CN101899497B - 一种鉴定目标核酸的方法 - Google Patents
一种鉴定目标核酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101899497B CN101899497B CN2009100521262A CN200910052126A CN101899497B CN 101899497 B CN101899497 B CN 101899497B CN 2009100521262 A CN2009100521262 A CN 2009100521262A CN 200910052126 A CN200910052126 A CN 200910052126A CN 101899497 B CN101899497 B CN 101899497B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- antibody
- double
- crossbred
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种鉴定目标核酸的方法，所述方法包括：(a)将待测的核酸样本解链处理，得到单链核酸样本；(b)将特异性识别目标核酸的探针与步骤(a)获得的单链核酸样本杂交，其中，当目标核酸是DNA时，所述探针是RNA；当目标核酸是RNA时，所述探针是DNA；得到双链杂交体样本；(c)将步骤(b)获得的双链杂交体捕获到固相载体上，测定被捕获的杂交体。本发明的方法操作步骤简单，测定结果稳定可靠，且灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及鉴定目标核酸的方法及试剂盒。
背景技术
ELISA方法是抗体应用技术中最常见的方法之一(BS Dunbar&SM Skinner(1985)“Preparation of monoclonal antibodies”.In：“Methods in Enzymology Vol.182，Guide to Protein Purification”.Ed.MP Deutscher，pp.670-679，AcademicPress；D Catty & C Raykundalia(1989)“ELISA and related enzymeimmunoassays”.In：“Antibodies：A practical approach.vol.2”Ed.D Catty，pp.97-154.IRL Press)。这些方法中，Sandwich ELISA是ELISA方法的一种变形，即第一种抗体首先包被于固定相上，清洗后，抗原(通常是蛋白质)结合于第一种抗体，再清洗后，第二种抗体结合于抗原上，其操作流程通常如图1所示。第二种抗体可以偶联有酶进行酶活性检测(图1虚线途径)，或者用抗第二种抗体的第三抗体与酶的偶联物进行检测酶活性(图1实线途径)。
现有技术中，用ELISA的方法研究蛋白质的技术已非常成熟。过去数十年来，ELISA的方法无实质性变化(GC Howard & DR Bethell(eds.)(2002)“Basicmethods in antibody production and characterization.”CRC Press；CF BarbasIII，DR Burton，JK Scott & GJ Silverman(eds.)(2001)“Phage Display：ALaboratory Manual.”Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
一种抗体与其蛋白质抗原相对应的抗原决定簇(epitope)相结合。本领域人员均了解，一种抗体只能与一个抗原决定簇位点相结合。一般情况下，常规抗原-抗体的结合检测(如Sandwich ELISA)很难将抗原先与抗体结合后再进行捕获测定而获得好的结果，特别是在应用多克隆抗体的情况下。因此，通常本领域人员都是将抗原先用一种抗体捕获后，洗涤后再用另一种抗体进行检测，两个抗体结合步骤分开进行。
作为抗原，DNA-RNA核酸双链杂交体是一种与蛋白质抗原存在显著差别的物质。现有技术中，均采用了类似ELISA方法捕获和检测DNA-RNA双链杂交体，这些方法的步骤基本上与世界专利PCT号WO93/10263所公布说明的杂交捕获法相一致，没有任何已发表的关于对其进行简化或优化操作的文献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定目标核酸的方法。
本发明的另一目的在于提供鉴定目标核酸的试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种鉴定目标核酸的方法，所述方法依次包括：
(a)将待测的核酸样本解链处理，得到单链核酸样本；
(b)将特异性识别目标核酸的探针与步骤(a)获得的单链核酸样本杂交，其中，当目标核酸是DNA时，所述探针是RNA；当目标核酸是RNA时，所述探针是DNA；得到双链杂交体样本；
(c)将步骤(b)获得的双链杂交体捕获到固相载体上，测定被捕获的杂交体；从而得知目标核酸的存在与否或存在量。
在一个优选例中，将双链杂交体捕获到固相载体上与测定被捕获的杂交体同步进行，也即所述的双链杂交体捕获到固相载体上与测定被捕获的杂交体两个步骤之间不经过洗涤步骤。
在另一优选例中，所述的目标核酸是DNA。
在另一优选例中，所述的目标核酸长度是200-50000bp，优选500-30000bp；所述的探针长度是200-50000bp，优选500-30000bp。
在另一优选例中，步骤(c)中，将双链杂交体捕获到固相载体上包括：将双链杂交体样本、检测抗体加样(优选同时加样)到包被有包被抗体的固相载体上，在固相载体上形成包被抗体-双链杂交体-检测抗体三元复合物；其中，所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号；所述的包被抗体是抗所述双链杂交体的抗体。
在另一优选例中，所述的包被抗体与所述的检测抗体基于相同的抗体或不同的抗体(即检测抗体在不携带可检测信号的情况下可以是与包被抗体相同的或不同的)。优选的，所述的包被抗体与所述的检测抗体基于不同的抗体。
