CN101897296B

CN101897296B - 欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法

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Publication number: CN101897296B
Application number: CN2010102308860A
Authority: CN
Inventors: 杨传平; 魏志刚; 闫绍鹏; 孟凡娟; 王秋玉
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-07-15
Also published as: CN101897296A

Abstract

本发明公开了一种欧美山杨杂种(Populus tremula×P.tremuloides)组织培养的快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)将欧美山杨杂种的外植体消毒后接种在启动培养基上培养，得到无菌试管苗；(2)将步骤(1)所得到试管苗截段，插入分化培养基中培养；(3)将步骤(2)所得到幼苗截段，插入生根培养基中进行生根培养；(4)将生根后的幼苗截段后转接至生根培养基进行继代培养；(5)炼苗、移栽，即得。本发明欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法具有幼苗生长速度快，成活率高，幼苗健壮，叶色嫩绿，不易玻璃化，生产成本低、可工厂化生产等优点。

Description

欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及欧美山杨杂种的快速繁殖方法，尤其涉及欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法，属于欧美山杨杂种的组织培养领域。

背景技术

欧美山杨杂种(Populus tremula×P.tremuloides)是欧洲山杨和北美山杨的杂交种，具有生长快、耐寒、耐贫瘠、树形高大、适应性强等特点，是温寒带山地造林的优良树种。同时该杂种材质较软，细密，洁白，树干端直，是造纸、胶合板、刨花板等工业的优质原料。

研究表明：在芬兰，欧美山杨杂种适于山地造林，平原造林长势更好，而且其轮伐期和生长速度都快于一般的山地针阔叶造林树种。而我国北方很多地区的气候环境要好于芬兰，土壤肥沃，温度高，日照长，生长期也长，直接采用引进优良山杨杂种无性系造林，其生长量更加显著。因此，该树种适于在我国黑龙江南部、吉林、辽宁以及华北地区种植。目前作为优良用材树种被许多国家广泛引进。

但在欧美山杨杂种组织培养的技术实施过程中，面临着培养基成本高、组培苗易玻璃化和褐化、商品苗出苗时间长等问题，在欧美山杨组织培养技术操作的各个环节中，以组培苗易出现玻璃化和褐化的问题最为严重，导致成苗率低，增加成本，这些问题严重限制了欧美山杨的繁殖系数，并影响了欧美山杨大面积的推广种植。为此，去除欧美山杨组培苗玻璃化和黄化以及缩短育苗时间的技术革新已经成为当务之急。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服欧美山杨杂种组织培养的过程中，所存在的培养基成本高、组培苗易玻璃化和褐化、商品苗出苗时间长等问题，提供一种新的欧美山杨杂种组织培养方法，该方法具有生产成本低、幼苗生长速度快、幼苗健壮，不易玻璃化，成活率高等优点。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种欧美山杨杂种组织培养的快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)欧美山杨杂种的外植体消毒后接种在启动培养基上培养，得到无菌试管苗；(2)将步骤(1)所得到幼苗截段，插入分化培养基中培养；(3)将步骤(2)所得到幼苗截段，插入生根培养基中进行生根培养；(4)将生根后的幼苗截段后转接至生根培养基进行继代培养；(5)炼苗、移栽，即得。

其中，步骤(1)中所述的欧美山杨杂种的外植体可以是欧美山杨杂种的嫩茎或新叶；所述的消毒方式可以是：在接种前用清水冲洗5min，无菌水冲洗3～4遍，再用75％酒精浸泡30s，边浸泡边摇动。然后用0.1％升汞灭菌2min，再用灭菌的蒸馏水洗4遍；所述的启动培养基的组成优选为：WPM+6-BA 1.0mg/L+2％绵白糖

步骤(2)中所述的分化培养基的组成及配制方法包括：其组成成分：去除肌醇的WPM+6-BA1.0mg/L+KT 0.5mg/L+2％绵白糖；其配制方法是采用自来水配制后并消毒。

为了达到更好的效果，步骤(2)中所述的苗木截段优选按照以下方法进行：2cm以下的幼苗切去生理下端叶片，直接插入分化培养基中培养；2cm以上的幼苗分割成1.5-2cm的截段，切去截段的生理下端叶片，分别得到尖端截段和中部截段(见图3)；

步骤(3)或步骤(4)中所述的生根培养基的组成和配制方法包括：(1)培养基的组成：去除肌醇的1/2WPM+IBA 0.5mg/L+2％绵白糖；(2)配制方法：用自来水代替蒸馏水配制培养基；用卡拉胶代替琼脂配制培养基；配制后高温高压灭菌。

步骤(3)或步骤(4)中所述的幼苗截段优选按照以下方法进行：将幼苗从培养基中取出，切取单棵幼苗；2cm以下的幼苗切去生理下端叶片；2cm以上的幼苗分割成1.5-2cm的截段，将截段生理下端叶片切去，分别得到尖端截段和中部截段(见图4)；

