CN101921309B - L-胱氨酰二-l-门冬氨酸三肽及其衍生物,制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种L-胱氨酰二-L-门冬氨酸三肽及其衍生物，制备方法及应用。采用的技术方案是：通式(I)所示的化合物及其药学上可接受的盐。本发明将胱氨酸与门冬氨酸通过肽键连接，再进行多种结构修饰，得到一类新型的L-胱氨酰二-L-门冬氨酸三肽化合物及其衍生物，不仅溶解度得以改善，同时在治疗脂肪肝及肝损伤中的应用可以发挥协同药理作用。而且可以作为血钾补充剂的应用。

Description

L-胱氨酰二-L-门冬氨酸三肽及其衍生物,制备方法及应用

技术领域

本发明涉及新颖的L-胱氨酰二-L-门冬氨酸三肽化合物及其衍生物，其制备方法，以及在治疗脂肪肝及肝损伤中的应用及作为血钾补充剂的应用。

背景技术

胱氨酸具有较广泛的生理活性，其结构中含有活泼的巯基-SH，易被氧化脱氧，这一特异结构使其在体内可发挥自由基清除作用。机体内新陈代谢产生的许多自由基会损伤细胞膜，侵袭生命大分子，促进机体衰老，并诱发肿瘤或动脉粥样硬化的产生，故清除自由基可起到强有力的保护作用。胱氨酸片是临床应用的氨基酸类药物，其主要成份为胱氨酸，该品能促进细胞氧化还原功能，使肝脏功能旺盛，并能中和毒素、促进细胞增生、阻止病原菌发育，用于慢性肝炎的辅助治疗等。谷胱甘肽为另一其活性成份的结构中含有胱氨酸结构片断的临床药物，它的主要生理功能是抗自由基，抗衰老，抗氧化，临床也应用于各类肝病的治疗，包括病毒性、药物毒性、酒精毒性及其它化学物质毒性引起的肝脏损害等。以上两种药物在肝脏疾病治疗领域的应用均与胱氨酸的生理活性密切相关。

门冬氨酸是另一在人体内具有重要生理活性的氨基酸：①门冬氨酸是草酰乙酸的前体，在三羧酸循环中起重要作用，促进能量代谢；②参与鸟氨酸循环，促进氨与二氧化碳结合生成尿素而排出，降低血氨浓度，达到解氨毒作用，这是肝细胞为维持其正常功能所必不可少的生化代谢；③参与生成核苷酸，是肝细胞修复和再生的重要物质，并可促进胆汁及胆色素排泄，有排黄、减少肝脂肪.增加肝糖元等作用。同时门冬氨酸与细胞有高度亲和力，能和金属离子(如钾离子、镁离子)结合成牢固的复合物，作为载体使K⁺、Mg⁺⁺进入细胞内，提高其在细胞内的浓度。

胱氨酸与门冬氨酸均难溶于水，这种溶解度差的特性使它们的应用受到很大限制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明将这两种氨基酸通过肽键连接，再进行多种结构修饰，得到一类新型的L-胱氨酰二-L-门冬氨酸三肽化合物及其衍生物，因胱氨酸与门冬氨酸本身均具有肝脏保护作用，使得这种新型的化合物在体内能发挥协同药理作用。

本发明所提供的L-胱氨酰二-L-门冬氨酸三肽化合物及其衍生物，由通式(I)所示：

其中

R₁表示氢、取代或未取代的低级烷基、碳环或杂环芳基、碳环或杂环芳基-低级烷基、环烷基、环烷基-低级烷基、联芳基、联芳基-低级烷基；氧杂环烷基、硫杂环烷基、氮杂环烷基、氧杂环烷基-低级烷基、硫杂环烷基-低级烷基、氮杂环烷基-低级烷基；取代或未取代的低级烷基酰基、碳环或杂环芳基酰基、碳环或杂环芳基-低级烷基酰基、环烷基酰基、环烷基-低级烷基酰基、联芳基酰基、联芳基-低级烷基酰基；氧杂环烷基酰基、硫杂环烷基酰基、氮杂环烷基酰基、氧杂环烷基-低级烷基酰基、硫杂环烷基-低级烷基酰基、氮杂环烷基-低级烷基酰基；取代或未取代的低级烷基氧羰基、碳环或杂环芳基氧羰基、碳环或杂环芳基-低级烷基氧羰基、环烷基氧羰基、环烷基-低级烷基氧羰基、联芳基氧羰基、联芳基-低级烷基氧羰基；氧杂环烷基氧羰基、硫杂环烷基氧羰基、氮杂环烷基氧羰基、氧杂环烷基-低级烷基氧羰基、硫杂环烷基-低级烷基氧羰基、氮杂环烷基-低级烷基氧羰基；

