CN101921295A - 羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物及其制备方法与用途 - Google Patents

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汪建军
郑小北
杨晶
吴王锁
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Abstract

本发明公开一类用放射性核素标记的化合物——羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，以及这种化合物的制备方法和用途。本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物其制备方法是首先合成配体NNN-PEGn-NIM或NNO-PEGn-NIM或NOO-PEGn-NIM，再将前述各配体分别与新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体在沸水浴中加热反应，得到相应的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物。本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物通过硝基咪唑的靶向作用浓集于乏氧肿瘤细胞，可用于乏氧肿瘤的SPECT显像诊断。

Description

羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及一类用放射性核素标记的化合物，以及这种化合物的制备方法和用途，具体讲本发明所涉及的是羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物。
背景技术
恶性肿瘤是导致人类非正常死亡的主要疾病之一，在我国和全世界的疾病死亡率和死亡原因上排在前列。乏氧是人和动物肿瘤共有的特征，实验观察与测定表明实体瘤中乏氧细胞的比例一般为10-20％，有的甚至高达50％。目前针对恶性肿瘤的治疗手段除手术外，主要是放疗和化疗，但是乏氧导致肿瘤组织对放疗和化疗不敏感，大大提高了其对放疗和化疗的抵抗性；同时，乏氧使肿瘤内氧调节蛋白(ORP)、血管内皮生长因子(VEGF)等过度表达而使其自身的侵袭性增加；此外，肿瘤乏氧还可以导致细胞凋亡和诱发肿瘤血管生成。因此，肿瘤细胞氧水平的测定在临床上具有重要意义，有助于肿瘤的早期诊断、治疗方案的确定及疗效评价。
放射性药物最重要的应用价值是研究生命过程中的生化变化；利用放射性核素标记的小分子进行PET或者SPECT显像可以活体非侵入性诊断各种疾病，是近年来分子影像学最活跃的研究领域。肿瘤乏氧显像剂是一类阳性显像剂，选择性地滞留在乏氧组织或细胞中，并通过核医学显像探测组织缺氧及其程度，它是近年来放射性药物的研究热点之一。理想的肿瘤乏氧显像剂应具备以下一些条件：①有足够的量选择性浓集于乏氧区并具有一定的滞留时间；②为探测组织氧压的细微变化，能提供可靠的正常组织与缺血组织的对照；③显像质量高，病人受辐照剂量小。
目前已用于临床研究的肿瘤乏氧显像剂包括18FMISO，99mTc-HL91，64Cu-ATSM等，但是它们的临床显像性能并不理想，主要的问题包括肿瘤绝对摄取偏低，正常组织清除较慢，肝腹部放射性浓集等。国内外的研究人员为了获得显像性质更加优异的肿瘤乏氧显像剂，进行了广泛而深入的研究，探索了一系列18F、99mTc、123/125I和62/64Cu等标记的硝基咪唑类或非硝基咪唑类衍生物，但遗憾的是这些衍生物在临床显像价值方面并没有实质性突破。因此研究具有理想的临床显像效果的新型肿瘤乏氧显像剂仍是本技术领域的一个重要研究课题。
99mTc是用于核医学SPECT显像的理想核素，羰基锝核心已广泛用于99mTc药物的研究。
中国专利95108299.X公开了一种肿瘤阳性显像剂标记平阳霉素用药盒，该药物采用显像剂锝[Tc-99m]标记平阳霉素(PYM)专用药盒，采用抗癌药PYM、微量亚锡盐、盐酸、生理 盐水及其他添加剂等为原材料，用Tc-99m作为放射性示踪原子，可用于核医学临床癌症诊断。
中国专利96194172.3公开了可用作诊断心血管疾病，感染性疾病和癌症造影剂的新的放射药物。该放射药物由膦或胂结合锝-99m标记的肼或二嗪修饰的生物活性分子组成，所述活性分子可选择性地对疾病位点进行定位，从而通过γ闪烁照相法可得到所处位点的影像。
中国发明专利申请200780024367.5公开一种锝标记的锡纳米胶体及其制备方法。所述胶体通过将放射性锝或其化合物的溶液与含有锡或其化合物、钠或其化合物、泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮的溶液混合来制备。
发明内容
本发明提供一类用于肿瘤乏氧显像的放射性示踪剂或者说药物，以及这种示踪剂的制备方法及其用途。
本发明的放射性示踪剂是羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其结构通式如式1所示：
Figure DEST_PATH_GSB00000041443500021
式1
其中：X为 
Figure DEST_PATH_GSB00000041443500022
当X和Y同为 时m为+1；X和Y分别为 
Figure DEST_PATH_GSB00000041443500024
与 
Figure DEST_PATH_GSB00000041443500025
时m为0；X和Y同为 
Figure DEST_PATH_GSB00000041443500026
时m为-1；R如式2：
Figure DEST_PATH_GSB00000041443500027
式2
其中n＝1～10。
优选地本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其聚合度n等于3。
