CN101920024A - 一种99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明名称是一种^99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂及其应用。本发明提出了用主动脑靶向脂质体包载^99mTc肿瘤显像药物的理念，采用快速薄膜分散法制备了^99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂，包封率大于99％，粒径小于30nm，其结构见附图1，磷脂在水中分散得单层或多层微囊，脂溶性^99mTc药物插在双分子脂膜中，缓激肽类似物RMP-7作为主动脑靶向导向分子伸展在脂质体表面。小鼠组织分布实验表明该制剂大大提高了^99mTc药物穿过BBB的能力，荷C6脑胶质瘤大鼠模型SPECT显像和自显影结果显示该主动靶向脂质体制剂应用于^99mTc肿瘤显像药物，可能实现脑瘤的早期诊断。属于放射性药物学和药物制剂学技术领域。

Description

一种99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种^99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂及其在人体和动物器官显像中的应用，尤其是在脑瘤早期诊断中的应用，属于放射性药物学和药物制剂学技术领域。

背景技术

流行病学研究显示，我国肿瘤患者死亡率呈明显上升趋势。早期诊断和治疗会给肿瘤患者带来更多治愈的机会和更好的效果。临床上常用的非特异性肿瘤显像剂有^99mTc-甲氧基异丁基异腈(^99mTc-MIBI)，^99mTc(V)-二巯基丁二酸钠(DMSA)，⁶⁷Ga-枸橼酸盐(citrate)，²⁰¹TlCl等。

目前，85％的核医学临床诊断药物是^99mTc-放射性药物。但是，迄今为止，尚未有一种^99mTc标记的脑瘤显像剂能够适用于临床显像研究。由于血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的存在，脑瘤的早期诊断一直是诊断界的难题。基于BBB的结构功能特点，药物跨越BBB的途径有以下四种：开放BBB上微血管内皮细胞间的紧密连接增加药物的通透性；修饰药物制成前体药物通过脂溶性实现融膜扩散；利用MDR逆转运对抗p-糖蛋白(p-gp)外排作用；特异受体介导的吞饮。众所周知，发现一个容易跨越BBB的脂溶性分子量小于500道尔顿的新药并非一件易事，而一个给药系统的研究成功将会给已知的CNS药物带来新的应用前景。脂质体作为一种新型药物载体(脂质体为磷脂在水中分散而得，其在结构上为单层或多层泡囊。而且脂质体具有生物相容性和生物可降解性)，将药物载于趋脑性脂质体中，通过脂质体与细胞的融合、内吞等相互作用是增加药物脑摄入的一种方法。缓激肽类似物RMP-7已被报道是靶向BBB的良好导向化合物，但由于它开放BBB的时效性，RMP-7在向FDA申报临床III期中被停滞。本发明发现用DSPE-PEG-NHS键合RMP-7后，制备的主动靶向脂质体将大大降低其毒性，更有利于RMP-7的应用，经文献检索，未发现关于RMP-7毒性改善的相关报道。

为实现^99mTc显像药物在脑瘤诊断中的应用，本发明采用脂质体和主动靶向脂质体包载^99mTc药物。以^99mTcN-NOET(^99mTc-氮-(N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸盐))为示例药物，研制^99mTcN-NOET药物脂质体制备工艺及处方优选；经动物实验研究发现^99mTcN-NOET脂质体血管给药后在小鼠脑组织的分布以及SPECT显像效果均好于游离的^99mTcN-NOET。说明^99mTc显像药物脂质体制剂在脑瘤临床诊断上较游离^99mTc药物具有更广阔的应用前景。经文献检索，目前没有^99mTc显像药物脂质体制剂在脑部肿瘤中应用的研究报道。

发明内容

1.本发明的创新点之一在于发现以缓激肽类似物RMP-7作为导向分子制备的主动靶向脂质体可明显降低RMP-7无效开放BBB的可能性，此种给药系统更有利于载药。

缓激肽类似物RMP-7能够和BBB上微血管内皮细胞上的B₂受体相互作用增加血管通透性。其暂时性无效开放BBB会造成脑脊液蛋白或其他有毒物质流入脑组织，因此RMP-7在向FDA申请临床III期实验时被停滞。本发明通过将RMP-7与DSPE-PEG-NHS键合后形成的DSPE-PEG-RMP-7插入脂质体膜，制备主动靶向脂质体，大鼠静脉给药后，死亡率为0％。细胞活性实验发现RMP-7接在脂质体上其活性未发生改变。因此将RMP-7作为导向分子接在脂质体上不仅能继续发挥其靶向BBB的作用，而且毒性明显降低。