在另一优选例中，所述的可检测信号选自：碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。
在另一优选例中，测定被捕获的杂交体包括：加入识别所述可检测信号的底物，测定底物的显色情况。
在另一优选例中，采用化学发光法测定底物的显色情况。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述的探针上携带标记物；步骤(c)中，所述的固相载体上包被有特异性结合所述标记物的结合物。
在另一优选例中，所述的标记物是生物素，所述的结合物是亲和素；或所述的标记物是他克莫司(FK506)，所述的结合物是他克莫司结合蛋白(FKBP，FK506结合蛋白)。
在另一优选例中，步骤(c)中，将双链杂交体捕获到固相载体上包括：将双链杂交体样本、检测抗体加样(优选同时加样)到包被有结合物的固相载体上，在固相载体上形成结合物-标记物-双链杂交体-检测抗体四元复合物；所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号。
在另一优选例中，所述的可检测信号选自：碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。
在另一优选例中，测定被捕获的杂交体包括：加入识别所述可检测信号的底物，测定底物的显色情况。
在本发明的第二方面，提供一种鉴定目标核酸的检测试剂盒，所述试剂盒含有：
(1)特异性识别目标核酸的探针，所述的探针能够与目标核酸结合形成双链杂交体；其中，当目标核酸是DNA时，所述探针是RNA；当目标核酸是RNA时，所述探针是DNA；
(2)检测抗体，所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号；和
(3)包被有包被抗体的固相载体，所述的包被抗体是抗所述双链杂交体的抗体。
在本发明的第三方面，提供一种鉴定目标核酸的检测试剂盒，所述试剂盒含有：
(1)特异性识别目标核酸的探针，所述的探针能够与目标核酸结合形成双链杂交体；其中，当目标核酸是DNA时，所述探针是RNA；当目标核酸是RNA时，所述探针是DNA；并且，所述的探针上携带标记物；
(2)检测抗体，所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号；和
(3)固相载体，其包被有特异性结合所述标记物的结合物。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有：
(4)核酸解链试剂(如碱处理试剂)；
(5)洗涤试剂；
(6)识别所述可检测信号的底物；或
(7)显色剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了现有技术中经典的Sandwich ELISA方法的操作流程。
图2显示了本发明实施例中一种快速测定单一目标核酸序列的方法的操作流程。
图3显示了PCT公开号为WO93/10263说明了杂交捕获法测定一种目标核酸序列(HPV为例)的方法。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，发现在分子动力学意义上，由DNA与RNA互补形成的双链杂交体与检测抗体在溶液中比双链杂交体在被捕获到固相载体后相比较更容易结合。在此基础上开发了一种快速测定待测样本中目标核酸的方法，该方法操作步骤简单，测定结果稳定可靠，且灵敏度高(信/噪比高)。
术语
如本文所用，“核酸”或“核酸序列”指聚合形式的任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)单链、双链的DNA或RNA，基因组DNA和cDNA。
如本文所用，“待测样本”或“待测核酸样本”是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。
如本文所用，“目标核酸”是指感兴趣的核酸，例如其是一种标志物或是疾病相关的。
如本文所用，“双链杂交体(双链杂合体)”是指一种核酸，其含有两条链，其中一条链是DNA链，另一条链是RNA链，所述的DNA链和RNA链的核苷酸序列是基本上互补的。“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，形成双链。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。
如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸(包括DNA或RNA，优选RNA)，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物或不携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。
如本文所用，“包被抗体”是指包被在固相载体上的，特异性地识别和结合所述的双链杂交体的抗体，其不结合单链的核酸(包括DNA或RNA等)。所述的“包被抗体”通过识别双链杂交体的双螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特异性的。将抗体包被在固相载体上是本领域技术人员熟知的技术。
如本文所用，“检测抗体”、“酶偶联抗体”是指特异性地识别和结合所述的双链杂交体的抗体，其不结合单链的核酸(包括DNA或RNA等)。所述的“检测抗体”通过识别双链杂交体的双螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特异性的。所述的“检测抗体”携带有可检测信号，用于报告双链杂交体的捕获情况。
测定方法
本发明提供了一种鉴定目标核酸的方法，所述方法包括：
(a)将待测的核酸样本解链处理，得到单链核酸样本；
(b)将特异性识别目标核酸的探针与步骤(a)获得的单链核酸样本杂交，其中，当目标核酸是DNA时，所述探针是RNA；当目标核酸是RNA时，所述探针是DNA；得到双链杂交体样本；