本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物其制备方法为：
a.将聚乙二醇和三乙胺溶于二氯甲烷，再在其中缓慢滴加对甲苯磺酰氯溶于二氯甲烷的溶液，充分反应后滤除固体，滤液水洗后除去溶剂得化合物1；
b.将化合物1、2-硝基咪唑和的Na2CO3加入到CH3CN中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物2；
c.将化合物2和NaN3加入到DMF中，加热反应，减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物3；
d.将PPh3(三苯基磷)、化合物3和水溶解于THF中，经充分反应再除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物4；
e.将化合物4、氯甲基吡啶盐酸盐和三乙胺溶解于乙腈中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，再除去溶剂得配体NNN-PEGn-NIM。
如将化合物2、2-氨甲基吡啶和Na2CO3加入到乙腈中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物5；将化合物5、2-溴乙酸叔丁酯和Na2CO3加入到乙腈中，室温反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物6；将化合物6溶解于盐酸中，室温充分反应后除去溶剂得配体NNO-PEGn-NIM。
如将化合物4、2-溴乙酸叔丁酯和Na2CO3加入到乙腈中，室温反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物7；将化合物7溶解于盐酸中，室温充分反应后除去溶剂得配体NOO-PEGn-NIM.。
以上制备方法中所用的聚乙二醇聚合度为1～10，其反应参见后述式3。
f.将前述所得各配体NNN-PEGn-NIM或NNO-PEGn-NIM或NOO-PEGn-NIM分别与新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体(参考文献：Alberto R.，Schibli R.，Egli A.，Schubiger，AP.J AmChem Soc，1998(120)，7987-7988)在沸水浴中加热反应，得到如式1所示的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物。
以上所述的制备方法中优选方法是：
a.将30mmol的三缩四乙二醇和90mmol的三乙胺溶于30mL二氯甲烷，再在其中缓慢滴加66mmol的对甲苯磺酰氯溶于以二氯甲烷30mL的溶液，充分反应后滤除固体，滤液水洗后除去溶剂得粘稠状液体的化合物1a；
b.将15.6mmol的化合物1a、13mmol的2-硝基咪唑和15.6mmol的Na2CO3加入到50mL乙腈中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物2a；
c.将4.51mmol的化合物2a、5.41mmol NaN3加入到2mL DMF中，加热到100℃反应2h；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物3a；
d.将5.35mmol的PPh3、4.20mmol的化合物3a和0.8g的水溶解于10mL THF中，在30-40℃充分反应再除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状的化合物4a；
e.将0.17mmol的化合物4a，0.85mmol的氯甲基吡啶盐酸盐和1.7mmol的三乙胺溶解于8mL乙腈中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，再除去溶剂得浅黄色油状的配体NNN-PEG3-NIM；
f.将0.89mmol的化合物2a、1.78mmol的2-氨甲基吡啶和1.34mmol的Na2CO3加入到10mL乙腈中，加热回流充分反应后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状的化合物5a；
g.将0.13mmol的化合物5a、0.195mmol的2-溴乙酸叔丁酯和0.195mmol的Na2CO3加入到3mL乙腈中，室温充分反应后反应溶液变为黄色，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状化合物6a；
h.将0.073mmol的化合物6a溶解于1mol/L盐酸中，30℃左右充分反应后除去溶剂得浅黄色固体的配体NNO-PEG3-NIM；
i.将0.104mmol的化合物4a、0.312mmol的2-溴乙酸叔丁酯和0.208mmol的Na2CO3加入到2mL乙腈中，室温充分反应后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状的化合物7a；
j.将0.0949mmol的化合物7a溶解于1mol/L盐酸中，30℃左右充分反应后除去溶剂得浅黄色固体的配体NOO-PEG3-NIM；
k.将新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体用1N和0.01N的盐酸调至pH＝7；在一西林瓶中加入0.1mL 500μg/mL的NNN-PEG3-NIM或NNO-PEG3-NIM或NOO-PEG3-NIM配体溶液，0.4mL已经调节pH值的中间体溶液(10mCi)和0.5mL pH＝7.4的PBS溶液，摇匀后在沸水浴中加热反应15min，得所需要的产物，各相应产物结构式见式4。