本发明欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法主要具有以下几方面的优点：

1.生产成本低、可实现工厂化生产：本发明方法使用廉价的替代品配制培养基(以普通自来水代替蒸馏水；以绵白糖代替分析用蔗糖，卡拉胶代替琼脂配制培养基)；去除肌醇；降低大量元素用量；本发明方法的生产成本相比于现有技术有显著降低，可实现工业化生产。

2.幼苗生长速度快：采用本发明组织培养方法，欧美山杨杂种生长20-30天即可成苗，与常规的组织培养方法(分化培养)相比，生长时间缩短了一半。

3.组培苗及移栽苗成活率高。组培苗：从幼苗尖端截段转接生根培养基，成活率高达98％以上；中、下端截段成活率也可达70％以上。移栽苗：幼苗尖端截段，生根移栽成活率50％以上；中、下端截段粗壮，生根移栽成活率60％-75％。

4.幼苗健壮，叶色嫩绿，不易玻璃化。

本发明使用生根继代培养来代替传统的无根继代培养技术：采用生根培养后幼苗截段，转接到生根培养基中，可以用于继代培养或直接成苗后移栽，从而克服欧美山杨杂种多次继代后植株黄化、繁殖系数低、组培苗成活率低等的缺点。

现有的组织培养方法多是分化培养后接着进行继代培养(图2)，分化培养后幼苗细弱，多次继代培养后，幼苗易出现玻璃化、黄叶、落叶等现象，连续继代后需复壮幼苗；本发明方法采用生根培养后再进行继代培养可避免这类现象省去复壮过程。生根继代培养虽不及分化培养产生幼苗数量多，但生长速度快、成活率高、苗势健壮。因此，选用生根培养转接生根继代培养的培养方法，可以防止由于长期继代后的幼苗玻璃化现象的出现。

总之，本发明欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法具有幼苗生长速度快，成活率高，幼苗健壮，叶色嫩绿，不易玻璃化，生产成本低、可工厂化生产等优点。

附图说明

图1本发明欧美山杨杂种的组织培养(生根继代)的流程图。

图2常规欧美山杨杂种组培(无根继代)的技术流程图。

图3本发明欧美山杨杂种的组织培养分化培养的幼苗(箭头所指部分是需要切取的截段)。

图4本发明欧美山杨杂种的组织培养生根培养的幼苗(箭头所指部分是需要切取的截段)。

图5本发明欧美山杨杂种的组织培养的有根继代植株(生根培养需要20天左右)。

图6常规欧美山杨杂种组培的无根继代植株(分化培养45天)。

图7本发明欧美山杨杂种的组织培养的幼苗尖端截段接入生根培养基中培养。

图8本发明欧美山杨杂种的组织培养的生根培养基中培养14天的生根状态(幼苗尖端截段)。

图9本发明欧美山杨杂种的组织培养的生根培养基中培养30天的生根状态(幼苗尖端截段)。

图10本发明欧美山杨杂种的组织培养的生根培养基中培养21天的生根状态(幼苗中部截段)。

图11本发明欧美山杨杂种的组织培养的幼苗中部截段接入生根培养基中培养。

图12生根培养基中培养30天的生根状态(幼苗中部截段)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

WPM培养基的具体组成成分如下：

(mg/L)

1)大量元素：

1.KNO₃ 1900

2.NH₄NO₃ 1650

3.MgSO₄·7H₂O 370

4.KH₂PO₄ 170

2)微量元素：

1.MnSO₄·H₂O 22.3

2.ZnSO₄·7H₂O 8.6

3.CuSO₄·5H₂O 0.025

4.H₃BO₃ 6.2

5.Na₂MoO₄·2H₂O 0.25

6.KI 0.83

7.CoCl₂·6H₂O 0.025

3)钙盐：

1.CaCl₂·2H₂O 440

4)铁盐：

1.FeSO₄·7H₂O 27.8

2.Na₂-EDTA 37.3

5)维生素：

1.烟酸 0.5

2.盐酸硫胺素(维生素B₁) 0.4

3.盐酸吡哆酸(维生素B₆) 0.5

6)氨基酸：

1.肌醇 100

2.甘氨酸 2

实施例1

(一)材料处理

欧美山杨杂种的枝条经过水培后，取嫩茎和新叶接种，在接种前用清水冲洗5min，无菌水冲洗3～4遍，再用75％酒精浸泡30s，边浸泡边摇动。然后用0.1％升汞灭菌2min，再用灭菌的蒸馏水洗4遍，接种在WPM+6-BA1.0mg/L+2％棉白糖培养基上使之启动，形成无菌试管苗。

