CN101948847B

CN101948847B - 水稻OsWRKY45-2基因在改良植物抵抗非生物逆境胁迫中的应用

Info

Publication number: CN101948847B
Application number: CN2010101947528A
Authority: CN
Inventors: 王石平; 陶增
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-06-01
Also published as: CN101948847A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及水稻OsWRKY45-2基因在抵抗非生物逆境胁迫中的功能验证。利用基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理的转基因技术，将OsWRKY45-2基因的部分DNA片段与能够表达双链RNA的载体连接并转入水稻品种，抑制水稻品种中OsWRKY45-2基因的表达。OsWRKY45-2基因表达量降低的遗传转化水稻对干旱、高盐、低温和脱落酸的耐受能力显著增强，证明OsWRKY45-2基因在水稻抵抗非生物逆境胁迫中是负调控因子。我们可以通过抑制OsWRKY45-2基因表达培育耐干旱、高盐和低温以及对脱落酸不敏感的农作物。

Description

水稻OsWRKY45-2基因在改良植物抵抗非生物逆境胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及水稻OsWRKY45-2基因在水稻应对非生物胁迫反应中的功能验证和应用。OsWRKY45-2基因是水稻抗旱、抗盐和抗冷反应中的负调控因子。抑制OsWRKY45-2基因功能后，水稻应对干旱、高盐和低温的抗性能力显著提高。

背景技术

农作物生产受到诸多环境因素的影响。干旱、高盐、低温是最为常见的非生物逆境，严重影响农作物的生长，造成产量和品质的下降，在许多地区是农业发展的瓶颈。因此，培育抗逆农作物一直是农作物品种改良的主要目标之一。长期的进化选择，使植物形成了抵抗干旱、高盐、低温等逆境胁迫的自我保护机制。虽然目前人们对这种自我保护机制的调控机理的认识仍然有限，但是已知许多植物基因参与调控这一自我保护机制(Seki，2007)。植物激素也参与植物应对非生物逆境胁迫的调控，其中脱落酸(abscisic acid，ABA)在植物抵抗干旱、高盐、低温等逆境胁迫反应中发挥重要作用(Verslues and Zhu，2005)。作为基因转录调控蛋白，转录因子在各种逆境胁迫反应中具有重要的作用(Hu等，2006；Qiu等，2008)。但是目前可用于农作物抗非生物逆境胁迫改良的优良基因资源非常有限。

水稻是禾本科农作物中的重要模式植物。因为禾本科植物的染色体共线性关系(Moore等，1995；Gale and Devos，1998)，禾本科植物间存在大量进化上同源的基因。这些进化上同源的基因在不同禾本科植物间可能参与调控相同或者相似的生理活动(Chen等，2003)。因此，从水稻中分离逆境相关基因，并鉴定其在提高植物抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻和其他禾本科农作物新品种将具有非常重要的意义。

本申请人于2008年10月21日提交了一份OsWRKY45-2基因专利申请，其申请号为200810197309.9，(发明名称：水稻抗病相关基因OsWRKY45-2和它在改良水稻抗病性中的应用)，公开号为CN101386856，公开日为2009年3月18日。该基因的序列为序列表SEQID NO：1所示，序列全长为1629bp。该OsWRKY45-2基因的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第113-1270位所示的核苷酸，该基因的功能是增加水稻对生物胁迫-白叶枯病菌和稻瘟病菌的抗性。

发明内容

本发明的目的是对已知OsWRKY45-2基因(专利申请公开号为CN101386856)新功能的进一步鉴定。该基因的新功能是增强水稻在非生物逆境胁迫条件下(如干旱、高盐和低温胁)的耐受能力；通过抑制OsWRKY45-2基因的表达增强水稻抵抗干旱、高盐和低温的能力，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御干旱、高盐和低温的能力奠定基础。

本发明所涉及的OsWRKY45-2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。可以采用已经克隆的OsWRKY45-2基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsWRKY45-2基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。可以采用遗传转化技术抑制OsWRKY45-2基因的功能，产生同时抗干旱和低温的转基因植株。采用这种技术创造抗性植物是传统育种技术所不能达到的。

本发明为增强水稻对非生物逆境胁迫的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将OsWRKY45-2基因的部分片段和与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接、转入水稻，通过抑制其自身OsWRKY45-2基因的表达改良水稻对非生物逆境胁迫的耐受能力。