本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物可在制备肿瘤乏氧显像药物中应用。
本发明涉及的这类羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物从结构上，该类配合物的靶向基团是2-硝基咪唑，99mTc鳌合基团通过聚乙二醇(PEG)连接基团与2-硝基咪唑相连。PEG作为连接基团，聚合度n的改变会影响配体及配合物的水溶性，进而影响到99mTc标记产物的药代动力学等；但是它不会影响配体的锝标记性能，也不会影响2-硝基咪唑的肿瘤乏氧靶向特性；因此，本发明连接基团的PEG的聚合度n没有特别要求，n的数目可在1-10之间，它们对应的羰基锝标记产物都会具有亲肿瘤特性，可通过SPECT进行肿瘤乏氧显像。
由于2-硝基咪唑是靶向作用于乏氧细胞的的生物分子，聚乙二醇(PEG)是一种广为应用的药效调节基团，同时本发明的各配合物均为水溶性物质，因此[99mTc(CO)3]+标记的聚乙二醇化(PEGylated)2-硝基咪唑配合物具有良好的肿瘤乏氧细胞亲和力，可提高肿瘤对药物的摄取，达到更好的显像诊断效果。
简言之，该类示踪剂以2-硝基咪唑为靶向分子，聚乙二醇(PEG)为连接基团，通过[99mTc(CO)3]+核心将放射性核素99mTc标记到新型硝基咪唑衍生物上，标记药物通过硝基咪唑的靶向作用浓集于乏氧肿瘤细胞，利用SPECT显像技术，对乏氧肿瘤进行诊断。
附图说明
图1为本发明的各中间体和各2-硝基咪唑配体的合成路线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
聚乙二醇化2-硝基咪唑配体的合成
将三缩四乙二醇(5.82g，30mmol)和三乙胺(9.1g，90mmol)溶于30mL二氯甲烷，缓慢滴加对甲苯磺酰氯(12.6g，66mmol)溶于二氯甲烷(30mL)的溶液，完成后继续室温反应4小时后，抽滤除去固体，滤液水洗4次，有机相干燥后真空除去溶剂得粘稠状液体的化合物1a(Tetraethylene glycol di(p-toluenesulfonate)12.67g(25.2mmol，84％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝2.45(s，6H，OCH3)，3.57(s，8H)，3.68(t，4H，J＝4.5Hz)，4.15(t，4H，J＝4.5Hz)，7.34(d，4H，J＝8.1Hz)，7.79(d，4H，J＝8.1Hz)，ppm.
将化合物1a(7.8g，15.6mmol)、2-硝基咪唑(1.5g，13mmol)和Na2CO3(1.65g，15.6mmol)加入到50mL CH3CN中，回流反应15h；旋干除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物2a(2-(2-(2-(2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl 4-methylbenzenesulfonate)：2.70g(6.09mmol，46.8％)。EI-MS：442(M+)。
将化合物2a(2g，4.51mmol)、NaN3(351.8mg，5.41mmol)加入到2mLDMF中，加热到100℃反应2h；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物3a(1-(2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-2-nitro-1H-imidazole)：1.32g(4.20mmol，93.1％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝3.40(t，2H)，3.60-3.70(m，10H)，3.86(t，2H)，4.63(t，2H)，7.13(s，1H)，7.29(s，1H)，ppm.ESI-MS：315.1(MH+)
将PPh3(1.40g，5.35mmol)，化合物3a(1.32g，4.20mmol)和水(0.8g)溶于10mLTHF中，30-40℃反应36小时；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物化合物4a(2-(2-(2-(2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethanamine)：1.04g(3.61mmol，86.0％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝2.87(t，2H)，3.49-3.61(m，10H)，3.86(t，2H)，4.63(t，2H)，7.13(s，1H)，7.28(s，1H)，ppm.ESI-MS：289.1(MH+)
将化合物4a(48mg，0.17mmol)，氯甲基吡啶盐酸盐(139.4mg，0.85mmol)和三乙胺(236μL，1.7mmol)溶解于8mL乙腈中，回流反应15h；减压除去溶剂并用硅胶柱过 柱纯化，得浅黄色油状物配体NNN-PEG3-NIM(2-(2-(2-(2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-N，N-bis(pyridin-2-ylmethyl)ethanamine)：64mg(0.136mmol，80％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：2.83(t，2H)，3.58(m，8H)，3.65(t，2H)，3.82(t，2H)，3.90(s，4H)，4.59(t，2H)，7.10(s，1H)，7.15(m，1H)，7.29(s，1H)，7.55(d，1H)，7.66(m，1H)，8.52(d，1H)，ppm.ESI-MS：471.2(MH+)
