CN101910201A - 治疗慢性疲劳综合征的b细胞耗竭剂,如抗-cd20抗体或其片段 - Google Patents

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Abstract

本发明第一方面涉及耗竭B细胞的抗-CD20抗体或者其结合CD20的抗体片段，用于治疗慢性疲劳综合征以及肌痛性脑脊髓炎。本发明特别涉及优选人源化的抗-CD20单克隆抗体或者其片段在治疗慢性疲劳综合征/肌痛性脑脊髓炎对象中的应用。

Description

治疗慢性疲劳综合征的B细胞耗竭剂，如抗-CD20抗体或其片段
本发明第一方面涉及治疗慢性疲劳综合征和肌痛性脑脊髓炎的耗竭B细胞的抗-CD20抗体或者其结合CD20的抗体片段。特别地，本发明涉及优选人源化的抗-CD20单克隆抗体或者其片段在治疗受累于慢性疲劳综合征/肌痛性脑脊髓炎的对象中所述疾病的应用。
另一方面，本发明涉及一般用于治疗受累于慢性疲劳综合征和肌痛性脑脊髓炎的对象中所述疾病的B细胞耗竭剂(depleting agents)。
技术背景
慢性疲劳综合征
慢性疲劳综合征(CFS)特征在于无法解释的严重疲劳，持续至少连续六个月，伴有职业、社会或者个人活动的先前水平明显降低。患者也通常经历持久或者复发的如短期记忆力或者注意力受损、肌肉疼痛、无关节炎迹象的关节疼痛、头痛、睡眠异常以及运动后精疲力竭等症状(Fukuda K，et al.，1994，Ann Intern Med 121：953-9et al 1994)。许多研究已经示出血液测试或者放射研究中的微细改变，但是还没有生物标记或者诊断测试。
全世界CFS的流行程度被认为是至少0.5％，且女性：男性比率为3∶1(Wyller VB.2007，Acta Neurol Scand Suppl 187：7-14)。
CFS的病原学还未明确。各种假说包括免疫学、病毒学、神经内分泌学以及心理学机制。推测CFS的发病机制是多因素的，且包括主体(host)和环境因素(Devanur & Kerr 2006)。
在2007年11月的新近综述中，描述了当前CFS的优先研究领域中迫切需要阐述CFS的发病机制(Kerr JR et al.，2007，J Clin Pathol 60：113-6)。
许多患有CFS的患者在发生疲劳之前具有急性病毒感染史。尽管研究数据指出免疫系统激活证据，但是疾病机制仍未知。在2001年成立合作研究小组，以阐明CFS的分子机制，旨在开发诊断测试及指导开发更特异性的治疗(Devanur LD，Kerr JR.2006，J Clin Virol 37：139-50)。
在CFS中已经进行了一些基因表达研究，根据免疫应答和防御机制中的功能失调表明存在特异性但复杂的基因变异。一项微阵列研究揭示CFS中16个基因的差异表达，提示T细胞激活及神经元和线粒体功能紊乱(Kaushik N，et.Al.，2005，J Clin Pathol 58：826-32)。另一项微阵列研究使用来自在埃巴病毒(EBV)感染之后发生CFS的患者以及感染EBV但是未发生疲劳的对象的外周血单个核细胞总RNA的系列样品，推断出影响线粒体功能和细胞周期的一些基因失调(Vernon SD，et.Al.，2006，BMC Infect Dis 6：15)。在CFS中进行的另一项基因表达研究提示运动应答基因包括参与膜转运和离子通道的一些基因的失调(Whistler T，et.al.，2005，BMC Physiol 5：5)。近年来，在CFS中进行的基因网络分析表明在临床表现和严重性方面不同的七个不同的基因组亚型(Kerr J，et.al.，2007，J Clin Pathol)。一些其它研究致力于CFS中全局基因表达(Fang H，et.al.，2006，Pharmacogenomics 7：429-40；Whistler T，et al.，2003，J Transl Med 1：10)。
基因表达数据不是结论性的，但是提示在CFS中存在代表多种细胞功能的基因表达失调，且可以表明所述疾病具有异源发病机制。
CFS研究的主要论题是持续免疫失调，随后是急性外源刺激如病毒感染。据报道与CFS相关的微生物病原体是埃巴病毒(Lemer AM，et al.，2004，In Vivo 18：101-6)、肠道病毒(Chia JK，Chia AY.2007，J Clin Pathol)、细小病毒B19(Matano S，et al.，2003，Intern Med 42：903-5)、巨细胞病毒(Lerner AM，et al.，2002，In Vivo 16：153-9)、人疱疹病毒类型6(Chapenko S，et al.，2006，JClin Virol 37Suppl 1：S47-51；Komaroff AL.2006，J Clin Virol 37Suppl1：S39-46)、肺炎衣原体(Nicolson GL，et al.，2003，Apmis 111：557-66)。然而，数据不一致(Soto NE，Straus SE.，2000，Herpes 7：46-50)。
近来对于感染后疲劳综合征的研究发现与在感染后立即康复的对照组相比，在超过12个月的时期在离体(ex vivo)细胞因子产生方面并无不同(Vollmer-Conna U，et al.，2007，Clin Infect Dis 45：732-5)。其它研究主张尽管通过激活的T细胞数目增加以及细胞因子水平提高表明免疫激活证据，但是CFS患者可能具有降低的免疫细胞功能，伴有低NK细胞细胞毒性和免疫球蛋白缺陷(Patarca R.2001，Ann N YAcad Sci 933：185-200)。
其它研究报道了与对照组相比，CFS患者中大量循环B淋巴细胞，改变的NK细胞亚系，也具有增加的粘附分子表达(Tirelli U，et al.，1994，ScandJ Immunol 40：601-8)，而其它研究示出在CFS患者中减少的CD56+NK-细胞和减少的CD4+和CD8+T-淋巴细胞(Racciatti D，et al.，2004，lnt Jlmmunopathol Pharmacol 17：57-62)。也发现来自CFS患者的T细胞和NK细胞表达较低水平的细胞内颗粒蛋白-穿孔蛋白，表明介导细胞毒性的能力降低。
一项研究示出在CFS患者中与免疫功能相关的实验室标记中的一些异常(Klimas NG，et al.，1990，J Clin Microbiol 28：1403-10)。最一致的结果是低NK细胞细胞毒性，但是也有CD8+T-细胞增加、CD20+B-细胞数目增加以及共表达CD20和CD5的B细胞亚系增加(Klimas et al 1990)。这些资料在一定程度上由一项研究支持，该研究报道在CFS患者中激活的CD8+细胞毒性T淋巴细胞扩增以及NK细胞活性明显降低(Barker E，et al.，1994.ClinInfect Dis 18 Suppl 1：S136-41)。
近来一项对比CFS患者与对照组的研究报道在体外促有丝分裂刺激之后T细胞和NK细胞上的CD69表达降低，表明由这些细胞介导的细胞免疫性的早期激活失调(Mihaylova I，et al.，2007，Neuro Endocrinol Lett28：477-83)。
然而，CFS中免疫失调数据不一致，一项对比CFS患者与抑郁症患者、多发性硬化症患者以及健康对照组的淋巴细胞亚系的研究发现T细胞、B细胞或者NK细胞亚系无差异(Robertson MJ，et al.，2005，Clin Exp Immunol141：326-32)。相似地，对于CFS免疫学的综述推断在研究领域进行的研究具有不同性质，不能鉴别出免疫学异常的一致模式(Lyall M，et al.，2003，JPsychosom Res 55：79-90)。
连同CFS中免疫失调的假说一起，已经提出对于内源血管活性神经肽的自身免疫性是该疾病的发病机制(Staines DR.，2005，Med Hypotheses64：539-42)，然而无科学数据支持。该作者也提示在纤维肌痛、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、帕金森氏症和婴儿猝死综合征病原学中的相似机制，推测对于发挥激素、神经递质、免疫调节剂和神经营养因子作用的血管活性神经肽的自身免疫性可以解释这些疾病的复杂临床表现。然而，未证明在CFS中具有这些神经肽的自身抗体。
一项研究调查了CFS患者和对照组中循环抗肌肉和抗CNS抗体的存在情况，未检测到病原性抗体。关于CFS中抗核自身抗体的另一报道推断不存在关联性(Skowera A，et al.，2002，Clin Exp Immunol 129：354-8)，而关于神经元特异性抗原的共有自身抗体和抗体另一项研究示出在CFS中较高比率的微管相关蛋白2和ssDNA抗体(Vernon SD，Reeves WC.2005，JAutoimmune Dis 2：5)。一项研究表明与对照组相比，CFS患者亚系中存在毒蕈碱胆碱能受体的自身抗体(Tanaka S，et al.，2003，lnt J MoI Med12：225-30)，以及在CFS中较高水平的不溶的细胞抗原自身抗体(yonMikeecz A.，et al.，1997，Arthritis Rheum 40：295-305)。