2.该发明的创新点之二是提出用脑靶向脂质体包载^99mTc显像药物。

首次提出了用脑靶向脂质体包载^99mTc显像药物的理念，以^99mTcN-NOET(^99m锝-氮-N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸盐))为示例药物(其为脂溶性心肌灌注显像剂和肿瘤显像剂)，采用脂质体包载^99mTc药物可以解决其水溶解度问题，方便给药。此外脑靶向脂质体包载^99mTc药物能改变其在体内的组织分布，使其在脑部肿瘤处浓集。^99mTc药物用脂质体包载的特征为脂质体由磷脂在水中分散而得，其在结构上为单层或多层微囊。脂溶性^99mTc药物插在双分子脂膜上(见附图1)。脂质体与由表面活性剂构成的胶团不同，其在体液中被稀释时，不会因浓度降低而破裂，具有较好的包载^99mTc药物能力。磷脂是生物膜的组成成分，具有生物降解性和生物相容性，因此脂质体是^99mTc药物一个良好药物载体。

3.该发明的创新点之三在于^99mTc显像药物脂质体的制备工艺。

制备脂质体的材料主要是磷脂和胆固醇。磷脂可以采用天然大豆磷脂(主要成分为磷脂酰胆碱)，蛋黄卵磷脂以及二硬脂酰磷脂酰胆碱，棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，氢化卵磷脂等。这里优选天然大豆卵磷脂(纯度＞95％)。

制备^99mTc药物脂质体的方法有薄膜分散法、逆向蒸发法，复乳法，冻融法，钙诱导融合法，注入法等。优选薄膜分散法。取适量大豆卵磷脂SPC，胆固醇CHol和适量^99mTc药物，用合适的油相溶解后，25～30℃下旋转减压蒸发成膜。然后补充一定量的生理盐水使其水化，超声5min后分散成均匀的脂质体混悬液。此法得到的^99mTc药物普通脂质体特征为透明液体，具有蓝色乳光，包封率为99％，平均粒径小于30nm。若在普通脂质体中加入适量二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-RMP-7(DSPE-PEG-RMP-7)孵育1hour后得到^99mTcN-NOET脑靶向脂质体，其特征亦为透明液体，具有蓝色乳光，包封率为99％，平均粒径小于30nm。

^99mTc药物脂质体制备工艺中旋转蒸发成膜和超声时间不超过5min，孵育时间不超过1小时，有利于保持^99mTc药物的放射性活度。上述脂质体制备工艺用于^99mTc药物未见报道。在脂质体制备工艺中，由于^99mTc药物放射性活度高，而化学质量很小，因此脂材SPC和CHol使用量小，整个制备工艺属于微量操作，脂质体浓度低于0.2mg/ml，有别于常规脂质体制剂。微量法的制备工艺以及快速操作得到小粒径半衰期短的^99mTc显像药物制剂属于方法创新。

4.该发明的创新点之四在于发现^99mTc药物脂质体制剂在诊断脑瘤中具有更好的优势。

由于血脑屏障的存在，长期以来限制了显像药物在中枢神经系统方面的应用。用脂质体包载^99mTcN-NOET后，静脉给药，能明显增加^99mTcN-NOET在小鼠脑组织的药物浓度，主动靶向脂质体效果更佳。经给荷C6脑胶质瘤模型大鼠的SPECT显像后发现，^99mTcN-NOET主动脑靶向脂质体组的肿瘤显像明显，^99mTc药物脑靶向脂质体静脉给药有望在脑瘤的诊断中发挥作用。

具体实施方式

实施例1以缓激肽类似物RMP-7为导向分子的主动靶向脂质体制备工艺和毒性

取适量DSPE-PEG-NHS和RMP-7分别用0.1mol/L的HEPES缓冲液溶液溶解；然后在4℃冰柜中将DSPE-PEG-NHS缓慢滴加到RMP-7的溶液中，缓慢搅拌，4℃下反应12小时后加入过量的0.1mol/L甘氨酸终止反应。反应液于-40℃，0.22mbar下冷冻干燥24小时即得到DSPE-PEG-RMP-7，RMP-7完全反应，无残留。将DSPE-PEG-RMP-7用生理盐水溶解后缓慢滴加到脂质体中，缓慢搅拌，DSPE-PEG-RMP-7的疏水端靠疏水相互作用自动插入到脂质体的脂膜上形成主动靶向脂质体。

SD大鼠静脉注射RMP-7，每日一次，注射14日，大鼠死亡率为33％；同样注射主动靶向脂质体14日，大鼠死亡率为0％。RMP-7为导向分子制备的主动靶向脂质体明显降低其无效开放BBB引起的毒性。