(二)培养操作过程

分化培养基：用自来水替代蒸馏水配制培养基；②WPM(去除肌醇)+6-BA1.0mg/L+KT 0.5mg/L+2％市售绵白糖(用自来水配制)。

1、分化继代培养

利用紫外灯将超净工作台灭菌30分钟。此次过程的全部操作均在超净工作台中的无菌环境下进行。在超净工作台中，切取单棵幼苗。2cm以下的幼苗需要切去生理下端叶片，直接插入分化培养基中培养；2cm以上的幼苗分割成1.5-2cm截段(见图3)，切去截段生理下端叶片，插入分化培养基中培养。

2、生根培养

生根培养基：①1/2WPM(去除肌醇)+IBA 0.5mg/L+2％棉白糖(用自来水代替蒸馏水配制培养基；用卡拉胶代替琼脂配制培养基)。

利用紫外灯将超净工作台灭菌30分钟。此次过程的全部操作均在超净工作台中的无菌环境下进行。在超净工作台中，将幼苗从培养基中取出，切取单棵幼苗。2cm以下的幼苗切去生理下端叶片；2cm以上的幼苗分割成1.5-2cm截段(见图4)，均切去截段后的生理下端叶片，插入生根培养基中进行生根培养。图8为幼苗尖端截段生根培养基中培养21天的生根状态；图9为幼苗尖端截段生根培养基中培养30天的生根状态；图10为幼苗中部截段生根培养基中培养21天的生根状态；图12为幼苗中部截段生根培养基中培养30天的生根状态；

从幼苗尖端截段转接生根培养基，成活率高达98％以上；中、下端截段成活率也可达70％以上。

3、生根后继代培养

将生根后的幼苗尖端截段后转接至生根培养基，成活率高达98％以上；中、下端截段成活率也可达70％以上。在超净工作台中，将生根培养的幼苗从培养基中取出，切取单棵幼苗。将幼苗分割成1.5-2cm的截段(每段保证2-3片完整叶片)(图4)，切去截段生理下端叶片，插入生根培养基中进行继代培养。继代培养所得到的幼苗健壮，叶色嫩绿，不易玻璃化。

4、炼苗及移栽

生长20-30天即可成苗，炼苗移至大棚培养。幼苗尖端截段细嫩，生根移栽成活率50％以上；中、下端截段粗壮，生根移栽成活率60％-75％。对比试验例1

一、试验方法：试验方法分为试验组和对照组；

试验组为采用实施例1的欧美山杨杂种的组织培养方法；

对照组：采用图2所示的技术流程图(所用到的培养基和培养条件为现有的欧美山杨杂种的组织培养方法所采用的培养基和培养条件)。

二、试验结果

对比试验结果见表1

表1生根继代和无根继代的效果比较

从对比试验结果可见，试验组无论是从苗木成活率、植株长势还是生长速度等方面都明显要优于对照组。

Claims

1.一种欧美山杨杂种Populus tremula×P.tremuloides组织培养的快速繁殖方法，其特征是包括以下步骤：（1）欧美山杨杂种的外植体消毒后接种在启动培养基上培养，得到无菌试管苗；（2）将步骤（1）所得到无菌试管苗截段，插入分化培养基中培养；（3）将步骤（2）所得到幼苗截段，插入生根培养基中进行生根培养；（4）将生根后的幼苗截段后转接至生根培养基进行继代培养；（5）炼苗、移栽，即得；

步骤（2）中所述的无菌试管苗截段按照以下方法进行：2cm以下的幼苗切去生理下端叶片，得到尖端截段直接插入分化培养基中培养；2cm以上的幼苗分割成1.5-2cm的截段，切去截段的生理下端叶片，分别得到尖端截段和中部截段；

步骤（3）或步骤（4）中所述的幼苗截段按照以下方法进行：将幼苗从培养基中取出，切取单棵幼苗；2cm以下的幼苗切去生理下端叶片得到尖端截段；2cm以上的幼苗分割成1.5-2cm的截段，将截段生理下端叶片切去，分别得到尖端截段和中部截段；

步骤（1）中所述的欧美山杨杂种的外植体是欧美山杨杂种的嫩茎或新叶；

步骤（1）中所述的启动培养基的组成为：WPM+6-BA 1.0mg/L+2%绵白糖；

步骤（2）中所述的分化培养基的组成成分及配制方法包括：其组成成分：去除肌醇的WPM+6-BA1.0mg/L+KT 0.5mg/L+2%绵白糖；其配制方法是采用自来水配制后并消毒；

步骤（3）或步骤（4）中所述的生根培养基的组成和配制方法包括：培养基的组成：去除肌醇的1/2WPM+IBA 0.5mg/L+2%绵白糖；其配制方法包括：用自来水代替蒸馏水配制培养基，用卡拉胶代替琼脂配制培养基；配制后高温高压灭菌；

其中，WPM培养基的具体组成成分如下：

。

2.按照权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于，步骤（1）中所述的消毒方式是：在接种前用清水冲洗5分钟，无菌水冲洗3～4遍，再用75%酒精浸泡30秒，边浸泡边摇动，然后用0.1%升汞灭菌2分钟，再用灭菌的蒸馏水洗4遍。