然而，没有一致的数据直接表明存在病原性自身抗体或者T淋巴细胞介导的自身免疫性。没有通过在动物模型中用类似于(推定的)人自身抗原的抗原免疫接种再现CFS疾病的间接证据。
目前未将CFS定义为自身免疫疾病，近来关于CFS的药物治疗方案的Cochrane综述指出其病原学还未知(Rawson KM，et al.，2007.Pharmacological treatments for chronic fatigue syndrome in adults.(Protocol)Cochrane Database of Systematic Reviews，Issue 4.Art.No.：CD006813.)。
关于CFS发病机制的的其它假说是血小板功能失调(Kennedy G，et al.，2006，Blood Coagul Fibrinolysis 17：89-92)、神经学(Natelson BH 1et al.，2005，Clin Diagn Lab Immunol 12：52-5)、神经内分泌学(Van Den Eede F，et al.，2007，Neuropsychobiology 55：112-20)、代谢或者自主神经紊乱、离子通道功能失调(Chaudhuri A，et al.，2000，Med Hypotheses 54：59-63)、锌缺乏(Maes M，etal.，2006，J Affect Disord 90：141-7)、毒素暴露或者先前的接种(Appel S，et al.，2007，Autoimmunity 40：48-53)。其它假说集中在对于运动的异常应答，细胞内免疫失常是一种可能的CFS发病机制(Nijs J，et al.，2004，Med Hypotheses62：759-65)。也已经提出合成n-3和n-6长链多不饱和脂肪酸的能力在感染后损害在CFS的病理生理学中是重要的(Puri BK.2007，J Clin Pathol60：122-4)。
因此，近来在颇具声望的期刊中对于CFS的综述指出目前对于该疾病的原因还未知(Hampton T.2006，Jama 296：2915；Hooper M.2007，J ClinPathol 60：466-71；Prins JB，et al.，2006，Lancet 367：346-55)。因此，对于CFS的病原学和发病机制呈现出无一致描述。
目前CFS的治疗
由于缺乏对于准确发病机制的了解以及无已知的因果机制，因此目前对于CFS没有标准的特异性治疗方案。一项系统综述推断CFS应与“生物心理社会模型”相关，强调进行性肌肉康复，组合行为和认知治疗(Maquet etal，2006，Ann Readapt Med Phys 49：337-47，418-27)。
CFS的病因学未知可能是极少进行基于生物学假说评价治疗的研究的原因。
由于大多数证据提示免疫系统失调，可能由于外来刺激所致，因此进行了两项研究评定静脉内使用丙种球蛋白治疗CFS。一项研究是在急性细小病毒B19感染后发生CFS的三个患者中报道的病例，通过静脉内使用免疫球蛋白治疗5天，临床症状改善以及细胞因子失调得以解决(Kerr et al，2003.，Clin Infect Dis 36：e100-6)。在对患有CFS的71名青少年进行的双盲的安慰剂对照的随机研究中，一个月内相隔一段时间输注三次丙种球蛋白，在6个月丙种球蛋白治疗组的功能得以改善，继续进行平均18个月。在实验的头6个月中，安慰剂组和丙种球蛋白治疗组均报道有改善(Rowe 1997，JPsychiatr Res 31：133-47)。
在以摘要形式报道的先导研究中(Lamprecht 2001，Meeting of theAmerican association of chronic fatigue syndrome(AACFS).Seattle)，给予6名CFS患者etanercept(Enbrel，即人肿瘤坏死因子受体p75Fc融合蛋白，其是可溶的竞争性TNF-受体，抑制TNF-介导的细胞应答)，报道临床受益。
在其它治疗策略中，使用valganciclovir治疗长期存在疲劳及对于埃巴病毒或者人疱疹病毒-6具有升高的抗体效价的12名患者，其中9名患者症状改善，然而不确定该作用是由于抗病毒作用还是由于免疫调节作用所致(Kogelnik AM，.2006.，J Clin Virol 37Suppl 1：S33-8)。用具有免疫调节性质的抗生素阿奇霉素治疗，99名CFS患者的59％得以改善(Vermeulen & Scholte2006，J Transl Med 4：34)。
在近来对于CFS的优先研究的综述中(Kerr et al 2007，J Clin Pathol60：113-6)，鼓励进行针对理解该疾病的分子发病机制的新研究，测试有效的分子标记，以及帮助开发特异性治疗方法。许多分子技术可利用，且已经用于此目的，包括使用微阵列进行全局基因表达分析。
RITUXIMAB在B细胞淋巴瘤和自身免疫中作为耗竭B细胞的抗体的实例Rituximab(Mabthera，
Figure BPA00001174934300051
)是针对跨膜分子CD20的胞外部分中的表位的单克隆抗体。该抗体是嵌合人-小鼠抗体，其中抗原结合片段(Fab)部分是小鼠的及Fc-部分是人的。CD20蛋白在B淋巴细胞上表达，但是在干细胞或者成熟的浆细胞上不表达。CD20也在大多数B细胞淋巴瘤上表达。CD20参与调节跨膜钙传导和细胞周期行进，但是确切功能未知(Janas etal 2005，Biochem Soc Symp：165-75)。基于Rituximab与CD20的结合，通过补体与Fc部分的结合激活补体级联以及通过活化抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导免疫细胞杀伤(Glennie et al 2007，MoI Immunol 44：3823-37)。
在Rituximab结合后，分子不内在化或者流出(shed from)浆膜，这使得单克隆抗体保持在细胞表面以扩大免疫攻击。
Rituximab在治疗B细胞淋巴瘤中的作用已经迅速显现，在惰性淋巴瘤中使用Rituximab组合化疗或者单一Rituximab治疗的免疫化疗方法目前是通用的标准治疗，在老年(Coiffier et al 2002，N Engl J Med 346：235-42)和年纪较小患者(Pfreundschuh et al 2006，Lancet Oncol 7：379-91)的大多数一般类型的侵袭性B细胞淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤)中均改善总体生存力，以及在大多数常见的惰性淋巴瘤(滤泡型淋巴瘤)中也如此(Marcus et al 2005，Blood 105：1417-23)。在选择的滤泡型淋巴瘤患者中，Rituximab也用作在诱导治疗之后的维持治疗，在两年内每第三个月输注一次，示出改善的总体生存力(van Oers et al 2006，Blood 108：3295-301)。
近年来，证实Rituximab在自身免疫疾病中也是有效的治疗方法，其中B细胞耗竭通常与临床症状改善相关，例如在类风湿性关节炎中(Dass et al2006，Expert Opin Pharmacother 7：2559-70)。其中Rituximab具有治疗作用的不同自身免疫疾病的列表逐渐增多(Sanz et al 2007，Front Biosci12：2546-67)。对于未来的B细胞靶向和耗竭，重要的是产生特异性B细胞亚系的抗体(Domer & Lipsky 2007，Expert Opin Biol Ther 7：1287-99)。
Rituximab抗体是针对CD20抗原的遗传工程化的嵌合鼠/人单克隆抗体。Rituximab是在美国专利No.5,736,137中被称作“C2B8”的抗体。
Figure BPA00001174934300061
指定用于治疗复发或者难以控制的低度或者滤泡型CD20阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤。体外作用机制研究已经证实结合人补体并且通过补体依赖性细胞毒性(CDC)裂解B淋巴细胞系(Reff et al.Blood83(2)：435-445(1994))。此外，其在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定中具有显著活性。最近揭示了
Figure BPA00001174934300063
在氚标记的胸苷掺入测定中具有抗增殖作用以及直接诱导凋亡，而其它抗CD19和CD20抗体则否(Maloney et alBlood 88(10)：637a(1996))。已经通过实验观测到
Figure BPA00001174934300071
与化疗和毒素之间的协同作用。特别地，
Figure BPA00001174934300072