在本发明的实施例部分，我们阐述了OsWRKY45-2基因在抗非生物逆境胁迫中的功能验证和应用过程。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1.是本发明所涉及的OsWRKY45-2基因的DNA序列。

图1.用定量RT-PCR技术分析水稻品种珍汕97在各种逆境和脱落酸处理下OsWRKY45-2基因的表达变化。对照是未处理的样品。

图2.抑制OsWRKY45-2基因表达的水稻植株(阳性)提高了对干旱的耐受能力。“阴性”表示分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。

图3.抑制OsWRKY45-2基因表达的水稻植株(阳性)提高了对高盐的耐受能力。“阴性”表示分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。

图4.抑制OsWRKY45-2基因表达的水稻植株(阳性)提高了对低温的耐受能力。“阴性”表示分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。

图5.抑制OsWRKY45-2基因表达的水稻植株(阳性)降低了对脱落酸的敏感性。“阴性”表示阴性转基因植株作为对照。

具体实施方式

本发明的前期研究工作结果提示水稻中的抗病相关基因OsWRKY45-2参与调控抗病反应(Tao等，2009)。已知有些水稻抗病相关基因(如OsWRKY13)除了参与调控抗病反应外，还具有其他功能(Qiu等，2008)。为了验证OsWRKY45-2基因是否还具有其他功能，产生了本发明。

本发明所用水稻株系是抑制OsWRKY45-2基因表达的纯合转基因株系D115RMH1和D115RMH6(Tao等，2009)，用分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照；这两个株系具有籼稻品种明恢63的遗传背景，是采用RNA干扰技术抑制OsWRKY45-2基因的表达所产生的转基因材料(Tao等，2009)。已知该OsWRKY45-2基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明所用抑制OsWRKY45-2基因表达的转基因株系是采用序列表SEQ ID NO：1中204-421、513-617和719-1038bp处对应的一条cDNA序列(该条cDNA序列只是序列表SEQ ID NO：1中编码序列的一部分)、利用能够表达双链RNA的农杆菌介导的遗传转化载体，通过农杆菌介导的遗传转化技术产生的(Tao等，2009)。产生这些转基因株系的载体的构建和遗传转化方法可参照相关文献(Tao等，2009)，限于篇幅本说明书不再展开描述。

以下实施例中进一步定义本发明，根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：OsWRKY45-2基因在各种逆境反应下的表达模式分析

我们选用籼稻品种Zhenshan 97(Oryza sativa L.subsp.indica cv.)作为表达谱分析的材料。种子催芽后，在正常生长条件下培养至四叶期时进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是将生长在沙土中的植株缺水，分别在胁迫前、胁迫后3天、4天、6天取样。高盐胁迫是将幼苗由水培液移入含有200mmol/LNaCl的水培液中，分别在胁迫前，胁迫后3小时、6小时、12小时和24小时取样。低温胁迫是把水稻幼苗放入4℃人工气候室，分别于胁迫前、胁迫后3小时、6小时、12小时和24小时取样。激素处理是用含有0.02％Tween-20的100μM脱落酸(ABA)均匀的喷洒水稻植株表面后，分别在胁迫前、胁迫后3小时、6小时、12小时和24小时取样。处理后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。取1～5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)15寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒Green PCR Master Mix(大连Tokara公司)、并根据试剂盒使用说明书，在ABI 7500 Real-Time PCR system(美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白(actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。定量反转录(qRT)-PCR分析中的OsWRKY45-2基因特异PCR引物是w45F(5′-TTCCTTGTTGATGTGTCGTCTCA-3′)和w45R(5′-CCCCCAGCTCATAATCAAGAAC-3′)，肌动蛋白基因PCR引物是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。分析结果表明，干旱抑制OsWRKY45-2基因表达，高盐和ABA先抑制后诱导OsWRKY45-2基因，低温诱导OsWRKY45-2基因(图1)。这些结果提示OsWRKY45-2基因可能参与调控水稻对高盐、干旱和低温胁迫的反应，同时可能还参与调控ABA信号传导。