(c)将步骤(b)获得的双链杂交体捕获到固相载体上，测定被捕获的杂交体；从而得知目标核酸的存在与否或存在量。
尽管本发明所述方法基于的基本原理是ELISA原理，但是本发明人设计的方法中，捕获的对象是特殊的，即由DNA与RNA互补形成的双链杂交体，而非常规的蛋白质。根据该双链杂交体的特殊性质，本发明人简化了ELISA的步骤，使得双链杂交体的捕获与测定被捕获的双链杂交体的过程能够同步进行，省去了中间的去除未杂交探针、洗涤的步骤，从而有效地缩短了操作时间。更为重要的是，还提高了检测的灵敏度(信/噪比)。
所述的目标核酸的种类没有特别的限制，通常是DNA或RNA。当目标核酸是DNA时，其在待测核酸样本中一般以双链形式存在，这就需要首先对其进行解链处理；当目标核酸是RNA时，其在待测核酸样本中一般以单链或双链形式存在，当其为单链时可省略解链处理的步骤，当其为双链时则也需要进行解链处理。使双链核酸解链形成单链的技术是本领域技术人员所已知的，较为常用的例如是碱处理(如采用含有NaOH的溶液)含双链核酸的样本，此外高温变性也可以形成单链，本领域技术人员通常知道如何选用合适的解链处理方法。
所述的探针的选择或设计通常根据所需要鉴定的目标核酸而定，使得其可以与“目标核酸”形成双链杂交体。所述的探针的长度也根据目标核酸的长度而定，例如其长度为200-50000bp，优选地为500-30000bp。
作为本发明的优选方式，所述的目标核酸是DNA，所述的探针是RNA。
所述的待测核酸样本可以是任何种类的样本，只要其中可能存在目标核酸。所述待测核酸样本可直接获自人体，或哺乳动物动物体，或其它生物体(如细菌)。当估计待测核酸样本中目标核酸的含量较低时，也可以事先对目标核酸进行扩增，再进行本发明的方法的鉴定或检测。对目标核酸进行扩增的方法是本领域技术人员所熟知的，如通过聚合酶链反应(PCR)。
作为本发明的优选方式，步骤(c)中，将双链杂交体捕获到固相载体上包括：将双链杂交体样本、检测抗体加样到包被有包被抗体的固相载体上，在固相载体上形成包被抗体-双链杂交体-检测抗体三元复合物；其中，所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号；所述的包被抗体是抗所述双链杂交体的抗体。
所述的包被抗体与所述的检测抗体可以基于相同的抗体或不同的抗体，即检测抗体在不携带可检测信号的情况下可以是与包被抗体相同的或不同的。以双链杂交体作为抗原与以蛋白质作为抗原不同，抗DNA-RNA双链杂交体所产生的抗体无特定的序列或抗原决定簇的要求，其特异性识别双链杂交体所特有的双螺旋结构。抗DNA-RNA抗体(无论是单克隆或多克隆抗体)能与任何DNA-RNA双链杂交体相结合。优选的，所述的包被抗体与所述的检测抗体基于不同的抗体，例如，所述的包被抗体是一种抗所述双链杂交体的多克隆抗体，而所述的检测抗体是一种抗所述双链杂交体的单克隆抗体。利用特定的双链杂交体来制备抗所述双链杂交体的抗体的方法是本领域已知的技术，例如可以按照Kitagawa&Stollar的方法(Kitagawa Y，Stollar BD，Mol Immunol 1982，19：413-420)来制备多克隆抗体；或可以按照Fliss等的方法(Fliss I，Laurent M，Emond E，et al.，Appl Environ Microbiol，1993，59(8)：2698-2705)来制备单克隆抗体。
本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与包被抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板(如96孔板)、或微球。将抗体包被到固相载体上的技术也是本领域技术人员所熟知的。
所述的可检测信号是连接或偶联于检测抗体上的、用于报告检测抗体的结合情况的报告分子。优选的，所述的可检测信号选自：碱性磷酸酶(AP)，辣根过氧化物酶(HRP)，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。这些可检测信号具有特定的底物，在与底物接触后可以发生显色反应或其它可被检测到或可见的反应，从而报告检测抗体的结合情况。所述的底物比如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)、CDP-Star；等等。
作为本发明的另一种优选方式，所述的探针上携带标记物；与之相对应地，所述的固相载体上包被有特异性结合所述标记物的结合物。将标记物标记到核酸样品上的方法可以选择直接氧化法，逆转录法或PCR法，这些方法的具体操作过程是本领域已知的技术。所述的标记物例如可选自：生物素或其类似物(如生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素)、或FK506；所述的结合物例如选自亲和素或其类似物(如卵白亲和素、链亲和素)、或FKBP(FK506结合蛋白)。优选的，所述的标记物是生物素，所述的结合物是亲和素，亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，它们之间的反应呈高度专一性。
所述的标记物与结合物特异性结合，从而可将双链杂交体捕获到固相载体上。因此，步骤(c)中，将双链杂交体捕获到固相载体上包括：将双链杂交体样本、检测抗体加样到包被有结合物的固相载体上，在固相载体上形成结合物-标记物-双链杂交体-检测抗体四元复合物；所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号。
试剂盒
本发明还提供一种鉴定目标核酸的检测试剂盒，所述试剂盒含有：
(1)特异性识别目标核酸的探针，所述的探针能够与目标核酸结合形成双链杂交体；其中，当目标核酸是DNA时，所述探针是RNA；当目标核酸是RNA时，所述探针是DNA；
(2)检测抗体，所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号；和
(3)包被有包被抗体的固相载体，所述的包被抗体是抗所述双链杂交体的抗体。
作为本发明的另一种优选方式，还提供一种鉴定目标核酸的检测试剂盒，所述试剂盒含有：