实施例2^99mTc药物(以^99mTcN-NOET为示例)脂质体制备工艺

按优化处方取适量大豆卵磷脂SPC，胆固醇CHol和适量^99mTc药物，用合适的油相溶解后，25～30℃下旋转减压蒸发成膜。然后补充一定量的生理盐水使其水化，超声5min后分散成均匀的脂质体混悬液。此法得到的^99mTc药物普通脂质体特征为透明液体，具有蓝色乳光，包封率为99％，平均粒径小于30nm。若在普通脂质体中加入适量DSPE-PEG-RMP-7和DSPE-PEG孵育1hour后得到^99mTcN-NOET脑靶向脂质体，其特征亦为透明液体，具有蓝色乳光，包封率为99％，平均粒径小于30nm。

其优化处方：

磷脂与胆固醇的比例为6∶1～2∶1(重量比)，

磷脂与RMP-7比例为15∶1～50∶1(重量比)，

磷脂与DSPE-PEG比例为8∶1～3∶1(重量比)

实施例3^99mTc药物(以^99mTcN-NOET为示例)脂质体静脉给药用于脑瘤诊断

1.^99mTcN-NOET脂质体静脉给药的小鼠脑组织分布

一、实验方法：

ICR雄性小鼠90只(体重20g)，分为3组，依次为游离^99mTcN-NOET，^99mTcN-NOET脂质体(^99mTcN-NOET-L)和^99mTcN-NOET主动靶向脂质体(^99mTcN-NOET-SSL-T)组。用15％乌拉坦麻醉后尾静脉给药0.1ml。分别于给药5、15、30、60和120min后进行眼部后静脉丛取血。然后蠕动泵心脏灌流生理盐水，流速为2mL/min，随即剪开右心耳放血，以此消除脑毛细血管中残留的药物对脑组织分布的影响，准确评价药物跨越血脑屏障进入脑组织的能力。

动物处死后，取脑、心、肝、脾、肺、肾、尾等组织，精确称重后γ计数。

给药剂量0.1mL药物100倍稀释后，取0.1mlγ计数，计算动物分布％ID/g值，计算公式如下：

二、实验结果：

游离^99mTcN-NOET，^99mTcN-NOET脂质体(^99mTcN-NOET-L)和^99mTcN-NOET主动靶向脂质体(^99mTcN-NOET-SSL-T)组给药后，各时间点脑组织药物分布％ID/g见附图2。由图可以看出，^99mTcN-NOET-SSLT，^99mTcN-NOET-L相对于^99mTcN-NOET有很大的提高。经WinNonLin软件计算其药动学参数，如表1所示。

表1.各组药物在ICR小鼠中血和脑组织的药动学参数(n＝5～6)

AUC：area under the tissue concentration time curve；C_max：maximum concentration；CL：clearance rate.

$T\arg \mathrm{etedcoefficient}=\frac{\mathrm{AUC}\left(\mathrm{brain}\right)}{\mathrm{AUC}\left(\mathrm{blood}\right)}$

通过药动学参数的计算可以看出，^99mTcN-NOET经脂质体包载后，5min时药物在脑组织浓度达峰，达峰时药物浓度提高1.63倍，脑内药物AUC较游离药物组提高了1.49倍，脑组织药物清除率明显低于游离药物组。此结果说明脂质体作为药物载体，增加了药物入脑效果，延长了^99mTcN-NOET在脑组织的显像时间。

^99mTcN-NOET经靶向脂质体脂质体包载后，5min时药物在脑组织浓度达峰，达峰时药物浓度较脂质体组略有增加，脑靶向系数亦略有提高。分析其原因，与^99mTcN-NOET在正常小鼠脑内没有受体可能有关。

三、结论：

^99mTcN-NOET用脂质体包载静脉给药，在小鼠脑组织的分布优于^99mTcN-NOET，尤其以脑靶向脂质体^99mTcN-NOET-SSL-T分布最高，表明其是一个较有潜力的脑靶向显像制剂。

2.^99mTcN-NOET脂质体静脉给药大鼠SPECT显像和放射自显影

一、实验方法：

取SD雄性大鼠2只(体重200g)，尾状核接种C6胶质瘤细胞，接种7日后制作的动物模型用于SPECT显像评价。标记为A鼠与B鼠。用15％乌拉坦麻醉后尾静脉分别给予游离^99mTcN-NOET和^99mTcN-NOET主动靶向脂质体(^99mTcN-NOET-SSL-T)，给药量分别为0.5ml(200uCi)。2小时后用德国Siemens E.cam SPECT仪采集图像。

上述2只肿瘤大鼠2日后，交叉给药，A鼠给予^99mTcN-NOET-SSL-T，B鼠给予游离^99mTcN-NOET。另取一只C6脑胶质瘤模型大鼠给予^99mTcN-NOET-L。2小时处死动物，解剖取完整脑组织，于液氮中冷冻。冷冻切片，储磷屏显影。

