JP6730744B2 - 免疫賦活剤、医薬組成物および飲食品 - Google Patents

Description

本発明は免疫賦活剤、医薬組成物および飲食品に関する。

ワクチン接種に併用される免疫アジュバントとして、種々の物質の有用性が知られている。例えば、多くの多糖類がアジュバント活性を持つことが知られているが、なかでも、キチンおよびキトサンが有用であることが示されている。これらは細菌細胞壁を構成するペプチドグリカンと類似した構造を有しており、生体防御機構によって処理されるため本質的に無毒である。キチンの生体親和性を活用した創傷被覆剤も実用化されている。一方で、動物体内では非自己の異物として単体でも免疫系を活性化することが知られており、これがキチンおよびキトサンのアジュバント作用の一角を担っている。キトサンは遊離アミノ基を有し、酸性条件においてカチオン化かつ可溶化するため、アニオン性基質（タンパク質または核酸など）との静電相互作用による複合体形成が可能となる。全ての細胞の表面はアニオン性に荷電している。そのため、キトサンは、生体内において細胞表面および粘膜に強く結合する。このように、キトサンは、カチオン化する特性を有しているために、免疫アジュバントとしてより好適であると考えられる。

ここで、免疫アジュバントとして使用する上でのキトサンの問題点の一つは、結晶性が高いことである。例えば、キトサンを酸性条件下で一度溶媒中に溶解させた場合であっても、生体内に導入された際、生体内でのｐＨ上昇によってキトサン分子は電荷を失って結晶化が進行し、微粒子として析出するか、あるいはゲル化してしまう。また、キトサンを溶液中でタンパク質などの他の物質と複合化させたものであっても、結晶化に伴い解離も進行するものと考えられる。これまでに、例えば非特許文献１に記載されているように、キトサンの性質を改質した種々のキトサン誘導体が報告されている。また、特許文献１には、水溶性と、低粘性等の機能性との両立のために開発された、キトサン主鎖にキトサン側鎖を有する分岐キトサン誘導体が記載されている。特許文献２には、カチオン化キトサンを含む免疫アジュバント水溶液が記載されている。

さらに、キトサンを微粒子化して用いる技術も知られている。特許文献３には、キトサン微粒子を含む免疫アジュバント分散液が記載されている。非特許文献２には、トリポリリン酸を用いて微粒子化したキトサンについて、薬剤輸送担体としての利用が記載されている。抗原を含む微粒子を貪食細胞に取り込ませることによって、抗原特異的な免疫応答が進行することも知られている。

キトサン微粒子は上記のトリポリリン酸またはヒアルロン酸などのポリアニオンとの混合により調製されることが多い。静電相互作用によって複合化したキトサン微粒子の開発例は多数報告されている。

日本国公開特許公報「特開２０１１−１３２３６９号公報（２０１１年７月７日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００９−２９７１５号公報（２００９年２月１２日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００９−２９７１４号公報（２００９年２月１２日公開）」

Yalpani and Hall, Macromolecules, vol. 17, pp.272-281, 1984 Xu et al., Int. J. Pharm., vol., 250, pp.215-226, 2003

しかしながら、免疫応答を誘導するアジュバントとして実用化に至ったものはない。動物実験で用いられるフロイントアジュバントとの比較においても、十分な効果を発揮しているとはいえない。免疫アジュバントとしてのキトサンの有用性および免疫活性化作用をより強化および向上させるためには、上述したキトサンの特性を生かした、新規な非晶質キトサン誘導体の開発および新規な微粒子化キトサンの開発が望まれる。

以上のことから、本願発明者らは、鋭意検討した結果、ある構造を有するキトサン誘導体は、より強い免疫賦活作用を有することを見出した。また、本願発明者らは、ある範囲の重量平均分子量を有するキトサンまたはキトサン誘導体をアニオン性界面活性剤を用いて微粒子化することにより、高い免疫賦活活性を有する微粒子が得られることを新たに見出した。そして、本願発明のキトサン誘導体およびキトサン誘導体を含む免疫賦活剤、ならびにその免疫賦活剤を有効成分として含んでいる医薬組成物および飲食品を想到するに至った。

上記の課題を解決するために、本願発明は以下の一態様を包含する。

重量平均分子量が１０ｋ〜１０００ｋである、キトサンおよび／またはキトサン誘導体、ならびに、アニオン性界面活性剤を含んでおり、微粒子形状であることを特徴とする、免疫賦活剤。

本発明は、免疫賦活作用を有するキトサン誘導体、そのキトサン誘導体を含む免疫賦活剤、その免疫賦活剤を有効成分として含んでいる医薬組成物、およびキトサン誘導体を含んでいる飲食品を提供することができるという効果を奏する。

本発明の実施例２に係る、マウス腹腔内への各キトサン誘導体投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例３に係る、キトサン、キトサン誘導体、微粒子化キトサンまたは微粒子化キトサン誘導体のマウス腹腔内への投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例４に係る、各種添加剤を用いて作製した微粒子化キトサン誘導体のマウス腹腔内への投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例５に係る、各種脂肪酸塩を用いて作製した微粒子化キトサン誘導体のマウス腹腔内への投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例６に係る、微粒子の製造において、異なる分子量のキトサンを用いて合成された各微粒子のマウス腹腔内への投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例７に係る、キトサンと添加剤との異なる混合比を有する各微粒子のマウス腹腔内への投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例７に係る、平均粒子径およびゼータ電位の測定結果を示している。 本発明の実施例８に係る、微粒子の製造において、キトサン誘導体、添加剤および抗原の各溶液について異なる混合順で製造された各微粒子のマウス腹腔内への投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例９に係る、微粒子化キトサン誘導体のラットへの筋肉内または皮下投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例１０に係る、微粒子化キトサン誘導体のウサギへの筋肉内または皮下投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例１２に係る、微粒子化キトサン誘導体のマウス腹腔内への投与後の抗体価を示している。 本発明の実施例１２に係る、フロイントアジュバント７回免疫後マウス剖検の結果を示している。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。

〔用語などの定義〕
本明細書において、「キトサン誘導体」は、キトサンの糖単位を主鎖として、当該主鎖に側鎖を有している化合物を指す。

本明細書において、「分岐度」は、キトサンを構成している糖単位のうち、側鎖を付加された単位の割合を意味している。本明細書においてはパラメータｚで表される。ｚの詳細については後述する。

本明細書において「脱アセチル化度」とは、キトサンを構成する糖単位の２位の炭素に結合しているアセチルアミノ基が脱アセチル化によって遊離アミノ基に変換されている割合を意味している。

本明細書において、側鎖の「置換度」とは、キトサンを構成する糖単位の２位の炭素に結合しているアミノ基が側鎖で置換されている程度を意味しており、キトサンを構成する糖単位の２位の炭素に結合している遊離アミノ基および置換アミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合として示される。ここで、置換度＝キトサンを構成する糖単位中の、側鎖置換アミノ基数／（遊離アミノ基数＋側鎖置換アミノ基数）として示すことができる。

本明細書において「微粒子」は、数１０μｍ以下の粒子径を有する粒子を指す。

本明細書において、「免疫賦活剤」とは、抗原特異的免疫応答を特異的または非特異的に変化、増大、誘導、再誘導、増強または開始する作用を有する、分子、物質または組成物を示す。本願発明に係る免疫賦活剤は、体液性免疫および細胞性免疫の何れか、または両方を強化することができるものを包含する。「免疫賦活剤」は、本明細書中では「アジュバント」あるいは「免疫アジュバント」と呼ぶ場合もある。

本明細書において「被験体」とは、本発明に係るキトサン誘導体、免疫賦活剤、医薬組成物および飲食品を投与される対象を指す。

本明細書において「予防」とは、疾病、疾患または障害に罹患することを防ぐことを指す。また、「治療」とは、すでに罹患している疾病、疾患もしくは障害、またはそれに伴う症状を緩和または除去することを指す。

〔１．キトサン誘導体〕
以下、本発明に係るキトサン誘導体について説明する。

本発明の一実施形態において、以下に示すキトサン誘導体を提供する。

下記一般式（Ｉ）で表される、免疫賦活作用を有するキトサン誘導体。
［式（Ｉ）中、ｘ、ｙ、ｚは、モル比であり、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、
Ｒ^１は、下記一般式（ＩＩ）：
で示されるプルラン側鎖である、または、
Ｒ^１は、下記一般式（ＩＩＩ）：
で示されるデキストラン側鎖である、または、
Ｒ^１は、下記一般式（ＩＶ）：
で示されるグルコサミン側鎖であって、Ｒ^２は、アセチル基である、または、
Ｒ^１は、下記一般式（Ｖ）：
で示されるリシン側鎖である、または、
Ｒ^１は、下記一般式（ＶＩ）：
で示されるラクトース側鎖である］
このように、本願発明のキトサン誘導体は、キトサンの糖単位を構成するグルコサミン単位の２位の炭素に結合しているアミノ基に、遊離したカルボキシル基末端を有する糖類が、還元的アルキル化によってシッフ塩基を経由して結合した構造を有するか、キトサンの糖単位を構成するグルコサミン単位の２位の炭素に結合しているアミノ基に、遊離したカルボキシル基末端を有するアミノ酸類が、縮合反応によってアミド結合した構造を有する。

（キトサン主鎖の各パラメータについて）
上記ｘおよびｙの割合は、本発明のキトサン誘導体の製造に使用する原料キトサンの種類によって異なっている。また、原料となるキトサンまたは生成したキトサン誘導体をアセチル化または脱アセチル化することによって調節することができる。なお、原料のキトサンについては、以下の（キトサン）の項目において後述する。ｚは、キトサンを構成している糖単位のうち、側鎖を付加された単位の割合を示している。ここで、ｚ＝（キトサン誘導体中の側鎖付加糖単位数）／（キトサン誘導体を構成する全糖単位数）として示される。ｚの値は主鎖となるキトサンの量および側鎖となる化合物の量を調節することによって制御可能である。

（キトサン主鎖の長さ）
本発明に係るキトサン誘導体は、グルコサミン単位、Ｎ−アセチルグルコサミン単位および上記Ｒ^１基がグルコサミン単位の２位の炭素に結合しているＮに結合したグルコサミン単位から構成される糖単位を有するキトサンを主鎖としている。キトサン主鎖は構成糖単位の数が３０〜１２，０００が好ましく、６０〜６，０００がより好ましく、１２０〜３０００がさらに好ましい。

（側鎖の長さおよび置換度）
本発明に係るキトサン誘導体は、親水性の側鎖を有するため、側鎖を有していないキトサンのみの場合と比較して、より広範なｐＨでの溶解性が向上する。一例としてｐＨ６．５〜８．０でも高い水溶性を示す。キトサン主鎖の糖単位における２位アミノ基の側鎖による置換度は、キトサン誘導体の種類および最終的なキトサン誘導体の用途などに応じて適宜設定することができる。例えば、免疫アジュバントに使用される場合、置換度は、好ましくは０．００５〜０．５、より好ましくは０．００５〜０．３である。なお、置換度は、公知の技術（例えば糖組成分析）に基づいて決定してもよく、例えば、ＮＭＲのスペクトルの解析によって算出されてもよい。