(1)特异性识别目标核酸的探针，所述的探针能够与目标核酸结合形成双链杂交体；其中，当目标核酸是DNA时，所述探针是RNA；当目标核酸是RNA时，所述探针是DNA；并且，所述的探针上携带标记物；
(2)检测抗体，所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号；和
(3)包被有结合所述标记物的结合物的固相载体。
为了便于操作，所述的试剂盒中还可含有进行解链处理、洗涤、显色等操作所需要的试剂。所述的试剂包括但不限于：核酸解链试剂(如碱处理试剂)、洗涤试剂、识别所述可检测信号的底物或显色剂。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。
本发明的主要优点在于：
本发明人发现，在分子动力学意义上，由DNA与RNA互补形成的双链杂交体与检测抗体在溶液中比双链杂交体在被捕获到固相载体后相比较更容易结合。基于此开发了一种快速测定待测样本中目标核酸的方法，该方法操作步骤简单，测定结果稳定可靠，且灵敏度高(信/噪比高)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南/第二版(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、载体构建和RNA制备
HPV(人乳头状瘤病毒)高危型亚型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型。这些亚型的基因组DNA已录入GenBank数据库。HPV16亚型、HPV18亚型和HPV66亚型的基因组DNA的登录号分别为：NC_001526、NC_001357和U31794。根据GenBank所记载的这3个亚型的基因组DNA序列，本发明人应用常规方法合成了这些DNA(即分别是GenBank登录号NC_001526、NC_001357和U31794所示序列中的第101碱基至第7600碱基)，并在它们的5’端分别加上Nhe I位点序列(GCTAGC)和3’端分别加上Not I位点序列(GCGGCCGC)。合成后的3个亚型的基因组DNA序列分别克隆到修饰过(见下面)的pUC19载体(购自NEB公司)。
pUC 19载体的修饰如下。首先合成下列DNA序列片断：
Kpn I T7启动子 Nhe I Not I Xba I
GAGGGTACC TAATACGACTCACTATAG GGCTAGC AAA GCGGCCGC TCTAGAGAC
上述DNA序列片断克隆到pUC19载体的Kpn I和Xba I位点而得到修饰后的pUC19载体。
上述合成的HPV16，HPV18和HPV66的序列分别克隆到修饰后的pUC19载体Nhe I/Not I位点中。在这些序列的上游端连接有T7启动子的序列。构建后的载体分别命名为：pUC-HPV16、pUC-HPV18和pUC-HPV66。以这些构建后的载体作为模板(模板DNA)，经Not I酶切后，应用T7RNA聚合酶而分别制备获得HPV16、HPV18和HPV66的RNA探针。
M13噬菌体内基因组为单链DNA。感染M13mp18(购自NEB公司)噬菌体的大肠杆菌(E.coli)(DH5αF’菌株)可重复感染而获得大量的M13mp18噬菌体颗粒。从M13mp18噬菌体颗粒可以常规方法制备获得其单链DNA。Sambrook等人，分子克隆：实验室指南/第二版(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press)中详细描述了制备M13mp18单链DNA的条件和方法等。
此外，为获得与M13mp18单链DNA互补的RNA，首先将含有T7启动子的序列片断(见下方)克隆入M13mp18的RF型DNA的Kpn I/Xba I位点(注：RF型DNA为双链DNA)。
GACTCTAGA TAATACGACTCACTATAG GGTACCGAG
Xba I T7启动子 Kpn I
T7启动子序列在M13mp18的RF型DNA的转录方向为其反义链(-)的方向。构建后的含T7启动子序列的M13mp18载体命名为：M13mp18-T7。用感染了M13mp18-T7噬菌体的大肠杆菌DH5αF’菌株细胞可制备M13mp18-T7的RF双链DNA。此RF双链DNA经Xba I酶线形化后应用T7RNA聚合酶可制备与上述M13mp18单链DNA探针互补的RNA。
类似地，合成HPV16第101碱基至第500碱基的序列并在5’端加上Xba I序列3’端加上Hind III序列。此片断克隆入M13mp18的RF双链DNA载体(于Xba I/Hind III位点)，将此构建转化入大肠杆菌DH5αF’可获得噬菌体颗粒，从该噬菌体颗粒即可获得含HPV16第101碱基至第500碱基序列的M13mp18单链DNA探针。此片断克隆到前述修饰后的pUC19载体(Xba I/Hind III位点)，并将其用Hind III酶切后，应用T7RNA聚合酶而制备获得HPV16第101碱基至第500碱基序列的RNA(在此，用于目标RNA)。
用上述诸方法，发明人分别获得了HPV16亚型、HPV18亚型和HPV66亚型的RNA探针；HPV16亚型、HPV18亚型和HPV66亚型的载体DNA；M13mp18单链DNA探针；和M13mp18单链DNA及其互补的RNA。
应用T7RNA聚合酶制备RNA的反应条件如下：
10μl 5×转录缓冲液；
10μl 10mM 4NTP(ATP，CTP，GTP，UTP)混合液；
1μg 模板DNA；
50U RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)；
1.5μl T7 RNA聚合酶(20U/μl)(美国Fermentas公司)；
加DEPC-处理水至总体积50μl；
上述混合液在37℃保温60-120分钟后，加入2μl 0.5M EDTA终止反应。
实施例2、制备抗DNA-RNA杂交体抗体和抗体-酶偶联体