R₁优选取代或未取代的低级烷基酰基如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丁酰基、新戊酰基或异戊基酰基，或者优选芳基酰基如苯甲酰基，最好是甲酰基或乙酰基。

R₁优选取代或未取代的低级烷基氧羰基如甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧羰基，或优选芳基氧羰基如苄氧羰基、9-芴基甲氧羰基，最好是叔丁氧羰基。

R₁优选氢、取代或未取代的低级烷基如甲基、乙基、正丙基、叔丁基，最好是氢或甲基。

R₂表示氢、取代或未取代的低级烷基、碳环或杂环芳基、碳环或杂环芳基-低级烷基、环烷基、环烷基-低级烷基、联芳基、联芳基-低级烷基；氧杂环烷基、硫杂环烷基、氮杂环烷基、氧杂环烷基-低级烷基、硫杂环烷基-低级烷基、氮杂环烷基-低级烷基；取代或未取代的低级烷基酰基、碳环或杂环芳基酰基、碳环或杂环芳基-低级烷基酰基、环烷基酰基、环烷基-低级烷基酰基、联芳基酰基、联芳基-低级烷基酰基；氧杂环烷基酰基、硫杂环烷基酰基、氮杂环烷基酰基、氧杂环烷基-低级烷基酰基、硫杂环烷基-低级烷基酰基、氮杂环烷基-低级烷基酰基；取代或未取代的低级烷基氧羰基、碳环或杂环芳基氧羰基、碳环或杂环芳基-低级烷基氧羰基、环烷基氧羰基、环烷基-低级烷基氧羰基、联芳基氧羰基、联芳基-低级烷基氧羰基；氧杂环烷基氧羰基、硫杂环烷基氧羰基、氮杂环烷基氧羰基、氧杂环烷基-低级烷基氧羰基、硫杂环烷基-低级烷基氧羰基、氮杂环烷基-低级烷基氧羰基；

R₂优选取代或未取代的低级烷基酰基如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丁酰基、新戊酰基或异戊基酰基，或者优选芳基酰基如苯甲酰基，最好是甲酰基或乙酰基。

R₂优选取代或未取代的低级烷基氧羰基如甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧羰基，或优选芳基氧羰基如苄氧羰基、9-芴基甲氧羰基，最好是叔丁氧羰基。

R₂优选氢、取代或未取代的低级烷基如甲基、乙基、正丙基、叔丁基，最好是氢或甲基。

R₃表示氢、取代或未取代的低级烷基、碳环或杂环芳基、碳环或杂环芳基-低级烷基、环烷基、环烷基-低级烷基、联芳基、联芳基-低级烷基；氧杂环烷基、硫杂环烷基、氮杂环烷基、氧杂环烷基-低级烷基、硫杂环烷基-低级烷基、氮杂环烷基-低级烷基；

R₃优选氢、取代或未取代的低级烷基如甲基、乙基、正丙基、叔丁基，最好是氢或甲基。

R₄表示氢、取代或未取代的低级烷基、碳环或杂环芳基、碳环或杂环芳基-低级烷基、环烷基、环烷基-低级烷基、联芳基、联芳基-低级烷基；氧杂环烷基、硫杂环烷基、氮杂环烷基、氧杂环烷基-低级烷基、硫杂环烷基-低级烷基、氮杂环烷基-低级烷基；

R₄优选氢、取代或未取代的低级烷基如甲基、乙基、正丙基、叔丁基，最好是氢或甲基。

根据本发明，通式(I)化合物的药学上可接受的盐，包括如下几种：

(一)，由含有酸性基团(如羧基)的通式(I)化合物与碱金属如钠、钾或碱土金属如镁或钙形成的盐；与氨形成的铵盐；与生理上可耐受的有机胺如三乙胺或三-(2-羟乙基)胺形成的盐；优选钾盐或镁盐。