また、本発明のキトサン誘導体を、他の活性または機能を付与するための官能基または官能性分子の付加または置換等を行うことによって、修飾し、さらなる活性または機能を同時に奏するように設計することもできる。さらなる修飾は当該修飾によって、修飾前の元のキトサン誘導体の有する特性または物性を維持する位置および性状のものであり得る。修飾の一例としては、４−マレイミド酪酸と、キトサン誘導体中のキトサン主鎖の糖単位における２位の炭素に結合しているアミノ基とをアミド化することが挙げられる。この修飾によって、例えば、本発明のキトサン誘導体をシステイン含有ペプチドとのカップリングに供することができる。

ここで、本発明に係るキトサン誘導体は、Ｒ^１が上記式（ＩＩ）で示されるプルラン側鎖である場合、ａは２０〜６００であることが好ましく、５０〜３００であることがより好ましい。また、置換度は０．００１〜０．１であることが好ましく、０．００２〜０．０５であることがより好ましい。

また、本発明に係るキトサン誘導体は、Ｒ^１が上記式（ＩＩＩ）で示されるデキストラン側鎖である場合、ａは１５〜３００であることが好ましく、３０〜２００であることがより好ましい。また、置換度は０．００１〜０．１であることが好ましく、０．００２〜０．０５であることがより好ましい。

本発明に係るキトサン誘導体は、Ｒ^１が上記式（ＩＶ）で示されるグルコサミン側鎖である場合、置換度は０．０５〜０．５であることが好ましく、０．１〜０．３であることがより好ましい。Ｒ^２は、Ｈ、アセチル基または該Ｒ^１であり、全てのＲ^２は同一でも異なっていてもよく、Ｒ^２は、Ｈ、アセチル基および該Ｒ^１のうち、すべてアセチル基であることが特に好ましい。

本発明に係るキトサン誘導体は、Ｒ^１が上記式（Ｖ）で示されるリシン側鎖である場合、置換度は０．０２〜０．５であることが好ましく、０．０５〜０．３であることがより好ましい。また、Ｒ^１におけるリシン側鎖の２位の炭素に結合しているアミノ基に、遊離したカルボキシル基末端を有するリシンが、縮合反応によってさらにアミド結合して、少なくとも１分子のリシンが連なった構造を有していてもよい。

（キトサン誘導体の溶解可能なｐＨ範囲）
上述した通り、脱アセチル化度７０％以上のキトサンは、ｐＨ６以下の酸性領域のｐＨでしか可溶化しない。これに対し、本発明のキトサン誘導体の溶解可能なｐＨ範囲は、キトサンの溶解可能なｐＨ範囲よりも広域であり、ｐＨ６．５〜８．０の中性〜アルカリ領域においても可溶化する。一実施形態において、本発明のキトサン誘導体は、通常、最大ｐＨ８．０以下の条件下で用いられることが好ましく、ｐＨ５．０〜７．５で用いられることがより好ましい。

本発明の一実施形態に係るキトサン誘導体は、プルラン側鎖を有するキトサン誘導体である。以下の（側鎖として有する糖類）の項目に記載している通り、プルランは、水に可溶性であり、低粘度にも関わらず、潤滑性および粘着性に優れている。プルラン側鎖である場合、溶解性に優れ、可溶性アジュバントとして特に好適である。

また本発明の一実施形態に係るキトサン誘導体は、グルコサミン側鎖またはデキストラン側鎖を有するキトサン誘導体である。グルコサミンおよびデキストランは生分解性である。そのため、これらの側鎖を有するキトサン誘導体は安全性に優れ、生体内へ導入する免疫アジュバントの成分として特に好適である。

また本発明の一実施形態に係るキトサン誘導体は、リシン側鎖を有するキトサン誘導体である。リシン側鎖である場合、ｐＨ７．４である血漿中でもカチオン化しているため、微粒子アジュバントとして特に好適である。

本発明に係るキトサン誘導体は、その製造において、主鎖の原料としてキトサン、および側鎖の原料として糖類およびアミノ酸類等の化合物を用いる。以下に、本発明のキトサン誘導体の原料となる化合物について順に記載する。

（キトサン）
通常、キトサンは、カニおよびエビなどの甲殻由来のキチン（ポリ−β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン）をアルカリ処理または酵素処理などによって脱アセチル化することによって調製することができる。以下、本明細書では、キチンの少なくとも一部が脱アセチル化されたものをキトサンと称する。なお、本発明に係るキトサンは天然由来のものに限らず、化学的に合成されたものであってもよい。本発明に係るキトサン誘導体の原料として使用されるキトサンは、キチン分子を構成するグルコサミン単位のうちのＮ−脱アセチル化されている分子の割合、すなわち、脱アセチル化度が、好ましくは６０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％の範囲にあるものである。なお、脱アセチル化度は、公知の技術（例えばコロイド滴定法）に基づいて定量してもよい。公知の技術の一例としてはＮＭＲが挙げられる。

また、多数の糖残基から構成される分子量の大きな天然由来のキトサン分子を、加水分解することによって、任意の分子量のキトサン分子に加工してもよい。

上述の通り、キトサン誘導体のキトサン主鎖は構成糖単位の数が３０〜１２，０００である。よって原料のキトサンの重量平均分子量としては、キトサンのグルコサミン残基の分子量を１６１、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の分子量を２０３とし、脱アセチル化度が、６０〜１００％の範囲とした場合において、原料のキトサン分子重量平均量は約５ｋ（５，０００）〜約２０００ｋ（２，０００，０００）であり得る。

本実施形態のキトサン誘導体の出発物質として、キトサン分子の性状は特に限定されず、例としては、粉末状、繊維状、フィルム状、シート状、ハイドロゲル状および溶液状のキトサン分子が挙げられる。

（側鎖として有する糖類）
本発明のある実施形態に係るキトサン誘導体は、キトサン主鎖に側鎖として糖類を有している。キトサン誘導体に適用される還元性末端を有する糖鎖としては、アルドース類およびケトース類に由来するものが挙げられる。構成糖単位の数が１個以上のものが用いられる。糖類のより具体的な例は、例えば、単糖の例である、ペンタオースおよびヘキサオースの例として、グルコース、フコース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロース、エリトロース、ヘプツロース、ヘキシロース、およびペンツロース等が挙げられる。また、アミノ糖類として、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン（例えば、Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン）、およびガラクトサミン等が挙げられる。さらに、糖誘導体として、ウロン酸類、およびデオキシ糖類等が挙げられる。また、これらの単糖類を構成成分として組み合わせた糖鎖からなる二糖または多糖の糖類としては、マルトース、イソマルトース、ラクトース、メリビオース、およびマルトトリオース等、ならびに各種オリゴ糖類等が挙げられる。さらに、プルラン、イヌリン、アミロース、アミロペクチン、デキストラン、デキストリン、澱粉等の天然多糖など、およびそれらの分解物、異性化物または誘導体が挙げられる。これらの糖類の１種類以上の組み合わせを製造に用いることができる。また、これらの原料としての糖類は水和物であってもよい。これらのうち、本発明に係るキトサン誘導体に用いられる糖類としては、Ｎ−アセチルグルコサミン（例えば、Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン）、デキストランおよびプルランが特に好適である。プルランは、水に可溶性であり、低粘度にも関わらず、潤滑性および粘着性に優れているため、増粘剤または安定剤として食品添加物として使用される。グルコサミンおよびデキストランは生分解性であり、生体へ適用するための免疫アジュバントの成分として用いるために特に好適である。

なお、メリビオースを側鎖として有する場合、本発明に係るキトサン誘導体は、下記式（ＶＩＩ）：
で示されるメリビオース側鎖を有する。

（側鎖として有するアミノ酸またはアミノ酸誘導体）
本発明の他の実施形態に係るキトサン誘導体は、キトサン主鎖に側鎖としてアミノ酸を有している。キトサン誘導体に適用される還元性末端を有するアミノ酸またはアミノ酸誘導体側鎖としては、リシン（例えばＬ−リシン）、カルニチン、アルギニン、プロリン、およびヒスチジンが挙げられる。これらのうち、本発明に係るキトサン誘導体に用いられるアミノ酸としては、リシンおよびカルニチンが特に好適である。なお、カルニチンが側鎖として導入される場合、本発明に係るキトサン誘導体は、下記式（ＶＩＩＩ）：
で示されるカルニチン側鎖を有する。

本発明の別の実施形態に係るキトサン誘導体は、キトサン主鎖に側鎖として複数の異なる糖類および／またはアミノ酸類を有している。

（側鎖として導入されるその他の化合物）
本発明のさらに他の実施形態に係るキトサン誘導体は、キトサンに側鎖としてポリエチレングリコールを有する。キトサン誘導体に適用される還元性末端を有する化合物としては、メトキシＰＥＧ-アルデヒドが挙げられる。

（キトサン誘導体の製造方法）
＜側鎖が糖類であるキトサン誘導体の製造方法＞
本実施形態に係るキトサン誘導体は、公知の製造方法によって製造することができる。一例として、キトサン誘導体の側鎖が糖類である場合、本実施形態に係るキトサン誘導体の製造方法は、キトサンを溶解してキトサン溶液を調製する、キトサン溶解工程と、当該キトサン溶液に糖類を添加し、溶解させる糖類溶解工程と、当該糖類溶解工程後に、さらに還元剤を添加する、還元剤添加工程とを包含することを特徴とする方法である。

キトサン誘導体の側鎖が糖類である場合の製造方法における反応は、概略的には、キトサンを構成するグルコサミン単位の２位の炭素に結合しているアミノ基と、糖類との間にシッフ塩基を経由して還元的Ｎ−アルキル化により結合させて得られるものである。

＜キトサン溶解工程＞
キトサン溶解工程は、キトサンを溶解してキトサン溶液を調製する工程である。一実施形態において、キトサン溶解工程では、キトサンを水に分散させたのち、酢酸を添加することによってキトサンを溶解する。なおキトサン溶解工程の前または同時にキチンを部分脱アセチル化する工程を行ってもよい。また、部分脱アセチル化反応は、公知の脱Ｎ−アセチル化の方法によって行えばよい。

＜糖類溶解工程＞
糖類溶解工程は、キトサン溶解工程に続いて、キトサン溶液に糖類をさらに添加し、溶解させる工程である。なお、糖類溶解工程はキトサン溶解工程と同時に行ってもよい。つまり、糖類は、キトサンと同時に溶媒中に添加してもよい。

＜還元剤添加工程＞
還元剤添加工程は、糖類溶解工程に続いて還元剤を添加する工程である。ここで還元剤は、キトサン誘導体の側鎖が糖類である場合、２−ピコリンボラン、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）またはアミンボラン系還元剤、例えばアンモニアボラン（ＮＨ_３ＢＨ_３）、およびモノメチルアミンボラン（ＣＨ_３（ＮＨ_２ＢＨ_３））などを用いることができ、２−ピコリンボランであることが好ましい。還元剤を添加後、室温で攪拌することによって反応させる。反応時間は、例えば２時間〜数日、または６時間〜２４時間であり、作業効率の観点からは２０時間以内である。また、＜還元剤添加工程＞は＜キトサン溶解工程＞および／または＜糖類溶解工程＞と同時に行ってもよい。