Poly(A)和Poly(dT)购自美国Sigma公司。Poly(A)和Poly(dT)制备DNA-RNA杂交体以及山羊抗DNA-RNA杂交体抗体的制备按照Kitagawa&Stollar的方法(Kitagawa Y，Stollar BD，Mol Immunol 1982，19：413-420)。即前述制备的DNA-RNA杂交体与甲基化的牛血清白蛋白(methylated bovineserum albumin，即mBSA)混合后再加Freund氏佐剂(Complete Freund’sAdjuvant)注射到山羊体内。第二次开始使用Incomplete Freund氏佐剂。山羊抗体用常规免疫纯化方法进行纯化制备。
本发明以下实施例中所用的鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体购自美国Z-BioMed，Inc.公司。该抗体的细胞株(S9.6)来自美国ATCC(#HB-8730)(Boguslawski SJ，Smith DE，Michalak MA，et al，(1986)J.Immunol.Methods 89：123-130)。
此外，鼠单克隆抗DNA-RNA杂交体抗体的制备也可按照Fliss等的方法(Fliss I，Laurent M，Emond E，et al.，Appl Environ Microbiol，1993，59(8)：2698-2705)。实施例1中所得到的M13mp18单链DNA与其互补的RNA进行杂交即得DNA-RNA杂交体。DNA-RNA杂交体与甲基化的牛血清白蛋白(mBSA)混合后再加Freund氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)注射到BALB/c小鼠体内。第二次开始使用Incomplete Freund氏佐剂。三次免疫后，小鼠脾细胞用PEG与SP2/0 Myeloma细胞融合，并经细胞培养[ISCOVE培养基(美国Sigma公司)加20％小牛血清，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，100μM次黄嘌呤-0.4μM氨基蝶呤，16μM Thymidine，15U/ml杂交瘤生长因子(白介素-6)]获得细胞株。再对单克隆抗体细胞株用96-孔板以常规ELISA法鉴定。
鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP，即HorseRadish Peroxidase)或碱性磷酸酶(AP，即Alkaline Phosphatase)的制备委托美国Applied Biomics公司完成。
利用上述方法，可分别获得山羊抗DNA-RNA杂交体抗体；鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体；鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)的偶联体；鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体与碱性磷酸酶(AP)的偶联体。
实施例3、一种快速测定单一目标核酸序列的方法
本实施例将应用本发明的方法所获得的结果与根据世界专利PCT号WO93/10263公布的方法所得到的结果进行比较。
首先将山羊抗DNA-RNA杂交体抗体包被于96-孔板(Costar High BindingWhite Plate高结合白色板)上。每孔用100μl PBS(10mM磷酸缓冲液，pH 7.4，150mM氯化钠)含有0.5μg/100μl山羊抗DNA-RNA杂交体抗体，4℃，包被16小时。包被后的96-孔板用300μl PBS清洗3次后用含有3％BSA的300μlPBS进行封闭处理。
以下实施例应用96-孔板作为固定相。固定相也可以是其它形式，例如表面合适的磁微球、塑料微球、纳米颗粒等。
1.本发明人对杂交捕获法测定目标核酸序列的发明方法的步骤顺序如下：
a)用碱处理样本；
b)将处理过样本中的核酸序列与其互补的核酸探针杂交以形成双链杂交体；
c)将上述杂交体捕获到一种固定相上与测定已被捕获的杂交体过程同步进行。
上述过程简要步骤如图2所示。
操作步骤如下：
a)往pUC-HPV16的DNA样本0.1ng/50μl加入25μl 2M NaOH，5mMEDTA，70℃处理15分钟将双链HPV16DNA解链变性处理。
b)往解链变性处理后的HPV16DNA加入25μl的3M醋酸钠-醋酸缓冲液，pH 4.0，和5mM EDTA(含HPV 16的RNA探针0.5ng)，70℃处理60分钟，使得HPV16RNA探针与解链后的HPV16互补DNA产生杂交体。
c)往上述DNA-RNA双链杂交体溶液中加入25μl含有鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体-AP偶联体的溶液(0.1M Tris-HCl，pH 7.4，0.6M NaCl，1mMMgCl2，0.1mM ZnCl2)。并将整个混合后的溶液转移到前述包被有山羊抗DNA-RNA杂交体抗体的96-孔板中，室温1小时。在此96-孔板混合溶液中DNA-RNA杂交体可同时与用于测定的鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体-AP偶联体以及包被在96-孔板固定相上的山羊抗DNA-RNA杂交体抗体捕获。在分子动力学意义上，鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体-AP偶联体与DNA-RNA杂交体在溶液中与DNA-RNA杂交体在被捕获到固定相后相比较更容易结合。
d)将混合液从96-孔板中倒掉，用每孔300μl PBST(PBS加0.1％Tween-20)清洗96-孔板3次。加入每孔100μl碱性磷酸酶(AP)的底物CDP-Star(购自美国Tropix公司)后用化学发光仪读取底物经AP酶解后所产生的化学发光值。
本方法化学发光的信号/噪声(Signal/Noise)比例结果见表1。
2.PCT号WO93/10263公布说明了杂交捕获法测定一种目标核酸序列(HPV为例)的方法，步骤顺序如图3。
操作步骤如下：
a)往pUC-HPV16的DNA样本0.1ng/50μl加入25μl 2M NaOH，5mMEDTA，70℃处理15分钟将双链HPV16DNA解链变性处理。
