CN101486707B - 亲乏氧肿瘤的硝基咪唑类配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一类亲乏氧肿瘤的放射性核素标记的配合物，其前体是含有1，4，8，11-四氮杂十四烷的2-甲基-5-硝基咪唑类化合物，结构如下式。本发明还提供了所述配合物及其前体的制备方法和该配合物作为潜在的肿瘤乏氧显像剂的应用。该类配合物亲水性好，在肿瘤有较高的摄取，尤其^99mTcO-MNIEC和^99mTcN-MNIEC配合物在肿瘤中的绝对摄取值高且肝本底低，并且瘤/肉和瘤/血比值也较高，明显改善了目前肿瘤乏氧显像剂肿瘤绝对摄取值低和肝本底高的缺点，有望成为一类新的性能更好的肿瘤乏氧显像剂。

Description

亲乏氧肿瘤的硝基咪唑类配合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一类亲乏氧肿瘤的放射性核素标记的硝基咪唑类配合物及其前体，还涉及它们的制备方法和在人或动物器官或组织的显像剂中的应用，特别是在肿瘤显像剂中的应用，属于放射性药物及核医学领域。 

背景技术

组织乏氧是临床上多种重要疾病的一个主要特征，动物和人实体肿瘤中普遍存在乏氧细胞，而乏氧细胞对放疗和化疗都不敏感，因而常成为肿瘤难以治愈、容易复发的重要原因。对肿瘤患者治疗前后肿瘤的氧水平进行检测，可评价疗效、有助于制定治疗方案。 

采用非侵入性方法确定肿瘤乏氧一直受到广泛重视，核医学技术是利用乏氧组织显像剂进行单光子发射计算机断层显像(SPECT)或正电子发射断层显像(PET)，该技术简便易行。乏氧显像能在活体水平上整体、无创性地评价肿瘤的乏氧程度，为临床选择合理的肿瘤治疗方案提供客观依据，非常适于临床推广应用。因此，用肿瘤乏氧组织显像剂检测肿瘤组织乏氧成为这一领域研究的热点。 

1955年，Nakamura发现5-硝基咪唑能迅速抗厌氧感染。硝基咪唑类在厌氧环境中的这种特性，已用于肿瘤乏氧组织放射增敏剂的研究。早在80年代初，Chapman等(Garrecht BM，Chapman JD.Br.J.Radiol.1983，56，745)就提出将这些化合物用于体内乏氧组织显像(PET或SPECT)测定组织中氧水平的设想。碳-14(¹⁴C)、氢-3(³H)、氟-18(¹⁸F)、溴-82(⁸²Br)以及放射性碘标记的2-硝基咪唑已用于心肌和肿瘤的显像研究(Nunn A.et al.Eur.J.Nucl.Med.1995，22：265；Schneider RF et al.Quarterly.J.Nucl.Med.1995，39：41；Groshar D，et al.J.Nucl.Med.1993，34：885；Al-Arafaj A，et al.Eur.J.Nucl.Med.1994，21：1338；Yeh SH，etal.J.Nucl.Med.1994，35：205；Webb P，et al.J.Labelled Compd.Radiopharm.1990，28：257；Tewson TJ，et al.Nucl.Med.Biol.1997，24：755；Piert M，et al.Eur.J.Nucl.Med.1999，26：95)。然而，这些放射性核素不易获得以及昂贵的PET显像设备严重制约着这些药物的广泛研究和应用。 

由于^99mTc的优良核性质以及很容易从⁹⁹Mo/^99mTc发生器中淋洗得到，这些优点吸引着研究者对⁹⁹mTc标记乏氧组织显像药物进行着艰苦的探索，并且成为近年研究的热点。近年来已经合成了一系列锝-99m(_99mTc)标记的2-硝基咪唑配合物。 

