基本不降解，在12小时内降解不超过80％；在肠液中(图3)，胃液中卡介菌多糖核酸注射液药物1小时内药物全部降解，普通卡介菌多糖核酸兽用脂质体中药物在1.5小时内全部降解，而酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体在4小时基本不降解，在12小时内降解不超过90％。由此可以发现酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸兽用口服脂质体能在胃肠道中很好的保护药物，修饰后的卡介菌多糖核酸兽用脂质体可以给动物口服使用，而不修饰的卡介菌多糖核酸兽用脂质体不适合口服使用。

本发明还解决了卡介菌多糖核酸脂质体和酰化支链淀粉修饰脂质体及其冻干制剂的工业化大生产的问题，制备方法适合工业化大生产。

本发明提供的适合工业化大生产的酰化支链淀粉修饰口服兽用卡介菌多糖核酸的制备方法，制备的脂质体安全性好，稳定性显著提高，包封效果好。

由于使用生物可降解的材料，减少了临床使用中的不安全性因素。使用酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体后可以显著提高药物在胃酸中和肠液中的稳定性，胃酸和肠液不会破坏药物，从而使介菌多糖核酸脂质体可让动物口服使用，提高了对动物使用的顺应性和安全性。将酰化支链淀粉修饰口服兽用卡介菌多糖核酸制备成冻干粉后，使其有效期显著延长，延长了药物在血液中的循环时间，从而提高了疗效，并且使用时可按实际需要配置所需浓度药物，使用方便。

附图说明

图1.三种制剂在模拟血浆条件中的释放C(◆)，B(■)，A(▲).(mean±SD，n＝3)。

图2.三种制剂在人工胃液中的释放C(◆)，B(■)，A(▲).(mean±SD，n＝3)。

图3.三种制剂在人工肠液中的释放C(◆)，B(■)，A(▲).(mean±SD，n＝3)。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例采用的卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)可以采用市售的产品，若市售产品中多糖核酸含量不高，也可以进行提纯，本发明采用的BCG-PSN中多糖含量为74～76％，核酸为20～22％，多糖核酸含量约为94～98％。

实施例1：制备没有使用酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸脂质体。

称取10mg卡介菌多糖核酸、200mg卵磷脂和20mg胆固醇溶于15ml的90％氯仿中，置于35-45℃水浴中用旋转蒸发仪120rpm并减压的条件下除去氯仿，使混合物在茄形瓶中形成均一的类脂膜，用25ml纯净水洗脱类脂物质，得到乳白色的脂质体混悬液，将脂质体混悬液倒入Niro Soavi Ns1001L均质机，在一级阀1100bar和二级阀200bar的压力下均质3次，得到较澄清透明的卡介菌多糖核酸脂质体溶液。制备的脂质体包封率为91％，粒径为211nm(马尔文zetasize3000测定)。

实施例2：

称取15mg卡介菌多糖核酸、375mg大豆磷脂和45mg胆固醇溶解于20ml的90％乙醇溶液中，通入氮气后混合均匀在温度45℃的水浴中用旋转蒸发仪抽干乙醇，形成均一的磷脂膜后，使用pH7.4的磷酸盐缓冲液洗脱磷脂膜。将得到的脂质体混悬液倒入Niro Soavi Ns1001L均质机中，在一级阀1250bar和二级阀250bar的压力下均质5次，然后用200nm的滤膜通过挤出仪挤压出来。制备得到脂质体混悬液后，脂质体混悬液冲入氮气在室温下缓慢搅拌，将取代度0.1棕榈酸酰化支链淀粉100mg溶解后以恒定速度滴入脂质体混悬液中，滴加完毕后在室温下孵化2小时，得到混悬液备用。将pH7～8的磷酸盐缓冲液加入到混悬液中，调节混悬液的pH到7.4左右，得到酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体。再将得到的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体使用均质机二次均质(采用Niro Soavi Ns1001L均质机，在一级阀1250bar和二级阀250bar的压力下均质3次)。制备的酰化支链淀粉修饰脂质体包封率为95％，粒径为120nm，4℃冰箱内观察其1个月后的物理稳定性没有显著变化。

实施例3：

称取20mg卡介菌多糖核酸、200mg卵磷脂、200mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和15mg胆固醇溶解于50ml的90％乙醇溶液中，通入氮气后混合均匀在温度45℃的水浴中用旋转蒸发仪抽干乙醇，形成均一的磷脂膜后，使用pH7.4的磷酸盐缓冲液洗脱磷脂膜。将得到的脂质体混悬液倒入BRANSON B5510E超声仪中最大功率超声30分钟，然后用200nm的滤膜通过挤出仪挤压出来。制备得到脂质体混悬液后，脂质体混悬液冲入氮气在室温下缓慢搅拌，将取代度0.5正己酸酰化支链淀粉120mg溶解后以恒定速度滴入脂质体混悬液中，滴加完毕后在室温下孵化3小时，得到混悬液备用。将pH7～8的磷酸盐缓冲液加入到混悬液中，调节混悬液的pH到7.4左右，得到酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体。制备的酰化支链淀粉修饰脂质体包封率为85％，粒径为500nm，4℃冰箱内观察其1个月后的物理稳定性没有显著变化。

