CN101912772A

CN101912772A - 一种键合型手性固定相的制备方法

Info

Publication number: CN101912772A
Application number: CN2010102568660A
Authority: CN
Inventors: 朱秀林; 程振平; 许文亮; 张丽芬; 周年琛; 张正彪
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-08-19
Filing date: 2010-08-19
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2030-08-19
Also published as: CN101912772B

Abstract

本发明属于手性固定相领域，具体涉及一种适用于高效液相色谱的以二氧化硅为载体的多糖类手性固定相的制备方法，具体包括以下步骤：(1)合成手性聚合物链：以对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯)作为单体，原子转移自由基聚合反应合成手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯；(2)制备二氧化硅载体：采用史托伯法合成二氧化硅粒子，通过氯甲基化硅烷偶联剂进行氯甲基化得到氯甲基化的二氧化硅粒子，然后与叠氮化钠反应得到叠氮化二氧化硅粒子；(3)将步骤(1)制备的手性聚合物链与步骤(2)所得叠氮化二氧化硅粒子通过点击化学反应，形成共价键连接而键合，得到键合型手性固定相。本发明可以设计不同分子量的手性聚合物链，不同粒径的二氧化硅粒子，从而得到不同性能的手性固定相。

Description

一种键合型手性固定相的制备方法

技术领域

本发明属于手性固定相领域，具体涉及一种适用于高效液相色谱(HPLC)的以二氧化硅为载体的多糖类手性固定相。

背景技术

手性固定相由具有光学活性的小分子或手性聚合物通过化学键合反应到或涂敷到硅胶载体表面上而得到。拆分时，由对映体样品与键合或涂敷的手性分子形成非对映异构体络合物的结合能力的差别而达到分离，分离效率和洗脱顺序取决于复合物的相对强度。手性固定相的主要类型有蛋白质键合相、多糖类键合相、手性聚合物键合相、环糊精键合相和大环抗体类等。其中多糖，具有良好精细的结构，经过改性后适用手性识别的范围和能力大大扩展，为当前手性固定相的首选材料。由于手性固定相分离测定对映体速度快、柱效高、操作简单、适应范围广，目前在三点作用分离理论的指导下已经发展成对映体分离最迅速的领域，也是手性色谱发展的关键和核心。

在目前报道的手性柱固定相合成中涉及的基本方法分为：涂敷法、整体成球法、共聚-交联法、键合法。涂敷法是将多糖衍生物溶解于合适的有机溶剂称为涂敷溶剂，再加入硅胶载体，使其充分吸附多糖衍生物，然后蒸除涂敷溶剂，使多糖衍生物析出并附着于硅胶表面。涂敷型多糖衍生物拆分能力强，但流动相选择范围窄。整体微球型手性固定相不使用昂贵的大孔硅胶担体，降低了固定相的制备成本，同时也提高了固定相的柱载量。但这种微球的孔性结构复杂，内扩散阻力大，溶质在短时间内很难达到吸附-脱附平衡而产生较宽的洗脱峰，仅仅在低流速条件下才体现其柱载量高的优点。交联-共聚法同时克服了键合型固定相拆分能力降低和涂敷型固定相流动相选择范围小的缺点。键合型固定相则是将纤维素衍生物键合于担体表面，扩大了流动相的选择范围但手性选择性有所降低，但选用糖类单体很好解决了这一问题。

目前多糖衍生物手性固定相键合法，主要采用常规方法合成的手性聚合物的种类少，分子结构不能进行设计、分子量及分子量分布很宽等；键合到二氧化硅粒子表面时接枝率低下，操作麻烦、所接手性聚合物接联点分布不均匀且难以控制等导致固定相载样量低使得拆分效率受到影响。

发明内容

本发明目的是提供一种键合型手性固定相的制备方法，控制聚合物的分子量以及分子量分布，同时提高多糖衍生物手性链在二氧化硅的表面接枝率。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种键合型手性固定相的制备方法，包括合成手性聚合物链，制备二氧化硅载体以及将手性聚合物链键合到二氧化硅载体上，具体地，包括以下步骤：

(1)合成手性聚合物链：以对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯(VBPG)作为单体，以含炔基的有机卤化物为引发剂，采用原子转移自由基聚合(ATRP)反应合成含炔基的手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯；