1994年Linder等合成了^99mTc-[PnAO-1-(2-硝基咪唑)](即BMS181321，结构如下面的结构式a)(Linder KE，et al.J.Med.Chem.1994，37：9)，1995年Wedeking等又合成了BMS194796(亦称BRU59-21，结构如下面的结构式b)(Wedeking P，et al.J.Nucl.Med.1995，36：17)，这是目前临床研究最多的一类乏氧显像剂。Ballinger等(Ballinger，J.R.；Kee，J.W.M.；Rauth，A.M.J.Nucl.Med.1996，37：1023)和Melo等(Melo，T.；Duncan，J.；Ballinger，J.R.；Rauth，A.M.J.Nucl.Med.2000，41：169)对BMS181321和BRU59-21两种显像剂的生物性能研究结果表明它们可以用于实体肿瘤乏氧状态的临床研究且目前已用于临床研究。国内外其他学者(例如：Ballinger JR.Semin.Nucl.Med.2001，31：321；Sophie M，et al.Tetrahedron.2001，57：9979)也在硝基咪唑类乏氧显像剂的研究中进行了大量的工作，并取得了一定的研究成果。然而，研究表明这些硝基咪唑类乏氧显像剂都存在肿瘤绝对摄取值较低和肝本底较高的缺陷，这影响了肿瘤乏氧显像效果。 

  a配合物BMS181321                 b配合物BRU59-21 

5-硝基咪唑类化合物，尽管其亲电性略低，但在一些新近研究中也显示出具有在乏氧细胞中摄取及滞留的能力，且表现出部分不典型的、不同于2-硝基咪唑类化合物的特征。近年来，一些学者(Kumar P，et al.Appl.Radiat.Isot.2002，57：719；Yang DJ，et al.Pharm.Res.1999，16：743；Das T，et al.Nucl.Med.Biol.2003，30，127.Mallia MB，et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15：3398；Mallia MB，et al.Bioorg.Med.Chem.2006，14：7666)报道合成了含2-甲基-5-硝基咪唑基团的配合物，研究表明该类配合物在肿瘤中有一定摄取且具有一定的乏氧选择性，并表现了不同于2-硝基咪唑类配合物的生物特征，但是这些配合物也存在着肿瘤摄取低和肝本底高的缺陷。 

氮杂大环的合成及其配位化学一直是人们感兴趣的领域，这是由于大环的不同腔径对不同金属离子具有配位选择性，氮杂大环配合物对酸催化降解不敏感，在低的pH下具有动力学稳定，这些性质有利于它作为螯合基团用于放射性诊断和治疗药物的研究。1，4，8，11-四氮杂环十四烷(cyclam)作为氮杂大环中重要的一种，可作为双功能联接剂标记生物分子(一般为小肽、蛋白质或单克隆抗体等)和其它生物活性分子，目前用于氮杂大环化合物标记的放射性核素主要为^99mTc、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y、¹¹¹In和⁶⁷Ga等。其中目前已报道的用^99mTc 标记氮杂大环化合物主要形成^99mTcO₂形式的配合物，而^99mTcO、^99mTcN和 ^99mTc(CO)₃形式的氮杂大环配合物鲜有报道。 

基于以上考虑，发明人合成了一种以1，4，8，11-四氮杂十四烷(cyclam)为双功能联接剂的2-甲基-5-硝基咪唑化合物，并用锝-99m对此化合物进行标记，得到了一类放射性锝-99m标记的配合物。该类配合物可以作为肿瘤乏氧显像剂，能够明显改善目前肿瘤乏氧显像剂肿瘤绝对摄取值低和肝本底高的缺点，从而明显改善在肿瘤乏氧组织中的显像质量，可广泛应用于医疗显像领域。 

发明内容

本发明的首要目的在于提供一类与乏氧肿瘤组织具有更高亲和力的硝基咪唑类配合物，该目的通过以下方案实现： 

先提供一种新的硝基咪唑类化合物，即含有1，4，8，11-四氮杂十四烷(cyclam)的2-甲基-5-硝基咪唑类化合物(MNIEC)，其结构如下式A。 

所述MNIEC的合成方法包括以下步骤： 

1)用三氟乙酸乙酯将1，4，8，11-四氮杂十四烷(cyclam)进行三氮保护； 

2)用甲磺酰氯对2-溴乙醇与2-甲基-5-硝基咪唑发生烷基化反应得到的产物进行磺酰化； 

3)将步骤2)的磺酰化产物与步骤1)的三氮保护产物发生烷基化反应； 

4)将步骤3)的烷基化产物在甲醇作为溶剂和氢氧化钠条件下脱保护，得到目标化合物MNIEC。 

上述合成方法的具体方案与实施例1中的方法相同，此处不再赘述。 

本发明进一步提供由放射性核素标记上述化合物MNIEC配体而得到的配合物。 

所述放射性核素可以是放射性锝-99m。 

所述由放射性核素标记配体而得到的配合物优选^99mTcO-MNIEC、 ^99mTcN-MNIEC或^99mTc(CO)₃-MNIEC。 

本发明还提供所述优选配合物的制备方法，包括下述步骤： 

1)分别制备^99mTc-葡庚糖酸钠(^99mTcO-GH)、[^99mTcN]⁺中间体或[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺中间体； 