将化合物2a(396mg，0.89mmol)、2-氨甲基吡啶(192mg，1.78mmol)和Na2CO3(142mg，1.34mmol)加入到10mL乙腈中，加热回流反应5小时；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物的化合物5a(2-(2-(2-(2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-N-(pyridin-2-ylmethyl)ethanamine)：195mg(0.51mmol，57.7％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝2.89(t，2H)，3.53-3.66(m，10H)，3.84(t，2H)，3.96(s，2H)，4.61(t，2H)，7.11(s，1H)，7.17(m，1H)，7.29(s，1H)，7.33(d，1H)，7.66(m，1H)，8.54(d，1H)，ppm.ESI-MS：280.2(MH+)
将化合物5a(50mg，0.13mmol)、2-溴乙酸叔丁酯(38mg，0.195mmol)和Na2CO3(20.7mg，0.195mmol)加入到3mL乙腈中，室温反应16个小时，反应溶液变为黄色；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状化合物6a(tert-butyl14-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)-3-(pyridin-2-ylmethyl)-6，9，12-trioxa-3-azatetradecan-1-oate)：35.9mg(0.073mmol，56.0％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.41(s，9H)，2.93(t，2H)，3.40(s，2H)，3.55-3.60(m，10H)，3.84(t，2H)，3.99(s，2H)，4.61(t，2H)，7.11(s，1H)，7.16(m，1H)，7.27(s，1H)，7.53(d，1H)，7.66(m，1H)，8.52(d，1H)，ppm.ESI-MS：494.3(MH+)。
将化合物6a(35.9mg，0.073mmol)溶解于1mol/L盐酸中，30℃左右反应三天，真空除去溶剂得浅黄色固体的配体NNO-PEG3-NIM(14-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)-3-(pyridin-2-ylmethyl)-6，9，12-trioxa-3-azatetradecan-1-oic acid)：32mg(0.073mmol，定量反应)。 1H NMR(400MHz，CD3OH)：δ＝3.53(m，8H)，3.78(m，4H)，4.11(s，2H)，4.63(s，2H)，4.66(t，2H)，7.11(s，1H)，7.50(s，1H)，7.79(m，1H)，7.89(d，1H)，8.31(m，1H)，8.78(d，1H)，ppm.EI-MS：437(M+)。
将化合物4a(30mg，0.104mmol)、2-溴乙酸叔丁酯(60.8mg，0.312mmol)和Na2CO3(22mg，0.208mmol)加入到2mL乙腈中，室温反应6h；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物的化合物7a(tert-butyl 3-(2-tert-butoxy-2-oxoethyl)-14-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)-6，9，12-trioxa-3-azatetradecan-1-oate)：49mg(0.0949mol，91.2％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.45(s，18H)，2.95(t，2H)，3.49(s，4H)，3.58-3.64(m，10H)，3.85(t，2H)，4.63(t，2H)，7.13(s，1H)，7.29(s，1H)，ppm.ESI-MS：517.2(MH+)。
将化合物7a(49mg，0.0949mmol)溶解于1mol/L盐酸中，30℃左右反应三天，真空 除去溶剂得浅黄色固体的配体NOO-PEG3-NIM(3-(carboxymethyl)-14-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)-6，9，12-trioxa-3-azatetradecan-1-oic acid)：38mg(0.094mmol，定量反应)。1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝3.40-3.48(m，10H)，3.72(m，4H)，4.14(s，4H)，4.54(t，2H)，7.14(s，1H)，7.61(s，1H)，ppm.ESI-MS：403.5(M-H+)。
本发明相关反应可参见图1给出的反应路线。
羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的制备方法
[99mTc(CO)3(NNN-PEG3-NIM)]+，        [99mTc(CO)3(NNO-PEG3-NIM)]和[99mTc(CO)3(NOO-PEG3-NIM)]-的制备：
将新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体用1N和0.01N的盐酸调至pH＝7；在一西林瓶中加入0.1mL 500μg/mL的NNN-PEG3-NIM或NNO-PEG3-NIM或NOO-PEG3-NIM配体溶液，0.4mL已经调节pH值的中间体溶液(10mCi)和0.5mL pH＝7.4的PBS溶液，摇匀后在沸水浴中加热反应15min，得所需要的产物。各相应产物结构式见式3：