使得药物抗性人B细胞淋巴瘤细胞系对于阿霉素、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒素的细胞毒性作用敏感(Demidem et al Cancer Chemotherapy&Radiopharmaceuticals 12(3)：177-186(1997))。体内临床前研究表明耗竭猕猴来自外周血、淋巴结和骨髓的B细胞，可能是通过补体和细胞-介导的过程实现(Reff et al.Blood83(2)：435-445(1994))。关于CD20抗体的专利和专利出版物包括美国专利No.5,776,456、5,736,137、5,843,439、6,399,061和6,682,734以及美国专利申请号US 2002/0197255A1、US 2003/0021781A1、US 2003/0082172A1、US 2003/0095963A1、US 2003/0147885A1(Anderson et al)；美国专利No.6,455,043B1和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO00/27428(Grillo-Lopezand White)；WO00/27433(Grillo-Lopez and Leonard)；WO00/44788(Braslawsky et al)；WO01/10462(Rastetter，W)；WO01/10461(Rastetter andWhite)；WO01/10460(White and Grillo-Lopez)；US2001/0018041A1，US2003/0180292A1，WO01/34194(Hanna and Hariharan)；美国专利申请号US2002/0006404和WO02/04021(Hanna and Hariharan)；美国专利申请号US2002/0012665A1和WO01/74388(Hanna，N.)；美国专利申请号US2002/0058029 A1(Hanna，N.)；美国专利申请号US 2003/0103971A1(Hariharan and Hanna)；美国专利申请号US2002/0009444A1和WO01/80884(Grillo-Lopez，A)；WO01/97858(White，C)；美国专利申请号US2002/0128488A1和WO02/34790(Reff，M.)；WO02/060955(Braslawsky eta/.)；WO2/096948(Braslawsky et al.)；WO02/079255(Reff and Davies)；美国专利No.6,171,586B1和WO98/56418(Lam et al)；WO98/58964(Raju，S.)；WO99/22764(Raju，S.)；WO99/51642，美国专利No.6,194,551B1，美国专利No.6,242,195B1，美国专利No.6,528,624B1和美国专利No.6,538,124(Idusogie et al)；WO00/42072(Presta，L.)；WO00/67796(Curd et al.)；WO01/03734(Grillo-Lopez et al.)；美国专利申请号US 2002/0004587A1和WO01/77342(Miller and Presta)；美国专利申请号US2002/0197256(Grewal，L)；美国专利申请号US 2003/0157108A1(Presta，L.)；美国专利No.6,565,827B1、6,090,365B1、6,287,537B1、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminski et al)；美国专利No.5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767、6,652,852B1(Robinson et al)；美国专利No.6,410,391B1(Raubitschek et al)；美国专利No.6,224,866B1和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO01/13945(B arbera-Guillem，E.)；WO00/67795(Goldenberg)；美国专利申请号US2003/0133930A1和WO00/74718(Goldenberg and Hansen)；WO00/76542(Golay et a/.)；WO01/72333(Wolin and Rosenblatt)；美国专利No.6,368,596B1(Ghetie et al)；美国专利No.6,306,393和美国专利申请号US2002/0041847A1，(Goldenberg，D.)；美国专利申请号US2003/0026801A1(Weiner andHartmann)；WO02/102312(Engleman，E.)；美国专利申请No.2003/0068664(Albitar et al)；WO03/002607(Leung，S.)；WO 03/049694、US2002/0009427A1和US 2003/0185796A1(Wolin et al)；WO03/061694(Sing and Siegall)；US2003/0219818A1(Bohen et al)；US 2003/0219433A1和WO 03/068821(Hansen et a/.)；US2003/0219818AI(Bohen et al)；US2002/0136719A1(Shenoyet al)；WO2004/032828(Wahl et al)，所述专利在此援引加入。也见美国专利No.5,849,898和欧洲专利申请no.330,191(Seed et al)；美国专利No.4,861,579和EP332,865A2(Meyer and Weiss)；USP 4,861,579(Meyer et al)；WO95/03770(Bhat et al)；US 2003/0219433A1(Hansen et al)所述。
RITUXIMAB的安全性谱(SAFETY PROFILE)
Rituximab在治疗B细胞淋巴瘤中的安全性谱已熟知且基于370,000名患者的数据库经验(Kavanaugh 2006，J Rheumatol Suppl 77：18-23)。在淋巴瘤治疗中，在第一次输注期间的轻度至中度反应是最常见的副作用，主要由于高初始肿瘤负担的患者中细胞因子释放导致(Solal-Celigny 2006，LeukRes 30Suppl 1：S16-21)。在输注期间也可以见到过敏反应，由于Rituximab分子的蛋白质性质导致。
对于所有B细胞定向治疗的考虑是对于体液免疫性的预期作用。通过长期治疗，特别是维持治疗，即在两年的时间内(在可能每三周输注6-8次Rituximab的诱导治疗之后)每三个月输注一次，更显著耗竭B细胞，大多数患者呈现出低丙种球蛋白血症。然而，低水平的免疫球蛋白和B细胞耗竭似乎对感染的临床危险无主要影响。
使用Rituximab的一种潜在的严重副作用是发生间质性肺病。这是潜在的危及生命的并发症，但是在文献中仅报道16例，非常罕见(Wagner et al2007，Am J Hematol 82：916-9)。
关于Rituximab在慢性自身免疫疾病治疗中的安全问题在临床研究中被研究(Edwards et al 2006，Best Pract Res Clin Rheumatol 20：915-28)，目前跟踪时间较短。因此长期安全性待阐明，特别是当每年给予一或两次Rituximab持续多年的情况。对于自身免疫疾病患者通常输注Rituximab两次(间隔几周)，6-12个月后可重复进行，即明显低于在淋巴瘤患者中的剂量(短期)。
目前能耗竭B细胞的下一代抗CD20抗体被用于临床实验中，推测在几年内将用于临床实践中。例如，目前Glaxo-Smith-Kline的完全人源化抗CD20抗体Ofatumomab在进行B细胞淋巴瘤复发临床实验。推测下一代的完全人源化抗CD-20抗体导致更有效的B细胞耗竭，因此在治疗B细胞淋巴瘤中应比Rituximab更有效。此外，推测其将显示低于Rituximab的部位效应(site effects)。
已经提出治疗慢性疲劳综合征的各种方案。例如在US 2007/025375中提供了一种复合治疗方案用于治疗患有慢性疲劳综合征的患者。所述方案包括给予milna cipran。
鉴于CFS/ME的未知病因学，仍然需要可用于有效治疗CFS的化合物。
发明概述
本发明旨在提供可用于治疗慢性疲劳综合征的新化合物。特别地，本发明人发现B细胞耗竭剂如抗-CD20抗体可用于治疗慢性疲劳综合征。
优选地，所述抗-CD20抗体或者其结合CD-20的抗体片段是单克隆抗体。特别优选地，当给予人对象时，所述单克隆抗体是人源化抗体。本发明还涵盖所述抗体以抗体片段存在，所述片段例如可以通过遗传工程重组产生。
另一方面，本发明涉及治疗慢性疲劳综合征/肌痛性脑脊髓炎的方法，所述方法包括给予患有所述疾病或失调的对象治疗有效量的B细胞耗竭剂例如耗竭B细胞的抗-CD20抗体或者结合CD20的抗体片段。
附图简述
图1示出在不同干预下三个患者在一年时期内CFS症状的发展，所述干预即
