CN101896615B - 制造糖类的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种制造糖类的方法，包括使消晶化纤维素糖化，该消晶化纤维素由纤维素I型结晶度高于33％的含纤维素的原材料制得，该方法包括：使用研磨机处理含纤维素的原材料，以将该纤维素的纤维素I型结晶度降低至33％或更低，由此制备消晶化纤维素，其中从该含纤维素的原材料中除去水而获得的该含纤维素的原材料的残余物中的纤维素的含量在20重量％以上，并使纤维素酶和/或半纤维素酶作用于该消晶化纤维素。
Description
技术领域
本发明涉及制造糖类的方法。
背景技术
通过研磨含纤维素的原材料，如纸浆(pulp)而获得的纤维素已经用作工业材料，如纤维素醚、化妆品、食品和生物质(biomass)材料的原材料。近年来，考虑到例如解决环境问题，已经试图由生物质材料制造糖类，并通过发酵技术将糖类转化为乙醇或乳酸。在使用例如纤维素酶的酶由生物质材料制造糖类中，在预处理步骤中获得纤维素晶体结构被消晶化(decrystallized)的纤维素是尤其有用的。例如，JP2006-223152A公开了通过使用纤维素溶剂，如氯化锂/二甲基乙酰胺，将纤维素消晶化。
同样，借助于研磨机机械处理纸浆以降低纸浆中纤维素的结晶度，这是已知的方法。
在JP 62-236801A的实施例1和4中，公开了使用振动球磨机或双螺杆挤压机处理浆板(sheet-like pulp)的方法。在JP 2003-64184A的实施例1至3中，公开了用球磨机处理纸浆的方法。在JP 2004-331918A的实施例1和2中，公开了用球磨机并进一步用气铣(air mill)处理通过对纸浆施以例如水解的化学处理所获得的纤维素粉末的方法。JP2005-68140A公开了用介质型研磨机，如振动球磨机处理保持分散在水中的纸浆的方法。
但是，当纤维素的结晶度降低时，这些方法未能获得令人满意的效率和生产能力。
同时，JP 2003-135052A公开了利用特定的纤维素酶糖化纤维素的方法。JP 2007-74992A和JP 2007-74993A公开了使用过氧化氢接着进行酶处理的糖化方法，其中纤维素或半纤维素已经用热水处理过。
但是，这些方法在糖化效率和生产能力方面不能令人满意。
发明内容
本发明涉及制造糖类的方法，包括使消晶化纤维素糖化，所述消晶化纤维素由含纤维素的原材料制得，所述含纤维素的原材料的采用下式(I)算出的纤维素I型结晶度大于33％：
纤维素I型结晶度(％)＝[(I22.6-I18.5)/I22.6]×100 (1)，其中I22.6是在X射线衍射分析中在22.6°的衍射角2θ处测量的晶格面(002面)的衍射强度；I18.5是在X射线衍射分析中在18.5°的衍射角2θ处测量的非晶部分的衍射强度，该方法包括：
通过使用研磨机处理含纤维素的原材料，以将该纤维素的纤维素I型结晶度降低至33％或更低，由此制备消晶化纤维素，其中从所述含纤维素的原材料中除去水而获得的所述含纤维素的原材料的残余物中的纤维素的含量在20重量％以上，和
令纤维素酶和/或半纤维素酶作用于该消晶化纤维素，由此糖化该消晶化纤维素。
具体实施方式
本发明涉及制造糖类的方法，包括纤维素酶或类似酶与作为底物的消晶化纤维素之间的酶促反应，所述消晶化纤维素具有降低的纤维素I型结晶度，并由含纤维素的原材料获得。该方法能够以具有优异的生产能力的有效方式制造糖类。
本发明人已经发现，通过借助于研磨机对作为起始物料的特定含纤维素的原材料进行预处理(消晶化)，随后通过使用例如纤维素酶进行酶促反应，可以解决上述问题。
由此，本发明涉及制造糖类的方法，包括使消晶化纤维素糖化，所述消晶化纤维素由含纤维素的原材料制得，所述含纤维素的原材料的采用下式(I)算出的纤维素I型结晶度大于33％：
纤维素I型结晶度(％)＝[(I22.6-I18.5)/I22.6]×100 (1)，
其中I22.6是在X射线衍射分析中在22.6°的衍射角2θ处测量的晶格面(002面)的衍射强度；I18.5是在X射线衍射分析中在18.5°的衍射角2θ处测量的非晶部分的衍射强度，该方法包括：
使用研磨机处理含纤维素的原材料，以将该纤维素的纤维素I型结晶度降低至33％或更低，由此制备消晶化纤维素，其中从所述含纤维素的原材料中除去水而获得的所述含纤维素的原材料的残余物中的纤维素的含量在20重量％以上，和
令纤维素酶和/或半纤维素酶作用于该消晶化纤维素，由此糖化该消晶化纤维素。
下面将详细描述本发明。本文中使用的术语“纤维素I型结晶度”可以简称为“结晶度”。
[含纤维素的原材料]
从本发明中使用的含纤维素的原材料中除去水而获得的残余物的纤维素含量，为20重量％或更高，优选40重量％或更高，更优选60重量％或更高。
本发明中使用的纤维素含量指的是纤维素和半纤维素的总含量。
本发明中使用的含纤维素的原材料没有特别限制。该含纤维素的原材料的例子包括木材，如各种木屑、剪掉的枝条、疏伐废弃物和枝条；纸浆，如由木材制造的木浆、和由棉籽周围的纤维获得的棉绒浆；纸张，如报纸、瓦楞纸板、杂志和无木浆纸；植物的茎或叶，如稻草和玉米秆；以及植物的壳，如谷壳、棕榈壳和椰壳。其中，纸浆、纸张、植物的茎或叶、植物的壳和木材是优选的，纸浆和纸张是更优选的。