(2)制备二氧化硅载体：采用史托伯

法合成二氧化硅粒子，通过氯甲基化硅烷偶联剂进行氯甲基化得到氯甲基化的二氧化硅粒子，然后与叠氮化钠反应得到叠氮化二氧化硅粒子；

(3)将步骤(1)制备的含炔基的手性聚合物链与步骤(2)所得叠氮化二氧化硅粒子通过点击化学(click chemistry)反应键合：将步骤(1)制备的手性聚合物链与步骤(2)所得叠氮化二氧化硅粒子充分溶解和分散在溶剂中，再加入抗坏血酸钠和无水硫酸铜的水溶液，反应得到手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子，所述手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子即键合型手性固定相。

具体地，上述技术方案包括以下步骤：

(1)以对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯作为单体，以含炔基的有机卤化物为引发剂，按摩尔比，单体∶引发剂∶催化剂＝20～200∶1∶0.1～1，将单体、引发剂、催化剂和配位剂加入溶剂中，在惰性气氛下，于70～100℃下，进行铜盐催化的原子转移自由基聚合反应合成含炔基的手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯，所得含炔基的手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯的聚合度为20～200；合成手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯(P(VBPG))的结构通式如下：

式中，X为溴(Br)或氯(Cl)，R为亚甲基(-CH₂-)、-CH₂CH₂-或-C(CH₃)₂-，聚合度n＝20～200；

其中，所述引发剂选自：α-溴异丁酸丙炔酯、α-溴异丁酸丁炔酯和α-溴异丁酸甲基丁炔酯中的一种；所述催化剂选自：溴化亚铜或者氯化亚铜中的一种；所述配位剂选自：2，2′-二联吡啶或者五甲基二乙烯基三胺中的一种；所述溶剂选自：甲苯、四氢呋喃或者苯甲醚中的一种；

(2)按照现有技术，采用史托伯法合成粒径为100～5000nm的二氧化硅粒子，然后将二氧化硅粒子分散在溶剂A中，在惰性气氛中，加入氯甲基化硅烷偶联剂，90～105℃反应10～21h，得到氯甲基化的二氧化硅粒子；然后将氯甲基化的二氧化硅分散在含有叠氮化钠的溶液中，于75～95℃反应18～24h，得到叠氮化二氧化硅粒子；

上述反应过程如下所示：

其中，所述溶剂A为苯或甲苯；所述含有叠氮化钠的溶液中的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或者四氢呋喃；叠氮化二氧化硅粒子的叠氮化程度即接枝率可以通过氯甲基化的时间和反应温度来控制；其接枝率可以通过元素分析来表征；

(3)按摩尔比，n(叠氮化二氧化硅粒子)∶n(聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯)∶n(CuSO₄)∶n(NaVc)＝100∶(102～110)∶1∶3，依次加入聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯，叠氮化二氧化硅粒子，充分溶解和分散在溶剂B中，再加入抗坏血酸钠和无水硫酸铜的水溶液，搅拌条件下，于45～75℃下进行炔基和叠氮的点击化学(Click Chemistry)反应，反应12～18h得到手性链修饰的二氧化硅粒子，所述手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子即键合型手性固定相；

上述反应过程如下所示：

其中，所述溶剂B为N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。

上述技术方案中，步骤(1)中，调整原子转移自由基聚合反应的时间可以调整手性聚合物链的分子量，从而改变手性杂化粒子的拆分性能；并且所得手性聚合物链的分子量分布PDI值保持在较低水平。

步骤(2)中，采用史托伯

法所得的二氧化硅粒子的粒径为100～5000nm，可以通过选择不同粒径的二氧化硅粒子改变最终手性固定相的粒径。

步骤(3)中，采用“Click”反应将叠氮化二氧化硅粒子与手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯键合，反应操作简单，条件温和，对氧、水不敏感；快速，高通量合成；产物收率高、选择性好；产物易纯化、后处理简单甚至不需要专门的分离提纯。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.由于采用ATRP法，聚合物的分子量可以很方便地设计，从而可以寻找最佳拆分聚合物的链长；

