CN101921775B - 水稻OsWRKY45-1基因在改良植物抵抗非生物逆境胁迫中的应用 - Google Patents
水稻OsWRKY45-1基因在改良植物抵抗非生物逆境胁迫中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及水稻OsWRKY45-1基因在抵抗非生物逆境胁迫中的功能验证。利用T-DNA插入技术抑制水稻品种中OsWRKY45-1基因的表达。OsWRKY45-1基因表达被抑制的遗传转化水稻对干旱和低温的耐受能力显著增强，证明OsWRKY45-1基因在水稻抵抗非生物逆境胁迫中是负调控因子。可以通过抑制OsWRKY45-1基因表达培育耐干旱和低温的农作物。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及水稻OsWRKY45-1基因在水稻应对非生物胁迫反应中的功能验证和应用。OsWRKY45-1基因是水稻抗旱和抗冷反应中的负调控因子。抑制OsWRKY45-1基因功能后，水稻应对干旱和低温的抗性能力显著提高。
背景技术
农作物生产受到诸多环境因素的影响。干旱、高盐、低温是最为常见的非生物逆境，严重影响农作物的生长，造成产量和品质的下降，在许多地区是农业发展的瓶颈。因此，培育抗逆农作物一直是农作物品种改良的主要目标之一。长期的进化选择，使植物形成了抵抗干旱、高盐、低温等逆境胁迫的自我保护机制。虽然目前人们对这种自我保护机制的调控机理的认识仍然有限，但是已知许多植物基因参与调控这一自我保护机制(Seki，2007)。植物激素也参与植物应对非生物逆境胁迫的调控，其中脱落酸(abscisic acid，ABA)在植物抵抗干旱、高盐、低温等逆境胁迫反应中发挥重要作用(Verslues and Zhu，2005)。作为基因转录调控蛋白，转录因子在各种逆境胁迫反应中具有重要的作用(Hu等，2006；Qiu等，2008)。但是目前可用于农作物抗非生物逆境胁迫改良的优良基因资源非常有限。
水稻是禾本科农作物中的重要模式植物。因为禾本科植物的染色体共线性关系(Moore等，1995；Gale and Devos，1998)，禾本科植物间存在大量进化上同源的基因。这些进化上同源的基因在不同禾本科植物间可能参与调控相同或者相似的生理活动(Chen等，2003)。因此，从水稻中分离逆境相关基因，并鉴定其在提高植物抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻和其他禾本科农作物新品种将具有非常重要的意义。
本申请人于2009年3月31日提交了一份OsWRKY45-1基因专利申请，其申请号为200910061356.5，(发明名称：水稻抗病相关基因OsWRKY45-1和它在和它在水稻抗病性改良中的应用)，公开号为CN101591663，公开日为2009年12月2日。该基因的序列为序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为2147bp。该OsWRKY45-1基因的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第116-1787位所示的核苷酸，该基因的功能是调控水稻对生物胁迫—即白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的抗性。
发明内容
本发明的目的是对已知OsWRKY45-1基因(专利公开号为CN101591663)新功能的进一步鉴定。该基因的新功能是增强水稻在非生物逆境胁迫条件下(如干旱和低温胁迫)的耐受能力；通过抑制OsWRKY45-1基因的表达增强水稻抵抗干旱和低温的能力，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御干旱和低温的能力奠定基础。
本发明所涉及的OsWRKY45-1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。可以采用已经克隆的OsWRKY45-1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsWRKY45-1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。可以采用遗传转化技术抑制OsWRKY45-1基因的功能，产生同时抗干旱和低温的转基因植株。采用这种技术创造抗性植物是传统育种技术所不能达到的。
在本发明的实施例部分，我们阐述了OsWRKY45-1基因在抗非生物逆境胁迫中的功能验证和应用过程。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1.是本发明所涉及的OsWRKY45-1基因的DNA序列。
图1.用定量RT-PCR技术分析水稻品种IRAT109在各种逆境和脱落酸处理下OsWRKY45-1基因的表达变化。对照是处理前的样品。
图2.抑制OsWRKY45-1基因表达的水稻植株(阳性)提高了对干旱的耐受能力。“阴性”表示从这个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。
图3.抑制OsWRKY45-1基因表达的水稻植株(阳性)提高了对低温的耐受能力。“阴性”表示从这个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。
具体实施方式
本发明的前期研究工作结果提示水稻中的抗病相关基因OsWRKY45-1参与调控抗病反应(Tao等，2009)。已知有些水稻抗病相关基因(如OsWRKY13)除了参与调控抗病反应外，还具有其他功能(Qiu等，2008)。为了验证OsWRKY45-1基因是否还具有其他功能，产生了本发明。
本发明所用水稻家系是抑制OsWRKY45-1基因表达的纯合转基因株系2C-50229(Tao等，2009)，用阴性转基因植株作为对照；这个株系具有粳稻品种Dongjin的遗传背景，是利用T-DNA插入技术抑制OsWRKY45-1基因的表达所产生的转基因材料(Tao等，2009；Jeong等，2006)。已知该OsWRKY45-1基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明所用2C-50229-7转基因株系的T-DNA插入在OsWRKY45-1基因的启动子中，使该基因的表达被抑制(Tao等，2009)。产生这个转基因株系的载体的构建和遗传转化方法可参照相关文献(Jeong等，2006)，限于篇幅本说明书不再展开描述。
以下实施例中进一步定义本发明，根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：OsWRKY45-1基因在各种逆境反应下的表达模式分析