Figure DEST_PATH_GSB00000041443500071
[99mTc(CO)3(NNN-PEG3-NIM)]+[99mTc(CO)3(NNO-PEG3-NIM)]    [99mTc(CO)3(NOO-PEG3-NIM)]-
Figure DEST_PATH_GSB00000041443500072
式3：羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的结构
羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的检测
采用薄层层析(TLC)法鉴定：以聚酰胺薄片为支持体，展开体系为丙酮/生理盐水＝1/1，待展开结束，将聚酰胺薄片等分成10段，以γ-计数仪测定各段的放射性计数，羰基锝标记的各2-硝基咪唑配合物的Rf值在0.4～0.7之间，而[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体的Rf值为0。
TLC分析结果表明按照上述方法制备的[99mTc(CO)3(NNN-PEG3-NIM)]+，[99mTc(CO)3(NNO-PEG3-NIM)]和[99mTc(CO)3(NOO-PEG3-NIM)]-的放化纯均大于95％；并且室温放置6h放化纯无明显变化，表明配合物具有良好的稳定性。
实施例4：羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的脂水分配系数
将正辛醇与磷酸盐缓冲液(25mM，pH＝7.4)等体积混合，加入适量待测标记配合物，充分振摇后，高速离心分层，取等体积有机相和水相，分别测定两相的放射性计数，待测配 合物的分配系数P为有机相与水相放射性计数的比值，多次重复该操作，求均值。脂水分配系数一般以LogP表示。
测定结果表明各配合物均为水溶性，[99mTc(CO)3(NNN-PEG3-NIM)]+，[99mTc(CO)3(NNO-PEG3-NIM)]和[99mTc(CO)3(NOO-PEG3-NIM)]-的Log P值分别为-1.11±0.08，-0.44±0.10，-1.64±0.10。
羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的荷瘤小鼠体内分布
荷S180肉瘤小鼠模型：于雌性昆明小鼠(体重约20-22g)左前腋下植入2×106个S180肿瘤细胞，饲养约10天后，肿瘤直径生长至6-10mm，质量约为0.4-1.0g。
通过荷S180肉瘤小鼠尾静脉注射适量待测配合物，注射后5、30、60、120min将小鼠断头处死，取其肿瘤、血、心、肝、脾、肺、肾、小肠、脑、骨、肌肉等感兴趣的器官与组织，分别称重后测量其放射性计数，结果以每克组织或器官的百分摄取剂量表示(％ID/g)。各标记药物的荷瘤小鼠体内分布结果分别示于表1、2和3。
[99mTc(CO)3(NNN-PEG3-NIM)]+具有一定的肿瘤摄取，并且滞留良好，注射后5、30、60和120min的肿瘤摄取(ID％/g)分别为0.75±0.08、0.68±0.07、0.48±0.04和0.37±0.05；[99mTc(CO)3(NNN-PEG3-NIM)]+主要通过肝和肾进行代谢，在血、肝和肾等正常组织的清除迅速，注射后2h的摄取分别降至0.58±0.10、5.83±0.47和5.75±0.66 ID％/g；[99mTc(CO)3(NNN-PEG3-NIM)]+在其它正常组织，如心、脾、肺、小肠、脑、肌肉和骨等的摄取均处于较低水平。
表1：[99mTc(CO)3(NNN-PEG3-NIM)]+在荷瘤小鼠体内分布结果(ID％/g，x±s，n＝3)
  ID％/g   5min   30min   60min   120min
  肿瘤   0.75±0.08   0.68±0.07   0.48±0.04   0.37±0.05
  血   1.77±0.26   1.16±0.28   0.84±0.18   0.58±0.10
  心   2.40±0.38   1.79±0.53   1.58±0.17   1.11±0.18
  肝   26.52±0.31   12.52±2.18   8.63±0.40   5.83±0.47
  脾   0.99±0.05   0.52±0.12   0.52±0.08   0.35±0.02
  肺   2.19±0.01   1.15±0.12   1.05±0.23   0.73±0.11
  肾   49.93±4.09   15.42±8.93   7.46±0.18   5.75±0.66
  小肠   1.64±0.03   3.54±1.73   6.92±2.27   1.35±0.65
  脑   0.11±0.02   0.07±0.01   0.06±0.01   0.02±0.01
  肌肉   0.91±0.16   0.65±0.42   1.02±0.40   0.61±0.21
[0077] 
  骨   0.70±0.15   0.12±0.00   0.23±0.04   0.28±0.23
  肿瘤/血   0.43±0.02   0.61±0.18   0.60±0.16   0.66±0.23
  肿瘤/肌肉   0.84±0.07   1.26±0.51   0.62±0.38   0.63±0.18