(二)，由含有碱性基团(如氨基)的通式(I)化合物与无机酸如盐酸、硫酸或磷酸，或与有机酸如乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、酒石酸和对甲苯磺酸形成的酸加成盐；优选盐酸或硫酸。

本发明中，通式(I)中胱氨酸与门冬氨酸通过肽键连接，它们是L构型或D构型，但最好是L构型的天然氨基酸。

本发明，通式(I)化合物的制备方法，包括使具有末端羧酸基团的胱氨酸片段或其反应性衍生物与具有游离氨基基团的门冬氨酸相应片段缩合，并根据需要将制得的化合物转换为药学上可接受的盐。

也就是说，通式(I)化合物可以用如下的步骤来进行制备：

将式(II)化合物的氨基

其中，R₃、R₄具有上面所定义的含义，与式(III)化合物的羧酸或其反应性的官能团衍生物进行缩合，其中R₁、R₂具有上面所定义的含义，

涉及式(II)的胺与式(III)的酸或其官能团反应性衍生物的缩合，制备本发明化合物的方法是通过现有技术中已知的肽合成方法来进行的。

式(II)的氨基酯与式(III)的游离羧酸的缩合是在缩合剂【如二环己基碳二酰亚胺、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、三乙胺或N-甲基吗啉】存在的条件下，在惰性溶剂【如N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃】中进行，优选在室温下进行。

式(II)的氨基酯与式(III)的酸的反应性官能团衍生物酰卤形式、混合酸酐形式或活性酯的缩合是在惰性溶剂如二氯甲烷或四氢呋喃中，在无机碱如碳酸钠或有机碱如三乙胺、N-甲基吗啉或吡啶的条件下进行，优选在室温下进行。

式(III)的酸的反应性官能团衍生物酰卤形式优选是酰氯，混合酸酐形式优选是特戊酰基或异丁氧基羰基酸酐，活性酯形式优选是1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑或六氟苯基酯。

缩合反应结束后，N-保护基可以根据现有技术中已知的方法进行除去，例如叔丁氧羰基用三氟乙酸或氯化氢除去；如有必要时，可除去羧基保护基，羧基保护基的除去根据保护基的种类不同而方法各异，如苄基保护基采用催化氢化法或转移氢化法除去，而其他羧酸酯可以被水解，例如用碱如碱金属碳酸盐或碱金属氢氧化物的水溶液来进行水解。

本发明中，可以将所得的任何本发明的化合物转换成另一种本发明的化合物；

本发明的化合物优选异构体是用纯的对映异构体制备的。

根据本发明，将通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，同时添加一种或多种无机的、有机的或医药上可用的赋形剂，制成医药制剂。可通过口服、静脉内或皮下给药，给药剂量依据动物种、体重、年龄及给药方式而定。

可按已知的溶解、混合、造粒或片剂包衣等加工过程制备本发明的医药制剂。

为了口服给药，可将通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与常用的添加剂如赋形剂、稳定剂或惰性稀释剂混合，按常规方法制成适于给药的剂型，如片剂、糖衣片剂、硬胶囊、含水、醇或油的悬浮剂或含水、醇或油的溶液。适用的惰性赋形剂包括阿拉伯树胶、氧化镁、碳酸镁、磷酸钾、乳糖、葡萄糖、硬脂酰富马酸镁或淀粉，特别是玉米淀粉。可制成干或湿颗粒状的制剂。适用的油性赋形剂或溶剂包括植物或动物油，如花生油和鱼肝油。

为了皮下或静脉内给药，可将通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐溶于溶剂中制成溶液，悬浮液或乳液，必要时还可加入稳定剂、乳化剂或其他辅助剂。适用的溶剂有水、生理盐水或醇，如乙醇、丙二醇或甘油，此外还有糖溶液如葡萄糖或甘露醇溶液，或者是上述不同溶剂的混合物。