＜キトサン誘導体の側鎖がアミノ酸類であるキトサン誘導体の製造方法＞
別の一例として、キトサン誘導体の側鎖がアミノ酸類である場合の本実施形態に係るキトサン誘導体の製造方法は、キトサンを溶解してキトサン溶液を調製する、キトサン溶解工程と、当該キトサン溶液にアミノ酸類を添加し、溶解させるアミノ酸類溶解工程と、当該アミノ酸類溶解工程後に、縮合剤をさらに添加する、縮合剤添加工程とを包含することを特徴とする方法である。

側鎖がアミノ酸類である場合の製造方法における反応は、概略的には、キトサンの構成糖であるグルコサミンの２位の炭素に結合しているアミノ基と、カルボキシル基末端が遊離したリシンおよびカルニチンなどのアミノ酸類との間に、縮合剤により縮合反応をすることによって、アミド結合を形成させて得られるものである。

＜キトサン溶解工程＞
キトサン溶解工程は、上述の側鎖が糖類であるキトサン誘導体の製造方法の同工程において記載されている通りである。

＜アミノ酸類溶解工程＞
アミノ酸類溶解工程は、キトサン溶解工程に続いて、キトサン溶液にアミノ酸類をさらに添加し、溶解させる工程である。なお、アミノ酸類溶解工程はキトサン溶解工程と同時に行ってもよい。つまり、アミノ酸類は、キトサンと同時に溶媒中に添加してもよい。

＜縮合剤添加工程＞
縮合剤添加工程は、アミノ酸類溶解工程に続いて縮合剤を添加する工程である。ここで縮合剤は、側鎖がアミノ酸類である場合、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などを用いることができ、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドであることが好ましい。縮合剤を添加後、室温で攪拌することによって反応させる。反応時間は、例えば４時間〜数日、または６時間〜２４時間であり、作業効率の観点からは１２時間以内である。また、＜縮合剤添加工程＞は＜キトサン溶解工程＞および／または＜アミノ酸類溶解工程＞と同時に行ってもよい。

以上のようにして得られたキトサン誘導体は、限外濾過、溶媒による洗浄、沈澱形成による精製、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭交換カラムクロマトグラフィー、セルロース透析膜および電気透析などの公知の方法に従って精製を行うこともできる。また、本発明のキトサン誘導体は、公知の方法に基づき、粉末、溶液および懸濁液などの形態に加工することができる。また、必要に応じて得られたキトサン誘導体を凍結乾燥などの適当な乾燥手段によって乾燥させ、乾燥状態で保存することもできる。

以下の実施例にも示されている通り、本発明のキトサン誘導体は、顕著な生体免疫系活性化作用、すなわち免疫賦活化作用を有している。また、したがって、本発明のキトサン誘導体は、安全かつ効果的な免疫賦活剤として、好適に使用できる。さらに、本願発明に係るキトサン誘導体は、ｐＨ６．５〜８．０の中性〜アルカリ領域においても可溶化する。よって、生体内においても安定であり、従来のキトサンおよびキトサン改質体と比較してより広範な用途に使用可能である。

〔２．免疫賦活剤〕
（キトサン誘導体を含む免疫賦活剤）
次に、本発明に係る免疫賦活剤について説明する。一実施形態において、本発明の免疫賦活剤は、上述した一般式（Ｉ）で表されるキトサン誘導体を、有効成分として少なくとも１種類含んでいることを特徴とする。別の実施形態において、本発明の免疫賦活剤は、上述した一般式（Ｉ）で表されるキトサン誘導体のうちの２種類以上の組み合わせを含んでいてもよい。本発明の免疫賦活剤は、顕著な免疫賦活化作用を有するので、例えば、本発明の免疫賦活剤を用いて、生体において正常な代謝免疫応答が低下または抑制される疾病、疾患または障害を有する患者の治療に有用である。また、本発明の免疫賦活剤は、免疫系に悪影響を及ぼす状態に起因する疾病、疾患または障害に罹患する危険性が高くなっている動物またはヒトなどの被験体を治療的または予防的に処置するために用いることができる。

さらに、本願発明者らは、ある範囲の分子量を有するキトサンまたはキトサン誘導体をアニオン性界面活性剤によって微粒子化することにより、高い免疫賦活活性を有する微粒子が得られることを新たに見出した。一実施形態において、免疫賦活剤は、微粒子形状である。以下、本願発明の免疫賦活剤が微粒子形状である場合（つまり免疫賦活剤としての微粒子）について、詳細に説明する。

（微粒子形状である免疫賦活剤（免疫賦活剤としての微粒子））
本実施形態の免疫賦活剤は、重量平均分子量が１０ｋ〜１０００ｋである、キトサンおよび／またはキトサン誘導体、ならびに、アニオン性界面活性剤を含んでおり、微粒子形状である。

以下微粒子に含まれる各種成分について説明する。

（微粒子に含まれる各種成分）
＜キトサンおよび／またはキトサン誘導体＞
微粒子に含まれるキトサンおよび／またはキトサン誘導体の重量平均分子量は１０ｋ〜１０００ｋであり、最終的に得られる微粒子の用途に応じて適宜設定される。本発明における微粒子は、キトサンの分子量が低いほど、高い免疫賦活効果が得られるという傾向を有する。

ただし、ある分子量以下の低分子量のキトサンおよび／またはキトサン誘導体、例えば、分子量が１０ｋ未満のキトサンおよび／またはキトサン誘導体は、製造工程が比較的煩雑である傾向がある。また、アニオン性界面活性剤を添加した後の溶液中で凝集しやすい。一方で、ある分子量以上の高分子量のキトサン、例えば、分子量が１０００ｋを超えるキトサンおよび／またはキトサン誘導体は、粘性が高くなる傾向にある。

したがって、高い免疫賦活化効果を有しつつも、取扱い易く、工業生産が容易であり、市場で入手しやすく、且つ、商業的に利用性が高いという観点からは、微粒子の製造原料として用いるキトサンまたはキトサン誘導体の重量平均分子量は、１０ｋ〜１０００ｋであり、２０ｋ〜５００ｋであることがより好ましく、３０ｋ〜１００ｋであることが最も好ましい。

また、本発明に係る微粒子の成分として使用されるキトサンまたはキトサン誘導体の主鎖であるキトサンは、脱アセチル化度が、好ましくは６０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％の範囲にあるものである。

一実施形態において、微粒子に含まれるキトサン誘導体は、上述の〔１．キトサン誘導体〕に記載されているキトサン誘導体または（側鎖として有する糖類）、（側鎖として有するアミノ酸またはアミノ酸誘導体）または（側鎖として導入されるその他の化合物）に記載されている構造を側鎖として有するキトサン誘導体であり得る。一例では側鎖として有する糖類として、Ｎ−アセチルグルコサミン（例えば、Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン）、デキストランおよびプルランから選択される糖類を有している。一例では、微粒子に含まれるキトサン誘導体は、デキストランである。かかるキトサン誘導体は、微粒子化する前のキトサン誘導体そのものに免疫賦活効果を備えている。そのため、当該キトサン誘導体を含むことにより、免疫賦活活性はキトサンそのもののみの微粒子に比べて、向上した免疫賦活活性を有し得る。また当該キトサン誘導体を含むことによりキトサンと比較して結晶性が低下していたり、中性多糖で被覆されていたりする。微粒子化後の結晶化および二次凝集の低減が期待でき、安定性が向上する。

また、別の実施形態において、微粒子に含まれるキトサン誘導体は、キトサン主鎖に、例えば３個〜１５０個のアミノ酸からなるペプチド、オリゴヌクレオチドおよびオリゴ糖等の分子が例えば共有結合によって結合されているものであってもよい。一例では、これらの結合される分子は、後述する[抗原]の項目に記載の抗原をコードするポリペプチドまたはその断片（例えばエピトープ）、当該抗原ポリペプチドをコードする遺伝子をコードしているポリヌクレオチドまたはその断片、細胞接着活性を有するペプチドまたはその断片である。

＜アニオン性界面活性剤＞
本発明の微粒子はアニオン性界面活性剤を含んでいる。微粒子が含有するアニオン性界面活性剤は、アニオン性基と疎水性基とを備えている。疎水性基はたとえば、置換または無置換であり、飽和または不飽和の炭素数２〜２２のアルキル基であり得る。

一実施形態において、アニオン性界面活性剤は、リン脂質および炭素数１０〜２２の脂肪酸およびその塩から選択される少なくとも１種である。アニオン性界面活性剤は単一種類のアニオン性界面活性剤であってもよく、複数種類の異なるアニオン性界面活性剤の組み合わせであってもよい。また微粒子は、リン脂質または炭素数１０〜２２の脂肪酸およびその塩のいずれか、または両方を含んでいる。

［リン脂質]
リン脂質としては、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、セファリン、およびそれらの混合物、全合成リン脂質ならびにレシチンおよびリゾレシチンが挙げられる。レシチンは、化学分野においては、ホスファチジルコリンと同義であり、本明細書ではホスファチジルコリンを指す。リン脂質は、好ましくはレシチンまたはリゾレシチンであり得る。より詳細には、レシチンとしては大豆レシチン、卵黄レシチン、水素化大豆レシチン（ＨＳＰＣ）および水素化卵黄レシチン（ＨＥＰＣ）が挙げられる。ホスホグリセリドとしては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、およびホスファチジン酸などが挙げられる。スフィンゴ脂質としては、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。なお、水溶性が十分でないリン脂質については、エタノール等有機溶媒に溶解させた後微粒子の製造に供することが可能である。

[脂肪酸およびその塩]
脂肪酸およびその塩には、炭素数が１０〜２２である脂肪酸ならびにそれらの塩およびグリセリドが含まれる。脂肪酸は、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。脂肪酸およびその塩は、炭素数が１０〜２２であることが好ましく、炭素数が１２〜１８であることがより好ましい。

脂肪酸の例としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、イコセン酸、ドコセン酸、テトラコセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、イコサジエン酸、イコサテトラエン酸、イコサトリエン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、カプリン酸、ラウリン酸、γ−リノレン酸およびアラキドン酸等が挙げられる。

上記した脂肪酸の塩の種類としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられる。なお、水溶性が十分でない脂肪酸については、エタノール等有機溶媒に溶解させた後微粒子の製造に供することが可能である。

一例では、微粒子はアニオン性界面活性剤としてオレイン酸ナトリウムまたはラウリン酸ナトリウムを含む。

[その他の添加剤]
ある実施形態の微粒子は、添加剤をさらに含んでいてもよい。例えば、添加剤として、トレハロース、グルコース、ショ糖、乳糖、グルコース、マンニトール、デキストラン、キシリトール、マルトース、フルクトース、グリシン、クエン酸および塩化ナトリウムまたはノニオン性界面活性剤などを含み得る。このような添加剤を含むことにより、凍結乾燥または長期の低温保存による凝集または免疫賦活活性の低下などの性質の不安定化を防止することができる。また、その他の添加剤としては、ビタミンＣおよびビタミンＥなどが挙げられる。これらを含むことにより脂肪酸の酸化分解を抑制することができる。

［その他の成分］
また別の実施形態の微粒子は、微粒子表面へ、薬物を担持させてもよい。また、ポリカルボン酸などのアニオン性高分子で微粒子表面を被覆してもよい。ポリカルボン酸としては、ペクチン、アルギン酸、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸およびポリ−γ−グルタミン酸などが挙げられる。かかる物質で被覆することによって、消化酵素に対する高い安定性を賦与することが可能である。