2.由于在二氧化硅粒子表面修饰过程中，选用“click”反应，反应操作简单、效率高、副反应少，便于大规模生产；

3.现有商品化的手性固定相无法很好地拆分外消旋的酒石酸、扁桃酸、3-氨基-1，2-丙二醇和阿拉伯糖，本发明所得手性固定相可以很好地拆分外消旋的酒石酸、扁桃酸、3-氨基-1，2-丙二醇和阿拉伯糖。

附图说明

图1A为实施例四所得粒径为108nm二氧化硅粒子；

图1B为实施例四中聚合物(M_n，GPC＝10050g/mol，PDI＝1.18.)修饰后的二氧化硅粒子的TEM图，标尺为100nm；

图1C为实施例四中聚合物(M_n，GPC＝10050g/mol，PDI＝1.18.)修饰后的二氧化硅粒子的TEM图，标尺为200nm；

图2为实施例六中不同链长聚合物修饰所得杂化粒子对外消旋物质拆分；

图3为实施例七中聚合物(M_n，GPC＝10050g/mol，PDI＝1.18.)修饰所得的杂化粒子对酒石酸重复拆分；

图4为实施例八中HPLC的手性拆分效果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

所用的化学试剂：D，L-阿拉伯糖，97％；3-氨基-1，2-丙二醇，98％，Alfa Aesar公司；五甲基二乙烯三胺(PMEDTA)98％，Sigma Aldrich公司；D，L-扁桃酸，L-(+)-扁桃酸，D-(-)-扁桃酸，98％；D，L-酒石酸，D-(-)-酒石酸，L-(+)-酒石酸，97％；溴化亚铜(CuBr)，分析纯；对氯甲基苯乙烯，90％；N-甲酰二甲胺，分析纯，中国医药(集团)上海化学试剂公司四氢呋喃和乙醇，分析纯，常熟市杨园化学试剂有限公司；对双丙酮-D-半乳糖(PG)，98％，Sigma Aldrich公司；氯甲基苯乙烯，90％，Sigma Aldrich公司；引发剂：α-溴异丁酸丁炔酯(BEiB)，自己合成；单体：对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯(VBPG)，自己合成；二氧化硅粒子球，自己合成；乙醇，色谱纯，中国医药(集团)上海化学试剂公司。

实施例一：对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯(VBPG)的合成

把2.36g对氯甲基苯乙烯滴入12g NaOH与0.3g四丁基溴化胺的混合水溶液中(30mL)，室温下搅拌数分钟；对双丙酮-D-半乳糖(PG)2.89g溶解于30mL四氢呋喃中，缓慢滴入上述混合水溶液，室温搅拌，反应24h。反应完成后，用三氯甲烷及蒸馏水洗涤该反应液直至溶液呈中性，粗产物在三氯甲烷中为黄色液体，接着用层析柱提纯(硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯＝8/1(体积比))。最终产物VBPG为白色雪花状固体，产率46％。

实施例二：α-溴异丁酸丁炔酯(BEiB)

0℃下，103g，0.45mol溴代异丁酰溴的无水乙酸乙酯溶液200mL，滴加到含有37.1g(0.53mol)正丁炔醇和43g(0.53mol)吡啶的150mL乙酸乙酯溶液中，搅拌反应2h后，再在室温下反应过夜。反应结束后分别用水、碳酸氢钠的盐酸溶液和饱和食盐水分别洗两遍，干燥，蒸馏，得到70.0g α-溴异丁酸丁炔酯。

实施例三：以BEiB为引发剂的功能性P(VBPG)手性链的合成

按配比n(VBPG)∶n(BEiB)∶n(CuBr)∶n(PMDETA)＝75∶1∶1∶3。依次加入CuBr，PMDETA，BEiB，VBPG以及甲苯(5mL)于10mL的安瓿瓶中，通氩气10分钟后封管。将封管后的安瓿瓶置于恒定温度(75℃)下的油浴中按预定的时间进行反应(6～18d)。反应结束后，取出封管，立即用冷水冷却，打开封管，用适量石油醚中沉淀、干燥即得到手性聚合物。

采用双官能团引发剂(BEiB)、VBPG为单体，在不同聚合时间下合成手性聚合链的数据如表1所示。由表中数据可以看出，采用溶液聚合得到的手性聚合物分子量随聚合时间呈线性增长，并且所有聚合物的分子量分布(PDI)值均保持在较低的水平(M_w/M_n＝1.10～1.26)。