本发明通式(I)的化合物及其药学上可接受的盐，可用于治疗脂肪肝及肝损伤。

本发明中，含有酸性基团(如羧基)的通式(I)化合物与含钾的无机碱形成钾盐化合物，可用于细胞补钾。

附图说明

图1是实施例7制备的钾盐化合物对钾离子进入血细胞的影响。

图中，1表示化合物2组；2表示门冬氨酸钾组；3表示谷氨酸钾组；4表示氯化钾组。

代表上清液中钾的含量；

代表进入血细胞中钾的含量。

具体实施方式

下面，通过实施例对本发明做进一步的说明。以代表性的方法为中心进行说明，本发明包括这些，但并不限于此。所给出的温度以摄氏度为单位。如果没有说明，所有的蒸发都是在减压条件下进行的，优选在约15至100mmHg下进行。

实施例1：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯盐酸盐的制备

向含有N-BOC-L-胱氨酸(0.44g，1mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu，0.23g，2mmol)、二环己基碳二酰亚胺(DCC，0.51g，2mmol)、L-门冬氨酸二甲酯盐酸盐(0.5g，2.5mmol)的四氢呋喃(150ml)溶液中加入三乙胺(2ml，12mmol)，将混合物室温搅拌过夜，真空下浓缩，浓缩物溶解于5ml二氯甲烷中，并且依次用浓度为5％的柠檬酸、5％的碳酸氢钠和饱和食盐水萃取，萃取后的产物用硫酸钠干燥并且进行真空浓缩得到固体0.6g，即为N-BOC-L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯，结构式如下：

MS[M+H]⁺：727。

将上述的N-BOC-L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯(0.73g，1mmol)溶解于二氯甲烷(20ml)中，并将其在冰浴中冷却，将该溶液用氯化氢气体饱和10分钟，然后在室温下搅拌过夜，抽滤得到白色固体0.56g，即为L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯盐酸盐。结构如下式所示。

MS[M-2HCl+H]⁺：527；

¹H-NMR(D₂O)：3.05(4H，d，2×CH₂)，3.23～3.46(4H，m，2×SCH₂)，3.73(6H，s，2×CH₃)，3.79(6H，s，2×CH₃)，4.43(2H，m，2×CH)，4.92(2H，m，2×CH)。

实施例2：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸的制备

向含有L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯盐酸盐(0.6g，1mmol)的甲醇(20ml)溶液中，加入1N的氢氧化钠溶液(10ml)，将该混合物在室温下搅拌四小时，用1N的盐酸酸化到pH＝1，抽滤，干燥，得到白色泡沫状固体0.29g，即为L-胱氨酰二L-门冬氨酸。结构如下式所示。

MS[M+H]⁺：471；

¹H-NMR(D₂O)：2.93(4H，d，2×CH₂)，3.04～3.19(4H，m，2×SCH₂)，4.26(2H，m，2×CH)，4.73(2H，m，2×CH)。

实施例3：N-乙酰基-L-胱氨酰二-L-门冬氨酸的制备

将L-胱氨酰二-L-门冬氨酸(0.47g，1mmol)溶解于1g/10ml的氢氧化钠溶液10ml中，室温下滴加醋酐(2.04g，2mmol)，搅拌12小时，用1N的盐酸酸化到pH＝1，抽滤，干燥，得到白色固体0.45g，即为N-乙酰基-L-胱氨酰二L-门冬氨酸。结构如下式所示。

MS[M+H]⁺：555。

实施例4：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-α-苄酯-β-甲酯盐酸盐的制备

(一)L-门冬氨酸-α-苄酯-β-甲酯盐酸盐的制备

将L-门冬氨酸(1.33g，10mmol)悬浮于甲醇(10ml)中，冰浴下滴加氯化亚砜(1.19g，10mmol)，缓慢升温，室温反应25分钟，加入乙醚(10ml)，析出白色固体，抽滤得到L-门冬氨酸-β-甲酯盐酸盐1.3g。

向含L-门冬氨酸-β-甲酯盐酸盐(1.83g，10mmol)的苄醇(10ml)溶液中，加入对甲苯磺酸(0.22g，1.3mmol)和30ml甲苯，回流带水反应4h，减压蒸去溶剂，所得物加入乙醚(30ml)，抽滤，得到白色固体2.2g，即为L-门冬氨酸-α-苄酯-β-甲酯盐酸盐，结构如下式所示。