[99mTc(CO)3(NNO-PEG3-NIM)]+具有一定的肿瘤摄取，并且滞留良好，注射后5、30、60和120min的肿瘤摄取(ID％/g)分别为0.70±0.01、0.62±0.10、0.61±0.16和0.40±0.10；[99mTc(CO)3(NNO-PEG3-NIM)]+主要通过肝和肾进行代谢，在血、肝、肾、小肠和肌肉等正常组织的清除迅速，注射后2h的摄取分别降至1.13±0.16、3.73±0.66、2.60±0.43、0.66±0.39和0.14±0.03ID％/g；[99mTc(CO)3(NNO-PEG3-NIM)]+在其它正常组织，如心、脾、肺、脑和骨等的摄取均处于较低水平；在靶/非靶比值方面，肿瘤/肌肉比值随时间的延长而升高，注射后2h达到了3.01±1.20。
表2：[99mTc(CO)3(NNO-PEG3-NIM)]在荷瘤小鼠体内分布结果(ID％/g，x±s，n＝3)
  ID％/g   5min   30min   60min   120min
  肿瘤   0.70±0.01   0.62±0.10   0.61±0.16   0.40±0.10
  血   3.18±1.03   1.99±0.24   1.19±0.20   1.13±0.16
  心   0.95±0.00   0.78±0.13   0.63±0.03   0.41±0.12
  肝   10.92±3.19   6.20±0.45   4.75±0.85   3.73±0.66
  脾   0.90±0.02   0.59±0.18   0.60±0.18   0.37±0.05
  肺   2.11±0.03   1.43±0.12   1.23±0.11   0.72±0.15
  肾   14.01±5.24   3.36±0.54   3.94±1.39   2.60±0.43
  小肠   8.31±4.05   6.07±4.45   1.44±0.50   0.66±0.39
  脑   0.11±0.03   0.07±0.01   0.09±0.05   0.05±0.01
  肌肉   1.16±0.21   0.41±0.22   0.54±0.40   0.14±0.03
  骨   0.71±0.01   0.37±0.18   0.45±0.16   0.14±0.04
  肿瘤/血   0.24±0.08   0.31±0.03   0.52±0.16   0.35±0.07
  肿瘤/肌肉   0.62±0.13   1.71±0.56   1.81±1.30   3.01±1.20
[99mTc(CO)3(NOO-PEG3-NIM)]+具有一定的肿瘤摄取，并且滞留良好，注射后5、30、60和120min的肿瘤摄取(ID％/g)分别为0.56±0.09、0.32±0.07、0.23±0.02和0.25±0.02；[99mTc(CO)3(NOO-PEG3-NIM)]+主要通过肝和肾进行代谢，在血、肝、肾和小肠等正常组织 的清除迅速，注射后2h的摄取分别降至0.40±0.06、3.39±1.43、0.81±0.05、和0.58±0.30ID％/g；[99mTc(CO)3(NOO-PEG3-NIM)]+在其它正常组织，如心、脾、肺、脑、肌肉和骨等的摄取均处于较低水平。
表3：[99mTc(CO)3(NOO-PEG3-NIM)]-在荷瘤小鼠体内分布结果(ID％/g，x±s，n＝3)
  ID％/g   5min   30min   60min   120min
  肿瘤   0.56±0.09   0.32±0.07   0.23±0.02   0.25±0.02
  血   2.36±1.35   0.69±0.16   0.55±0.09   0.40±0.06
  心   0.64±0.37   0.20±0.05   0.25±0.09   0.16±0.03
  肝   18.69±5.37   3.42±1.47   2.46±0.13   3.39±1.43
  脾   0.75±0.38   0.32±0.04   0.24±0.05   0.18±0.05
  肺   1.31±0.38   0.60±0.09   0.44±0.09   0.37±0.07
  肾   7.48±1.34   0.93±0.25   1.15±0.38   0.81±0.05
  小肠   15.86±4.69   0.50±0.03   2.52±0.00   0.58±0.30
  脑   0.13±0.07   0.04±0.01   0.04±0.01   0.03±0.01
  肌肉   0.69±0.39   0.17±0.03   0.24±0.13   0.26±0.08
  骨   0.45±0.16   0.33±0.05   0.43±0.19   0.26±0.09
  肿瘤/血   0.29±0.15   0.47±0.01   0.42±0.07   0.63±0.07
  肿瘤/肌肉   0.98±0.48   1.90±0.09   1.14±0.54   1.01±0.39
总之，本发明涉及到一类新型的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物及制备方法与用途。该类配合物的结构特点在于：(1)以2-硝基咪唑为靶向基团，靶向作用于乏氧肿瘤细胞；(2)以聚乙二醇PEG为连接基团进行药效调节；(3)以NNN、NNO或NOO为配位点与羰基锝核心螯合得到标记物。本发明设计的2-硝基咪唑配体合成方法可靠，配合物的制备简单有效。该类羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物具有良好的水溶性，放化纯高并且稳定稳定性良好。荷S180肿瘤小鼠体内分布实验均证实了它们具有一定的肿瘤摄取并且滞留良好。各配合物在小鼠体内代谢模式的不同与各配合物的锝螯合基团及价态有关。该类羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物通过硝基咪唑的靶向作用浓集于乏氧肿瘤细胞，可用于乏氧肿瘤的SPECT显像诊断。