表1.通过ATRP法合成不同分子量的含炔基手性P(VBPG)链

序号反应时间(h) 单体转化率(％) M_n(th) M_n(GPC) PDI

PVBPG-1 6×24 25 6890 6700 1.10

PVBPG-2 12×24 43 11860 10050 1.18

PVBPG-3 18×24 64 17590 15310 1.26

注：聚合条件：VBPG＝0.6g；甲苯＝1mL；[VBPG]∶[BEiB]∶[CuBr]∶[PMDETA]＝75∶1∶1∶3；T＝75℃。

实施例四：含叠氮基的二氧化硅粒子的合成

(1)、采用

法合成SiO₂纳米粒子：250mL无水乙醇中加入15mL氨水(28wt％)，强力搅拌下，滴加10mL四乙氧基硅烷，30℃下反应(24～30h)得到白色的乳液。离心后得到白色SiO₂纳米粒子，分别在乙醇、丙酮和乙醚中洗涤得以纯化物，如图1(A)所示，干燥备用。

(2)、取2.5g上述得到108nm的SiO₂纳米粒子分散在40mL甲苯中，通氩气30min，加入0.3g氯甲基化硅烷偶联剂，(90～105℃)反应(16～21h)，离心的固体分别用甲苯、丙酮和乙醚洗涤两次，烘干得到氯甲基化的SiO₂纳米粒子(SiO₂-Cl)，备用。

(3)、取2g SiO₂-Cl分散在含有0.8g叠氮化钠的100mL的DMF溶液中(75～95℃)反应(18～24h)，离心的固体分别用DMF、水和乙醚洗涤，干燥得到叠氮化的二氧化硅粒子(SiO₂-N₃)。

采用相同的氯甲基和叠氮化试剂和实验方法，使用粒径为5μm的二氧化硅粒子，同样可以得到粒径为5μm的叠氮化二氧化硅粒子。

实施例五：“click”反应合成杂化手性粒子(手性固定相)

按配比n(SiO₂-N₃)∶n(P(VBPG))∶n(CuSO₄)∶n(NaVc)＝100∶(102～110)∶1∶3，依次加入P(VBPG)，SiO₂-N₃，充分溶解和分散在DMF中，再加入抗坏血酸钠和无水硫酸铜的水溶液，(45～75℃)下搅拌反应(12～18h)反应得到的手性链修饰的二氧化硅球(手性固定相)如图1(B和C)所示。

采用108nm叠氮化的二氧化硅粒子，使用不同聚合度带炔基手性聚合物，得到不同聚合物修饰的杂化手性粒子。

5μm的手性杂化粒子球的合成步骤同上。

实施例六：手性拆分

为了验证上述实施例合成的有机/无机手性杂化粒子(实施例三所得手性固定相)对拆分的有效性，首先分别用三种不同聚合度聚合物修饰过108nm的手性杂化粒子在乙醇溶剂，分别对外消旋的酒石酸、扁桃酸、3-氨基-1，2-丙二醇和阿拉伯糖进行手性拆分(拆分条件：外消旋在乙醇溶液中浓度为1mg/mL；外消旋和杂化粒子的质量比为1g/20g；拆分温度为20℃)。该粒子在乙醇溶液中，表现出良好的分散性能。对拆分液乙醇溶液进行旋光测试，得到结果如图2所示。可看出该手性杂化粒子对所选定的外削旋物质都有较好的手性拆分能力。

实施例七：手性杂化粒子的重复拆分

为考察该手性杂化纳米粒子(实施例三所得手性固定相)重复拆分使用的次数和效率。分别在溶解了20mg酒石酸的20mL乙醇和四氢呋喃溶液中加入400mg的杂化纳米粒子球(M_n，GPC＝10050g/mol，M_w/M_n＝1.18)，在反应7.5h，静置取得溶液测其旋光度；收集杂化粒子用乙醇溶液反复超声洗涤后，真空烘箱烘干进行下次拆分(拆分条件：外消旋在乙醇溶液中浓度为1mg/mL；外消旋和杂化粒子的质量比为1/20；拆分温度为20℃)。