MS[M-HCl+H]⁺：238。

(二)向含有N-BOC-L-胱氨酸(0.44g，1mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu，0.23g，2mmol)、二环己基碳二酰亚胺(DCC，0.51g，2mmol)和L-门冬氨酸-α-苄酯-β-甲酯盐酸盐(0.68g，2.5mmol)的四氢呋喃(150ml)溶液中加入三乙胺(2ml，12mmol)，将混合物室温搅拌过夜，真空下浓缩，浓缩物溶解于二氯甲烷中，并且依次用浓度为5％的柠檬酸、5％的碳酸氢钠和饱和食盐水萃取，将萃取后的产物用硫酸钠干燥并且进行真空浓缩，得到固体0.6g，即为N-BOC-L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-α-苄酯-β-甲酯；结构式如下：

MS[M+H]⁺：879。

(三)将上述的N-BOC-L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-α-苄酯-β-甲酯(0.88g，1mmol)溶解于二氯甲烷(20ml)中，并将其在冰浴中冷却，将该溶液用氯化氢气体饱和10分钟，然后在室温下搅拌过夜，抽滤得到白色固体0.69g，即为L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-α-苄酯-β-甲酯盐酸盐化合物，结构如下式所示。

MS[M-2HCl+H]⁺：679。

实施例5：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-β-甲酯的制备

将L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-α-苄酯-β-甲酯盐酸盐(1.5g，2mmol)溶解于甲醇(20ml)中，加入三乙胺(0.28ml，2mmol)，搅拌5分钟，抽滤，滤液中加入5％钯碳(80mg)，室温通氢2～3小时，抽滤，减压蒸去溶剂，得到白色固体0.73g，即为L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-β-甲酯，结构如下式所示；

MS[M+H]⁺：499。

实施例6：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-β-甲酯盐酸盐的制备

将L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-β-甲酯(1.0g，2mmol)溶解于乙酸乙酯(12ml)中，搅拌下滴加10ml浓度为2mol/L的氯化氢/乙酸乙酯溶液，搅拌30分钟，抽滤，滤饼减压真空干燥，得到白色固体1.04g，即为L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-β-甲酯盐酸盐，结构如下式所示；

MS[M+H]⁺：499。

实施例7：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-β-甲酯钾盐的制备

将L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-β-甲酯(1.0g，2mmol)悬浮于水(10ml)中，搅拌下滴加饱和碳酸钾溶液直至固体全部溶解，加入活性碳(50mg)，搅拌20分钟，抽滤，滤液冷冻干燥，得白色固体1.12g，即为L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-β-甲酯钾盐，结构如下式所示；

MS[M-K]⁺：536。

实施例8：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯盐酸盐(以下简称化合物1)对非酒精性脂肪肝大鼠的作用

取雄性Wistar大鼠60只，普通饲料喂养一周后，随机分为6组，分别为空白对照组(A)、高剂量给药组(B)、中剂量给药组(C)、低剂量给药组(D)、阳性对照组(E)、模型组(F)，除A组外，其余均每日饲以高脂饲料(每100g基础饲料中加入下列营养饲料：奶粉10g、猪油10g、鸡蛋1只、浓鱼肝油10滴、新鲜黄豆250g)。6周后，各组在继续用高脂饲料喂养的同时，B、C、D组分别给予100、50、25mg/ml的化合物1溶液灌胃，1ml/100g；E组给予泛脂通片27mg/ml灌胃，1ml/100g；A、F组给予生理盐水1ml/100g灌胃。给药4周(试验10周)，末次给药后12h，眼眶静脉丛取血，分离血清，检测谷丙转氨酶(ALT)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)。取血后处死动物留取肝组织，称重，另取肝组织浸泡于福尔马林中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。结果见表1和表2。

肝细胞脂肪变分级方法：重度(+++)：脂变肝细胞超过肝小叶2/3；中度(++)：脂变肝细胞占肝小叶1/3～2/3；轻度(+)：脂变肝细胞呈散在小灶分布；无(-)：肝小叶结构完好，基本无脂变。

表1化合物1对非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞脂肪变的影响结果

表2化合物1非酒精性脂肪肝大鼠肝湿重和血清检验结果(X±SD，n＝10)