我们选用粳稻品种IRAT109(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.)作为表达谱分析的材料。种子催芽后，在正常生长条件下培养至四叶期时进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是将生长在沙土中的植株缺水，分别在胁迫前、胁迫后3天、4天、6天取样。高盐胁迫是将幼苗由水培液移入含有200mmol/LNaCl的水培液中，分别在胁迫前，胁迫后3小时、6小时、12小时和24小时取样。低温胁迫是把水稻幼苗放入4℃人工气候室，分别于胁迫前、胁迫后3小时、6小时、12小时和24小时取样。激素处理是用含有0.02％Tween-20的100μM脱落酸(ABA)均匀的喷洒水稻植株表面后，分别在胁迫前、胁迫后3小时、6小时、12小时和24小时取样。处理后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。取1～5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)15寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒SYBR
Green PCR Master Mix(大连Tokara公司)、并根据试剂盒使用说明书，在ABI 7500 Real-Time PCR system(美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白(actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。定量反转录(qRT)-PCR分析中的OsWRKY45-1基因特异PCR引物是w45F(5′-TTCCTTGTTGATGTGTCGTCTCA-3′)和w45R(5′-CCCCCAGCTCATAATCAAGAAC-3′)，肌动蛋白基因PCR引物是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。分析结果表明，干旱抑制OsWRKY45-1基因表达，高盐和ABA先诱导后抑制OsWRKY45-1基因，低温诱导OsWRKY45-1基因(图1)。这些结果提示OsWRKY45-1基因可能参与调控水稻对高盐、干旱和低温胁迫的反应，同时可能还参与调控ABA信号传导。
实施例2：转基因植株增强了对干旱的耐受能力
本实施例对抑制OsWRKY45-1基因表达的株系(2C-50229)和对应的阴性株系进行了干旱的胁迫实验。将如上材料催芽后直播到小圆桶中，试验用的土壤为南方水稻土与粗沙按体积比1∶1混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。在植株长至4叶期时进行断水干旱胁迫3到5天，然后复水，3到7天后调查植株的存活率并拍照。结果表明，与阴性对照相比，抑制OsWRKY45-1基因表达的株系增强了对干旱的耐受能力(图2)。在复水后三天，抑制OsWRKY45-1基因表达的株系的成活率是56％，而其阴性植株的成活率是43％(图2)。
实施例3：转基因植株增强了对低温的耐受能力
本实施例对抑制OsWRKY45-1基因表达的株系(2C-50229)和对应的阴性株系进行了低温的胁迫实验。将如上材料催芽后直播到小圆桶中，试验用的土壤为普通的南方水稻土，试验设3次重复。在植株长至4叶期时进行低温(4℃)胁迫4到6天，然后将植株搬至正常的室温条件下，恢复3到7天后调查植株的存活率并拍照。结果表明，与阴性对照相比，抑制OsWRKY45-1基因表达的株系增强了对低温的耐受能力(图3)。在恢复后7天，抑制OsWRKY45-1基因表达的株系的成活率是48％，而阴性植株的成活率是16％(图3)。
以上结果说明OsWRKY45-1基因在水稻抵抗非生物逆境胁迫中是负调控因子。我们可以通过抑制OsWRKY45-1基因表达培育耐干旱和低温的农作物。
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<130>
<141>2010-06-01
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
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<400>1
gggtgctttg agctccatca ccagctgagc tgcgaggaag agagagtgcg agagtgcgcg 60
gcagcggcag tgtagtgtca gtcactgggt gtgcgcttgc ttgcttggat tgagg atg 118
Met
1
acg tca tcg atg tcg ccg gcg ccg gcg ccg gcg tac gcg cag gtg atg 166
Thr Ser Ser Met Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Tyr Ala Gln Val Met
5 10 15
gag gac atg gag aag ggg aag gag ctg gcg gcg cag ctg cag ggg ctc 214
Glu Asp Met Glu Lys Gly Lys Glu Leu Ala Ala Gln Leu Gln Gly Leu
20 25 30
ctc cgc gac tcg ccg gag gcc ggc cgc ttc gtc gac cag att ctc cac 262
Leu Arg Asp Ser Pro Glu Ala Gly Arg Phe Val Asp Gln Ile Leu His
35 40 45
acc ttc tcc cgg gcg atg cgg gcg ctc gac aag gcg gcg gtc tcc gcc 310
Thr Phe Ser Arg Ala Met Arg Ala Leu Asp Lys Ala Ala Val Ser Ala
50 55 60 65
gcc gga gga gaa ggg tcg gag gtg cag agc gag gtc acc tgc ggg ggc 358
Ala Gly Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Ser Glu Val Thr Cys Gly Gly
70 75 80
ggg gcc agc gcc ggc ggg aag agg aaa gcc ccc gcc gcc gac cgg aag 406
Gly Ala Ser Ala Gly Gly Lys Arg Lys Ala Pro Ala Ala Asp Arg Lys
85 90 95
gcc aac tgc cgc agg agg tgagaacgaa ggccagagca tagctcatca 454
Ala Asn Cys Arg Arg Arg
100