Figure BPA00001174934300101
或者Methotrexat(M)。CFS症状的症状得分在0-10范围内，其中0是指无症状，而10是指非常严重的CFS症状。
发明详述
本发明涉及治疗慢性疲劳综合征/肌痛性脑脊髓炎的B细胞耗竭剂或耗竭B细胞的生物学实体，如抗-CD20抗体或者其结合CD20的抗体片段或者化学实体，如具有耗竭B细胞活性的小分子。
在本发明中，术语“慢性疲劳综合征(CFS)”与“肌痛性脑脊髓炎(ME)”同义使用。
如本文所用，术语“B细胞耗竭”或者“B细胞耗竭活性”是指实体如化学或者生物学实体如抗体降低对象循环B细胞水平的能力。B细胞耗竭可以通过例如诱导细胞死亡或者降低增殖而实现。
“CD20”抗原或者“CD20”是在人外周血或者淋巴器官的90％以上的B细胞表面上发现的大约35-kDa的非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上，但是在干细胞上不表达。文献中CD20的其它名称包括“B-淋巴细胞限制抗原”和“Bp35”。例如，CD20抗原在Clark et al.Proc.Natl.Acad.Sd.(USA)82：1766(1985)中描述。术语CD20包括除人之外其它物种的等价分子。近年来已经报道了CD20在T细胞和NK细胞亚系上的低水平表达。
“B细胞”是在骨髓内成熟的淋巴细胞，包括幼稚B细胞、记忆B细胞或者效应B细胞(浆细胞)。
广义而言，本发明不仅涉及抗体或者其片段在治疗CFS中的应用，而且还涉及一般具有B细胞耗竭活性的CD20分子的拮抗剂在治疗CFS中的应用。
在本文可互换使用的“拮抗剂”或者“B细胞耗竭剂”是这样的分子，当其结合B细胞表面标记如B细胞上的CD20时破坏或者耗竭哺乳动物中的B细胞和/或干扰一或多种B细胞功能，例如通过降低或者阻止由B细胞激发的体液应答进行。本发明的拮抗剂或者B细胞耗竭剂能耗竭用其治疗的哺乳动物中的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这种耗竭可以通过各种机制实现，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(例如通过凋亡)。本发明范围内的拮抗剂包括结合B细胞表面标记的抗体，合成或者天然序列肽以及小分子拮抗剂，任选与细胞毒性剂缀合或者融合。优选的拮抗剂是CD20抗体或者结合CD20的抗体片段。此外，优选小分子拮抗剂，如已知的B细胞耗竭剂Methotrexat。
目前除了B细胞之外其它细胞表达CD20抗原如T细胞和NK细胞亚系，这些细胞也被通过CD20起作用的B细胞耗竭剂耗竭。
“诱导凋亡”的拮抗剂是诱导例如B细胞程序化细胞死亡的那些物质，通过标准凋亡测定确定，如annexin V的结合、DNA片段化、细胞皱缩、内质网膨胀、细胞破碎，和/或膜小泡形成(称作凋亡体)。
术语“抗体”在本文以其广义使用，特别包括单克隆抗体、多克隆抗体、至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要其呈现所需的生物学活性即可。
在优选的实施方案中，可用于治疗CFS的抗体是耗竭B细胞的结合CD20的抗体片段。
“结合CD20的抗体片段”包含完整抗体的一部分，其包含完整抗体的抗原结合区域。举例的抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。对于本发明的目的，“完整抗体”是包含重链和轻链可变结构域以及Fc区域的抗体。
“天然抗体”通常是大约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每个轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同的免疫球蛋白同种型的重链之中有所不同。每个重链和轻链也可以具有规则间隔的链内二硫键。每个重链在一个末端具有可变结构域(V11)，随后是多个恒定结构域。每个轻链在一个末端具有可变结构域(V1)，在其另一末端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域排列在一起，轻链可变结构域与重链的可变结构域排列在一起。据信特定的氨基酸残基形成轻链与重链可变结构域之间的界面。
术语“可变”是指在抗体序列中可变结构域的某些部分十分不同，用于每个特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性不是均匀分布于抗体的可变结构域中。其集中于在轻链和重链可变结构域中的称作高变区的三个节段。可变结构域的更高度保守的部分被称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域均包含四个FR，主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，形成环连接的β-折叠结构及在一些情况中形成部分β-折叠结构。每个链中的高变区通过FR与其它链的高变区紧密连接在一起，使得抗体的抗原结合位点形成(见Kabat et ah，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原结合，但呈现出各种效应物功能，如在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
“Fv”是最小抗体片段，其含有完整的抗原识别和抗原结合位点。这个区域由紧密非共价连接的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在这个构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用，限定VH-VL二聚体表面上抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即使一个可变结构域(或者包含仅三个特异于抗原的高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但是比全部结合位点的亲和性低。Fab片段也含有轻链的恒定结构域以及重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段不同，在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本文是Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有至少一个游离硫醇基团。F(ab′)2抗体片段最初作为成对的Fab’片段产生，在其之间具有铰链半胱氨酸。也已知抗体片段的其它化学偶联。基于其恒定结构域的氨基酸序列，任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”均可以被指定为两个明显不同的类型之一，称作kappa(κ)和lambda(λ)。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体可以被指定为不同类别。有五个主要类别的完整抗体：IgA5、IgD、IgE、IgG和IgM，以及一些类别可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。相应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别被称作α、δ、e、γ和μ。本领域熟知不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型。“单链Fv”或者“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一个多肽链中。优选地，Fv多肽进一步包含VH与VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv形成为抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-V1)中与轻链可变结构域(V1)连接的重链可变结构域(V11)。通过使用接头(所述接头很小，不能使在同一链上的两个结构域之间配对)，使所述结构域与另一链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404097、WO 93/11161和Hollinger et al，Proc.Natl.Acad.Sd.USA，90：6444-6448(1993)中更充分描述。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同质抗体的抗体，即该群包含的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了在单克隆抗体产生期间可以产生的可能变体，如通常以少量存在的变体。