与A组比较P＜0.01；^△与F组比较P＜0.05，^△△与F组比较P＜0.01

结论：化合物1对非酒精性脂肪肝大鼠具有明显降低血脂、减少肝脏重量，改善肝功能、改善肝细胞脂肪浸润和炎症活动度的作用，高剂量组的抗脂效果优于阳性对照组。

实施例9：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯盐酸盐(以下简称化合物1)对酒精性脂肪肝的影响

昆明种小鼠40只，体重18～22g，随机分为空白对照组(A)、模型组(B)、化合物1高剂量给药组(C)、小剂量给药组(D)，每组10只。化合物1用0.9％氯化钠注射液稀释后灌胃给药，高、低剂量组给药浓度分别为100、25.0mg/ml，给药体积0.2ml/10g。

小鼠适应性喂养3d，C组及D组每日按照上述浓度给予化合物1外，2h后给予乙醇灌胃，灌胃量为0.12ml/10g，禁食6h后，再给予正常饲料，为避免高浓度乙醇造成小鼠死亡，先给予15％(L/L)的低浓度乙醇，3d后浓度提高到50％；B组小鼠用0.9％氯化钠注射液替代化合物1，乙醇灌胃方法同前；A组小鼠用0.9％氯化钠注射液代替化合物1和乙醇。试验连续4周，末次给药12h后，眼眶静脉丛取血，分离血清，检测甘油三脂(TG)、胆固醇(CHO)、丙谷转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)，取血后处死动物取肝切片，甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察。结果见表3和表4。

按前例脂肪变分级方法评价，小鼠造模成功，C组及D组脂肪肝分级明显降低(P＜0.05)。

表3化合物1对酒精性脂肪肝小鼠肝细胞脂肪变的影响结果

表4化合物1对酒精性脂肪肝小鼠血清学检验结果(X±SD，n＝10)

^※※与A组比较P＜0.01；^△与B组比较P＜0.05，^△△与B组比较P＜0.01

结论：化合物1两个剂量组对小鼠酒精性脂肪肝具有保护作用，与模型组比较差别明显，且肝保护作用随剂量增加疗效增强。

实施例10：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯盐酸盐(以下简称化合物1)对小鼠CCL₄所致急性肝损伤的影响

将雄性昆明种小鼠随机分为6组，每组10支，分别为空白对照组(A)、高剂量给药组(B)、中剂量给药组(C)、低剂量给药组(D)、阳性对照组(E)、模型组(F)。化合物1用0.9％氯化钠注射液溶解稀释后腹腔注射给药，高、中、低剂量组给药浓度分别为25.0、50.0、100.0mg/ml，0.2ml/10g，空白对照组、模型组给予同体积0.9％氯化钠注射液，阳性对照组灌胃给予10mg/ml的联苯双酯，给药体积0.2ml/10g。连续给药4天，末次给药后1小时，除空白对照组外，每组动物腹腔注射0.5％CCL₄大豆色拉油溶液(0.2ml/10g)，空白对照组给予同体积的0.9％氯化钠注射液。48h后小鼠眼眶静脉丛取血，分离血清，分别测定总胆红素(T-BIL)和丙谷转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。结果见表5。

表5化合物1对小鼠CCL₄肝损伤的影响(X±SD，n＝10)

^※※与A组比较P＜0.01；^△与F组比较P＜0.05，^△△与F组比较P＜0.01

结论：化合物1高、中剂量组对CCL₄肝损伤小鼠有明显的退黄降酶作用，与模型组比较差异显著或非常显著，且存在一定量效依存关系。

实施例11：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯盐酸盐(以下简称化合物1)对大鼠D-氨基半乳糖(D-Gal)所致急性肝损伤的影响

Wistar大鼠60只，雄性，体重250-300g，随机分为6组，每组10支，分别为空白对照组(A)、高剂量给药组(B)、中剂量给药组(C)、低剂量给药组(D)、阳性对照组(E)、模型组(F)。化合物1用0.9％氯化钠注射液溶解稀释后缓慢i.v.给药，高、中、低剂量组给药浓度分别为12.5、25.0、50.0mg/ml，0.2ml/10g，空白对照组、模型组给予同体积0.9％氯化钠注射液，阳性对照组灌胃给予10mg/ml的联苯双酯，给药体积0.2ml/10g。连续给药4天，末次给药后1小时，除空白对照组外，每组动物皮下注射10％D-Gal的0.9％氯化钠溶液(8mg/10g)，空白对照组给予同体积的0.9％氯化钠注射液。48h后眼眶静脉丛取血，分离血清，分别测定总胆红素(T-BIL)和丙谷转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。结果见表6。

