CN101899422B - 轮状病毒p[2]g3株和p[8]g1株在kmb17细胞上适应培养方法和免疫原性 - Google Patents

Abstract

轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株在KMB17细胞上适应性培养方法和免疫原性，属于病毒培养方法。本发明将两株轮状病毒在KMB17细胞上连续10代适应培养，使细胞病变随病毒代次逐渐增快，感染性滴度递增并稳定在较高水平。病毒滴度分别达到7.75CCID₅₀/ml及7.33CCID₅₀/ml。病毒适应KMB17细胞且基因组稳定，用复制的病毒免疫小鼠其血清中和抗体效价分别为1∶16384及1∶8192。本发明适应性培养轮状病毒P[2]G3株株和P[8]G1株可在KMB17细胞中稳定复制，所产生病毒保持了亲本毒株的基本生物学特性，且有较好免疫原性。

Description

轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株在KMB17细胞上适应培养方法和免疫原性

技术领域

本发明属于病毒培养方法，特别涉及轮状病毒在人细胞上的培养。

背景技术

任何一种疫苗的安全性和有效性都是其最重要的基本要素，在研制疫苗时最大限度考虑安全性非常重要。影响疫苗安全性的因素很多，其中用于制备疫苗的细胞基质是重要因素之一。细胞基质作为制备疫苗的原材料，其质量的优劣，直接影响疫苗的质量和产量，尤其是疫苗的安全性。轮状病毒(Rotavirus，RV)疫苗在预防RV感染中发挥了重要作用，但截至目前，国内外RV疫苗主要是在动物源性的细胞中制备的。由于动物源性的原代细胞可能携带潜在病毒和其他可传播因子，对人用疫苗存在极大的安全隐患；其次非人源性传代细胞的残余DNA具有使其他细胞生长失控和致肿瘤性的潜在风险。而人二倍体细胞与之相比，携带潜在病毒和致肿瘤的潜在危险性较小。因此，使用人源性细胞取代非人源性细胞制备人体疫苗是今后发展的方向。人二倍体细胞KMB17已成功用于甲型肝炎生产多年，是一株安全、可靠的人源性细胞，基于这一思路，在前期研究中，我们选用轮状病毒P[2]G3株在人胚肺二倍体细胞KMB17上进行了病毒的适应性培养和适应毒株生物学性质及其免疫原性研究，但仅限于轮状病毒P[2]G3株，未建立和研究P[8]G1株的免疫原性，而且所获得的轮状病毒感染性滴度较低(10^5.5PFU/mL)。

发明内容

本发明目的是选用轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株在人胚肺二倍体细胞KMB17上进行病毒的适应性培养方法，进一步提高病毒滴度，并通过毒株生物学性质测试和参数确定培养物所具有的免疫原性。

本发明的目的通过以下方式实现：

轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株在KMB17细胞上的适应性培养方法：

用含10％新生牛血清的MEM培养基在转瓶中培养KMB17细胞，待细胞长成致密单层后，按0.05MOI接种激活的轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株，待CPE达+++～++++时，收获病毒液，以此方法，将病毒连续传代10代。

所述培养方法是用20ug/ml乙酰化胰酶、600ug/ml的CaCl₂ 37℃水浴60min以激活轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株，接种病毒后于37℃吸附90min，弃去未吸附的病毒液，加入含终浓度为0.5ug/ml乙酰化胰酶的MEM维持液，在37℃恒温室中旋转培养备用。

轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株在KMB17细胞上的适应性培养的免疫原性：

病毒液的感染性滴度随代次递增，P[2]G3株峰10代的病毒滴度为7.75CCID₅₀/ml，P[8]G1株峰10病毒滴度为7.33CCID₅₀/ml。

所述病毒在传代过程中核酸带型一致，呈典型的4∶2∶3∶2型。

所述该病毒分别用以下两组引物扩增：

P[2]G3株VP7全长基因特异性引物为Beg9，End9。序列如下：

Beg9：5’-GAGAGAATTTCCGTTTGG-3’

End9：5’-GGTCACATCATACAATTCTAACC-TAAG-3’；

P[8]G1株VP7基因特异性引物为9con1，9con2(37-941bp)。序列如下：

9con1：5’-TAGCTCCTTTTAATGTATGG-3’，

9con2：5’-GTATAAAATACTTGCCACCA-3’。

回收PCR产物测序：

P[2]G3P[8]G1株第1代和第10代均扩增出长度1062bp的VP7特异性产物，P[8]G1株第1代和第10代均扩增出长度905bp的VP7特异性产物，且核苷酸序列稳定。