二、实验结果：

1.荷C6胶质瘤大鼠模型SPECT显像结果

^99mTcN-NOET与^99mTcN-NOET-SSLT分别在2小时左右的SPECT成像照片见附图3。从照片光斑显像结果可以看出A鼠给予^99mTcN-NOET后，脑组织未见明显肿瘤；而B鼠给予^99mTcN-NOET-SSL-T后，在右侧脑组织中可见两处明显肿瘤。为进一步确定肿瘤存在，做脑组织冷冻切片查看肿瘤情况并做自显影。

2.荷C6胶质瘤大鼠模型自显影研究结果

C6胶质瘤模型大鼠交叉给予^99mTcN-NOET-SSL-T(A鼠)、^99mTcN-NOET(B鼠)和^99mTcN-NOET-L，2小时左右处死动物的自显影印迹见附图4。可以看出，A鼠冷冻切片的大脑横切面解剖照片显示脑组织中有两个肿瘤区域，其呈现茂盛的新生血管，边界比较清楚，取该切面的脑组织于磷屏下曝光，得到显影印迹图，图中可见明显的两个肿瘤区域。B鼠冷冻切片的大脑横切面解剖照片也显示脑组织中有两个肿瘤区域，其呈现茂盛的新生血管，上侧靠近尾状核的肿瘤边界不太清楚，下侧出现的小肿瘤边界清楚，为其转移瘤。^99mTcN-NOET给药后的自显影印迹可看到上侧肿瘤周边有一圈明显的浓集，但下侧新生瘤没有印迹。比较SPECT显像和自显影结果，可以明显看出游离^99mTcN-NOET在肿瘤后期可以显像，但对于肿瘤的早期诊断作用欠佳。

C鼠冷冻切片的大脑横切面解剖照片显示其脑组织中明显可见茂盛的新生血管，但肿瘤边界不太清楚，C鼠为肿瘤后期模型。经分析给予^99mTcN-NOET-L自显影印迹可以看出，印迹不如主动脑靶向制剂^99mTcN-NOET-SSLT清楚，仅在肿瘤边界出现浓集。

三、结论：

^99mTcN-NOET经主动靶向脂质体包载后，其对于脑部肿瘤的早期诊断优于游离药物组和普通脂质体组。以RMP-7作为导向分子的主动靶向脂质体是一种良好的^99mTc显像药物的给药系统，其有望于为脑部肿瘤的早期诊断提供灵敏的分子探针。

附图说明：

附图1.^99mTcN药物主动靶向脂质体的结构示意图

附图2.^99mTcN-NOET和^99mTcN-NOET脂质体在小鼠脑组织的药时曲线

附图3.^99mTcN-NOET和^99mTcN-NOET-SSL-T在荷C6胶质瘤大鼠模型的SPECT显像

附图4.^99mTcN-NOET和^99mTcN-NOET脂质体在荷C6胶质瘤大鼠模型的冰冻脑切片和自显影

Claims (8)

1.一种^99mTc肿瘤显像药物的脑靶向脂质体制剂，其特征在于以缓激肽类似物RMP-7为导向分子制备的主动脑靶向脂质体。

2.根据权利要求1所述的^99mTc显像药物为^99mTcN-NOET(^99mTc-氮-N-乙基-N一乙氧基二硫代氨基甲酸盐))，^99mTcN-NOET衍生物，^99mTc-MIBI(甲氧基异丁基异腈)以及所有^99mTc标记的肿瘤显像剂。

3.根据权利要求1所述的制剂，该制剂含有脂质体微囊和包裹于其中的^99mTc显像药物，所述脂质体浓度低于1.5mg/ml，粒径小于60nm的微囊，所述脂质体微囊含有磷脂，胆固醇，以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-RMP-7导向化合物。

4.根据权利要求3所述的制剂，其中所述的聚乙二醇为聚乙二醇2000和聚乙二醇3400。

5.根据权利要求3所述的制剂，其中所述的磷脂选自大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂，二硬脂酰磷脂酰胆碱，棕榈酰磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，氢化卵磷脂。

6.根据权利要求3所述的制剂，其中所述的磷脂为大豆卵磷脂。

7.权利要求1所述制剂的制备方法，其特征在于该方法为薄膜分散法，具体步骤如下：取大豆卵磷脂，胆固醇和适量^99mTc药物，用合适的油相溶解后，25～30℃下旋转减压蒸发成膜。补充一定量的生理盐水使其水化，超声5min后加入适量二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-RMP-7孵育1hour后得到脂质体透明溶液。

8.权利要求1所述的^99mTc肿瘤显像药物靶向脂质体的用途，在于脑部肿瘤的诊断和治疗。

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