与典型包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每个单克隆抗体针对抗原上单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势是其不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特性，其得自基本同质的抗体群，且不需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler et al，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组DNA方法产生(见例如美国专利No.4,816,567所述)。“单克隆抗体”也可以分离自噬菌体抗体文库，例如使用Clackson etal，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al，J.MoI Biol，222：581-597(1991)所述技术分离。在本文中，单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或者属于特定抗体类别或者亚类的抗体中相应序列相同或同源，而剩余的链与衍生自另一物种或者属于另一抗体类别或者亚类的抗体中相应序列相同或者同源，以及包括这种抗体的片段，只要其呈现出希望的生物学活性即可(美国专利No.4,816,567；Morrison et al，Proc.Natl.Acad.Sd.USA，81：6851-6855(1984))。感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类动物源化(primatized)”抗体，其包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴，如狒狒、恒河猴或者猕猴)的可变结构域抗原结合序列以及人恒定区序列(美国专利No.5,693,780)。“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。大部分人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基由来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或者非人灵长类动物的高变区的具有希望的特异性、亲和性和能力的残基置换。在一些情况中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或者供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、典型两个可变结构域，其中所有或者基本上所有高变环相应于非人免疫球蛋白的那些，以及所有或者基本上所有FR均是人免疫球蛋白序列的那些，除了上述FR取代之外。人源化抗体任选也包含至少一部分免疫球蛋白典型人免疫球蛋白的恒定区。进一步的详细描述见Jones et al，Nature 321：522-525(1986)；Riechmannet al，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)所述。本文所用术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。所述高变区包含来自“互补决定区”或者“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如轻链可变结构域中残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.MoI.Biol.196：901-917(1987))。“构架”或者“FR”残基是除了本文所述高变区残基之外的那些可变结构域残基。“裸抗体”(在本文定义)是未与异源分子如细胞毒性部分或者放射性标记缀合的抗体。举例的结合CD20抗原的抗体包括：C2B8，其目前被称作Rituximab
Figure BPA00001174934300141
(美国专利No.5,736,137，在此援引加入本文)；钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，称作Y2B8或“IbritumomabTiuxetan”
Figure BPA00001174934300142
(美国专利No.5,736,137，在此援引加入本文)；鼠IgG2a“Bl”，也称作“Tositumomab”，任选用131I标记以产生“131I-Bl”抗体(碘I131tositumomab，BEXXARTM)(美国专利No.5,595,721，在此援引加入本文)；鼠单克隆抗体“1F5”(Press et al.Blood 69(2)：584-591(1987)及其包括“framework patched”或者人源化1F5的变体(WO03/002607，Leung，S.；ATCC保藏HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利No.5,677,180，在此援引加入本文)；人源化2H7；Ofatumumab，针对CD20huMax-CD20上新表位的完全人源化的IgG1(Genmab，Denmark；WO2004/035607)；AME-133(Applied Molecular Evolution)；A20抗体或者其变体如嵌合或者人源化A20抗体(分别为cA20和hA20)(US 2003/0219433，lmmunomedics)；以及可得自International Leukocyte Typing Workshop(Valentine et ah，In：Leukocyte Typing III(McMichael，Ed.，p.440，Oxford University Press(1987))的单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-Cl或者NU-B2。此外，合适的抗体是例如Ocrelizumab，这是得自Biogen Idec/Genentech/Roche的完全人源化抗-CD20抗体；抗体GA101，这是得自Biogen Idec/Genentech/Roche的第三代人源化抗-CD20-抗体。此外，合适的抗体可以是得自Biolex Therapeutics的具有优化糖基化的BLX-301人源化抗CD20或者均是人源化抗-CD20抗体的得自lmmunomedics的Veltuzumab(hA20)或者得自Inexus Biotechnology的DXL625。
此外，推测其它B细胞耗竭剂、特别是抗CD22抗体如Epratuzumab或者抗CD19人源化抗体如MDX-1342可用于治疗CFS。
在本文术语“rituximab”或者
Figure BPA00001174934300151
或者“mabthera”是指针对CD20抗原的遗传工程化的嵌合鼠/人单克隆抗体，在美国专利No.5,736,137(援引加入本文)中称作“C2B8”，包括其保留结合CD20能力的片段。纯粹为了本发明之目的及除非特别指出，“人源化2H7”是指结合人CD20的人源化抗体，或者其抗原结合片段，其中所述抗体在体内有效地耗竭灵长类动物B细胞。
B细胞耗竭剂或者拮抗剂、特别是抗CD20抗体或者其结合CD20的抗体片段的“有效量”是指有效治疗CFS的B细胞耗竭剂或者拮抗剂的量。例如，治疗慢性疲劳综合征/肌痛性脑脊髓炎的抗-CD20抗体的施用量在10mg-5000mg每剂范围内。例如，所述剂量可以在100-1000mg/m2范围内，特别是Rituximab的一次输注为500mg/m2。典型地，氨甲蝶呤的剂量在5mg-30mg每周的范围内。
在一个优选的实施方案中，所述B细胞耗竭剂是化学实体，例如小分子。本领域已知许多B细胞耗竭剂，例如已知的B细胞耗竭剂是BAFF-拮抗剂。此外，已知的B细胞耗竭剂包括BR3的拮抗剂、α-4-整联蛋白的激动剂等。例如，氨甲蝶呤是显示B细胞耗竭活性的叶酸类似物。其它可用的B细胞耗竭剂是针对CD20的小模块免疫药物(SMIP)。例如，具有B细胞耗竭剂作用的SMIP是Trubion Pharmaceuticals的TRU-015或者SBI-087。SMIP也可以是具有强B细胞耗竭活性的比抗体小的单链多肽。
在优选的实施方案中，代表B细胞耗竭剂的生物学实体的抗CD20抗体与代表B细胞耗竭剂的化学实体的氨甲蝶呤的组合用于治疗慢性疲劳综合征或者肌痛性脑脊髓炎。可以同时、单独或者相继施用这些实体。例如，在第一个方案中，给对象施用所述抗体或者氨甲蝶呤；在第二个方案中，给对象施用其它制剂。