＜微粒子の特性＞
[ゼータ電位]
一般に、液体中に分散された粒子の多くは正または負に帯電しており、逆の電荷を有するイオンが粒子表面に強く引き寄せられ固定された層（固定層）と、その外側に存在する層（拡散層）とで、いわゆる拡散電気二重層が形成されており、拡散層の内側の一部と固定層とが粒子と共に移動するものと推定される。

ゼータ電位は、粒子から十分に離れた電気的に中性な領域の電位を基準とした場合の、上記移動が生じる面（滑り面）の電位である。ゼータ電位は微粒子の分散状態の指標として用いることができる。ゼータ電位の絶対値が増加すれば、粒子間の反発力が強くなって粒子の安定性は高くなり、逆にゼータ電位が０に近づくにつれて粒子は凝集を起こしやすくなる。微粒子表面が正のゼータ電位を有するように帯電させることは、負帯電の細胞壁に対する微粒子の接着性を増大させ、生物活性分子の細胞内移行性を向上させる観点からも好ましい。

一実施形態において、微粒子のゼータ電位は１０ｍＶ〜１００ｍＶ、より好ましくは２０ｍＶ〜５０ｍＶである。

（微粒子の製造方法）
本発明の微粒子の製造方法は、一実施形態において、溶媒中でキトサンおよび／またはキトサン誘導体とアニオン性界面活性剤とを混合する工程を包含する。

微粒子の形成は、（１）プロトン化したキトサンのアミノ基（−ＮＨ_３ ^＋）と脱プロトン化したアニオン性界面活性剤のカルボキシル基のカルボキシラートイオン（−ＣＯＯ⁻）の静電的相互作用を介した、キトサンとアニオン性界面活性剤との複合化、および（２）疎水性相互作用によるアニオン性界面活性剤の会合によって生じると考えられる（参考文献；黒岩崇著、浦上財団研究報告書 Ｖｏｌ．２２、１６〜２０頁（２０１５））。

微粒子の各成分を混合する条件としては、キトサンがカチオン性を示す中性〜弱酸性のｐＨであることが好ましい。

＜溶媒＞
微粒子の製造において、溶媒は、キトサンを溶解することが知られているどのようなものでもよい。溶媒としては、酢酸緩衝液、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、リンゴ酸、コハク酸および乳酸の水溶液が挙げられる。緩衝液は例えば、最終濃度が５〜５０ｍＭの濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、生理食塩水）である。

微粒子は、キトサンおよび／またはキトサン誘導体とアニオン性界面活性剤とを上記の溶媒中において混合することによって製造することができる。

溶媒中へのキトサンまたはキトサン誘導体およびアニオン性界面活性剤の各成分の混合順はどのような順序であってもよい。さらに、医薬組成物の項目に後述する通り、溶媒中への抗原、キトサンまたはキトサン誘導体、およびアニオン性界面活性剤の各成分の混合順はどのような順序であってもよく、各成分の混合を同時に行ってもよい。

すなわち、本発明の微粒子形状の免疫賦活剤を製品として提供する場合、キトサンまたはキトサン誘導体とアニオン性界面活性剤とを混合した混合物形態において製品とすれば、当該製品を使用するにあたり、使用者は当該混合物に所望の抗原を添加するのみでよく、複数の成分を混合したりする煩雑な操作を必要としない。そのため、使用手順がより簡素化された製品を提供することができる。

＜各成分のモル比＞
微粒子あたりのキトサンまたはキトサン誘導体と、アニオン性界面活性剤との比率は、キトサンの分子量または使用される界面活性剤の種類等の条件に応じて変化する。一実施形態では微粒子あたりのキトサンまたはキトサン誘導体アミノ基と、アニオン性界面活性剤アニオン性基とのモル比は、好ましくは１：０．０５〜１：１の範囲であり、より好ましくは１：０．１〜１：０．５であり、さらに好ましくは１：０．１５〜１：０．３である。

＜各成分の含量＞
微粒子に含有されるキトサンおよび／またはキトサン誘導体ならびにアニオン性界面活性剤の量は、例えば、キトサンおよび／またはキトサン誘導体の溶媒中の最終濃度を決定することで決定される。一例では、キトサンおよび／またはキトサン誘導体の溶媒中の最終濃度は０．１％となるように調製される。

このように本発明に係る微粒子は、水性溶媒中ですべての成分を混合し製造可能である。そのため、エマルジョン化等の操作が不要であり、容易に製造することができる。

[粒子径]
本発明の免疫賦活剤を生体内に投与するための微粒子形状とする場合は、粒子のサイズは、例えば、粒子径を２０ｎｍ〜１０μｍとすることができる。

本明細書において、粒子径という場合は、特に記載をしていない場合は平均粒子径を指している。「平均粒子径」とは、複数個（例えば１００個）の粒子の粒子径の平均値をいう。

本発明の微粒子は、アジュバントとしてだけでなく、薬物の輸送キャリアとして用いることができる。また、生分解性であり、かつ生体に対して毒性を有していないキトサンまたはキトサン誘導体を使用しているために、生体内にて好適な徐放性を示しつつ、生体に長期残留せず、適度な期間を経て完全に分解し、消滅する。そのため生体内で残留して生体の健康に副作用を及ぼすことなく安全に使用することができる。

また、従来用いられてきたフロイントアジュバントは、ホストの動物の投与部位に炎症および組織の壊死を引き起こすことから、動物愛護の観点において問題視されている。そのため、フロイントアジュバントの使用に関して種々のガイドラインによる規定が設けられている（ARAC. Guidelines for the Use of Adjuvants in Research, Revised 04/10/13（http://oacu.od.nih.gov/ARAC/documents/Adjuvants.pdf）、Canadian Council on Animal Care guidelines on: antibodyproduction(2002)(http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Antibody_production.pdf)）。

これに対し、本発明の免疫賦活剤は、動物に過度の苦痛を与えることなく投与可能であり、安全、安価かつ容易に製造することができるので商業的価値が非常に高い。

例えば、トリポリリン酸ナトリウムを用いた従来の微粒子化キトサンは、アジュバントとして、およびタンパク質または核酸等を含む薬剤の輸送キャリアとしても検討されている。これは、陽性に荷電している微粒子化キトサンと表面が陰性に荷電している物質のイオン結合を利用したものである。

これに対し本発明に係る微粒子では、アニオン性界面活性剤として疎水性基を有する物質が用いられる。そのため、アジュバントとしての粒子と、粒子の担持する物質としての抗原との結合として、イオン結合に加えて疎水性結合も生じている。これによって、アジュバントと抗原とが強固に結合している。そのため、本発明の微粒子は、従来公知の微粒子と比較して、著しく向上した免疫賦活活性を有し得る。なお、本発明の免疫賦活剤の免疫賦活効果は、例えば、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法によって抗体価を測定することによって評価することができる。

〔３．医薬組成物〕
続いて、本発明に係る医薬組成物について説明する。本発明は、本発明に係る免疫賦活剤を有効成分として含んでいる医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、生体内の免疫を活性化させるための組成物であって、免疫活性化作用の増強または向上によって疾病、疾患または障害の予防および／または治療を目的とする組成物である。

（キトサン誘導体含有免疫賦活剤を含む医薬組成物）
一実施形態において、医薬組成物は、本発明に係るキトサン誘導体を２種類以上組み合わせて含み得る。別の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種類の抗原をさらに含んでいる。一例として、本発明の医薬組成物は、ワクチン組成物として構成される。さらに別の実施形態として、本発明の医薬組成物は、好適な溶媒、担体、賦形剤、および補助剤等から選択される少なくとも一つの物質をさらに含んでいる。免疫賦活剤の補助剤としては、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ調整剤および他のアジュバント等が挙げられる。以下に医薬組成物を構成する各成分について記載する。

[キトサン誘導体]
本発明に係る医薬組成物に含まれる本発明に係るキトサン誘導体は、上述の〔１．キトサン誘導体〕に記載のものが好適に用いられる。

[抗原]
本発明の医薬組成物の抗原の例としては、ポリペプチドを含む抗原、リコンビナントタンパク質、天然タンパク質、核酸およびそれらの部分分解物などの抗原が挙げられる。抗原は、例えば、ＨＩＶをはじめとするウイルス、細菌、真菌および寄生生物などの病原性の生物またはアレルゲン由来であり得る。本発明の医薬組成物は免疫賦活剤および抗原を含むことによってワクチン組成物として用いることができる。また、特定の抗原を含むことによって、特定の疾病、疾患または障害の予防および／または治療を目的とするワクチン組成物とすることができる。

[溶媒]
本発明の医薬組成物の溶媒の例としては、水および緩衝液等が挙げられ、緩衝液としては、生理食塩水、リン酸緩衝液およびリンゲル液などが挙げられる。また、組成物に用いられる溶媒は上述の溶媒の２種類以上の混合物であってもよい。

[ｐＨ調整剤]
本発明に係る医薬組成物は少なくとも１種類以上のｐＨ調整剤を含んでいてもよい。本発明に係るキトサン誘導体を含む医薬組成物のｐＨを調整するために用いられる物質としては、必要に応じてアルカリ物質または酸性物質のいずれも使用可能である。ｐＨの調整に使用されるアルカリ物質としては、水酸化ナトリウムなどが挙げられる。また、ｐＨの調整に使用される酸性物質としては酢酸および塩酸などが挙げられる。

[他のアジュバント]
別の実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、１種類または複数の他のアジュバントを含んでいてもよい。他のアジュバントとしては、例えば、アルム、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、オイルアジュバント、サポニン、細胞壁骨格構成物、リポポリサッカライド、エンドトキシン、アブリシン、リポソーム、細菌ＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、ビタミンＥ、糖脂質およびスクワレン等が挙げられる。アジュバントを複数種類組み合わせることによって、免疫応答の促進等において各アジュバントを個別に投与する場合よりも相乗効果を有する場合がある。

[キトサン誘導体の含有量]
本発明の医薬組成物中のキトサン誘導体の含有量としては、組成物の全質量あたり０．０１重量％〜１０重量％であることが好ましく、組成物の全質量あたり０．１重量％〜５重量％であることがより好ましく、組成物の全質量あたり０．５重量％〜２重量％であることが特に好ましい。０．５重量％以上の濃度とすることによって、免疫応答反応を促進するための免疫アジュバントとしての効果を十分に得ることができる。また、２重量％以下の濃度とすることによって、組成物を扱いやすい粘度に保つことができ、例えば、注射用の組成物として好適な粘度とすることができる。

また、本発明の医薬組成物の粘度としては、１００ｍＰａ・ｓ以下が好ましく、１０ｍＰａ・ｓ以下がより好ましい。また、粘度は、当技術分野で公知の方法で測定することができる。

[剤型]
本発明の医薬組成物の剤形は特に限定されず、液体、固体または半固体もしくは半液体とすることができる。これらの剤形は、当業者に公知の方法に基づき、容易に製造することができる。剤型が液体の場合は、例えば、実質的に水性の溶媒にキトサン誘導体を分散、懸濁または溶解して含有させた製剤が挙げられる。ここで、実質的に水性である製剤または調製物とは、ある実施形態においては、一定の割合で１以上の非水性成分または１以上の薬学的に許容される他の成分を含むものであることを意図している。剤型が固体の場合は、粉末、顆粒、錠剤、およびカプセル剤などが挙げられる。また、剤型が半固体または半液体の場合は、軟膏、ローション、クリームおよびゲルなどが挙げられる。

