CN101921302B - 可利霉素的纯化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从发酵液提取可利霉素的纯化工艺，包括如下步骤：(1)向发酵液中加入絮凝剂沉淀蛋白，过滤获得滤液；(2)用溶媒萃取法从步骤(1)获得的发酵滤液中提取可利霉素，取得酯相；(3)用盐溶液、纯水交替洗涤步骤(2)获得的酯相；(4)用反萃取法将可利霉素从酯相反萃取到水相；(5)将步骤(4)得到的水相可利霉素结晶、干燥，获得成品。该纯化方法通过萃取，尤其是通过缓冲盐溶液洗涤萃取相，去除了其中残留的螺旋霉素，优化了可利霉素的组分配比，所得产品符合质量指标要求，而洗涤液中的螺旋霉素可以分离回收，大大提高了产品的质量和收率。

Description

可利霉素的纯化工艺

【技术领域】

本发明涉及医药化工技术领域，更具体地讲，涉及一种从发酵液中提取可利霉素的纯化工艺。 

【背景技术】

可利霉素，又称必特螺旋霉素，是中国第一个抗生素一类新药。它是由转基因的螺旋霉素产生菌发酵得到的，在螺旋霉素4″位加入异戊酰基侧链形成的多种结构类似成分的混合物。其成品的主要组分为异戊酰螺旋霉素I、II、III，除此以外还含有少量丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素II、III等酰化螺旋霉素，化学结构如下图，具体组分见表1。成品组分要求为异戊酰螺旋霉素III含量不低于30％，总异戊酰螺旋霉素含量不低于65％，总酰化螺旋霉素含量不低于80％。 

可利霉素成分复杂，用溶媒萃取法从发酵液中提取获得的萃取液由于含有过多乙酰、丙酰螺旋霉素而使最终获得的成品不能达到组分指标要求。因此，在溶媒萃取法的基础上建立合理有效的分离纯化工艺，去除杂质，优化组分配比，是提高可利霉素产品质量的有效方法。可利霉素化学结构式示意图如图3所示。 

目前，对大环内酯类抗生素的提取分离研究主要集中于对溶媒萃取法、大孔树脂吸附法等工艺的研究。例如，中国发明专利CN1228437A公开了一种从发酵滤液中提取螺旋霉素的工艺，通过改进传统工艺和设备，简化操作，提高收率。但针对去除杂质、优化组分而进行的研究还较少，尤其是可利霉素作为一类新药，对其组分纯化研究的报道更少。 

表1可利霉素组分一览表 

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是，提供一种通过缓冲盐溶液洗涤溶剂萃取相、分离杂质、优化组分的纯化方法。 

为了解决上述问题，本发明提供了一种提取可利霉素的纯化工艺，包括如下步骤： 

(1)向发酵液中加入絮凝剂沉淀蛋白，过滤获得滤液，其中，所述絮凝剂加入量的质量约为发酵液质量的3％～6％； 

(2)用溶媒萃取法从步骤(1)获得的发酵滤液中提取可利霉素，取得酯相，所述溶媒萃取法包括：向滤液中加入乙酸丁酯，滤液与乙酸丁酯的体积比为10～30∶1，充分搅拌，加入NaOH溶液调节pH至8.0～8.8，静置； 

(3)用盐溶液、纯水交替洗涤步骤(2)获得的酯相； 

(4)用反萃取法将可利霉素从酯相反萃取到水相； 

(5)将步骤(4)得到的水相可利霉素结晶、干燥，获得成品。 

步骤(1)所述的絮凝剂为聚合氯化铝或者聚丙烯酰胺。 

步骤(2)所述的溶媒萃取法中，在酯相中加入破乳剂消除萃取时的乳化现象，乳化现象不严重时也可不使用破乳剂； 

所述破乳剂是指NaCl或者十二烷基三甲基氯化铵1231。 

步骤(3)所述的洗涤过程包括：先用纯水洗涤，再用盐溶液洗涤，最后再用纯水洗涤； 

所述洗涤过程包括： 

(1)用纯水洗涤，酯与纯水的体积比为3～5∶1； 

(2)用盐溶液洗涤，酯与盐溶液的体积比为3～5∶1； 

(3)用纯水洗涤，酯与纯水的体积比为3～5∶1。 

步骤(3)所述的盐溶液为pH4～7的缓冲溶液； 

所述的盐溶液为磷酸盐缓冲液体系或者醋酸盐缓冲液体系；盐溶液质量浓度为0.4％～1％；所述的盐溶液为质量浓度为0.4％～1％的NaH₂PO₄溶液时最优。 

本发明的优点在于，该纯化方法操作简单，通过萃取，尤其是步骤(3)缓冲盐溶液的选择性作用，酯相提取液中去除了大部分螺旋霉素等杂质，使主要组分达到优化，最终成品中异戊酰螺旋霉素III、总异戊酰螺旋霉素及总螺旋霉素含量高于质量控制指标，而洗涤液中的螺旋霉素可以分离回收，本发明大大提高了产品的质量和收率。 