实施例4：

称取10mg卡介菌多糖核酸、500mg磷脂和40mg胆固醇溶解于15ml的90％乙醇溶液中，将溶液匀速缓慢的滴入到pH7.4的磷酸盐缓冲液中，在室温下挥干乙醇。将得到的脂质体混悬液倒入Niro Soavi Ns1001L均质机中，在一级阀1200bar和二级阀200bar的压力下均质5次，然后用200nm的滤膜通过挤出仪挤压出来。制备得到脂质体混悬液后，在脂质体混悬液冲入氮气在室温下缓慢搅拌，将取代度0.2月桂酸酰化支链淀粉40mg溶解后以恒定速度滴入脂质体混悬液中，滴加完毕后在室温下孵化2小时，得到混悬液备用。将pH7～8的磷酸盐缓冲液加入到混悬液中，调节混悬液的pH到7.4左右，得到稳定的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体。得到的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体使用均质机二次均质(采用Niro Soavi Ns1001L均质机，在一级阀1200bar和二级阀200bar的压力下均质5次)，得到更小粒径的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体。称取800mg甘露醇溶解于水中，将制备得到的更小粒径的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体缓慢滴入到溶液中，边滴入边搅拌，得到稳定的混悬液后通过0.2μm的微孔滤膜过滤灭菌后放入超低温冰箱，在零下70℃下放置一天后放入冻干机中进行冻干，冻干完毕后冲入氮气封口。制备的酰化支链淀粉修饰脂质体冻干粉水合后的脂质体包封率为91％，粒径为186nm，冻干粉在4℃冰箱内观察其1年后的物理稳定性没有显著变化。

Claims (10)

1.一种酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体，其特征在于该脂质体的配方含有以下重量份的原料：

卡介菌多糖核酸    1份

酰化支链淀粉      1-10份

磷脂              10-50份

胆固醇            1-10份。

2.根据权利要求1所述的卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体，其特征在于该脂质体的配方含有以下重量份的原料：

卡介菌多糖核酸    1份

酰化支链淀粉      3-4份

磷脂              20-25份

胆固醇            2-3份。

3.根据权利要求1或2所述的卡介菌多糖核酸脂质体，其特征在于酰化支链淀粉为碳链中碳原子数目从6～20的酰化支链淀粉；优选为正己酸酰化支链淀粉、月桂酸酰化支链淀粉或棕榈酸酰化支链淀粉；磷脂为天然磷脂和/或合成磷脂，其中天然磷脂为卵磷脂或大豆磷脂，合成磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱。

4.根据权利要求1或2所述的卡介菌多糖核酸脂质体，其特征在于酰化支链淀粉为取代度为0.1-1的酰化支链淀粉。

5.一种酰化支链淀粉修饰的卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体冻干制剂，其特征在于在权利要求1或2所述的原料中再加入赋形剂，卡介菌多糖核酸与赋形剂的重量比为1∶30～100，通过冷冻干燥制备成冻干制剂。

6.根据权利要求5所述的卡介菌多糖核酸脂质体冻干制剂，其特征在于赋形剂选自甘露醇、蔗糖、右旋糖甘、山梨醇、葡萄糖和海藻糖中的一种或几种，。

7.权利要求1或2所述的卡介菌多糖核酸脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a.酰化支链淀粉修饰前的卡介菌多糖核酸脂质体的制备：采用薄膜分散法、乙醇注入法、逆相蒸发法、乙醚注入法或机械法等常规方法制备脂质体混悬液；

b.制备得到脂质体混悬液后，将脂质体混悬液冲入氮气在室温下缓慢搅拌，将酰化支链淀粉溶液以恒定速度滴入脂质体混悬液中，滴加完毕后在室温下孵化1～3小时，得到混悬液备用；

c.使用pH7～8的磷酸盐缓冲液加入到混悬液中，调节混悬液的pH到7.4，得到酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体；

d.更进一步，可将步骤c得到的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体进行二次均质和/或挤压，得到所需脂质体；也可以不进行二次均质和/或挤压。

8.根据权利要求7所述的卡介菌多糖核酸脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a.酰化支链淀粉修饰前的卡介菌多糖核酸脂质体混悬液的制备：称取处方量的卡介菌多糖核酸、磷脂和胆固醇溶解于适量的90％乙醇溶液中，通入氮气后混合均匀，放入温度30～45℃的水浴中用旋转蒸发仪抽干乙醇，形成均一的磷脂膜，使用pH7.4的磷酸盐缓冲液洗脱磷脂膜；将得到的脂质体混悬液进行均质和/或挤压，得到脂质体混悬液；

b.将得到的脂质体混悬液冲入氮气在室温下缓慢搅拌，将酰化支链淀粉溶液以恒定速度滴入脂质体混悬液中，滴加完毕后在室温下孵化1～3小时，得到混悬液备用；

c.使用pH7～8的磷酸盐缓冲液加入到步骤b所得的混悬液中混合，调节混悬液的pH到7.4左右，得到酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体；

d.更进一步，可将步骤c得到的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体进行二次均质和/或挤压，得到所需脂质体；也可以不进行二次均质和/或挤压。

9.根据权利要求7或8所述的卡介菌多糖核酸脂质体的制备方法，其特征在于均质采用Niro Soavi Ns1001L均质机，在一级阀1100～1250bar和二级阀200～250bar的压力下均质3～5次；挤压采用200nm的滤膜通过挤出仪挤压出来。

10.权利要求5或6所述的卡介菌多糖核酸脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

称取处方量的赋形剂溶解于适量的水中，混合均匀后，将制备得到的酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸脂质体缓慢滴入到溶液中，边滴入边搅拌，得到稳定的混悬液后通过0.2μm的微孔滤膜过滤灭菌后在零下70℃下放置一天，然后放入冻干机中进行冻干，冻干完毕后冲入氮气封口。

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