2)将步骤1)得到的^99mTc-GH、[^99mTcN]²⁺中间体或[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺中间体分别加入到配体中，用0.1M氢氧化钠溶液将之调整为PH 13，沸水浴加热30分钟，分别得到^99mTcO-配合物、^99mTcN-配合物或^99mTc(CO)₃-配合物。 

通过上述方法制备所述3种优选配合物的具体方案分别与实施例2～4中的方法相同，此处不再赘述。 

本发明还提供所述配合物在人或动物的器官与组织中作为显像剂的用途，特别是作为肿瘤乏氧显像剂的用途。 

本发明所述的配合物是以cyclam为双功能联接剂的放射性核素标记的2-甲基-5-硝基咪唑化合物，因其特定的分子结构而具有较高的肿瘤摄取，特别是 ^99mTcO-MNIEC和^99mTcN-MNIEC配合物，它们的肿瘤绝对摄取值高且肝本底低，肿瘤/肝比值在1左右，瘤/肉和瘤/血比值也较高，瘤/肉比值在注射后2小时都大于3.5，并且瘤/血比值也在1左右，作为显像剂应用于肿瘤显像时，与目前用于临床的比较流行的肿瘤乏氧显像剂^99mTc-BMS181321和^99mTc-BRU59-21的生物分布比较，都具有肿瘤摄取高和肝本底低的显著特点，^99mTcO-MNIEC和 ^99mTcN-MNIEC在注射后2小时，肿瘤绝对摄取值分别为2.12±0.45％ID/g和2.52±0.69％ID/g，明显高于^99mTc-BMS181321和^99mTc-BRU59-21(后者注射后2小时，肿瘤摄取值分别为0.55±0.08％ID/g和0.37±0.14％ID/g)。注射后2小时， ^99mTcO-MNIEC和^99mTcN-MNIEC的肝摄取分别为2.29±0.37％ID/g和2.26±0.22％ID/g，明显低于^99mTc-BMS181321和^99mTc-BRU59-21的肝摄取(后者注射后2小时，肝摄取分别为8.79±3.05％ID/g和8.37±0.87％ID/g)。 

因此，本发明所述的配合物，特别是^99mTcO-MNIEC和^99mTcN-MNIEC配合物显示出明显优于目前用于临床的比较流行的肿瘤乏氧显像剂 ^99mTc-BMS181321和^99mTc-BRU59-21的生物性能，有望发展为具有我国自主知识产权的新型肿瘤乏氧显像剂。 

具体实施方式

以下通过具体的实施例可使本发明得到更清楚地说明，但本发明的技术方案并不局限于下列实施例。 

实施例1 

按照下面所示的合成路线合成本发明提供的化合物MNIEC： 

其中每个步骤所用的试剂为： 

(a)EtOTFA、Et₃N和MeOH； 

(b)2-bromoethanol、K₂CO₃和CH₃CN； 

(c)CH₃SO₂Cl、CH₂Cl₂和Et₃N； 

(d)化合物1、K₂CO₃和CH₃CN； 

(e)NaOH和MeOH 

具体步骤如下： 

Tri-TFA cyclam(化合物1)的合成： 

在干燥的50mL三口烧瓶中，将cyclam(1.0g，5mmol)和三乙胺(0.69mL，5mmol)溶解于20mL的无水甲醇中，通入氮气保护并用冰水浴将反应液保持在0-5℃，然后滴加入三氟乙酸乙酯(6.0mL，50.0mmol)，滴加持续十分钟，搅拌反应7小时，悬蒸除去溶剂，残留物通过一个小的硅胶柱，用乙酸乙酯作为淋洗剂，得到化合物1的白色泡沫状固体。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：3.79-3.51(m，12H)，2.95(m，2H)，2.72(m，2H)，2.18(m，2H)，1.86(m，2H)。 