所述P[2]G3株免疫小鼠抗血清产生的抗体效价为1∶16384，P[8]G1株免疫小鼠抗血清产生的抗体效价为1∶8192。

以上人胚肺二倍体细胞KMB17是一株用于人用疫苗生产的细胞株，由中国医学科学院医学生物学研究所分子生物室保存，并能以商品出售和购买的细胞株。

轮状病毒P[2]G3和P[8]G1株通过本发明在KMB17细胞上适应性培养证明：在传代过程中，病毒感染性滴度能够稳定在较高水平上，病毒能够保持一致的核酸带型及高度的遗传稳定性，并且，用复制的病毒经两种途径免疫小鼠均产生了较好的免疫效果。

本发明具有的积极效果是：

本发明适应性培养的轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株可在KMB17细胞中稳定复制，所产生的病毒保持了亲本毒株的基本生物学特性，并且有较好的免疫原性，由于KMB17细胞进行转瓶培养，更适宜于轮状病毒的生长特性，另一方面，CaCl₂有助于轮状病毒在细胞中的复制，经CaCl₂处理的轮状病毒株，使得所获得的病毒感染性滴度显著高于之前的实验结果，从而，能够以人源性KMB17细胞作为轮状病毒增殖的一种理想和安全的细胞基质，为制备安全的人体轮状病毒疫苗奠定了重要基础。

附图说明

图1是轮状病毒感染KMB17细胞后的CPE及免疫荧光检测结果。其中，A：正常KMB17细胞；B：轮状病毒感染KMB17细胞后的CPE；C：阴性KMB17细胞对照D：接种轮状病毒后的阳性细胞

图2是轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株1-10代病毒的感染性滴度曲线。

图3是两株病毒1-10代基因组核酸带型。图中，M：DNA markerDL2000；A，B：1-10：P[2]G3株1-10代病毒基因组核酸带型；C，D：P[8]G1株1-10代病毒基因组核酸带型。

图4是两株病毒扩增的VP7基因片段。其中，A：P[2]G3株第1代和第10代VP7全长基因；B：P[8]G1株第1代和第10代VP7基因片段(37-941bp)。

以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明，具体实施方式包括但不限于实施例内容。

具体实施方式

以下实施例所使用的材料包括：

猴轮状病毒P[2]G3株(第18代，Vero细胞上增殖)，

人轮状病毒P[8]G1株(第10代，Vero细胞上增殖)。

(一)轮状病毒在KMB17细胞上的适应性培养

用含10％新生牛血清的MEM培养基在转瓶中培养KMB17细胞，待细胞长成致密单层后，按0.05MOI接种P[2]G3和P[8]G1株病毒，观察病变情况，待CPE达+++-++++时，收获病毒液。以此方法，将病毒连续传代10代。

病毒接种前可用20ug/ml的乙酰化胰酶、600ug/ml的CaCl₂在37℃水浴60min激活，接种病毒后于37℃吸附90min，弃去未吸附的病毒液，加入含终浓度为0.5ug/ml乙酰化胰酶的MEM维持液中旋转培养。

对照为等体积，培养条件相同的KMB17细胞。

KMB17细胞接种P[2]G3(P[8]G1)株病毒后，可见细胞出现明显的病变效应(CPE)。随着病毒传代代次的增高，细胞病变逐渐增快，收毒时间逐渐提前，在P[2]G3株第3代，P[8]G1株第5代稳定在种毒后48h以内。

(二)病毒感染细胞免疫荧光试验

病毒感染细胞后24h，进行免疫荧光试验。先用甲醇4℃固定10min，再用3％的BSA37℃封闭30min，然后依次加入一抗、二抗，分别在37℃，5％CO₂孵箱中孵育90min，荧光显微镜下观察结果。一抗分别为：经纯化的轮状病毒P[2]G3株全病毒颗粒免疫豚鼠的多克隆血清；经纯化的轮状病毒P[8]G1株全病毒颗粒免疫豚鼠的多克隆血清；二抗为：FITC标记的兔抗豚鼠IgG。

免疫荧光试验显示：轮状病毒的复制是在细胞质内完成的，接种的两株病毒细胞质内均出现明亮的绿色荧光，胞核黯淡，表明两株病毒在KMB17细胞中确有增殖。

(三)微量滴定结合荧光灶的方法测定病毒感染性滴度

将MA104细胞按1.5×10⁴/孔细胞数接种96孔板，待细胞长成致密单层后，将病毒用维持液做10倍等比稀释，从10^-1-10^-7，每个稀释度设10孔，每孔接种稀释后的病毒100ul，并设细胞对照和未稀释的病毒对照。于37℃5％CO₂孵箱培养15小时，进行免疫荧光实验。具体操作方法同(2)。