caaagcatag catcatctgt gtgtaattag ctgcgttctt tcagggaaga taggggggat 514
tgtccctcgt tttccgcgcg cacgcttttc aaactactat acggtgcgtt tttcgtataa 574
attttctata ggaaagttgc tttaaaaaat catattaatc catttttgaa gtttcaaaat 634
cataaaatca tgcgctaatg gttcacctcg ttttgcgtat attcccaatc ttctctattt 694
ccttctcctc aaacacagcc tgggagtgtt tgagaagggg attgaggaga ttgggaagat 754
acgtaaaacg aggtgagcca ttagctcatg attaattgag tattaactat tttaaatttt 814
aaaaatagat taatatgatt ttttaaagca actttcctat agaaattttt tgcaaaaaac 874
gtaccgttta atagtttgaa aagcgtgcgc gcggaaaacg agagccaatc tcccctatca 934
cccctaaacg aacgatacct tccctatcac ccctaaacga acgatacctt aatgtactaa 994
gatttgtgtg tacgtattgc agg acg cag caa tcg tcc ggg aat tcg gtg gtc 1047
Thr Gln Gln Ser Ser Gly Asn Ser Val Val
105 110
gtc aag aac ctc gac gac ggc cag gca tgg cgc aag tac ggg cag aag 1095
Val Lys Asn Leu Asp Asp Gly Gln Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys
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Glu Ile Gln Asn Ser Lys His Pro Lys
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ggggtatgct acgtgtacag g gcc tac ttc cgg tgc acg cac aag tac gac 1253
Ala Tyr Phe Arg Cys Thr His Lys Tyr Asp
140 145
cag ctg tgc acg gcg cag cgg cag gtg cag cgc tgc gac gac gac ccg 1301
Gln Leu Cys Thr Ala Gln Arg Gln Val Gln Arg Cys Asp Asp Asp Pro
150 155 160
gcg agc tac agg gtc acc tac atc ggc gag cac acc tgc cgg gac ccg 1349
Ala Ser Tyr Arg Val Thr Tyr Ile Gly Glu His Thr Cys Arg Asp Pro
165 170 175 180
gcc acc gcc ccc atc atc gcg gcg cac gtc atc cac cag gtc gcc gcc 1397
Ala Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala His Val Ile His Gln Val Ala Ala
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Gly Asp Asn Asp Asp Gly Cys Gly Gly Leu Gln Ala Gly Ser Arg Leu
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atc agc ttc gtc gcc gcg ccg gcg gcg cca gta gac gct gcc gcg gcg 1493
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Gln Pro Leu Lys Val Glu Gly Gly Val Gly Ser Ser Asp Gln Glu Glu
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gtg ctg agc agc ctc acg ccc ggc agc tcc gcg gcg cgc ggc ggc ggc 1637
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Gly Gly Gly Gly Val Ala Gly Pro Phe Gly Pro Asp Gln Gly Asp Val
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Thr Ser Ser Leu His Trp Ser Tyr Asp Ala Val Ala Gly Met Glu Phe
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325
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1.抑制OsWRKY45-1基因表达在增加水稻耐干旱和低温中的应用，其特征在于：该基因的核苷酸序列如序列表SEO ID NO：1所示。
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| CN101386856A (zh) * | 2008-10-21 | 2009-03-18 | 华中农业大学 | 水稻抗病相关基因OsWRKY45-2和它在改良水稻抗病性中的应用 |
| CN101591663A (zh) * | 2009-03-31 | 2009-12-02 | 华中农业大学 | 水稻抗病相关基因OsWRKY45-1和它在水稻抗病性改良中的应用 |
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2010
- 2010-06-04 CN CN201010196054.1A patent/CN101921775B/zh not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101921775A (zh) | 2010-12-22 |
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