2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethyl methanesulfonate(化合物3)的合成： 

在50mL三口瓶中将2-甲基-5-硝基咪唑(0.96g，5mmol)和2-溴-1-乙醇(1.04g，7.5mmol)溶解于20mL无水乙腈中，然后加入无水碳酸钾(1.04g，7.5mmol)，混合物搅拌回流七小时。滤去固体，旋蒸除去溶剂，得到淡黄色化合物2，无需提纯可以用于下一步的反应。 

将化合物2(1.25g，5mmol)和三乙胺(1mL，7.5mmol)溶解于50mL二氯甲烷中，冷却至0～5℃，然后用恒压滴液漏斗逐滴加入甲磺酰氯(0.87g，7.5mmol)的二氯甲烷溶液，室温搅拌过夜，反应液分别用饱和氯化铵溶液(30mL)和饱和食盐水(30mL)洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，悬蒸除掉溶剂，残留物用色谱柱提纯，淋洗流动相选取V(甲醇)/V(二氯甲烷)＝1/15，得到化合物3的白色固体。¹H NMR(500MHz，DMSO)δ：8.07(s，1H)，4.64-4.67(m，2H)，4.55-4.57(m，2H)，3.16(s，3H)，2.46(s，3H)。 

[2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethyl]Tri-TFA-cyclam(化合物4)的合成： 

在50mL三口瓶中，将反应物1(0.97g，2mmol)和无水碳酸钾(0.42g，3mmol)加入到20mL无水DMF中，然后加入反应物3(0.65g，2mmol)，混合物搅拌回流9小时。滤去固体，旋蒸除去溶剂，残留物用色谱柱提纯，淋洗流动相选取V(甲醇)/V(二氯甲烷)＝1/15，得到化合物4的白色固体。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：7.93(s，1H)，4.56-4.59(m，2H)，3.82-3.85(m，2H)，3.44-3.69(m，12H)，2.61-2.81(m，4H)，2.51(s，3H)，2.10-2.12(m，4H)。 

[2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethyl]cyclam(MNIEC)的合成： 

将化合物4(0.36g，0.5mmol)溶解在10mL的甲醇中，用冰水浴将反应液冷却至0～5℃后将NaOH(0.40g，10mmol)分批次加入到反应液中，然后混合物室温搅拌30分钟，滤去固体，旋蒸除去溶剂得到白色固体，然后加入水(20mL)和氯仿(10mL)搅拌，用分液漏斗分离有机相，用水(3×10mL)洗涤，水溶液再次用氯仿(15mL)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，悬蒸除掉溶剂得到化合物MNIEC的白色固体。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：7.98(s，1H)，4.34-4.37(m，2H)，3.63-3.65(m，2H)，3.24-3.57(m，12H)，2.64-2.89(m，4H)，2.47(s，3H)，2.06-2.14(m，4H)。 

实施例2 

制备^99mTcO-MNIEC配合物 

1)^99mTcO-GH的制备 

称取GH配体25mg，用0.5mL生理盐水使其完全溶解，加入0.5mL的SnCI₂·2H₂O(1mg/mL，0.1M HCI)，调节pH＝7-7.5，加入0.5mL新鲜淋洗的^99mTcO₄ ^-溶液(大约10mCi)，40℃水浴加热反应10分钟，冷至室温，备用于配体交换法 的前体。 

2)^99mTcO-MNIEC的制备 

将20mg的化合物MNIEC配体溶解于20mL甲醇中，取出0.15mL放入青霉素小瓶中，用1.0mL的pH＝13即0.1M的NaOH缓冲液调节pH值为13，加入0.15mL的^99mTc-GH溶液，混合物沸水浴加热45min，滤膜过滤，得到电中性且水溶性的目标配合物，标记率大于95％。 