b)往解链变性处理后的HPV16DNA加入25μl的3M醋酸钠-醋酸缓冲液，pH 4.0，和5mM EDTA(含HPV16的RNA探针0.5ng)，70℃处理60分钟，使得HPV16RNA探针与解链后的HPV16互补DNA产生杂交体。
c)将上述DNA-RNA双链杂交体溶液转移到前述包被有山羊抗DNA-RNA杂交体抗体的96-孔板中，室温1小时。DNA-RNA双链杂交体被包被在96-孔板固定相上的山羊抗DNA-RNA杂交体抗体所捕获。
d)将DNA-RNA杂交体溶液从96-孔板中倒掉，用每孔300μl PBST(PBS加0.1％Tween-20)清洗96-孔板3次。
e)往上述96-孔板中加入100μl含有鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体-AP偶联体的溶液(0.1M Tris-HCl，pH 7.4，0.6M NaCl，1mM MgCl2，0.1mMZnCl2)，室温1小时。
f)将溶液从96-孔板中倒掉，用每孔300μl PBST(PBS加0.1％Tween-20)清洗96-孔板3次。加入每孔100μl碱性磷酸酶(AP)的底物CDP-Star(购自美国Tropix公司)后用化学发光仪读取底物经AP酶解后所产生的化学发光值。
该方法化学发光的信号/噪声(Signal/Noise)比例结果见表1。
表1、杂交捕获测定HPV16二方法的化学发光结果比较
| 方法 | 化学发光信/噪(S/N)比例 |
| 本发明方法 | 21.4 |
| WO93/10263方法 | 18.2 |
由表1可见，采用本发明的方法与WO93/10263的方法相比，信/噪比显著提高了17.6％。
实施例4、快速测定多目标核酸序列
宫颈癌如能早期发现，是可以治愈的。因此，对高危性HPV的早诊断早治疗对宫颈癌的治疗是至关重要的。在病人生物样本中，可能同时得到多种HPV亚型的感染。检测生物样本中是否感染多种高危型HPV病毒有着重要的临床意义。
本发明人应用本发明方法检测二种(HPV16和HPV18亚型)和三种高危性HPV亚型(HPV16、HPV18和HPV66亚型)混合DNA(总高危性HPV DNA)。
方法步骤按照实施例3。但是，HPV DNA和RNA探针组成如下：
实验1)：在步骤a)中，pUC-HPV16∶pUC-HPV18为0.05ng∶0.05ng(即1∶1)。在步骤b)中，HPV16RNA探针和HPV18RNA探针均为0.5ng。
实验2)：在步骤a)中，pUC-HPV16∶pUC-HPV18为0.1ng∶0.01ng(即10∶1)。在步骤b)中，HPV16RNA探针和HPV18RNA探针均为0.5ng。
实验3)：在步骤a)中，pUC-HPV16∶pUC-HPV18∶pUC-HPV66为0.03ng∶0.03ng∶0.03ng(即1∶1∶1)。在步骤b)中，HPV16RNA探针、HPV18RNA探针和HPV66探针均为0.5ng。
上述三组实验的化学发光的信号/噪声(Signal/Noise)比例结果见表2。
表2、杂交捕获测定多种HPV亚型二方法的化学发光结果比较
实施例5、生物素-亲和素(Biotin-Avidin)杂交捕获法测定目标核酸(DNA)
在实施例3和4中，本发明人应用包被有抗DNA-RNA杂交体抗体的96-孔板用于捕获DNA-RNA杂交体。捕获也可用其它方法来实现，例如生物素-亲和素(Biotin-Avidin)。
1)制备生物素(Biotin)标记的RNA探针
应用T7RNA聚合酶制备生物素(Biotin)标记的RNA探针(M13mp18)的反应条件如下：
10μl 5×转录缓冲液；
10μl 10mM 4NTP(ATP，CTP，GTP，UTP)混合液；
1μl生物素标记的UTP(1mM)；
1μg模板M13mp18-T7RF DNA(Xba I酶切)；
50U RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)；
1.5μl T7RNA聚合酶(20U/μl)(美国Fermentas公司)；
加DEPC-处理水至总体积50μl；
上述混合液在37℃保温60-120分钟后，加入2μl 0.5M EDTA终止反应。
2)亲和素(Avidin)包被96-孔板
96-孔板为Costar高结合白色板(Costar High Binding White Plate)上。每孔用100μl PBS(10mM磷酸缓冲液，pH 7.4，150mM氯化钠)含有10μg/ml亲和素(美国Sigma公司)，4℃，包被16小时。包被后的96-孔板用300μl PBS清洗3次后用含有3％BSA的300μl PBS进行封闭处理。
3)杂交捕获测定步骤如下：
a)将0.1ng单链M13mp18DNA与0.2ng生物素标记的M13mp18RNA混合于75μl PBS加0.3M NaCl溶液(pH 7.0)中，70℃处理60分钟，以产生生物素RNA-DNA杂交体。
b)往上述DNA-RNA双链杂交体溶液中加入25μl含有鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体-AP偶联体的溶液(0.1M Tris-HCl，pH 7.4，0.6M NaCl，1mMMgCl2，0.1mM ZnCl2)。并将整个混合后的溶液转移到上述包被有亲和素的96-孔板中，室温1小时。在此96-孔板混合溶液中含生物素RNA-DNA杂交体可同时与用于测定的鼠抗DNA-RNA杂交体单克隆抗体-AP偶联体以及包被在96-孔板固定相上的亲和素捕获。
c)将混合液从96-孔板中倒掉，用每孔300μl PBST(PBS加0.1％Tween-20)清洗96-孔板3次。加入每孔100μl碱性磷酸酶(AP)的底物CDP-Star(购自美国Tropix公司)后用化学发光仪读取底物经AP酶解后所产生的化学发光值。
本方法化学发光的信号/噪声(Signal/Noise)比例结果见表3。
表3、生物素-亲和素杂交捕获法测定目标核酸(DNA)的化学发光结果
| 方法 | 化学发光信/噪(S/N)比例 |
| 本发明方法 | 28.4 |
上述实施例中，本发明人以单链DNA与生物素标记的RNA探针结合产生DNA-RNA杂交体。