Claims (9)

1.羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其结构通式如式1所示：
Figure F2009101732171C00011
式1
其中：X为
Figure F2009101732171C00012
Y为
Figure F2009101732171C00013
当X和Y同为
Figure F2009101732171C00014
时m为+1；X和Y分别为
Figure F2009101732171C00015
时m为0；X和Y同为
Figure F2009101732171C00016
时m为-1；
R如式2：
Figure F2009101732171C00017
式2
其中n＝1～10。
2.如权利要求1所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其特征是n等于3。
3.如权利要求1所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其特征是其制备方法为：
a.将聚乙二醇和三乙胺溶于二氯甲烷，再在其中缓慢滴加对甲苯磺酰氯溶于二氯甲烷的溶液，充分反应后滤除固体，滤液水洗后除去溶剂得化合物1；
b.将化合物1、2-硝基咪唑和Na2CO3加入到CH3CN中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物2；
c.将化合物2、NaN3加入到DMF中，加热反应；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物3；
d.将PPh3、化合物3和水溶解于THF中，经充分反应再除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物4；
e.将化合物4、氯甲基吡啶盐酸盐和三乙胺溶解于乙腈中回流，反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，再除去溶剂得配体NNN-PEGn-NIM；
f.将新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体用盐酸调至pH＝7，在NNN-PEGn-NIM中加入中间体溶液和pH＝7.4的PBS溶液，摇匀后在沸水浴中加热反应15min，得所需要的产物[99mTc(CO)3(NNN-PEGn-NIM)]+。
4.如权利要求2所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其特征是其制备方法为：
a.将30mmol的三缩四乙二醇和90mmol的三乙胺溶于30mL二氯甲烷中，再在其中缓慢滴加66mmol的对甲苯磺酰氯溶于二氯甲烷30mL的溶液，充分反应后滤除固体，滤液水洗后除去溶剂得粘稠状液体的化合物1a；
b.将15.6mmol的化合物1a、13mmol的2-硝基咪唑和15.6mmol的Na2CO3加入到50mL的CH3CN中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物2a；
c.将4.51mmol的化合物2a、5.41mmolNaN3加入到2mLDMF中，加热到100℃反应2h；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物3a；
d.将5.35mmol的PPh3、4.20mmol的化合物3a和0.8g的水溶解于10mL THF中，在30-40℃充分反应再除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状的化合物4a；
e.将0.17mmol的化合物4a、0.85mmol的氯甲基吡啶盐酸盐和1.7mmol的三乙胺溶解于8mL乙腈中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，再除去溶剂得浅黄色油状的配体NNN-PEG3-NIM；
f.将新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体用1N和0.01N的盐酸调至pH＝7；在西林瓶中加入0.1mL 500μg/mL的NNN-PEG3-NIM配体溶液，0.4mL已经调节pH值的中间体溶液(10mCi)和0.5mL pH＝7.4的PBS溶液，摇匀后在沸水浴中加热反应15min，得所需要的产物[99mTc(CO)3(NNN-PEG3-NIM)]+。
5.如权利要求1所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其特征是其制备方法为：
a.将聚乙二醇和三乙胺溶于二氯甲烷中，再在其中缓慢滴加66mmol的对甲苯磺酰氯溶于30mL二氯甲烷的溶液，充分反应后滤除固体，滤液水洗后除去溶剂得化合物1；
b.将化合物1、2-硝基咪唑和Na2CO3加入到CH3CN中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物2；
c.将化合物2、2-氨甲基吡啶和Na2CO3加入到乙腈中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物5；
d.将化合物5、2-溴乙酸叔丁酯和Na2CO3加入到乙腈中，室温反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物6；
e.将化合物6溶解于盐酸中，室温充分反应后除去溶剂得配体NNO-PEGn-NIM；
f.将新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体用盐酸调至pH＝7，在NNO-PEGn-NIM中加入中间体溶液和pH＝7.4的PBS溶液，摇匀后在沸水浴中加热反应15min，得所需要的产物[99mTc(CO)3(NNO-PEGn-NIM)]。