实施例3 

制备^99mTcN-MNIEC配合物 

(1)中间体[^99mTcN]²⁺的制备 

可以采用两种方法制备^99mTcN中间体，即 

取1～2mL^99mTcO₄ ^-新鲜淋洗液加入到DTCZ药盒中，摇匀，沸水浴加热15min，可获得中间体[^99mTcN]²⁺，标记率大于98％； 

或 

取1～2mL^99mTcO₄ ^-新鲜淋洗液加入到SDH药盒中，摇匀，室温静置15min，可获得中间体[^99mTcN]²⁺，标记率在98％以上。 

(2)^99mTcN-MNIEC的制备 

取0.1mL上述配制的配体溶液MNIEC放入青霉素小瓶中，用1.0mL的0.1M的NaOH缓冲液调节MNIEC配体溶液pH值为13，然后加入0.1mL[^99mTcN]²⁺中间体，沸水浴加热40min，得到电中性且水溶性的目标配合物，标记率在95％以上。 

实施例4 

制备^99mTc(CO)₃-MNIEC配合物 

1)[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺中间体的制备 

称取5mg无水碳酸钠、10mg硼氢化钠、15mg酒石酸钾钠放入10mL青霉素小瓶中，通一氧化碳5min排净瓶中的空气后，加入1mL的Na^99mTcO₄(大约290～370MBq)。继续通一氧化碳并在75℃条件下加热20min，反应结束后，将溶液冷却至室温，制备得到标记率在95％以上的[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺中间体。 

2)^99mTc(CO)₃-MNIEC的制备 

取0.1mL上述配制的配体溶液MNIEC放入青霉素小瓶中，用1.0mL的0.1M的NaOH缓冲液调节MNIEC配体溶液pH值为13，然后加入0.1mL[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺中间体，沸水浴加热40min，得到正电荷且水溶性的 ^99mTc(CO)₃-MNIEC，标记率在95％以上。 

对实施例2～4的配合物进行薄层色谱(TLC)鉴定 

体系1：生理盐水/聚酰胺； 

体系2：乙腈/聚酰胺。 

各个组分的R_f值列于表1中。 

表1.各组分在TLC上的R_f值 

通过薄层色谱(TLC)能很好的区分各中间体与目标配合物，是良好的TLC检测体系。 

配合物在S180肿瘤小鼠体内生物分布 

1)S180肿瘤小鼠的培养： 

取S180肿瘤细胞约1×10⁶个通过皮下注射到昆明小鼠(雌性，18～20g)的左前腿，9～10天后，肿瘤直径为10～15mm，待用。 

2)按实施例2～4方法分别制备标记率大于95％的^9mTcO-MNIEC、 ^99mTcN-MNIEC、和^99mTc(CO)₃-MNIEC配合物溶液，从S180肿瘤小鼠的尾静脉注射0.1mL标记配合物(约20μCi)，注射后1h、2h、4h断头处死小鼠。取血及脑、心、肝、肺、肉、骨、血、脾、肾、肿瘤等有关组织和器官，擦净后称重，并测定放射性计数，选用1％ID/g作为标准，计算放射性药物在小鼠体内各组织中的分布情况。每组实验取四组平行数据，即n＝4。实验结果列于表2～4。 

表2.^99mTcO-MNIEC在S180肿瘤小鼠体内生物分布(n＝4) 

表3.^99mTcN-MNIEC在S180肿瘤小鼠体内生物分布(n＝4) 

表4.^99mTc(CO)₃-MNIEC在S180肿瘤小鼠体内生物分布(n＝4) 

由表2～4可见，本发明的上述三种配合物都具有一定的肿瘤摄取，特别是 ^99mTcO-MNIEC和^99mTcN-MNIEC配合物，它们肿瘤绝对摄取值高和肝本底低，肿瘤/肝比值在1左右。瘤/肉和瘤/血比值也较高，瘤/肉比值在注射后2小时都大于3.5，并且瘤/血比值也在1左右，显示出优良的生物性能。 