由图3结果可看出：以四氢呋喃为溶剂时拆分后的旋光度为-13°(光学纯L-型酒石酸在四氢呋喃中旋光度为-14°)；以乙醇为拆分溶剂拆分后的旋光度为-11°(光学纯L-型酒石酸在四氢呋喃中旋光度为-12°)。从实验结果还可看出在首次拆分后，重复拆分时拆分效能能够保持在比较高的拆分效率，且稳定性较好。

实施例八：HPLC的手性拆分

将合成的5μm的手性杂化粒子(实施例三所得手性固定相)填充到HPLC柱子中(150mm×4.6mm，5μm)作为手性固定相，以正己烷/异丙醇/甲酸(85∶15∶0.1，体积比)为流动相，在pH＝4.5时，选用扁桃酸的外消旋体进行拆分试验(拆分条件：柱子(150mm×4.6mm，5μm，苏州赛分科技填装)，流动相：正己烷/异丙醇/甲酸(85∶15∶0.1，体积比)，流速＝0.5mL/min，紫外检测灯波长＝230nm，T＝20℃)。结果如图4所示，通过改手性相可以达到很好的分离效果。

Claims

1.一种键合型手性固定相的制备方法，包括合成手性聚合物链，制备二氧化硅载体以及将手性聚合物链键合到二氧化硅载体上，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成手性聚合物链：以对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯作为单体，以含炔基的有机卤化物为引发剂，采用原子转移自由基聚合反应合成含炔基的手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯；

(2)制备二氧化硅载体：采用史托伯法合成二氧化硅粒子，通过氯甲基化硅烷偶联剂进行氯甲基化得到氯甲基化的二氧化硅粒子，然后与叠氮化钠反应得到叠氮化二氧化硅粒子；

(3)将步骤(1)制备的含炔基的手性聚合物链与步骤(2)所得叠氮化二氧化硅粒子通过点击化学反应键合：将步骤(1)制备的手性聚合物链与步骤(2)所得叠氮化二氧化硅粒子充分溶解和分散在溶剂中，再加入抗坏血酸钠和无水硫酸铜的水溶液，反应得到手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子，所述手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子即键合型手性固定相。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括以下步骤：以对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯作为单体，以含炔基的有机卤化物为引发剂，按摩尔比，单体∶引发剂∶催化剂＝20～200∶1∶0.1～1，将单体、引发剂、催化剂和配位剂加入溶剂中，在惰性气氛下，于70～100℃下，进行铜盐催化的原子转移自由基聚合反应合成含炔基的手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯，所得含炔基的手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯的聚合度为20～200；合成手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯的结构通式如下：

式中，X为溴或氯，R为-CH₂-、-CH₂CH₂-或-C(CH₃)₂-，聚合度n＝20～200；

其中，所述引发剂选自：α-溴异丁酸丙炔酯、α-溴异丁酸丁炔酯和α-溴异丁酸甲基丁炔酯中的一种；所述催化剂选自：溴化亚铜或者氯化亚铜中的一种；所述配位剂选自：2，2′-二联吡啶或者五甲基二乙烯基三胺中的一种；所述溶剂选自：甲苯、四氢呋喃或者苯甲醚中的一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括以下步骤：按照现有技术，采用史托伯法合成粒径为100～5000nm的二氧化硅粒子，然后将二氧化硅粒子分散在溶剂A中，在惰性气氛中，加入氯甲基化硅烷偶联剂，90～105℃反应10～21h，得到氯甲基化的二氧化硅粒子；然后将氯甲基化的二氧化硅分散在含有叠氮化钠的溶液中，于75～95℃反应18～24h，得到叠氮化二氧化硅粒子；

其中，所述溶剂A为苯或甲苯；所述含有叠氮化钠的溶液中的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或者四氢呋喃。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体包括以下步骤：按摩尔比，n(叠氮化二氧化硅粒子)∶n(聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯)∶n(CuSO₄)∶n(NaVc)＝100∶(102～110)∶1∶3，依次加入聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯，叠氮化二氧化硅粒子，充分溶解和分散在溶剂B中，再加入抗坏血酸钠和无水硫酸铜的水溶液，搅拌条件下，于45～75℃下进行炔基和叠氮的点击化学反应，反应12～18h得到手性链修饰的二氧化硅粒子，所述手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子即键合型手性固定相；

其中，所述溶剂B为N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。