以上实施例中以人乳头状瘤病毒高危型亚型的基因或单链M13mp18DNA作为目标核酸，然而应理解，其它基因均可作为目标核酸。
实施例6、生物素-亲和素杂交捕获法测定目标核酸(RNA)
本实施例中，采用的杂交方法与实施例5基本上相同，不同点在于：以前述制备的HPV16第101碱基至第500碱基序列的RNA作为待捕获的目标核酸，以前述制备的含HPV16第101碱基至第500碱基序列的M13mp18单链DNA探针作为探针(经生物素标记)。
本方法化学发光的信号/噪声(Signal/Noise)比例结果见表4。
表4、生物素-亲和素杂交捕获法测定目标核酸(RNA)的化学发光结果
| 方法 | 化学发光信/噪(S/N)比例 |
| 本发明方法 | 22.5 |
因此可见，单链DNA也可以作为探针应用本发明来检测RNA分子。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种鉴定目标核酸的方法，所述方法依次包括：
(a)将待测的核酸样本解链处理，得到单链核酸样本；
(b)将特异性识别目标核酸的探针与步骤(a)获得的单链核酸样本杂交，其中，当目标核酸是DNA时，所述探针是RNA；当目标核酸是RNA时，所述探针是DNA；得到双链杂交体样本；和
(c)将步骤(b)获得的双链杂交体捕获到固相载体上，包括：将双链杂交体样本、检测抗体加样到包被有包被抗体的固相载体上，在固相载体上形成包被抗体-双链杂交体-检测抗体三元复合物；其中，所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号；所述的包被抗体是抗所述双链杂交体的抗体；
测定被捕获的杂交体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测信号选自：碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，测定被捕获的杂交体包括：加入识别所述可检测信号的底物，测定底物的显色情况。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的探针上携带标记物；
步骤(c)中，所述的固相载体上包被有特异性结合所述标记物的结合物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的标记物是生物素，所述的结合物是亲和素；或
所述的标记物是他克莫司，所述的结合物是他克莫司结合蛋白。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，将双链杂交体捕获到固相载体上包括：将双链杂交体样本、检测抗体加样到包被有结合物的固相载体上，在固相载体上形成结合物-标记物-双链杂交体-检测抗体四元复合物；所述的检测抗体是抗所述双链杂交体的抗体，其携带有可检测信号。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100521262A CN101899497B (zh) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | 一种鉴定目标核酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100521262A CN101899497B (zh) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | 一种鉴定目标核酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101899497A CN101899497A (zh) | 2010-12-01 |
| CN101899497B true CN101899497B (zh) | 2012-11-07 |
Family
ID=43225415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009100521262A Active CN101899497B (zh) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | 一种鉴定目标核酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101899497B (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102676640B (zh) * | 2011-03-10 | 2014-11-26 | 国家纳米科学中心 | 催化复合物及可视化检测方法 |
| CN104583423A (zh) * | 2012-08-30 | 2015-04-29 | 凯杰有限公司 | 确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法 |
| CN103525942A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-01-22 | 武汉中帜生物科技有限公司 | 一种rna扩增与杂交捕获法相结合的检测核酸方法 |
| CN105368982B (zh) * | 2014-08-28 | 2019-01-29 | 杭州德同生物技术有限公司 | 一种高危型人乳头瘤病毒检测及分型方法 |
| CN111979300B (zh) * | 2019-05-23 | 2023-03-28 | 杭州百殷生物科技有限公司 | 一种快速定量检测靶标dna的方法 |
| CN112226485A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-01-15 | 天津贝猫科技有限公司 | 核酸检测方法 |
| CN112708690B (zh) * | 2021-01-13 | 2022-04-26 | 杭州德同生物技术有限公司 | 念珠菌检测及分型的方法和试剂盒 |
| CN113088560B (zh) * | 2021-04-16 | 2022-02-25 | 杭州德同生物技术有限公司 | 基于杂交捕获及酶保护的microRNA高通量检测方法及试剂盒 |