[投与経路]
医薬組成物の投与経路としては、経口、局所、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、経粘膜および経皮などが挙げられるが、これらに限定されない。

[投与方法]
本発明の医薬組成物の被験体への投与は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内または腹腔内等への直接注射、鼻腔内、口腔内、肺内、膣内または直腸内等の粘膜への噴霧、ならびに経口投与および血管内投与などの、公知の方法に基づいて行われる。

[使用用途]
本発明の医薬組成物のより具体的な使用用途としては、がん、感染または自己免疫疾患またはアレルギーのような疾患の治療または予防が挙げられる。例えば、ワクチン療法、がんなどに対する免疫療法、アレルギーの原因物質に対する減感作療法などが挙げられる。

[投与の対象]
本発明に係る医薬組成物の投与対象となる被験体としては、あらゆる動物が挙げられ、哺乳類および鳥類などの脊椎動物が好ましく、哺乳類であることがより好ましい。さらに、哺乳類の前記被験体はヒトであることが好ましいが、家畜、実験動物またはペット動物が被験体となる場合もあり得る。具体的にはニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびウシなどの家畜類、ネコ、イヌ、ハムスター、ウサギおよびモルモットなどのペット動物、マウス、ラット、サル、魚類および鳥類等が挙げられる。

（微粒子形状の免疫賦活剤を含む医薬組成物）
[抗原］
別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、微粒子形状である免疫賦活剤および抗原を含む。微粒子形状である免疫賦活剤は、上述の[微粒子形状である免疫賦活剤］の項目に記載の通りである。免疫賦活剤が粒子形状である医薬組成物が含有する抗原の量は、用途または投与部位によって好適な量が用いられ得る。

本発明の医薬組成物であれば、従来のアジュバントと比較して、少ない量の免疫賦活剤および抗原を用いても非常に高い免疫賦活活性および高い中和抗体価を得ることができる。アジュバント量と抗原量とを減らすことができるので、生体への過剰な刺激が生じず、安全性が高く、コストの面でも安価なワクチン組成物とすることができる。

（抗原および微粒子含有医薬組成物の製造方法）
抗原および微粒子含有医薬組成物は、一実施形態において、抗原、キトサンおよび／またはキトサン誘導体、およびアニオン性界面活性剤を溶媒中において混合することによって製造することができる。

この時、溶媒中への抗原、キトサンおよび／またはキトサン誘導体、およびアニオン性界面活性剤の各成分の混合順はどのような順序であってもよく、各成分の混合を同時に行ってもよい。一例では、緩衝液等の溶媒中において、あらかじめキトサンおよび／またはキトサン誘導体と抗原とを混合したものに、アニオン性界面活性剤を後から添加する。別の一例では、溶媒中において、あらかじめアニオン性界面活性剤と抗原とを混合したものに、キトサンおよび／キトサン誘導体を後から添加する。さらに別の一例では、溶媒中において、キトサンまたはキトサン誘導体とアニオン性界面活性剤とを混合したものに、抗原を後から添加する。

[剤型］
剤型は、キトサン誘導体含有免疫賦活剤を含む医薬組成物と同様である。

[投与経路］
医薬組成物の投与経路としては、経口、局所、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、経粘膜および経皮などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の免疫賦活剤が微粒子である場合の医薬組成物の場合の投与経路としては、例えば、経口、皮下、筋肉内、皮内、経粘膜および経皮が挙げられる。

[投与方法］
本発明の免疫賦活剤が微粒子である場合の医薬組成物は、例えば、筋肉内、皮内、または腹腔内へ直接注射される。あるいは、鼻腔内、口腔内、肺内、膣内または直腸内等の粘膜へ噴霧される。また、別の実施形態においては、本発明の免疫賦活剤が微粒子である場合の医薬組成物は、経口投与される。経口投与の場合、微粒子は胃腸液中で安定しており、分解することなく腸に到達し、組成物中の抗原等を放出することができる。

[投与用量］
本発明の医薬組成物は、一般に免疫系強化をもたらすのに十分な量で動物およびヒト等の被験体に投与される。例えば、ヒトに経口投与する場合において、本発明の医薬組成物の用量は、医師が患者の状態を見ながら適宜決定することができる。一実施形態において、上述の微粒子形状である免疫賦活剤および抗原を含む医薬組成物を対象へ投与する場合、投与量は、対照の種類、目的および投与回数等に応じて適宜すればよい。

このような投与量で投与することによれば、対象ヘの過剰な免疫賦活による悪影響を及ぼすことなく、生体への安全性を保ちつつ十分な免疫賦活活性を得ることができるため、効果的である。

[使用用途および投与の対象］
使用用途および投与の対象は、[キトサン誘導体含有免疫賦活剤を含む医薬組成物］と同様である。

〔４．飲食品〕
本発明はまた、本発明に係る免疫賦活剤を含んでいる飲食品を提供する。一実施形態において、本発明の飲食品は、上述の〔１．キトサン誘導体〕の項目に記載のキトサン誘導体を含んでいる。別の実施形態において、本発明の飲食品は、上述の〔２．免疫賦活剤〕の項目に記載の免疫賦活剤を有効成分として、当該飲食品を摂取した生体の免疫作用を賦活化するために有効量含んでいる。

本発明に係る飲食品は、飲食によって免疫作用を賦活化させることを目的とする。本明細書において「飲食品」とは、ヒトが摂取する飲料、食物および健康食品のみならず、家畜および愛玩動物等の動物に給餌される飼料または食餌も含む。

飲食品の形態は、特に限定されず、例えば、製剤形態、加工食品および各種飲料とすることができる。製剤形態としては、健康食品、機能性食品および特定保健用食品などが挙げられる。本発明の「飲食品」を、製剤形態とする場合は医薬組成物に準じた構成にすることができる。すなわち、免疫賦活用飲食品中の免疫賦活剤の含有量を医薬組成物に準じた含有量とし、剤形を医薬組成物に準じた錠剤、カプセル剤、ドリンク剤および粉剤等の剤形とすることができる。また、飲食品が加工食品である場合、公知の加工食品に有効量の免疫賦活剤を添加すればよい。加工食品としては、例えば、パン類、麺類および菓子類ならびに動物飼料が挙げられる。また、飲食品が飲料である場合は、公知の飲料に有効量の免疫賦活剤を添加すればよい。飲料としては、例えば、ジュース、乳飲料およびシロップ等が挙げられる。被験体は、本発明の飲食物を経口摂取することによって、免疫系を賦活化させることができ、疾病、疾患もしくは障害を予防または改善することができる。以上のことから、本発明に係る免疫賦活剤を、健康食品または医薬品として生体に長期的に摂取させておいてもよい。

本発明に係るキトサン誘導体、当該キトサン誘導体を含む免疫賦活剤、当該免疫賦活剤を含む医薬組成物および当該キトサン誘導体を含む飲食物の有する免疫賦活化作用は、イオン化による抗原の捕捉、補助アニオン添加による微粒子化または生体内ｐＨでのゲル化による滞留化、リゾチームまたは食細胞による分解によって誘起されているものと考えられる。本発明のキトサン誘導体は、主鎖および側鎖の構造、長さ、分子量ならびに置換度等を変化させることによって、所望の特性を多様に引き出し、使用用途に対して最適化することが可能である。例えば生体内に送達するための最適粒子サイズへ適応させることが可能であり、必要に応じてリポソームなどにすることによって微粒子化することができる。この本発明に係るキトサン誘導体は本願発明で初めて見出されたものであり、種々の用途への利用が期待される。

したがって、本願発明のキトサン誘導体は、化粧品、医薬、および医療用被覆材等の医療用素材などの従来公知のキトサンおよびその誘導体の基本的な用途に加え、Drug Delivery System（ＤＤＳ）担体およびマイクロカプセルなどの新たな用途への適用が望まれる。

さらに本願発明の微粒子形状の免疫賦活剤は、生体への安全性が高くかつ製造が容易でありながら、従来のフロイントアジュバント等と比較して、非常に高い免疫賦活効果が免疫アジュバントとして、ワクチン組成物等に好適に用いられる。

〔５．本発明に係る具体的な態様の例示〕
本発明は、一例として、以下の何れかの発明を包含する。
＜１＞ 重量平均分子量が１０ｋ〜１０００ｋである、キトサンおよび／またはキトサン誘導体、ならびに、アニオン性界面活性剤を含んでおり、微粒子形状であることを特徴とする、免疫賦活剤。
＜２＞ 上記アニオン性界面活性剤は、リン脂質および炭素数１０〜２２の脂肪酸およびその塩から選択される少なくとも１種類であることを特徴とする、＜１＞に記載の免疫賦活剤。
＜３＞ 上記リン脂質はレシチンおよびリゾレシチンからなる群から選択され、上記脂肪酸およびその塩は、オレイン酸ナトリウムおよびラウリン酸ナトリウムからなる群から選択されることを特徴とする、＜２＞に記載の免疫賦活剤。
＜４＞ 上記キトサン誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される、免疫賦活作用を有するキトサン誘導体であることを特徴とする、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の免疫賦活剤。
［式（Ｉ）中、ｘ、ｙ、ｚは、モル比であり、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、式（Ｉ）の構成糖単位の数は３０〜１２，０００であり、
Ｒ^１は、下記一般式（ＩＩ）：
で示されるプルラン側鎖であって、ａは２０〜６００の整数を示しており、置換度が０．００１〜０．１である、または、
Ｒ^１は、下記一般式（ＩＩＩ）：
で示されるデキストラン側鎖であって、ａは１５〜３００の整数を示しており、置換度が０．００１〜０．１である、または、
Ｒ^１は、下記一般式（ＩＶ）：
で示されるグルコサミン側鎖であって、Ｒ^２は、アセチル基であり、置換度が０．０５〜０．５である、または、
Ｒ^１は、下記式（Ｖ）：
で示されるリシン側鎖であって、置換度が０．０２〜０．５である］
＜５＞ 上記式（Ｉ）の構成糖単位の数は、６０〜６，０００であることを特徴とする＜４＞に記載の免疫賦活剤。
＜６＞ 上記ｚは、０．００１〜０．５であることを特徴とする＜４＞または＜５＞に記載の免疫賦活剤。
＜７＞ 上記微粒子あたりの上記キトサンおよび／またはキトサン誘導体アミノ基と上記アニオン性界面活性剤アニオン性基とのモル比が１:０．０５〜１:１であることを特徴とする、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の免疫賦活剤。
＜８＞ ＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の免疫賦活剤を有効成分として含んでいることを特徴とする医薬組成物。
＜９＞ ＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の免疫賦活剤を含んでいることを特徴とする飲食品。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。