包含B细胞耗竭剂、拮抗剂、特别是抗CD20抗体或者其结合CD20的抗体片段的组合物，可以以符合良好医学实践的形式配制、确定剂量和施用。在这方面需要考虑的因素包括待治疗的特定疾病或者失调的阶段、待治疗的特定哺乳动物、各个对象的临床状况、输送所述药剂的部位、施用方法、施用时间安排以及为医学从业人员已知的其它因素。根据这些需考虑的因素决定施用的B细胞耗竭剂如抗体或者抗体片段的有效量。一般而言，经胃肠外施用的每剂拮抗剂的有效量在大约20mg/m2-10,000mg/m2对象机体的范围内，给予一或多剂。举例的完整抗体给药方案包括375mg/m2每周×4；1000mg×2(例如在第1和15天)；或者1g×3。以所述抗体的单个治疗有效剂量给对象施用的抗体为50-2000mg/m2或者施用多个所述抗体或者其结合CD20的抗体片段的治疗有效剂量50-2000mg/m2。然而，如上所述，这些建议的抗体量要进行大量治疗性判断。选择合适剂量和时间安排的关键因素是获得的结果，如上所述。B细胞耗竭剂拮抗剂如抗体通过任何合适方式施用，包括胃肠外、局部、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或病灶内(intralesional)施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或者皮下施用。本发明也涵盖鞘内施用。此外，B细胞耗竭剂拮抗剂如抗体可适当地通过脉冲输注施用，例如使用渐减剂量的拮抗剂。优选通过静脉内注射给予。
本文描述了产生这种耗竭B细胞的拮抗剂的方法。用于产生或者筛选拮抗剂的抗原可以是例如含有希望表位的可溶形式的CD20或者其一部分。或者或另外，在其细胞表面表达CD20的细胞可用于产生或者筛选拮抗剂。可用于产生拮抗剂的其它形式的CD20对于本领域技术人员是明显的。
虽然优选的拮抗剂是抗体，但是本发明也涵盖除抗体之外的拮抗剂。例如，拮抗剂可包含小分子拮抗剂。可以针对CD20筛选小分子文库以鉴别结合抗原的小分子。或者，可以通过已知技术基于其B细胞耗竭活性筛选小分子。可以根据其拮抗性质进一步筛选所述小分子。拮抗剂也可以是通过合理设计或者通过噬菌体展示产生的肽(见例如1998年8月13日公开的WO98/35036所述)。在一个实施方案中，选择的分子可以是基于抗体CDR设计的“CDR模拟物”或者抗体类似物。虽然这种肽可以是自身拮抗的，但是可任选将所述肽与细胞毒性剂融合以添加或者增强所述肽的拮抗性质。下文描述了生产本发明使用的抗体拮抗剂的示例技术。
(i)多克隆抗体
多克隆抗体优选在动物中通过多次皮下(sc)或者腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而产生。可以使用双功能或者衍生化物质使相关抗原与被免疫的物种中免疫原性蛋白质如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或者大豆胰蛋白酶抑制剂缀合，所述双功能或者衍生化物质例如是马来酰亚胺苄磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOC12或者R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基团。
通过组合例如100μg或者5μg蛋白质或者缀合物(分别针对兔或者小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂并且在多个部位皮内注射所述溶液，针对所述抗原、免疫缀合物或者衍生物对动物进行免疫接种。一个月后，通过在多个部位皮下注射在完全佐剂中的1/5-1/10原始量的肽或者缀合物对动物进行加强免疫。7-14天之后，取该动物血样，测定血清抗体效价。对动物进行加强免疫直至效价平稳期。优选地，使用与不同蛋白质和/或通过不同交联剂缀合的相同抗原的缀合物对动物进行加强免疫。缀合物也可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合体产生。也可以适当地使用聚集剂如明矾以增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体得自一群基本同质的抗体，即除了在单克隆抗体产生期间产生的可能变体之外，该群的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，这种变体通常以少量存在。因此，修饰语“单克隆”是指抗体的特性，其不是分立的或者多克隆抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以通过使用最初由Kohler et al，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法产生，或者通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)产生。
使用常规方法可易于分离和测序编码单克隆抗体的DNA(例如通过使用能特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。分离后，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染宿主细胞如不另外产生免疫球蛋白的大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者骨髓瘤细胞以在该重组宿主细胞中合成单克隆抗体。对于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra et ah，Curr.Opinion in Immuno1.，5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。在另一个实施方案中，抗体或者抗体片段可以分离自使用在McCafferty et ah，Nature，348：552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库。Clackson et al，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al，J.MoI.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(chain shuffling)方法产生高亲和性(nM范围)人抗体(Marks et ah，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouseet al，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，可以选择这些技术代替传统的单克隆抗体杂交瘤技术以分离单克隆抗体。DNA也可以被修饰，例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison，et ah，Proc.Natl Acad.ScL USA，81：6851(1984))，或者通过将非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或部分与免疫球蛋白编码序列共价结合。典型地，这种非免疫球蛋白多肽由抗体的恒定结构域取代，或者由抗体的一个抗原组合位点的可变结构域取代，产生嵌合二价抗体，其包含对于抗原具有特异性的一个抗原组合位点以及对于不同抗原具有特异性的另一个抗原组合位点。
(iii)人源化抗体
本领域已经描述了人源化非人抗体的方法。优选地，人源化抗体具有导入其中的来自非人来源的一或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称作“输入(import)”残基，其典型来自“输入”可变结构域。人源化可以基本根据Winter及其同事(Jones et al，Nature，321：522-525(1986)、Riechmann et al，Nature，332：323-327(1988)、Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988))所述方法进行，用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中完整人可变结构域的很少一部分由非人物种的相应序列取代，实践中，人源化抗体典型是人抗体，其中一些高变区残基以及可能一些FR残基由啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。用于产生人源化抗体的人可变结构域轻链和重链的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“best-fit”方法，针对已知人可变结构域序列的完整文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后将与啮齿动物最密切的人序列作为人源化抗体的人构架区(FR)(Sims etal，J.Immunol，151：2296(1993)；Chothia et al，J.MoI.Biol，196：901(1987))。另一方法使用衍生自轻链或重链可变区的特定亚群的所有人抗体的共有序列的特定构架区。相同构架可用于一些不同的人源化抗体(Carter et al，Proc.Natl Acad.ScL USA，89：4285(1992)；Presta et al，J.Immunol，151：2623(1993))。重要的是被人源化的抗体保持对于抗原的高亲和性及其它有利的生物学性质。为了实现这个目标，根据优选的方法，通过使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列及各种概念上的人源化产物的方法制备人源化抗体。可通常利用三维免疫球蛋白模型，该模型为本领域技术人员所熟知。可以利用计算机程序，其示出并展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。测试这些表现使得可以分析所述残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方法，可以选择和组合来自受体的FR残基和输入序列，由此获得希望的抗体特性，如增加的与靶抗原的亲和性。一般高变区残基直接且最主要参与影响抗原结合。