表6化合物1对大鼠D-氨基半乳糖所致肝损伤的影响(X±SD，n＝10)

^※※与A组比较P＜0.01；^△与F组比较P＜0.05，^△△与F组比较P＜0.01

结论：化合物1三个剂量组对D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠有明显的退黄降酶作用，与模型组比较差异显著或非常显著，并随剂量增大降酶作用有增强趋势，低剂量组与阳性对照组药效强度相似。

实施例12：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸二甲酯盐酸盐(以下简称化合物1)对大鼠α-萘异硫氰酸酯急性肝损伤的影响

Wistar大鼠60只，雄性，体重200-250g，随机分为6组，每组10支，分别为空白对照组(A)、高剂量给药组(B)、中剂量给药组(C)、低剂量给药组(D)、阳性对照组(E)、模型组(F)。化合物1用0.9％氯化钠注射液溶解稀释后腹腔注射给药，高、中、低剂量组给药浓度分别为12.5、25.0、50.0mg/ml，0.2ml/10g，空白对照组、模型组给予同体积0.9％氯化钠注射液，阳性对照组灌胃给予10mg/ml的联苯双酯，给药体积0.2ml/10g。连续给药4天，末次给药后1小时，除空白对照组外，每组动物腹腔注射2％α-萘异硫氰酸酯大豆色拉油溶液(0.5ml/100g)，空白对照组给予同体积的0.9％氯化钠注射液。48h后眼眶静脉丛取血，分离血清，分别测定总胆红素(T-BIL)和丙谷转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。结果见表7。

表7化合物1对大鼠α-萘异硫氰酸酯肝损伤的影响(X±SD，n＝10)

^※※与A组比较P＜0.01；^△与F组比较P＜0.05，^△△与F组比较P＜0.01

结论：化合物1三个剂量组对α-萘异硫氰酸酯所致急性肝损伤大鼠有明显的退黄降酶作用，与模型组比较差异显著或非常显著，保肝作用随剂量增加疗效增强，中剂量组与阳性对照组间药效强度相似。

实施例13：L-胱氨酰二-L-门冬氨酸-β-甲酯钾盐(简称化合物2)补钾作用研究

体重约为2.8kg的雄性家兔，绝食24h，心脏穿刺取血，加入肝素防止血液凝固，2500转/分离心10分钟，分离血浆和血细胞。血细胞用0.9％氯化钠注射液洗涤2次，取0.5ml，加至4.5ml 0.9％氯化钠注射液中，加入0.1ml含有等量钾离子的不同溶液(化合物2、门冬氨酸钾、氯化钾和谷氨酸钾)，置37℃恒温水浴槽中，不时振荡，孵育1小时，离心分离上清液及血细胞部分，取上清液测定钾量。结果见图1。

化合物2给药组上清液中钾减少量最大，其次为门冬氨酸钾组、谷氨酸钾组、氯化钾组。结论：血细胞中钾量的增加，以化合物2给药组最为显著，其次门冬氨酸钾组、谷氨酸钾组、氯化钾组。说明化合物2具有血细胞补钾功能。

Claims (6)

1.通式（Ⅰ）所示的化合物及其药学上可接受的盐，

其中

R₁表示氢；R₂表示氢；R₃表示氢、或未取代的低级烷基；R₄表示氢、或未取代的低级烷基。

2.如权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于：R₁表示氢；R₂表示氢；R₃表示甲基；R₄表示甲基。

3.如权利要求1或2所述的化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述的药学上可接受的盐是无机酸形成的盐，或与碱金属形成的盐。

4.如权利要求3所述的化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述的无机酸选自盐酸；碱金属选自钠或钾。

5.权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗脂肪肝及肝损伤药物中的应用。

6.权利要求4所述的化合物的药学上可接受的钾盐，在制备作为血钾补充剂药物中的应用。

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