分别测定两株病毒各代病毒液的感染性滴度，结果显示两株病毒在传代过程中，滴度随传代代次的增加成逐渐递增的趋势，并稳定在较高水平，即P[2]G3株峰10代的病毒滴度7.75CCID₅₀/ml，P[8]G1株峰10病毒滴度7.33CCID₅₀/ml。

(四)病毒基因组检测

采用小量病毒RNA/DNA抽提试剂盒提取两株病毒1-10代收获液基因组RNA，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离胶浓度为10％，压缩胶浓度为3.5％。90V，电泳8小时，硝酸银染色。

结果显示，两株病毒在传代过程中保持了一致的核酸带型，呈典型的4∶2∶3∶2型，具有良好的遗传稳定性。

(五)RT-PCR扩增VP7基因及测序

P[2]G3株VP7全长基因特异性引物为Beg9，End9。序列如下：

Beg9：5’-GAGAGAATTTCCGTTTGG-3’

End9：5’-GGTCACATCATACAATTCTAACC-TAAG-3’；

P[8]G1株VP7基因特异性引物为9con1，9con2(37-941bp)。序列如下：

9con1：5’-TAGCTCCTTTTAATGTATGG-3’，

9con2：5’-GTATAAAATACTTGCCACCA-3’。

分别以以上两组引物扩增SA11株第1代和第10代，Wa株第1代和第10代。PCR产物经回收纯化后测序。

RT-PCR反应得到的产物电泳结果显示：P[2]G3株第1代和第10代均扩增出了VP7特异性产物，大小为1062bp。P[8]G1株第1代和第10代也扩增出了大小为905bp的VP7特异性产物。测序结果表明，P[2]G3株第10代和第1代病毒相比，基因序列未发生任何改变。P[8]G1株第10代和第1代病毒相比，仅有一处基因发生了突变，即第421位核苷酸序列：C→G。表明两株病毒在传代过程中保持了高度的遗传稳定性。

(六)动物免疫试验和ELISA检测血清抗体效价

小鼠免疫分皮下注射和口服两种途径，每组6只小鼠。免疫原为经氯仿抽提初步纯化后的P[8]G1株病毒液。皮下注射组0.1ml/只，分两点皮下注射；口服组0.2ml/只，灌胃。对照组分别皮下注射0.1ml PBS和口服0.2ml PBS。免疫接种后2周和4周再分别加强免疫一次，第5周尾静脉采血。

将经凝胶过滤纯化的P[8]G1株病毒作为抗原，稀释至终浓度为1ug/ml，取0.1ml以碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液4℃包被过夜，用3％的BSA37℃封闭1h。将制备的抗血清按最低稀释度1∶4起倍比稀释，取0.1ml加入酶标板，每个稀释度设2孔。37℃孵育1h后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h，用OPD避光显色20min，2mol/L硫酸终止反应，测定D₄₉₀值。

轮状病毒特异抗体的阳性判定标准为：同稀释度P[2]G3或P[8]G1株免疫组OD₄₉₀值≥2.1倍PBS免疫组，且OD₄₉₀绝对值≥0.2。通过ELISA检测三次免疫后的小鼠血清结果表明，在KMB17细胞上扩增的P[2]G3和P[8]G1株病毒经皮下注射和口服免疫两种途径均能有效刺激小鼠产生针对两株病毒的特异性抗体，两种免疫效果无明显差别，免疫P[2]G3株产生的抗体效价达到1∶16384，免疫P[8]G1株产生的抗体效价达到1∶8192。

Claims (3)

1.轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株在KMB17细胞上适应培养方法，其特征是：

用含10％新生牛血清的MEM培养基在转瓶中培养KMB17细胞，待细胞长成致密单层后，按0.05MOI分别接种激活的轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株后于37℃吸附90min，弃去未吸附的病毒液，加入含终浓度为0.5ug/ml乙酰化胰酶的MEM维持液，在37℃恒温室中旋转培养，待细胞病变效应达+++～++++时，收获病毒液，以此方法，将病毒连续传代10代；

所述的激活的轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株是指在接种病毒前，将轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株用20ug/ml乙酰化胰酶、600ug/ml的CaCl₂ 37℃水浴60min。

2.如权利要求1所述的适应培养方法，其特征是该病毒株的感染性滴度随代次递增，P[2]G3株第10代的病毒滴度为7.75CCID₅₀/ml，P[8]G1株第10代的病毒滴度为7.33CCID₅₀/ml。

3.如权利要求1或2所述的适应培养方法，其特征是P[2]G3株免疫小鼠抗血清产生的抗体效价为1∶16384，P[8]G1株免疫小鼠抗血清产生的抗体效价为1∶8192。 

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