实施例2：转基因植株增强了对干旱的耐受能力

本实施例对抑制OsWRKY45-2基因表达的两个T₂株系(D115RMH1和D115RMH6)进行了干旱的胁迫实验，用分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。将抑制OsWRKY45-2基因表达植株(阳性)和对应的阴性转基因植株催芽后直播到小圆桶中。试验用的土壤为南方水稻土与粗沙按体积比1∶1混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。在植株长至4叶期时进行断水干旱胁迫3到5天，然后复水，3到7天后调查植株的存活率并拍照。结果表明，与阴性对照相比，抑制OsWRKY45-2基因表达的转基因株系增强了对干旱的耐受能力(图2)。在复水后三天，两个抑制OsWRKY45-2基因表达株系(D115RMH1和D115RMH6)的成活率分别是28％和28％，而对应的阴性植株的成活率分别是18％和20％(图2)。

实施例3：转基因植株增强了对高盐的耐受能力

本实施例对抑制OsWRKY45-2基因表达的两个T₂株系(D115RMH1和D115RMH6)进行了高盐的胁迫实验，用分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。按照实施例二中的方法种植水稻材料。在植株长至4叶期时用200mM的NaCl溶液灌溉4到6天，持续观察表型，恢复3到7天后调查植株的存活率并拍照。结果表明，与阴性对照相比，抑制OsWRKY45-2基因表达转基因株系增强了对高盐的耐受能力(图3)。在胁迫后5天，两个抑制OsWRKY45-2基因表达株系(D115RMH1和D115RMH6)的成活率分别是43％和42％，而对应的阴性植株的成活率分别是20％和18％(图3)。

实施例4：转基因植株增强了对低温的耐受能力

本实施例对抑制OsWRKY45-2基因表达的两个T₂株系(D115RMH1和D115RMH6)进行了低温的胁迫实验，用分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。按照实施例二中的方法种植水稻材料。在植株长至4叶期时进行低温(4℃)胁迫4到6天，然后将植株搬至正常的室温条件下，恢复3到7天后调查植株的存活率并拍照。结果表明，与阴性对照相比，抑制OsWRKY45-2基因表达转基因株系增强了对低温的耐受能力(图4)。在恢复后7天，两个抑制OsWRKY45-2基因表达株系(D115RMH1和D115RMH6)的成活率分别是51％和36％，而对应的阴性植株的成活率分别是36％和13％(图4)。

实施例5：转基因植株降低了对脱落酸的敏感性

很多外界环境的变化会影响植物体内脱落酸含量的变化(Christmann等，2006)，而过量脱落酸抑制水稻幼苗的生长(Xiang等，2008)。本实施例对抑制OsWRKY45-2基因表达的两个T₂株系(D115RMH1和D115RMH6)进行了对脱落酸的敏感性实验，用分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。将抑制OsWRKY45-2基因表达植株(阳性)和对应的阴性转基因植株的种子去壳消毒，在1/2MS培养基(Murashige and skoog，1962)平板上生长3天左右后，挑选发芽良好长势一致的种子转移到含有3μM脱落酸的1/2MS培养基的小方盒中，每个小方盒一半种植对照材料，另一半种植转基因材料，同时以不含脱落酸的1/2MS培养基中生长材料作为对照，生长7-10天后观察表型并照相，分别统计根长和株高。结果表明，与阴性对照相比，抑制OsWRKY45-2基因表达株系(D115RMH1和D115RMH6)降低了对脱落酸的敏感性(图5)。在脱落酸处理生长7天，抑制OsWRKY45-2基因表达株系D115RMH1的根长和株高分别是2.22厘米与4.26厘米，株系D115RMH6的根长和株高分别是2.25厘米与4.44厘米，而阴性对照的根长和株高分别为1.38厘米和3.88厘米(图5)。

以上结果说明OsWRKY45-2基因在水稻抵抗非生物逆境胁迫中是负调控因子。我们可以通过抑制OsWRKY45-2基因表达培育耐干旱、高盐和低温以及对脱落酸不敏感的农作物，特别是应用在水稻作物上。

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序列表

<110>华中农业大学

<120>水稻OsWRKY45-2基因在改良植物抵抗非生物逆境胁迫中的应用

<130>

<141>2010-05-29

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1629

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1629)

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(112)

<220>

<221>CDS

<222>(113)..(421)

<220>

<221>Intron

<222>(422)..(512)

<220>

<221>CDS

<222>(513)..(617)

<220>

<221>Intron

<222>(618)..(718)

<220>

<221>CDS

<222>(719)..(1270)

<220>

<221>3’UTR

<222>(1271)..(1629)

<400>1

tgctttgagc tccatcacca gctgagctgc gaggaagaga gagtgcgaga gtgcgcggca 60

gcggcagtgt agtgtcagtc actgggtgtg cgcttgcttg cttggattga gg atg acg 118

Met Thr

1

tca tcg atg tcg ccg gcg ccg gcg ccg gcg tac gcg cag gtg atg gag 166

Ser Ser Met Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Tyr Ala Gln Val Met Glu

5 10 15

gac atg gag aag ggg aag gag ctg gcg gcg cag ctg cag ggg ctc ctc 214

Asp Met Glu Lys Gly Lys Glu Leu Ala Ala Gln Leu Gln Gly Leu Leu

20 25 30

cgc gac tcg ccg gag gcc ggc cgc ttc gtc gac cag att ctc cac acc 262

Arg Asp Ser Pro Glu Ala Gly Arg Phe Val Asp Gln Ile Leu His Thr

35 40 45 50

ttc tcc cgg gcg atg cgg gcg ctc gac aag gcg gcg gtc tcc gcc gcc 310

Phe Ser Arg Ala Met Arg Ala Leu Asp Lys Ala Ala Val Ser Ala Ala

55 60 65

gga gga gaa ggg tcg gag gtg cag agc gag gtc acc tgc ggg ggc ggg 358

Gly Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Ser Glu Val Thr Cys Gly Gly Gly

70 75 80

gcc agc gcc ggc ggg aag agg aaa gcc ccc gcc gcc aac cgg aag gcc 406

Ala Ser Ala Gly Gly Lys Arg Lys Ala Pro Ala Ala Asn Arg Lys Ala

85 90 95

aac tgc cgc agg agg tgagaacgaa ggccagagca tagctcatca caaagcatag 461

Asn Cys Arg Arg Arg

100

catcatctgt gtgtaattaa tgtactaaga tttgtgtgta cgtattgcag g acg cag 518

Thr Gln

105

caa tcg tcc ggg aat acg gtg gtc gtc aag aac ctc gac gac ggc cag 566

Gln Ser Ser Gly Asn Thr Val Val Val Lys Asn Leu Asp Asp Gly Gln

110 115 120

gca tgg cgc aag tac ggg cag aag gag atc caa aac tcc aag cac cca 614

Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Glu Ile Gln Asn Ser Lys His Pro

125 130 135

aag tgagtagact tgtcccgaca aaaaacaatg tgttcgagac tgtacagttg 667

Lys

gatgcgttgc gcgctgacga ggagttgttt ggggtatgct acgtgtacag g gcc tac 724

Ala Tyr

140

ttc cgg tgc acg cac aag tac gac cag atg tgc acg gcg cag cgg cag 772

Phe Arg Cys Thr His Lys Tyr Asp Gln Met Cys Thr Ala Gln Arg Gln

145 150 155

gtg cag cgc tgc gac gac gac ccg gcg agc tac agg gtc acc tac atc 820

Val Gln Arg Cys Asp Asp Asp Pro Ala Ser Tyr Arg Val Thr Tyr Ile

160 165 170

ggc gag cac acc tgc cgg gac ccg gcc acc gcc ccc atc atc gcg gcg 868

Gly Glu His Thr Cys Arg Asp Pro Ala Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala

175 180 185

cac gtc atc cac cag gtc gcc gcc ggc gac gac gac gac ggc tgc ggc 916

His Val Ile His Gln Val Ala Ala Gly Asp Asp Asp Asp Gly Cys Gly

190 195 200

ggc ctc cac gcg ggg tcc cgc ctc atc agc ttc gtc gcc gcg ccg gcg 964

Gly Leu His Ala Gly Ser Arg Leu Ile Ser Phe Val Ala Ala Pro Ala

205 210 215 220

gcg cca gta gac gct gcc gcg gcg ccg acg acc agc acg atc acc acg 1012

Ala Pro Val Asp Ala Ala Ala Ala Pro Thr Thr Ser Thr Ile Thr Thr

225 230 235

gtc acc gcg ccg ggc ccg ctg ctg cag ccg ctc aag gtg gag ggc ggc 1060

Val Thr Ala Pro Gly Pro Leu Leu Gln Pro Leu Lys Val Glu Gly Gly

240 245 250

atc ggc tcg tcc gac cag gag gag gtg ctg agc agc ctc acg ccc ggc 1108

Ile Gly Ser Ser Asp Gln Glu Glu Val Leu Ser Ser Leu Thr Pro Gly

255 260 265

agc tcc gcg gcg cgc ggc ggc gga gtc gcg ggt ccc ttc ggg ccg gac 1156

Ser Ser Ala Ala Arg Gly Gly Gly Val Ala Gly Pro Phe Gly Pro Asp

270 275 280

cag ggc gat gtc acg tcc tcc ctg cac tgg agc tac gac gcc gtc gcc 1204

Gln Gly Asp Val Thr Ser Ser Leu His Trp Ser Tyr Asp Ala Val Ala

285 290 295 300

ggc atg gag ttc ttc aag aac gac gag gtt gtc ttc gat ctg gac gac 1252

Gly Met Glu Phe Phe Lys Asn Asp Glu Val Val Phe Asp Leu Asp Asp

305 310 315

att atg ggt ttg agc ttt tgatcaccga agaatcatgg atggacacgg 1300

Ile Met Gly Leu Ser Phe

320

gccgggtaaa acgatcgaaa gaagatggat tccacgcgtg tgtacagaaa taattagcgg 1360

cagcgcggat cttaatttgg aacttgcaaa gatactccta attagcctgg ctagattagt 1420

ttgtaaattc cttgttgatg tgtcgtctca gctttaagct gcagacatgc tagcaagtaa 1480

caacacgatt agtacgtagt aatgtggttc ttgattatga gctgggggtc ttaacctttt 1540

ttgtgtgaca agcaagagaa gaggatttgg gtacaatgta atcctgttct tccgctttcg 1600

aaaaaaaaaa catatagctt cacgtgcct 1629

<210>2

<211>322

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Thr Ser Ser Met Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Tyr Ala Gln Val

1 5 10 15

Met Glu Asp Met Glu Lys Gly Lys Glu Leu Ala Ala Gln Leu Gln Gly

20 25 30

Leu Leu Arg Asp Ser Pro Glu Ala Gly Arg Phe Val Asp Gln Ile Leu

35 40 45

His Thr Phe Ser Arg Ala Met Arg Ala Leu Asp Lys Ala Ala Val Ser

50 55 60

Ala Ala Gly Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Ser Glu Val Thr Cys Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ala Ser Ala Gly Gly Lys Arg Lys Ala Pro Ala Ala Asn Arg

85 90 95

Lys Ala Asn Cys Arg Arg Arg Thr Gln Gln Ser Ser Gly Asn Thr Val

100 105 110

Val Val Lys Asn Leu Asp Asp Gly Gln Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln

115 120 125

Lys Glu Ile Gln Asn Ser Lys His Pro Lys Ala Tyr Phe Arg Cys Thr

130 135 140

His Lys Tyr Asp Gln Met Cys Thr Ala Gln Arg Gln Val Gln Arg Cys

145 150 155 160

Asp Asp Asp Pro Ala Ser Tyr Arg Val Thr Tyr Ile Gly Glu His Thr

165 170 175

Cys Arg Asp Pro Ala Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala His Val Ile His

180 185 190

Gln Val Ala Ala Gly Asp Asp Asp Asp Gly Cys Gly Gly Leu His Ala

195 200 205

Gly Ser Arg Leu Ile Ser Phe Val Ala Ala Pro Ala Ala Pro Val Asp

210 215 220

Ala Ala Ala Ala Pro Thr Thr Ser Thr Ile Thr Thr Val Thr Ala Pro

225 230 235 240

Gly Pro Leu Leu Gln Pro Leu Lys Val Glu Gly Gly Ile Gly Ser Ser

245 250 255

Asp Gln Glu Glu Val Leu Ser Ser Leu Thr Pro Gly Ser Ser Ala Ala

260 265 270

Arg Gly Gly Gly Val Ala Gly Pro Phe Gly Pro Asp Gln Gly Asp Val

275 280 285

Thr Ser Ser Leu His Trp Ser Tyr Asp Ala Val Ala Gly Met Glu Phe

290 295 300

Phe Lys Asn Asp Glu Val Val Phe Asp Leu Asp Asp Ile Met Gly Leu

305 310 315 320

Ser Phe

Claims

1.抑制OsWRKY45-2基因表达在增加水稻耐干旱、高盐和低温以及对脱落酸不敏感中的应用，其特征在于所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。