| CN113186268B (zh) * | 2021-05-08 | 2023-05-12 | 苏州海苗生物科技有限公司 | Dna-rna杂合双链特异性缀合物在促进核酸复制及在新型冠状病毒检测中应用 |
| CN113215274B (zh) * | 2021-05-10 | 2022-07-29 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种miRNA的检测方法以及用于检测miRNA的侧流层析试纸条 |
-
2009
- 2009-05-27 CN CN2009100521262A patent/CN101899497B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101899497A (zh) | 2010-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101899497B (zh) | 一种鉴定目标核酸的方法 | |
| Reller et al. | Yield of stool culture with isolate toxin testing versus a two-step algorithm including stool toxin testing for detection of toxigenic Clostridium difficile | |
| Van Doorn et al. | The efficacy of laboratory diagnosis of Helicobacter pylori infections in gastric biopsy specimens is related to bacterial density and vacA, cagA, and iceA genotypes | |
| Slotved et al. | Serotype IX, a proposed new Streptococcus agalactiae serotype | |
| Shinkai et al. | Localization of ruminal cellulolytic bacteria on plant fibrous materials as determined by fluorescence in situ hybridization and real-time PCR | |
| Musher et al. | Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay and quantitative PCR for diagnosis of invasive aspergillosis with bronchoalveolar lavage fluid | |
| Van Lint et al. | Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples | |
| Kato et al. | Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification | |
| CN109913565B (zh) | 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法 | |
| CN101603096A (zh) | 一种检测传染病病原体的方法及试剂盒 | |
| CN103215357A (zh) | 番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法 | |
| Hou et al. | Development of an isothermal recombinase‐aided amplification assay for the rapid and visualized detection of Klebsiella pneumoniae | |
| Müller et al. | Multiplex PCR for the detection of Lactobacillus pontis and two related species in a sourdough fermentation | |
| CN112708690B (zh) | 念珠菌检测及分型的方法和试剂盒 | |
| CN104419751A (zh) | miRNA检测探针、试剂盒及其检测方法 | |
| CN116087508A (zh) | 基于hcr的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法及其应用 | |
| CN108531633A (zh) | 一种用于检测金黄色葡萄球菌活性的荧光raa引物、探针及检测方法 | |
| WO2012081907A2 (ko) | 이콜라이 ｏ１５７：ｈ７균주에 대한 ｒｎａ 앱타머 | |
| Chin et al. | Bacteriophage adaptation to a mammalian mucosa reveals a trans-domain evolutionary axis | |
| CN101429545A (zh) | 一种应用悬浮芯片技术检测志贺氏菌方法 | |
| CN103014024B (zh) | 用于检测弗氏枸橼酸杆菌的靶基因及检测试剂盒 | |
| CN106053403B (zh) | 一种蛋白定量检测方法 | |
| CN103409549A (zh) | 枯草芽孢杆菌pcr检测、鉴定特异引物对 | |
| JP4427806B2 (ja) | 腸内細菌検出用オリゴヌクレオチド及び腸内細菌の検出方法 | |
| CN109797233A (zh) | 一种检测肺炎链球菌的rca方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |