CN101921323A - 一种人的核糖体蛋白s20蛋白质及其在自身免疫性肝炎诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自身免疫性肝炎特异的蛋白质核糖体蛋白S20及其应用。该蛋白质具有序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列。本发明还公开了用其基因克隆表达该蛋白质，并进行蛋白质芯片和酶联免疫吸附试验检测的方法，由本方法制备的核糖体蛋白S20可用于自身免疫性肝炎的诊断。

Description

一种人的核糖体蛋白S20蛋白质及其在自身免疫性肝炎诊断中的应用

技术领域

本发明涉及一种人的核糖体蛋白S20自身抗原，更具体地说是一种自身免疫性疾病特异抗原核糖体蛋白S20，在制备检测自身免疫性疾病试剂盒中的应用及含有该自身抗原的检测试剂盒，属于生物工程和疾病诊断领域。

背景技术

自身免疫性肝炎(Autoimmune Hepatitis，AIH)又称自免肝，是一种非病毒性的慢性肝炎，其致病原因不明，临床表现为慢性肝细胞发炎及坏死。如治疗不及时，AIH重症患者仅有50％的5年存活率。中国人群中AIH的患病率较低，但随着临床经验的积累以及实验室诊断技术的进步，我国人群中这类疾病逐渐增多。只有通过早期发现，才有可能对病期进行更准确的评估，尽早地进行针对性治疗，从而提高生存率，改善预后。

AIH患者血清内能检测到多种自身抗体，如抗核抗体(anti-nuclearautoantibody，ANA)、抗平滑肌抗体(smooth muscle autoantibody，SMA)、抗肝肾微粒体抗体(anti-liver and kidney microsomal antigens，anti-LKM)等。目前临床检验科常用间接免疫荧光法(indirectimmunofluoresence，IIF)检测，即用啮齿类动物组织或Hep-2细胞制备成组织/细胞芯片，与患者血清反应，继之以荧光标记的抗人IgG抗体检测血清抗体和芯片上抗原的结合，通过荧光图像判断，主观性强。近年来，对AIH自身抗体靶标进行了探索，已知的有CYP2D6、ASGP-R、F-actin等，为使用客观的诊断方法提供了分子基础。

蛋白质芯片技术可以全面地分析血清的抗体谱，提供具有疾病特异性的自身抗体标志物。

核糖体蛋白S20(ribosomal protein S20，RPS20)是1993年从人皮肤血管内皮细胞cDNA文库中克隆出的一个核糖体结构蛋白的基因。该基因编码119个氨基酸。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：

本发明的第一个目的是提供一种特异性自身免疫性肝炎RPS20抗原。

本发明的第二个目的是提供RPS20抗原在制备人自身免疫性肝炎的蛋白质芯片检测试剂及其相应试剂盒的用途。

本发明的第三个目的是提供RPS20抗原在制备人自身免疫性肝炎的ELISA检测试剂及其对应ELISA检测试剂盒的用途。

解决技术问题所采用的技术手段：

本发明利用蛋白质芯片技术，首先利用5000人类蛋白质芯片比较AIH和健康对照的血清抗体谱，筛选出14个与AIH相关的候选自身抗原。然后制备该14个候选抗原的蛋白质芯片，对AIH、健康对照、以及其它需要和不需要进行鉴别诊断的血清样本进行检测，鉴定出在AIH样本中特异的RPS20自身抗原。

发明人制备了RPS20蛋白质，通过特异性蛋白质芯片和酶联免疫吸附试验((enzyme-l inked immunosorbent assay，ELISA)方法，验证了其自身抗体可在部分AIH病人血清中检测到。单独检测时，检出率为40.0％-47.70％。RPS20与其他5个自身抗原一起，可联合检测AIH，特异性和敏感性分别为96.2％和68.2％(逻辑回归)及93.2％和84.1％(判别分析)，准确率达到91.7％(表1)。另外，RPS20可特异性地鉴别诊断PBC和HC等其他肝脏疾病(图1)。因此，RPS20可作为AIH诊断的分子标志。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

1、一种人的RPS20蛋白质，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列；

2)将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或多于一个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可识别针对序列表中SEQ IDNo：2的自身抗体的蛋白质序列或可识别用序列表中SEQ ID No：2的序列表达的蛋白质所制备的抗体的蛋白质序列。

2、项目1所述人的RPS20蛋白质的编码基因，是具有下述核苷酸序列之一的基因：

1)序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID No：1的DNA序列具有85％以上同源性。

3、含有项目1所述蛋白质的检测试剂，其用于检测人的自身免疫性肝炎。

4、项目1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的蛋白质芯片检测试剂。

5、项目1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的ELISA检测试剂。

6、项目1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的检测试剂。

7、使用项目1所述的蛋白质进行检测的方法，其包括使项目1所述的蛋白质与生物样品接触。

8、含有项目1所述蛋白质的抗体在自身免疫性肝炎中的应用。

9、含有项目1所述蛋白质为药物靶标的应用。

10、项目2所述的核酸分子的应用，其特征在于作为引物用于核酸扩增反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，或者用于作为自身免疫性肝炎诊断的标志。

本发明的优点及有益效果：

(1)本发明RPS20具有极强的特异性，为特异的AIH标志物。

(2)本发明克隆了其全长，具免疫反应的高特异性和高敏感性；其可以制备检测AIH的试剂盒，检测效率高，使用方便，该试剂盒具有较高的应用价值。

(3)本发明RPS20还可以作为治疗AIH药物研发的靶标。

(4)本发明RPS20蛋白质及其核酸序列均可以作为AIH检测的靶标。

附图说明

图1是RPS20蛋白质与各组血清反应信号值的盒须图分析。将含有RPS20的蛋白质芯片检测包含自免肝、健康对照、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、丙肝(HC)、及其他疾病对照共278份样品。长方形定义四分位距(IQR)；长方形内的横线表示中位值；长方形上下方的误差棒定义了1.5IQR的离群值。所有1.5*IQR+中位值之外的末端离群值点用黑色小方块表示。结果显示RPS20可特异性地鉴别AIH与非AIH，包括需要与AIH鉴别诊断的PBC及HC。

具体实施方式

材料来源：

本发明具体实施方式所用血清标本来源于北京协和医院。留取的血液经沉淀离心后，血清移入低温保存。疾病标本均经临床检验确诊，并有患者知情同意书。

本具体实施方式所用试剂均为市售产品。

实施例1RPS20自身抗原的制备

以人肝脏cDNA文库为模板，根据RPS20基因序列设计特异引物，引物两端含有酵母重组位点：

上游引物：5’gcatcaccatcaccatcacggtggtggtatggcttttaaggataccgg 3’(SEQID No：3)；

下游引物：5’aggcagatcgtcagtcagtcacgatgaaagcatctgcaatggtgacttcc3’(SEQID No：4)。

PCR(参数：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，共35循环；72℃10min，4℃保存)扩增出全长RPS20基因，与线性载体pEGH(XbaI+HindIII双酶切)共同化学转化酵母感受态细胞Y258(参考文献1)，挑单克隆提取质粒进行测序，验证序列无误。筛选得到的阳性克隆，用2％半乳糖诱导表达14小时。诱导后的酵母细胞裂解后，用GST亲和树脂纯化蛋白(洗脱条件为30mM还原性谷胱甘肽)。

实施例2RPS20蛋白质制备蛋白质芯片检测AIH

取10微升纯化的蛋白质溶液至384孔板中，用PerkinElmer Spotarray72型芯片点样仪将经5000个人类蛋白质芯片筛选出的包含PRS20的14个与AIH相关的候选自身抗原在表面经过化学处理适用于蛋白质芯片点制的显微玻片上连续点制成12个完全一致的方阵，每个方阵都包括了这12个候选自身抗原以及人IgG作为正对照，一个随机选取的重组人蛋白质和点样缓冲液作为负对照(参考文献1)。每个蛋白质样品被点制成横排相邻的两个重复的点。芯片点制完成后，室温下放置1小时，存放于4℃。

将上述芯片，对包含44份AIH及其他各种疾病和健康对照在内的共278份样品进行芯片杂交分析实验。所有样品均以1∶1000的比例稀释，血清中与芯片上蛋白结合的抗体用Cy5标记的羊抗人IgG抗体(1∶1000稀释)来测定。

RPS20自身抗原在AIH的检出率为47.70％(21、44)。对RPS20自身抗原与各组血清反应信号值的盒须图分析结果(图1)表明，RPS20可特异性地鉴别AIH与非AIH，包括需要与AIH鉴别诊断的PBC及HC。

本发明还通过训练数学判别模型，得到了包括RPS20在内的6个抗原及其判别公式。针对278份样品，AIH的判别准确率达到91.7％(表1)。

表1：两种判别模式对训练样品的判别

本发明用蛋白质芯片的方法对另外15份AIH和26份健康对照样品进行双盲判别，准确率达到85.4％(表2)。

表2：两种判别模式对双盲样品的判别

实施例3PRS20蛋白质制备ELISA试剂盒检测AIH

选择聚苯乙烯ELISA板，保证单孔的吸光值和96孔吸光值的平均值之间的差值在10％以内。在每孔中包被100μl的Alba-like抗原(2.5μg/ml)，并用1％的牛血清白蛋白进行封闭。对板材和包被的抗原进行干燥处理和真空包装。

将包被的ELISA板与15份AIH和15份健康对照血清(1∶40稀释)反应，进行ELISA分析实验。与AIH和健康人血清反应的结果(吸光度)做T检验，p值小于0.01，显示其与两种血清反应时有显著差异。

以健康对照血清与RPS20蛋白质反应的光吸收值的平均值加上标准差的三倍作为阈值，判断RPS20蛋白质与15份AIH反应的阳性率及特异性。阳性率为40％(6/15)，特异性为100％，即没有一例对照血清被误诊。

参考文献

1.Hu S.，Li Y.，Liu G.，Song Q，Wang L.，Han Y.，Zhang Y.，SongY.，Yao X.，Tao Y.，Zeng H.，Yang H.，Wang J.，Zhu H.，Chen ZN，and Wu L.(2007)A Protein Chip approach for high-throughputantigen identification and characterization.Proteomics 2007，7，2151-2161.

序列表

<110>北京华大蛋白质研发中心有限公司

<120>一种人的核糖体蛋白S20蛋白质及其在自身免疫性肝炎诊断中的应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>357

<212>DNA

<213>HUMAN

<400>1

atggctttta aggataccgg aaaaacaccc gtggagccgg aggtggcaat tcaccgaatt     60

cgaatcaccc taacaagccg caacgtaaaa tccttggaaa aggtgtgtgc tgacttgata    120

agaggcgcaa aagaaaagaa tctcaaagtg aaaggaccag ttcgaatgcc taccaagact    180

ttgagaatca ctacaagaaa aactccttgt ggtgaaggtt ctaagacgtg ggatcgtttc    240

cagatgagaa ttcacaagcg actcattgac ttgcacagtc cttctgagat tgttaagcag    300

attacttcca tcagtattga gccaggagtt gaggtggaag tcaccattgc agatgct       357

<210>2

<211>119

<212>PRT

<213>HUMAN

<400>2

Met Ala Phe Lys Asp Thr Gly Lys Thr Pro Val Glu Pro Glu Val Ala

1               5                   10                  15

Ile His Arg Ile Arg Ile Thr Leu Thr Ser Arg Asn Val Lys Ser Leu

            20                  25                  30

Glu Lys Val Cys Ala Asp Leu Ile Arg Gly Ala Lys Glu Lys Asn Leu

        35                  40                  45

Lys Val Lys Gly Pro Val Arg Met Pro Thr Lys Thr Leu Arg Ile Thr

    50                  55                  60

Thr Arg Lys Thr Pro Cys Gly Glu Gly Ser Lys Thr Trp Asp Arg Phe

65                  70                  75                  80

Gln Met Arg Ile His Lys Arg Leu Ile Asp Leu His Ser Pro Ser Glu

                85                  90                  95

Ile Val Lys Gln Ile Thr Ser Ile Ser Ile Glu Pro Gly Val Glu Val

            100                 105                 110

Glu Val Thr Ile Ala Asp Ala

        115

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>Primer

<400>3

gcatcaccat caccatcacg gtggtggtat ggcttttaag gataccgg    48

<210>4

<211>50

<212>DNA

<213>Primer

<400>4

aggcagatcg tcagtcagtc acgatgaaag catctgcaat ggtgacttcc    50

Claims (10)

1.一种人的核糖体蛋白S20蛋白质，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列；

2)将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或多于一个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与针对序列表中SEQ ID No：2的自身抗体识别的蛋白质的序列或可与用序列表中SEQ ID No：2表达的蛋白质制备的抗体识别的蛋白质的序列。

2.权利要求1所述人的核糖体蛋白S20蛋白质的编码基因，是具有下述核苷酸序列之一的基因：

1)序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID No：1的DNA序列具有85％以上同源性。

3.含有权利要求1所述蛋白质的检测试剂，其用于检测人的自身免疫性肝炎。

4.权利要求1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的蛋白质芯片检测试剂。

5.权利要求1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂。

6.权利要求1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的检测试剂。

7.使用权利要求1所述的蛋白质进行检测的方法，其包括使权利要求1所述的蛋白质与生物样品接触。

8.含有权利要求1所述蛋白质的抗体在自身免疫性肝炎中的应用。

9.含有权利要求1所述蛋白质为药物靶标的应用。

10.权利要求2所述的核酸分子的应用，其特征在于作为引物用于核酸扩增反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，或者用于作为自身免疫性肝炎诊断的标志。

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