(iv)人抗体
代替人源化，可以产生人抗体。例如，可以产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫基础上能产生人抗体的所有组成部分，不存在内源免疫球蛋白产生。例如，已经描述了在嵌合和种系(germ-line)突变小鼠中抗体重链结合区(J11)基因的纯合缺失导致完全抑制内源抗体产生。这种种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移导致在抗原攻击时产生人抗体。见例如Jakobovits et al，Proc.Natl.Acad.ScL USA，90：2551(1993)；Jakobovits et al，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann et al，Year in Immuno.，7：33(1993)；和美国专利Nos.5,591,669、5,589,369和5,545,807所述。或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组成部分中产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V结构域符合读框地克隆进丝状噬菌体如Ml3或者fd的主要或者次要外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性质加以选择也导致可以选择编码呈现这些性质的抗体的基因。因此，所述噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以各种形式进行，综述见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3：564-571(1993)所述。V基因节段的一些来源可用于噬菌体展示。Clackson et al，Nature，352：624-628(1991)从衍生自免疫的小鼠脾的V基因的小的随机组合文库中分离不同的抗噁唑酮抗体阵列。基本根据Marks et al.，J.MoI.Biol.222：581-597(1991)或者Griffith et al，EMBOJ.12：725-734(1993)所述技术可以从未免疫的人供体中构建V基因的所有组成部分以及可以分离不同抗原阵列(包括自体抗原)的抗体。也见例如美国专利Nos.5,565,332和5,573,905所述。人抗体也可以通过体外激活的B细胞产生(见美国专利5,567,610和5,229,275所述)。
(v)抗体片段
已经开发了许多技术用以产生抗体片段。传统地，这些片段是通过对完整抗体进行蛋白酶解而衍生的(见例如Morimoto et al，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan et al，Science，229：81(1985)所述)。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，抗体片段可以分离自上述抗体噬菌体文库。或者，Fab′-SH片段可以直接从大肠杆菌回收以及化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter et al，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一方法，F(ab′)2片段可以直接分离自重组宿主细胞培养物。本领域技术人员熟知产生抗体片段的其它技术。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO 93/16185、美国专利No.5,571，894和美国专利No.5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如美国专利5,641,870所述。这种线性抗体片段可以是单特异性或者双特异性的。
药物配制物
以冻干配制物或者水溶液形式制备本发明中使用的B细胞耗竭剂如抗体或者其它拮抗剂的治疗性配制物并贮存，通过将具有希望纯度的抗体或者其片段与任选药物可接受载体、赋形剂或者稳定剂混合制备(Remington′sPharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))。可接受载体、赋形剂或者稳定剂在所用剂量和浓度对于受体无毒性，包括缓冲液如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及其它有机酸缓冲液；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯如甲基或者丙基对羟苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及m-甲酚)；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或者免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯比咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或者赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或者糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或者山梨醇；形成盐的平衡离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或者聚乙二醇(PEG)。
举例的抗-CD20抗体配制物在WO98/56418中描述，所述文献援引加入本文。这个出版物描述了液体多剂量配制物，包含40mg/mL rituximab、25mM乙酸盐、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、0.02％聚山梨醇酯20，pH 5.0，在2-8℃最小保质期为两年。另一感兴趣的抗-CD20配制物包含10mg/mLrituximab于9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和无菌注射用水中，pH 6.5。适合皮下施用的冻干配制物在美国专利No.6,267,958(Andya et al)中描述。这种冻干的配制物可以用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度，所述重建配制物可以皮下施用给待治疗的哺乳动物。本发明也涵盖晶体形式的抗体或者拮抗剂。见例如US2002/0136719A1所述。
也可以在胶体药物输送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液(microemulsions)、纳米颗粒和纳米胶囊)或者粗乳液(macroemulsions)中将活性成分包含于例如通过凝聚技术或者通过界面聚合制备的微囊中，例如分别为羟甲基纤维素或者凝胶-微囊和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊。这种技术在Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中揭示。可以制备持续释放制备物。合适的持续释放制备物的例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质是成形物品形式，例如膜或者微囊。举例的持续释放基质包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或者聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)，L-谷氨酸与？乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。用于在体内施用的配制物必须是无菌的。这可以通过灭菌滤膜过滤实现。
实施例