〔実施例１：キトサン誘導体の合成〕
（Ｃｈ１０−Ｄｅｘの合成）
キトサン１０（１．００ｇ、アミノ基５．０８ｍｍｏｌ）（和光純薬工業社製、脱アセチル化度８５％、Ｌｏｔ ＴＬＥ３２０１）を水（４５ｍＬ）に分散し、酢酸（３００μＬ）を加えて溶解後、デキストラン４０（４．００ｇ）（名糖産業社製、重量平均分子量Ｍｗ４０，０００、Ｌｏｔ ＣＬ−Ａ５９４Ａ）をさらに加えて溶解した。その後２−ピコリンボラン（１００ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を加えて２５時間攪拌した。限外ろ過後の凍結乾燥により、デキストラン側鎖を有するキトサン誘導体（デキストランブランチキトサン）Ｃｈ１０−Ｄｅｘ（２．３３ｇ）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ＋ＴＦＡ−ｄ）：δ２．０７（ＮＨＣＯＣＨ_３のＣＨ_３）、３．１９（ＧｌｃＮのＣ２位のＨ）、３．５０−４．００（他糖残基のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６位のＨ）。

原料であるキトサン１０のスペクトルとの比較の結果、Ｃｈ１０−Ｄｅｘ中のデキストラン含量は６９％であった。このとき、キトサンの分子量を約１００，０００としたときキトサンを構成するグルコサミン単位は６００残基であり、キトサン／デキストラン分子数の比＝１／５．６となり、５．６置換／６００残基で置換度は０．０１であった。また、デキストランを構成する二糖単位の残基数＝デキストラン平均分子量４０，０００／二糖単位分子量３２４＝約１２０であった。

（Ｃｈ１０−Ｐｕｌの合成）
キトサン１０（５００ｍｇ、アミノ基２．５４ｍｍｏｌ）（和光純薬工業社製、脱アセチル化度８５％、Ｌｏｔ ＴＬＥ３２０１）を水（２２．５ｍＬ）に分散し、酢酸（１５０μＬ）を加えて溶解後、低分子量化プルラン（２．００ｇ、還元末端残基０．０７１ｍｍｏｌ）（重量平均分子量Ｍｗ７３，０００、数平均分子量Ｍｎ２８，０００）をさらに加えて溶解した。その後２−ピコリンボラン（５０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加えて２４時間攪拌した。限外ろ過後の凍結乾燥によりプルランブランチキトサンＣｈ１０−Ｐｕｌ（１．３９ｇ）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ＋ＴＦＡ−ｄ）：δ２．１０（ＮＨＣＯＣＨ_３のＣＨ_３）、３．２０（ＧｌｃＮのＣ２位のＨ）、３．４０−４．１０（他糖残基のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６位のＨ）
原料キトサン１０のスペクトルとの比較の結果、Ｃｈ１０−Ｐｕｌ中のプルラン含量は７２％であった。このとき、キトサンの分子量を約１００，０００としたときキトサンを構成するグルコサミン単位は６００残基であり、キトサン／プルラン分子数の比＝１／３．５となり、３．５置換／６００残基で置換度は０．００６であった。また、プルランを構成する三糖単位の残基数＝平均分子量７３，０００／三糖単位分子量４８６＝約１５０であった。

（Ｃｈ１０−ＧｌｃＮＡｃ合成）
キトサン１０（５００ｍｇ、アミノ基２．５４ｍｍｏｌ）（和光純薬工業社製、脱アセチル化度８５％、Ｌｏｔ ＴＬＥ３２０１）を水（２０ｍＬ）に分散し酢酸（２００μＬ）を加えて溶解後、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（５５０ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ）を加えて溶解した。その後２−ピコリンボラン（２６６ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）と水を加えて全溶液量を２５ｇとした後、１８日間攪拌した。限外ろ過後の凍結乾燥によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンブランチキトサンＣｈ１０−ＧｌｃＮＡｃ（６４２ｍｇ）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ＋ＴＦＡ−ｄ）：δ２．１０（ＮＨＣＯＣＨ_３のＣＨ_３）、３．２１（ＧｌｃＮのＣ２位のＨ）、３．３２（置換ＧｌｃＮのＣ２位のＨ）、３．５０−４．４０（他糖残基のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６位のＨ）
置換および無置換ＧｌｃＮのＣ２位Ｈの比から置換度０．２６であった。

（Ｃｈ１０−Ｌｙｓ合成）
キトサン１０（５００ｍｇ、アミノ基２．５４ｍｍｏｌ）（和光純薬工業社製、脱アセチル化度８５％、Ｌｏｔ ＴＬＥ３２０１）を水（１５ｍＬ）に分散し１Ｍ−塩酸（１．９ｍＬ）を加えて溶解後、１Ｍ−炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ６に調整した。Ｌ−リシン一塩酸塩（６９６ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ）を加えて溶解した後、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（１．１２ｇ、３．８１ｍｍｏｌ）と水を加えて全溶液量を２５ｇとした後、２４時間攪拌した。限外ろ過後の凍結乾燥によりＬ−リシンブランチキトサンＣｈ１０−Ｌｙｓ（５０６ｍｇ）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ＋ＴＦＡ−ｄ）：δ１．５２（リシンγ−ＣＨ_２）、１．７３（リシンδ−ＣＨ_２）、１．９０（リシンβ−ＣＨ_２）、２．０８（ＮＨＣＯＣＨ_３のＣＨ_３由来）、３．００（リシンε−ＣＨ_２）、３．１９（ＧｌｃＮのＣ２位のＨ）、３．４０−４．４０（他糖残基のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６位のＨ）リシンおよび無置換ＧｌｃＮのＣ２位Ｈの比から置換度０．０９であった。

（ＦＬ８０−Ｄｅｘの合成）
ＦＬ−８０（５００ｍｇ、アミノ基２．７２ｍｍｏｌ）（甲陽ケミカル社製、脱アセチル化度９０％、重量平均分子量Ｍｗ３０ｋ（３，０００）、Ｌｏｔ ０５０７−２７）を水（２５ｍＬ）に分散し、酢酸（２００μＬ）を加えて溶解後、デキストラン４０（２．００ｇ）（名糖産業社製、重量平均分子量Ｍｗ２９ｋ（２９，０００）、Ｌｏｔ ＣＬ−Ａ５９４Ａ）をさらに加えて溶解した。その後２−ピコリンボラン（５０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加えて２４時間攪拌した。限外ろ過後の凍結乾燥により、デキストラン側鎖を有するキトサン誘導体ＦＬ８０−Ｄｅｘ（８７６ｍｇ）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ＋ＴＦＡ−ｄ）：δ２．０７（ＮＨＣＯＣＨ_３のＣＨ_３）、３．１８（ＧｌｃＮのＣ２位のＨ）、３．５０−４．１０（他糖残基のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６位のＨ）、４．５８（Ｎ−アセチルグルコサミンＣ１位のＨ）、４．８７（グルコサミンＣ１位のＨ）、４．９８（デキストランＣ１位のＨ）。

原料であるＦＬ−８０のスペクトルとの比較の結果、ＦＬ８０−Ｄｅｘ中のデキストラン含量は５０モル％（単糖比）であった。このとき、キトサンの分子量を約３０，０００としたときキトサンを構成するグルコサミン単位は１８０残基であり、キトサン／デキストラン分子数の比＝１／１．０３となり、１．０３置換／１８０残基で置換度は０．００５７であった。

〔実施例２：キトサン誘導体の抗体アジュバント活性評価試験〕
以下、実施例１で製造したキトサン誘導体を用いて、抗体アジュバントとしての活性評価試験を行った。

（試験材料）
＜被験体動物＞
５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを１週間の馴化後に各群３匹となるようにランダムに群わけを行った。

＜免疫抗原＞
各試験溶液を投与したマウスを１〜６群として以下の実験に用いた。１群は、生理食塩水のコントロール、２群は比較例として非誘導体キトサン（実施例１において使用した原料であるキトサン１０）、３群は、実施例１において作製したデキストランブランチキトサン、４群は、実施例１において作製したプルランブランチキトサン、５群は、実施例１において作製したＮ−アセチルグルコサミンブランチキトサン、および６群は実施例１において作製したリシンブランチキトサンを用いた。２〜６の各群を２％濃度で１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、５００μＬ分取した。１群は、コントロールのため生理食塩水５００μＬとした。各群の溶液に、４μｇ／ｍＬの抗原溶液（ペプチドコンジュゲートＫＬＨ：Sigma-Aldrich、溶媒：生理食塩水）を等量加え混合したものを免疫抗原とした。なお免疫量はマウス１匹当たり１００μＬとした。

（試験方法）
＜免疫スケジュール＞
マウスに、６週齢時に初回免疫（腹腔内投与）を行い、その後は２週間毎に同様の手順で追加免疫を行った。２回目の免疫後からは免疫を行った１週間後に尾静脈から採血を行い、血清を得た。

＜抗体価測定方法＞
血清の希釈手順
上記で得られた血清を希釈液（０．１％ＢＳＡ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０ ＰＢＳ（phosphate buffered saline））にて１００倍希釈し、それをストックサンプルとした。ストックサンプルを１０倍希釈して１０００倍希釈液を作り、その後３倍の希釈を繰り返して２１８７０００倍希釈液までの段階的な希釈液を作製した。

評価プレートの作製
ＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）を２μｇ／ｍＬの濃度で炭酸緩衝液に溶解し、９６穴タイタープレートに５０μＬずつ分注して各抗原の固相化プレートを作製し、それを評価プレートとして用いた。

抗体価測定
評価プレートの縦１列のウェルに、上述マウス１匹ごとに得た段階的な血清希釈液（１０００倍〜２１８７０００倍希釈）を５０μＬずつ入れ、４℃で一晩、抗原抗体反応を行った。その後プレートを１００μＬの洗浄液（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄を行い、ＰＯＤ標識された抗マウスＩｇＧ（シンプルステインＭＡＸ−ＰＯ（Ｍ）：ニチレイ／１００倍希釈）またはＰＯＤ標識された抗マウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ／１００００倍希釈）を二次抗体としてさらに反応させた。１時間の反応後洗浄を行い、ＴＭＢを基質として室温で１０分間発色を行い、２Ｎ硫酸で反応を停止させた。反応停止後速やかにプレートリーダーにて吸光度（読取波長：４５０ｎｍ、参照波長：６５０ｎｍ）を測定した。以上のようにして得られたＫＬＨに対するＩｇＭの抗体価を図１に示す。図１は、各キトサン誘導体投与後の抗体価を示している。血清１０００倍希釈時（ａ）および３０００倍希釈時（ｂ）それぞれについて、２回免疫後および３回免疫後の１〜６群における抗体価を示している。

〔実施例３：微粒子化による力価上昇〕
以下の各群についてマウスへの二回免疫後の抗原特異的抗体の力価を評価した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
実施例２と同様に、マウスについては５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを１週間の馴化後に各群３匹となるようにランダムに群わけを行った。

＜免疫抗原＞
各試験溶液を投与したマウスを１〜５群として以下の実験に用いた。１群は、フロイントアジュバントによる比較例、２群は非誘導体キトサン（実施例２において使用した原料であるＦＬ８０）、３群は、実施例２において作製した、デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ）、４群は、オレイン酸ナトリウムによる微粒子化非誘導体キトサン（ＦＬ８０＋ＯＡ）、５群は、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）による微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ＋ＯＡ）を用いた。