本发明的上述三种配合物与目前用于临床的比较流行的肿瘤乏氧显像剂 ^99mTc-BMS181321和^99mTc-BRU59-21的生物分布比较列于表5。 

表5.本发明的三种配合物与其它已知乏氧显像剂的在注射后2h的比较 

由表5可见，本发明的上述三种配合物都具有较高的肿瘤摄取，尤其是 ^99mTcO-MNIEC和^99mTcN-MNIEC配合物，它们在注射后2小时，肿瘤绝对摄取值分别为2.12±0.45％ID/g和2.52±0.69％ID/g，明显高于^99mTc-BMS181321和 ^99mTc-BRU59-21(注射后2小时，肿瘤摄取值分别为0.55±0.08％ID/g和0.37±0.14％ID/g)。此外，^99mTcO-MNIEC和^99mTcN-MNIEC在具有较高肿瘤摄取的同时还具有较低的肝摄取，注射后2小时，^99mTcO-MNIEC和^99mTcN-MNIEC的肝摄取分别为2.29±0.37％ID/g和2.26±0.22％ID/g，明显低于^99mTc-BMS181321和^99mTc-BRU59-21的肝摄取(注射后2小时，肝摄取分别为8.79±3.05％ID/g和8.37±0.87％ID/g)。 

上述各项结果表明，本发明所述的配合物，特别是^99mTcO-MNIEC和 ^99mTcN-MNIEC配合物显示出明显优于目前用于临床的比较流行的肿瘤乏氧显像剂^99mTc-BMS181321和^99mTc-BRU59-21的生物性能，有望发展为具有我国自主知识产权的新的^99mTc标记的肿瘤乏氧显像剂。 

Claims (6)

1.一类由放射性核素标记的配合物，其特征在于：它是1，4，8，11-四氮杂十四烷的2-甲基-5-硝基咪唑配体MNIEC分别与^99mTcO核、^99mTcN核或^99mTc(CO)₃核形成的配合物，即^99mTcO-MNIEC、^99mTcN-MNIEC或^99mTc(CO)₃-MNIEC配合物，所述的配体MNIEC结构如下式A

2.权利要求1所述的配合物^99mTcO-MNIEC的制备方法，包括以下步骤：

1)称取葡庚糖酸钠配体25mg，用0.5mL生理盐水使其完全溶解，加入0.5mL的1mg/mL的SnCl₂·2H₂O，调节pH＝7～7.5，加入0.5mL新鲜淋洗的^99mTcO₄ ^-溶液，40℃水浴加热反应10分钟，冷至室温，得到备用于配体交换法前体的^99mTc-葡庚糖酸钠；

2)将20mg的化合物MNIEC配体溶解于20mL甲醇中，取出0.15mL放入青霉素小瓶中，用1.0mL的pH＝13即0.1M的NaOH缓冲液调节pH值为13，加入0.15mL步骤1)制备的^99mTc-葡庚糖酸钠溶液，混合物沸水浴加热45min，滤膜过滤，得到电中性且水溶性的^99mTcO-MNIEC配合物。

3.权利要求1所述的配合物^99mTcN-MNIEC的制备方法，包括以下步骤：

1)取1～2mL^99mTcO₄ ^-新鲜淋洗液加入到DTCZ药盒中，摇匀，沸水浴加热15min，可获得中间体[^99mTcN]²⁺；或取1～2mL^99mTcO₄ ^-新鲜淋洗液加入到SDH药盒中，摇匀，室温静置15min，可获得中间体[^99mTcN]²⁺；

2)取0.15mL MNIEC配体溶液放入青霉素小瓶中，用1.0mL的0.1M的NaOH缓冲液调节MNIEC配体溶液pH值为13，然后加入0.1mL步骤1)制备的[^99mTcN]²⁺中间体，沸水浴加热40min，得到电中性且水溶性的^99mTcN-MNIEC配合物。

4.权利要求1所述的配合物^99mTc(CO)₃-MNIEC的制备方法，包括以下步骤：

1)称取5mg无水碳酸钠、10mg硼氢化钠、15mg酒石酸钾钠放入10mL青霉素小瓶中，通一氧化碳5min排净瓶中的空气后，加入1mL的Na^99mTcO₄，继续通一氧化碳并在75℃条件下加热20min，反应结束后，将溶液冷却至室温，得到[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺中间体；

2)将步骤1)得到的[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺中间体加入到1.5mg配体MNIEC中，用0.1M氢氧化钠将其pH值调整为13，沸水浴加热40min，得到带正电荷且水溶性的^99mTc(CO)₃-MNIEC配合物。

5.权利要求1所述的配合物在制备人或动物器官或组织显像剂中的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用是在制备肿瘤乏氧显像剂中的应用。