【附图说明】

图1为产品HPLC组分分析图； 

图2为产品HPLC组分分析图；

图3为可利霉素化学结构式示意图。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式做详细说明。 

实施例1 

向25L可利霉素发酵液(效价796u/ml)中加入150g聚合氯化铝，板框过滤，获得37.5L滤液。向滤液中加入乙酸丁酯1.46L，搅拌的同时加入6mol/LNaOH溶液调节pH至8.5，继续搅拌30min后静置，加NaCl后分层获得1.13L酯相提取液。依次用280mL水、质量浓度为1％的NaH₂PO₄溶液、水对丁酯提取液进行洗涤。向洗后体积为1.07L的丁酯提取液中加入纯水310mL，搅拌的同时加入3mol/L盐酸溶液调节pH至2.1，继续搅拌30min后静置、分层，获得325ml水相提取液。加入2mol/L NaOH溶液调节pH至中性，通入N₂吹气5h。向获得的300ml水相提取液中加入2mol/L NaOH溶液调节pH至10.0，静置、抽滤、干燥，获得可利霉素成品8.6g。 

经检测，成品中异戊酰螺旋霉素III含量为32.9％，总异戊酰螺旋霉素含量为75.9％，总螺旋霉素含量为91.8％，产品总收率为45.9％。产品HPLC组分分析图见图1，其中每个峰号代表的物质与表一中的组分对应。 

实施例2 

向25L可利霉素发酵液(效价1470u/ml)中加入125g聚合氯化铝，用板框过滤，获得40L滤液。向滤液中加入乙酸丁酯3.5L，搅拌的同时加入6mol/LNaOH溶液调节pH至8.2，继续搅拌30min后静置，分层获得2.98L酯相提取液。用745ml水对酯相提取液进行一次洗涤，再用745ml质量浓度为0.7％的NaH₂PO₄溶液对酯相提取液进行两次洗涤。向洗后体积为2.86L的提取液中加入质量浓度为0.7％的NaH₂PO₄溶液1L，搅拌的同时加入3mol/L盐酸溶液调节pH至2.2，继续搅拌30min后静置、分层，获得1.04L水相提取液。加入2mol/L NaOH溶液调节pH至中性，通入N₂吹气5h。向获得的1.18L提取液中加入2mol/L NaOH溶液调节pH至9.8，静置、抽滤、干燥，获得可利霉素成品19.7g。 

经检测，成品中异戊酰螺旋霉素III含量为39.6％，总异戊酰螺旋霉素含量为81.0％，总螺旋霉素含量为96.9％，产品总收率为40.1％。产品HPLC组 分分析图见图2，其中每个峰号代表的物质与表一中的组分对应。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (5)

1.一种可利霉素的纯化工艺，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向发酵液中加入絮凝剂沉淀蛋白，过滤获得滤液，其中，所述絮凝剂质量为发酵液的3％～6％；

(2)用溶媒萃取法从步骤(1)获得的发酵滤液中提取可利霉素，取得酯相，所述溶媒萃取法包括：向滤液中加入乙酸丁酯，滤液与乙酸丁酯的体积比为10～30∶1，充分搅拌，加入NaOH溶液调节pH至8.0～8.8，静置；

(3)用盐溶液、纯水交替洗涤步骤(2)获得的酯相；

(4)用反萃取法将可利霉素从酯相反萃取到水相；

(5)将步骤(4)得到的水相可利霉素结晶、干燥，获得成品，

步骤(1)所述的絮凝剂为聚合氯化铝，步骤(3)中所述盐溶液为质量浓度为0.4％～1％的NaH₂PO₄溶液。

2.根据权利要求1所述的可利霉素的纯化工艺，其特征在于，步骤(2)所述的溶媒萃取法中，在酯相中加入破乳剂消除萃取时的乳化现象。

3.根据权利要求2所述的可利霉素的纯化工艺，其特征在于，所述破乳剂是指NaCl或者十二烷基三甲基氯化铵1231。

4.根据权利要求1所述的可利霉素的纯化工艺，其特征在于，步骤(3)所述的洗涤过程包括：先用纯水洗涤，再用盐溶液洗涤，最后再用纯水洗涤。

5.根据权利要求4所述的可利霉素的纯化工艺，其特征在于，所述洗涤过程包括：

(1)用纯水洗涤，酯与纯水的体积比为3～5∶1；

(2)用盐溶液洗涤，酯与盐溶液的体积比为3～5∶1；

(3)用纯水洗涤，酯与纯水的体积比为3～5∶1。

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