１群については抗原溶液としてオボアルブミン（ＯＶＡ）（和光純薬工業社製、２０μｇ／ｍＬ生理食塩水）と、フロイントコンプリートアジュバント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１：１で混合した後、ダブルハブニードルで連結したルアーロック式シリンジ２本でエマルジョン化したものを用いた。投与液量はマウス１頭あたり１００μＬとし、抗原投与量１μｇ／頭とした。２〜５の各群についてはキトサン最終濃度０．１％、添加剤の添加量はキトサンアミノ基の０．２８当量とした。緩衝液は酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、生理食塩水）を用い最終濃度５ｍＭとした。なお投与液量はマウス１頭当たり１００μＬとした。各群の溶液に、抗原溶液としてオボアルブミン（ＯＶＡ）（和光純薬工業社製）を投与量１μｇ／頭となるよう試験溶液に混合したものを免疫抗原とした。

（試験方法）
＜免疫スケジュール＞
マウスに、６週齢時に初回腹腔内投与を行い、その後は２週間後に同様の手順で追加免疫を行った。２回目免疫１週間後に尾静脈から採血を行い、血清を得た。

＜抗体価測定方法＞
血清の希釈手順
上記で得られた血清を希釈液（０．１％ＢＳＡ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０ ＰＢＳ（phosphate buffered saline、リン酸緩衝生理食塩水））にて１００倍希釈し、それをストックサンプルとした。ストックサンプルを１０倍希釈して１０００倍希釈液を作り、その後３倍の希釈を繰り返して２，１８７，０００倍希釈液までの段階的な希釈液を作製した。

評価プレートの作製
ＯＶＡを２μｇ／ｍＬの濃度で炭酸緩衝液に溶解し、９６穴タイタープレートに５０μＬずつ分注して各抗原の固相化プレートを作製し、評価プレートとして用いた。

抗体価測定
評価プレートの縦１列のウェルに、上述マウス１匹ごとに得た段階的な血清希釈液（１０００倍〜２１８７０００倍希釈）を５０μＬずつ入れ、４℃で一晩、抗原抗体反応を行った。その後プレートを１００μＬの洗浄液（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄を行い、ＰＯＤ標識された抗マウスＩｇＧ（シンプルステインＭＡＸ−ＰＯ（Ｍ）：ニチレイ／１００倍希釈）を二次抗体としてさらに反応させた。１時間の反応後洗浄を行い、ＴＭＢを基質として室温で５分間発色を行い、２Ｎ硫酸で反応を停止させた。反応停止後速やかにプレートリーダーにて吸光度（読取波長：４５０ｎｍ、参照波長：６５０ｎｍ）を測定した。

以上のようにして得られたＯＶＡに対するＩｇＧの抗体価を図２に示す。図２の結果からオレイン酸ナトリウムを添加した群である４群および５群ではＦＣＡ群と比べて４００倍以上の力価を示した。

〔実施例４：各種添加剤の評価〕
微粒子化に用いる添加剤を検討するために、以下の各群についてマウスへの二回免疫後の抗原特異的抗体の力価を評価した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
実施例２と同様に、マウスについては５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを１週間の馴化後に各群３匹となるようにランダムに群わけを行った。

＜免疫抗原＞
各試験溶液を投与したマウスを１〜８群として以下の実験に用いた。１群は、フロイントアジュバントによる比較例、２〜８群はそれぞれ、オレイン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、リゾレシチン、コール酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウムおよびアルギン酸ナトリウムによる微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ）を用いた。

１群に用いた抗原溶液は実施例３の１群と同様とした。２〜８の各群についてはキトサン最終濃度０．１％、添加剤の添加量はキトサンアミノ基の０．２８当量とした。緩衝液は酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、生理食塩水）を用い最終濃度５ｍＭとした。なお投与液量はマウス１頭当たり１００μＬとした。各群の溶液に、抗原溶液としてオボアルブミン（ＯＶＡ）（溶媒：生理食塩水）を投与量１μｇ／頭となるよう試験溶液に混合したものを免疫抗原とした。免疫スケジュール、抗体価測定方法は実施例３と同様とした。

以上のようにして得られたＯＶＡに対するＩｇＧの抗体価を図３に示す。図３の横軸は、血清の希釈倍率、縦軸は吸光度を示している。比較例である１群のＦＣＡにおける３０００倍希釈における吸光度と、２〜４群の７２９０００倍希釈における吸光度はほぼ同等であった。このことから、２〜４群の投与ではマウスにおいて抗体がＦＣＡの投与の約２５０倍の量の抗体が生産されていると考えられた。

図３の結果から２群のオレイン酸ナトリウム、３群ラウリン酸ナトリウム、４群のリゾレシチンといったアルキル鎖を有するアニオン性界面活性剤が力価上昇に特に有効であった。

〔実施例５：各種脂肪酸塩の評価〕
微粒子化に用いる脂肪酸塩をさらに検討するために、以下の各群についてマウスへの二回免疫後の抗原特異的抗体の力価を評価した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
実施例２と同様に、マウスについては５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを１週間の馴化後に各群３匹となるようにランダムに群わけを行った。

＜免疫抗原＞
各試験溶液を投与したマウスを１〜３として以下の実験に用いた。１群は、フロイントアジュバントによる比較例、２群および３群はそれぞれ、ラウリン酸ナトリウムおよびカプリン酸による微粒子化キトサン（ＦＬ８０）を用いた。

１群に用いた抗原溶液は実施例３の１群と同様とした。２群および３群についてはキトサン最終濃度０．１％、添加剤の添加量はキトサンアミノ基の０．２８当量とした。緩衝液は酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、生理食塩水）を用い最終濃度５ｍＭとした。なお投与液量はマウス１頭当たり１００μＬとした。各群の溶液に、抗原溶液としてオボアルブミン（ＯＶＡ）（溶媒：生理食塩水）を投与量１μｇ／頭となるよう試験溶液に混合したものを免疫抗原とした。免疫スケジュール、抗体価測定方法は実施例３と同様とした。

以上のようにして得られたＯＶＡに対するＩｇＧの抗体価を図４に示す。図４の横軸は、血清の希釈倍率、縦軸は吸光度を示している。

図４の結果から２群のラウリン酸ナトリウムによる微粒子化は力価上昇に特に有効であった。

〔実施例６：キトサン分子量の評価〕
キトサン分子量の、抗体価への影響を評価するために、以下の各群についてマウスへの二回免疫後の抗原特異的抗体の力価を評価した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
実施例２と同様に、５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを１週間の馴化後に各群３匹となるようにランダムに群わけを行った。

＜免疫抗原＞
各試験溶液を投与したマウスを１〜７群として以下の実験に用いた。１群は、Ｃｈ１００（Ｍｗ１０００ｋ）、２群はＦＭ−４０（Ｍｗ５００ｋ）、３群はＦＭ−４０（Ｍｗ４１０ｋ）、４群はＣｈ１０（Ｍｗ６５ｋ）、５群はＦＬ−８０（Ｍｗ３０ｋ）、６群は低分子化キトサン（Ｍｗ４．１ｋ）、７群はオリゴグルコサミン（製品名：コーヨーオリゴグルコサミンＷＧ（２〜８糖（Ｍｗ３４０〜１３０６））甲陽ケミカル株式会社）を用いた。

各群について、それぞれ、Ｃｈ１００（和光純薬工業社製、脱アセチル化度８３％、Ｌｏｔ ＤＰＨ０２７９）、ＦＭ−４０（甲陽ケミカル社製、脱アセチル化度９２％、Ｌｏｔ ０４０２−２７および脱アセチル化度９５％、Ｌｏｔ ０９３０−２６）、Ｃｈ１０（和光純薬工業社製、脱アセチル化度８５％、Ｌｏｔ ＴＬＥ３２０１）、ＦＬ−８０（甲陽ケミカル社製、脱アセチル化度９０％、Ｌｏｔ ０５０７−２７）については２．５％酢酸溶液に溶解後凍結乾燥し、酢酸塩として使用した。低分子化キトサンは、ＦＬ−８０を７％塩酸中８０℃にて３時間加水分解した後、限外ろ過を行い３ｋ〜１０ｋ画分を凍結乾燥して使用した。コーヨーオリゴグルコサミンＷＧ（甲陽ケミカル社製、Ｌｏｔ １４０９１０ＷＧ）はそのまま使用した。添加剤（ラウリン酸ナトリウム）混合量はキトサンアミノ基の０．２８当量とした。キトサン誘導体と添加剤の総量が最終濃度０．１％となるように調製した緩衝液は酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、生理食塩水）を用い最終濃度５ｍＭとした。投与液量はマウス１頭当たり１００μＬとした。各群の溶液に、抗原溶液としてオボアルブミン（ＯＶＡ）を投与量１μｇ／頭となるよう試験溶液に混合したものを免疫抗原とした。免疫スケジュール、抗体価測定方法は実施例３と同様とした。以上のようにして得られたＯＶＡに対するＩｇＧの抗体価を図５に示す。図５の結果からＭｗ３０ｋ〜５００ｋのキトサンを用いた場合に特に高い抗体価を示すことがわかった。

〔実施例７：キトサン／添加剤混合比の評価〕
キトサン／添加剤混合比の、抗体価への影響を評価するために、以下の各群についてマウスへの二回免疫後の抗原特異的抗体の力価を評価した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
実施例２と同様に、５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを１週間の馴化後に各群３匹となるようにランダムに群わけを行った。

各試験溶液を投与したマウスを１〜３群として以下の実験に用いた。１〜３群は、それぞれ、キトサン誘導体と添加剤との混合比（キトサン誘導体／添加剤）を１／０．２８、１／１および１／７としたオレイン酸ナトリウム（ＯＡ）による微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ＋ＯＡ）を用いた。

各群についてキトサン誘導体ＦＬ８０−Ｄｅｘを用い、添加剤（オレイン酸ナトリウム）混合量はキトサンアミノ基の０．２８〜７当量とした。キトサン誘導体と添加剤の総量が最終濃度０．１２％となるように調製した。緩衝液は酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、生理食塩水）を用い最終濃度５ｍＭとした。投与液量はマウス１頭当たり１００μＬとした。各群の溶液に、抗原溶液としてオボアルブミン（ＯＶＡ）を投与量１μｇ／頭となるよう試験溶液に混合したものを免疫抗原とした。免疫スケジュール、抗体価測定方法は実施例３と同様とした。以上のようにして得られたＯＶＡに対するＩｇＧの抗体価を図６に示す。

またこのときのキトサン誘導体と添加剤との混合比を有する各群について、抗原を用いない以外は上記と同様の調製方法にて、抗原を含まない混合液系を調製し、微粒子を調製した。これらの微粒子について、平均粒子径およびゼータ電位の測定を行った。平均粒子径の測定は濃厚系粒径アナライザー（大塚電子社製、ＦＰＡＲ−１０００）を用いて行った。ゼータ電位の測定はレーザーゼータ電位計（大塚電子社製、ＥＬＳ−８０００）を用いて行った。平均粒子径およびゼータ電位の測定結果を図７に示す。
図６および図７の結果から、添加剤過剰の３群では抗体価は大きく減少した。この抗体価減少はゼータ電位が負に変化することも一因と考えられる。

〔実施例８：キトサン、添加剤および抗原の各溶液の混合順の評価〕
キトサン、添加剤および抗原の各溶液の混合順の抗体価への影響を評価するために、以下の各群についてマウスへの二回免疫後の抗原特異的抗体の力価を評価した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
実施例２と同様に、５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを１週間の馴化後に各群３匹となるようにランダムに群わけを行った。