6.如权利要求2所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其特征是其制备方法为：
a.将30mmol的三缩四乙二醇和90mmol的三乙胺溶于30mL二氯甲烷，再在其中缓慢滴加66mmol的对甲苯磺酰氯溶于二氯甲烷30mL的溶液，充分反应后滤除固体，滤液水洗后除去溶剂得粘稠状液体的化合物1a；
b.将15.6mmol的化合物1a、13mmol的2-硝基咪唑和15.6mmol的Na2CO3加入到50mL的CH3CN中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物2a；
c.将0.89mmol的化合物2a、1.78mmol的2-氨甲基吡啶和1.34mmol的Na2CO3加入到10mL乙腈中，加热回流充分反应后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状的化合物5a；
d.将0.13mmol的化合物5a、0.195mmol的2-溴乙酸叔丁酯和0.195mmol的Na2CO3加入到3mL乙腈中，室温充分反应后反应溶液变为黄色，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状化合物6a；
e.将0.073mmol的化合物6a溶解于1mol/L盐酸中，30℃左右充分反应后除去溶剂得浅黄色固体的配体NNO-PEG3-NIM；
f.将新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体用1N和0.01N的盐酸调至pH＝7；在一西林瓶中加入0.1mL 500μg/mL的NNO-PEG3-NIM配体溶液，0.4mL已经调节pH值的中间体溶液(10mCi)和0.5mL pH＝7.4的PBS溶液，摇匀后在沸水浴中加热反应15min，得所需要的产物[99mTc(CO)3(NNO-PEG3-NIM)]。
7.如权利要求1所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其特征是其制备方法为：
a.将聚乙二醇和三乙胺溶于二氯甲烷，再在其中缓慢滴加对甲苯磺酰氯溶于二氯甲烷的溶液，充分反应后滤除固体，滤液水洗后除去溶剂得化合物1；
b.将化合物1、2-硝基咪唑和的Na2CO3加入到CH3CN中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物2；
c.将化合物2、NaN3加入到DMF中，加热反应；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物3；
d.将PPh3、化合物3和水溶解于THF中，经充分反应再除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物4；
e.将化合物4、2-溴乙酸叔丁酯及Na2CO3加入到乙腈中，室温充分反应后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状的化合物7；
f.将化合物7溶解于盐酸中，左右充分反应后除去溶剂得浅黄色固体的配体NOO-PEGn-NIM；
g.将新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体用盐酸调至pH＝7，在NOO-PEGn-NIM中加入中间体溶液和pH＝7.4的PBS溶液，摇匀后在沸水浴中加热反应15min，得所需要的产物[99mTc(CO)3(NOO-PEGn-NIM)]-。
8.如权利要求2所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其特征是其制备方法为：
a.将30mmol的三缩四乙二醇和90mmol的三乙胺溶于30mL二氯甲烷，再在其中缓慢滴加66mmol对甲苯磺酰氯溶于30mL二氯甲烷的溶液，充分反应后滤除固体，滤液水洗后除去溶剂得粘稠状液体的化合物1a；
b.将化合物1a、2-硝基咪唑和的Na2CO3加入到的CH3CN中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物2a；
c.将化合物2a、NaN3加入到DMF中，加热到100℃反应2h；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物3a；
d.将PPh3、化合物3a和水溶解于THF中，在30～40℃充分反应再除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状的化合物4a；
e.将化合物4a、2-溴乙酸叔丁酯及Na2CO3加入到乙腈中，室温充分反应后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状的化合物7a；
e.将化合物7a溶解于盐酸中，30℃左右充分反应后除去溶剂得浅黄色固体的配体NOO-PEG3-NIM；
f.将新鲜制备的[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体用1N和0.01N的盐酸调至pH＝7；在一西林瓶中加入0.1mL 500μg/mL的NOO-PEG3-NIM配体溶液，0.4mL已经调节pH值的中间体溶液(10mCi)和0.5mL pH＝7.4的PBS溶液，摇匀后在沸水浴中加热反应15min，得所需要的产物[99mTc(CO)3(NOO-PEG3-NIM)]-。
9.权利要求1或2所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物在制备肿瘤乏氧显像药物中的应用。
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