在Department of Oncology and Medical Physics，Haukeland UniversityHospital，一名具有稳定CFS(在埃巴病毒感染后于1997年初次显现)的43岁女性患者在细胞毒性化疗后观测到症状显著改善。她在2003年出现霍奇金病，使用化疗和放疗方法治疗。她在2004年复发淋巴瘤，使用化疗方法治疗。与预期相反(CFS患者通常耐受所有类型药物以及应激不佳)，该患者在这次化疗期间和之后CFS症状明显减轻。所述改变未被解释为与淋巴瘤活性相关，在化疗开始后作用持续大约5个月，然后CFS样症状逐步复发。除了细胞毒性作用之外，化疗药物也具有免疫调节作用。推测对CFS症状的作用主要通过在化疗期间施用的药物氨甲蝶呤介导。
当试图理解这个患者在癌症化疗期间和之后的经历而回顾关于CFS的文献时，结论是免疫系统的修饰似乎是患者经历明显但短暂的症状改善的最可能解释。在CFS患者中见到的长期B细胞激活对于所述症状以及报道的生理学改变是重要的，所述生理学改变例如中枢神经血液循环改变，以及脑组织、脊神经根或者心肌中淋巴细胞侵润的报道。
B细胞耗竭的可能的作用模式可以在几个部位，如与T细胞系统相互作用，因此修饰炎症过程，以及在免疫稳态中影响重要的多效性参与者(pleiotropic players)如血管活性神经肽的水平。这些在中枢神经系统中具有广泛活性。
综合现有资料与在免疫调节性细胞毒性治疗之后CFS患者的疲劳和疼痛得以未曾预料的改善，推测B细胞耗竭在概念上可以治疗CFS。
目前实现B细胞耗竭最容易的方法是使用单克隆抗-CD20抗体Rituximab。然而，推测新一代抗-CD20抗体由于推测实现更有效的B细胞耗竭而对于CFS症状也具有至少类似作用。
先导(pilot)患者1：
作为第一个先导患者，在告知有关方法的实验性质和风险之后，上文提及的妇女接受一次Rituximab 500mg/m2输注。在治疗前，她具有伴有明显疲劳的稳定CFS，不能离家工作或者做家务。她使用电动轮椅在室外活动。在输注之后5-6周之间开始，她经历明显的症状改善，疲劳明显减轻、肌痛明显减轻、皮肤灼痛减轻以及头痛减轻，伴随阿片类镇痛药物的需要量逐渐减少。由于疲劳减轻，她可以长距离步行，重新开始其爱好且能做家务及照顾孩子。她还报道认知功能显著改善，保持集中注意力的能力，且再次能阅读以及例如使用计算机工作。第一次输注Rituximab之后的作用持续直至14周，然后逐渐消退，但是CFS症状未完全复发。
在第一次输注Rituximab之后5个月，她再次出现稳定及失去工作能力的CFS症状。她接受新一次相同剂量的Rituximab输注。6周后，她再次经历所有CFS症状(疲劳、疼痛、认知症状)逐步消退及大部分痊愈，对于生活质量具有较大作用。在第二次输注后(也是输注一次低剂量500mg/m2)，治疗作用持续直至16周，然后出现症状缓慢和逐步恶化。
然后决定从第二次输注Rituximab之后，从18周开始每周口服低剂量氨甲蝶呤，开始时每周7.5mg，在接下来两个月期间增加剂量至每周12.5mg。从每周氨甲蝶呤之后12周开始，她再次经历逐步和中等程度CFS症状痊愈。她现在使用氨甲蝶呤22周，症状中等至显著改善，但是目前不如在Rituximab治疗后明显和快速。然而她仍经历其状况逐步改善。CFS症状的发展在图1示出。
先导患者2：
他是42岁男性，在8年前感染埃巴病毒之后发生CFS。自从感染病毒后他具有明显的疲劳及不能做任何工作。大多数时间被迫坐在椅子中。在轻度运动后，即出现疲惫、肌痛和头痛增强等显著问题。他也具有发热感觉、出汗和腹泻。他具有严重的认知障碍。尽管先前是电脑工程师，但是现在他不能使用计算机或者连续阅读1-2页书籍。
给予他输注一次Rituximab 500mg/m2。第一个改善的症状(在输注3周后)是长期腹泻。从输注后6周开始，他经历疲劳、疼痛、认知和自主功能症状显著改善。然后他能进行手工劳动以及享受计算机游戏和阅读的乐趣。在相对低剂量(一次输注1000mg)之后，作用直至12周最明显，之后逐步降低。他和家人描述临床症状显著改善，对全家的生活质量具有显著影响。
在第一次输注Rituximab之后5个月，间隔两周输注两次1000mg的Rituximab进行再次治疗。与在第一次治疗之后一样，他首先痊愈的是腹泻(3周后)。然后在6周后，认知症状减轻，之后几天疲劳症状开始改善。
输注两次Rituximab在输注后16周明显的CFS症状改善最显著。之后，他经历非常缓慢和逐步的症状加重。然而，在输注5个月后，他仍具有临床反应(仍好于治疗前)(图1)。目前他开始每周口服低剂量氨甲蝶呤进行治疗。
先导患者3：
她是22岁学生，7年前在单核细胞增多症之后出现CFS。最初她出现全部临床症状，明显疲劳、疼痛包括头痛、认知障碍以及自主症状。然而在后四年期间，她经历一些症状改善，但是仍出现明显疲劳，嗜睡以及腹泻。她具有中等认知障碍和中等肌痛。
给予她输注一次500mg/m2的Rituximab。这个患者在输注后3周也经历腹泻症状改善。输注6周后，她注意到肌痛有一些改善。在前5个月，她还具有疲劳症状略微改善，但是较其它患者短暂及持续时间短。
然而，在输注6个月之后，她经历所有CFS症状的明显临床反应，直至在最后7年中未经历的高水平功能性。她开始全天学习，可以无困难阅读，以及其短期记忆明显改善。这种显著的改善持续4个半月。随后几周她经历CFS症状逐步复发。目前她接受新的Rituximab输射(间隔两周输注两次500mg/m2)。
氨甲蝶呤(Methotrexat，Mtx)是具有已知(但未充分了解的)免疫调节性质的治疗剂。对于类风湿性关节炎的治疗方案是每周口服一次，药物作用之一是中等B细胞耗竭，机制与Rituximab作用相似但不如其明显(Edwards etal.NEJM，2004.Efficacy of B-CeII Targeting Therapy with Rituximab inPatients with Rheumatoid Arthritis)。对于三个先导患者之一(患者1)，每周用氨甲蝶呤治疗一次，持续22周，从最初Mtx治疗之后10周开始，CFS症状也具有显著和中等的临床反应。
总而言之，观测到在三个先导患者中在Rituximab治疗之后三个均出现明显临床反应，其中两个患者在第二次Rituximab治疗后也出现重复的临床反应。
第三个患者在输注Rituximab之后6周CFS症状有限改善。然而，从输注后第6至10个半月，她具有所有CFS相关症状的显著临床反应，持续至今(输注后10个半月)。然后她的症状逐步复发，现在她接受新的Rituximab治疗(在第一次Rituximab治疗之后在第47和49周进行两次输注)。
对这三个患者的所有五次治疗均导致显著至中等程度的主要症状改善。对于这三个患者，症状改善的动力学非常相似，但是在第三个患者中额外具有较晚和长期反应，如图1所示。间隔时间与已知的可以由B淋巴细胞产生的某些蛋白质的降解和半衰期一致。在Rituximab治疗后症状的再现与在CD20抗原指导的B细胞裂解之后前浆细胞B-淋巴细胞从干细胞成熟一致，这是通过补体指导的细胞毒性(CDC)及通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的。这些不成熟的B细胞示出能产生蛋白质，在其中能产生抗体。

Claims (13)

1.B细胞耗竭剂，用于治疗慢性疲劳综合征和肌痛性脑脊髓炎。
2.权利要求1的B细胞耗竭剂，其是耗竭B细胞的抗-CD20抗体或者其结合CD-20的抗体片段。
3.权利要求2的耗竭B细胞的抗-CD20抗体或者结合CD20的抗体片段，其是单克隆抗体或者其结合CD20的抗体片段。
4.权利要求2的B细胞耗竭剂，其是人源化抗-CD20抗体或者其结合CD20的抗体片段。
5.权利要求2的B细胞耗竭剂，其是结合CD20的耗竭B细胞的CD20抗体片段，优选选自由F(ab′)2、F(ab′)、Fab、Fv和sFv组成的组中的抗原结合片段。
6.前述权利要求任一项的B细胞耗竭剂，其选自人源化抗体Rituximab.Ofatumumab、Ocrelizumab、GA101、BCX-301、Veltuzumab或者DXL 625。
7.权利要求1的B细胞耗竭剂，其是Methotrexat TRU-015或者SBI-087。
8.用于治疗慢性疲劳综合征/肌痛性脑脊髓炎的权利要求1-6任一项的B细胞耗竭剂，其中耗竭B细胞的抗CD20抗体的量在10mg-5000mg每剂的范围内。
9.权利要求1-6任一项的B细胞耗竭剂，其中所述B细胞耗竭剂是耗竭B细胞的抗CD20抗体或者其结合CD20的抗体片段，用于给对象施用所述抗体的单个治疗有效量50-2000mg/m2或者施用多个所述抗CD20抗体或者其结合抗CD20的抗体片段的治疗有效量50-2000mg/m2。
10.治疗慢性疲劳综合征和肌痛性脑脊髓炎的方法，包括给患有此疾病的对象施用权利要求1-9任一项定义的B细胞耗竭剂的步骤。
11.治疗慢性疲劳综合征和肌痛性脑脊髓炎的方法，包括在两周内两次施用一或两次输注权利要求1-9任一项定义的B细胞耗竭剂的步骤。
12.权利要求10或11的治疗慢性疲劳综合征和肌痛性脑脊髓炎的方法，其中同时、单独或者相继给患有慢性疲劳综合征或者肌痛性脑脊髓炎的对象施用耗竭B细胞的抗CD20抗体或者其结合CD20的抗体片段与Methotrexat的组合。
13.权利要求1-9任一项的B细胞耗竭剂在治疗慢性疲劳综合征或者肌痛性脑脊髓炎中的应用。
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