各試験溶液を投与したマウスを１〜３群として以下の実験に用いた。１群は、キトサン誘導体（ＦＬ８０−Ｄｅｘ）と抗原（ＯＶＡ）とを混合したのちにオレイン酸ナトリウム（ＯＡ）を添加して微粒子化した微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ＋ＯＡ）を用いた。２群は、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）と抗原（ＯＶＡ）とを混合したのちにキトサン誘導体（ＦＬ８０−Ｄｅｘ）を添加して微粒子化した微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ＋ＯＡ）を用いた。３群は、キトサン誘導体（ＦＬ８０−Ｄｅｘ）とオレイン酸ナトリウム（ＯＡ）とを混合したのちに抗原（ＯＶＡ）を添加して微粒子化した微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ＋ＯＡ）を用いた。

キトサンとしてＦＬ８０−Ｄｅｘ最終濃度０．１％、添加剤混合量はキトサンアミノ基の０．２８当量とした。緩衝液は酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、生理食塩水）を用い最終濃度５ｍＭとした。投与液量はマウス１頭当たり１００μＬとした。各群の溶液に、抗原溶液としてオボアルブミン（ＯＶＡ）を投与量１μｇ／頭となるよう試験溶液に混合したものを免疫抗原とした。免疫スケジュール、抗体価測定方法は実施例３と同様とした。以上のようにして得られたＯＶＡに対するＩｇＧの抗体価を図８に示す。図結果からキトサン、添加剤および抗原の各溶液の混合順によらず、いずれの混合順であっても同等の高い抗体価を示すことがわかった。

〔実施例９：ラットにおける抗体産生〕
各種の動物における抗体産生の効果を検討するために、以下の各群についてラットへの二回免疫後の抗原特異的抗体の力価を評価した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
メスのＳＤラットを用いた。

＜免疫抗原＞
各試験溶液を各経路で各ラット個体へ投与した。個体１、２は、フロイントアジュバントの筋肉内投与による比較例、個体３、４は、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）による微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ＋ＯＡ）の筋肉内投与、個体５は、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）による微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ＋ＯＡ）の皮下投与とした。

個体１、２に用いた抗原溶液は実施例３の１群、個体３〜５に用いた抗原溶液は実施例３の５群と同様とした。投与液量はラット１頭当たり１００μＬとし、免疫スケジュールは初回免疫を行い、その後は２週間毎に同様の手順で追加免疫を行った。２回目の免疫後からは免疫を行った１週間後に頚静脈から採血を行い、血清を得た。抗体価測定方法は実施例３と同様とした。以上のようにして得られたＯＶＡに対するＩｇＧの二回免疫後の抗体価を図９に示す。図９の結果に示されているように、マウスのみならずラットでも十分な抗体産生が生じることを確認した。また、筋肉内投与および皮下投与のいずれであっても十分な抗体産生を示した。

〔実施例１０：ウサギにおける抗体産生〕
各種の動物における抗体産生の効果を検討するために、以下の各群についてウサギへの免疫後の抗原特異的抗体の力価を評価した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
メスの日本白色種のウサギを用いた。

＜免疫抗原＞
各試験溶液を各経路で各ウサギ個体へ投与した。個体１、２は、フロイントアジュバントの筋肉内投与による比較例、個体３、４は、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）による微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ＋ＯＡ）の筋肉内投与、個体５は、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）による微粒子化デキストランブランチキトサン（ＦＬ８０−Ｄｅｘ＋ＯＡ）の皮下投与とした。

個体１、２に用いた抗原溶液は実施例３の１群、個体３〜５に用いた抗原溶液は実施例３の５群と同様とした。投与液量はウサギ１頭当たり１００μＬとし、免疫スケジュールは初回免疫を行い、その後は２週間毎に同様の手順で追加免疫を行った。２回目の免疫後からは免疫を行った１週間後に頚静脈から採血を行い、血清を得た。抗体価測定方法は実施例３と同様とした。以上のようにして得られたＯＶＡに対するＩｇＧ抗体価を図１０に示す。図１０の結果からウサギでも十分な抗体産生が生じることを確認した。

〔実施例１１：ニワトリにおける抗ウイルス免疫〕
各種の動物における抗体産生の効果を検討するため、またウイルス抗原に対する免疫付与について確認するために、以下の各群についてニワトリへの二回または三回免疫後の抗原特異的抗体の力価および中和抗体価を評価した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
２週齢のＳＰＦ鶏Ｌｉｎｅ−Ｍ系（白色レグホン種、雌雄混合）を体重及び雌雄が均等になるよう、層別無作為抽出法にて群わけを行った。各群５〜６羽となるよう供試した。

＜免疫抗原＞
１〜３群に各試験溶液を投与した。１群はＰＢＳコントロール、２群はオレイン酸ナトリウムによる微粒子化非誘導体キトサン（ＦＬ８０＋ＯＡ）、３群はフロイントアジュバントとした。２群はキトサン最終濃度０．１％、緩衝液は酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、生理食塩水）最終濃度５０ｍＭとし、添加剤量はキトサンアミノ基の０．２５当量とした。抗原溶液は伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）ウイルス・ルカート株（不活化前のウイルス量として１０^６．４８ＰＦＵ／ｍＬ含有）をβ−プロピオラクトンにより不活化し、２群、３群ともに各アジュバントと１：１で混合し調製した。投与量はニワトリ１羽当たり初回免疫時２００μＬ、二回目以降５００μＬ（２５０μＬずつ二箇所）とし、脚部筋肉内に投与した。

（試験方法）
＜免疫スケジュール＞
ニワトリに、２週齢時に初回免疫、７週齢時に二回目免疫、１群全てならびに２および３群の半数には１０週齢時に３回目免疫を行った（いずれも脚部筋肉内投与）。採血は６、９、１０および１２週齢時に行い血清を得た。

＜抗体価測定方法＞
ＥＬＩＳＡ測定はＩＢＤエリーザキットＩＤＥＸＸ ＩＢＤ（アイデックスラボラトリーズ社製）を用い、プロトコル通りに行った。

中和抗体価測定は１２週齢の血清を５６℃で３０分非働化し、血清希釈用液を用いて２倍階段希釈した。０．１ｍＬ中に１００〜２００ＰＦＵを含む中和試験用ウイルス液を等量混合し、４℃で１８〜２４時間処理した。また、同ウイルス液と血清希釈用液を等量混合した液をウイルス対照として同様に調整した。各混合液０．１ｍＬずつをそれぞれ２枚の鶏胚初代細胞（ＣＥＦ）に接種し、５％ＣＯ_２、３７℃で６０分間静置した後、第１次重層寒天培地を重層し、同条件で３〜４日間静置培養した。その後、第２次重層寒天培地を重層し、同条件で更に６〜１８時間静置培養して観察した。ウイルス対照と比較し、プラック数を５０％減少させる血清の最高希釈倍数を中和抗体価とした。

以上のようにして得られたＩＢＤ抗体ＥＬＩＳＡ測定結果および中和抗体価を表１に示す。表１の結果から本発明のキトサン微粒子免疫群はフロイントアジュバント免疫群と比べて有意に高い抗体価を示すことがわかった。
〔実施例１２：マウスにおける頻回投与による影響〕
キトサン微粒子化アジュバントの頻回投与による影響と抗体価の推移を評価するために、以下の各群についてマウスにおける抗原特異的抗体力価を測定した。

（試験材料）
＜被験体動物＞
実施例２と同様に、５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを１週間の馴化後に各群５匹となるようにランダムに群わけを行った。

＜免疫抗原＞
各試験溶液を投与したマウスを１および２群として以下の実験に用いた。１群はフロイントアジュバントによる比較例、２群はオレイン酸ナトリウムによる微粒子化非誘導体キトサン（ＦＬ−８０＋ＯＡ）を用いた。１群に用いた抗原溶液は実施例３の１群と同様とした。２群については実施例３の４群と同様とした。投与液量はマウス１頭当たり１００μＬとした。各群の溶液に、抗原溶液としてオボアルブミン（ＯＶＡ）を投与量１μｇ／頭となるよう試験溶液に混合した。免疫スケジュールは実施例３と同様とし、さらに２回目以降２週間毎の追加免疫、各免疫１週間後の尾静脈からの採血により血清を得た。抗体価測定方法は実施例３と同様とした。

以上のようにして得られたＯＶＡに対するＩｇＧの抗体価を図１１に示す。図１１の横軸は、追加免疫の回数、縦軸は吸光度を示している。図１１の結果からキトサン微粒子群はフロイントアジュバント群と比べて有意に高い抗体価を示すことがわかった。

また、免疫後のマウスの剖検を行い、腹腔内の状態の観察を行った。その結果、キトサン微粒子群は１０回免疫後でも異常を認めなかった（図示せず）。一方、フロイントアジュバント７回免疫後には、図１２に示すように大量の腹水による膨張が進行し、アジュバントの残存が確認された。

本発明に係るキトサン誘導体は免疫賦活作用を有しており、免疫賦活剤として利用することができる。また、本発明に係るキトサンおよび／またはキトサン誘導体ならびに陰性界面活性剤を含む微粒子は、免疫賦活剤として利用することができる。

Claims (7)

1. 重量平均分子量が１０ｋ〜１０００ｋである、キトサンおよび／またはキトサン誘導体、ならびに、
   アニオン性界面活性剤を含んでいる微粒子形状であり、
   上記キトサン誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される、免疫賦活作用を有するキトサン誘導体であることを特徴とする、免疫賦活剤。
   ［式（Ｉ）中、ｘ、ｙ、ｚは、モル比であり、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１であり、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、０≦ｘ＜１、０≦ｙ＜１、０＜ｚ≦１であり、式（Ｉ）の構成糖単位の数は３０〜１２，０００であり、
   Ｒ ^１ は、下記一般式（ＩＩ）：
   で示されるプルラン側鎖であって、ａは２０〜６００の整数を示しており、置換度が０．００１〜０．１である、または、
   Ｒ ^１ は、下記一般式（ＩＩＩ）：
   で示されるデキストラン側鎖であって、ａは１５〜３００の整数を示しており、置換度が０．００１〜０．１である、または、
   Ｒ ^１ は、下記一般式（ＩＶ）：
   で示されるグルコサミン側鎖であって、Ｒ ^２ は、アセチル基であり、置換度が０．０５〜０．５である、または、
   Ｒ ^１ は、下記式（Ｖ）：
   で示されるリシン側鎖であって、置換度が０．０２〜０．５である］
2. 上記アニオン性界面活性剤は、リン脂質および炭素数１０〜２２の脂肪酸およびその塩から選択される少なくとも１種類であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫賦活剤。
3. 上記リン脂質はレシチンおよびリゾレシチンからなる群から選択され、
   上記脂肪酸およびその塩は、オレイン酸ナトリウムおよびラウリン酸ナトリウムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の免疫賦活剤。
4. 上記式（Ｉ）の構成糖単位の数は、６０〜６，０００であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫賦活剤。
5. 上記ｚは、０．００１〜０．５であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫賦活剤。
6. 上記微粒子あたりの上記キトサンおよび／またはキトサン誘導体アミノ基と上記アニオン性界面活性剤アニオン性基とのモル比が１:０．０５〜１:１であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫賦活剤。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫賦活剤を有効成分として含んでいることを特徴とする医薬組成物。