在市售的纸浆产品中，从中除去水获得的残余物的纤维素含量通常为75至99重量％，该纸浆还可含有木质素等作为其它成分。此外，市售的纸浆通常具有60％或更高的纤维素I型结晶度。
该含纤维素的原材料的水含量优选为20重量％或更低，更优选15重量％或更低，进一步优选10重量％或更低。当含纤维素的原材料的水含量为20重量％或更低时，该原材料易于研磨，容易通过下述研磨处理降低其结晶度，由此可以以高效率进行后继的糖类生产。
[纤维素I型结晶度]
按照本发明制备的消晶化纤维素具有33％或更低的降低的纤维素I型结晶度。由按照Segal法的X射线衍射分析测量的衍射强度值计算该纤维素I型结晶度，其由下列计算式(1)确定：
纤维素I型结晶度(％)＝[(I22.6-I18.5)/I22.6]×100 (1)，
其中I22.6是在X射线衍射分析中在22.6°的衍射角2θ处测量的晶格面(002面)的衍射强度；I18.5是在X射线衍射分析中在18.5°的衍射角2θ处测量的非晶部分的衍射强度。
33％或更低的结晶度提高了纤维素的化学反应性。例如，当生产纤维素醚时向纤维素中加入碱时，纤维素向碱纤维素的转化可以容易地进行，在纤维素醚化反应中获得提高的反应转化速率。从这一角度看来，消晶化纤维素的结晶度优选为20％或更低，更优选10％或更低，最优选0％，表明在分析该纤维素时没有检测到纤维素I型晶体。同时，由上述计算式(1)确定的纤维素I型结晶度有时可计算为负值(负数值)。由这样的负数值表示的纤维素I型结晶度被认为是0％。
本文中使用的纤维素I型结晶度指的是纤维素I型晶体占纤维素结晶区总量的比例。同样，纤维素I型指的是天然纤维素的一种晶体结构。纤维素的结晶度与其物理和化学性质有某些联系。当结晶度升高时，纤维素的硬度、密度等因其高结晶度和较少的非晶部分而升高，但伸长、柔软度、在水或溶剂中的溶解度、以及化学反应性降低。
[消晶化处理]
在本发明中，借助于研磨机处理优选具有100至500千克/立方米体积密度和0.01至1毫米平均粒径的含纤维素的原材料，以便将其中所含的纤维素的纤维素I型结晶度降低至33％或更低。当使用体积密度低于100千克/立方米的含纤维素的原材料时，优选进行预处理以由此将体积密度增加至100至500千克/立方米。由此，通过用研磨机处理该含纤维素的原材料，可以进一步研磨该原材料以降低其结晶度，由此有效地进行纤维素的消晶化。
在本发明中，优选使用介质型研磨机作为研磨机。介质型研磨机分为容器驱动型研磨机和介质搅拌型研磨机。容器驱动型研磨机包括球磨机、振动式研磨机、行星式研磨机和离心流体研磨机。在这些容器驱动型研磨机中，从良好的研磨效率和良好的生产能力的角度来看，振动式研磨机是优选的。介质搅拌型研磨机的例子包括塔型研磨机，如塔式研磨机；搅拌槽型研磨机，如超微磨碎机(Attritor)、Aquamizer和砂磨机；流体槽型研磨机，如Visco研磨机和珠磨机(Pearl mill)；流体管型研磨机；环形研磨机，如环隙球磨机(co-ball mill)；以及连续型动态研磨机。在这些介质搅拌型研磨机中，从良好的研磨效率和良好的生产能力的角度来看，搅拌槽型研磨机是优选的。当使用介质搅拌型研磨机时，其搅拌桨叶的圆周速度优选为0.5至20米/秒，更优选1至15米/秒。
参阅“Progress of Chemical Engineering(化学工程进展)；30thCollection；Control of Microparticles”，Institute of Chemical Engineering，Tokai Division，1996年10月10日，Maki-Shoten，将了解上述类型的研磨机。
该处理方法可以是分批法或连续法。
研磨机中使用的介质(研磨介质)的例子包括球、棒和管。在这些介质中，从高研磨效率和良好的生产能力的角度来看，优选的是球和棒。
研磨机中使用的介质的材料没有特殊限制。该介质的材料的例子包括铁、不锈钢、氧化铝、氧化锆、碳化硅、氮化硅和玻璃。
当振动式研磨机用作研磨机，球用作其介质时，球的外径优选为0.1至100毫米，更优选0.5至50毫米。当球的尺寸落入上述具体范围时，可以获得所需的研磨力，可以在不污染含纤维素的原材料(否则由向其中混入球的碎片而导致)的情况下有效地使纤维素消晶化。
按照本发明，采用充填有棒的振动式研磨机研磨含纤维素的原材料，由此能够有效地将该原材料中所含的纤维素消晶化，这是优选的。
使用棒作为其研磨介质的振动式研磨机的例子包括可获自ChuoKakohki Co.，Ltd.的振动式研磨机、可获自Yoshida Seisakusho Co.，Ltd.的小型振动式棒磨机“1045Model”、可获自德国的Fritsch Inc.的杯式振动研磨机“P-9Model”、和可获自Nitto Kagaku Co.，Ltd.的小型振动式研磨机“NB-O Type”。这些振动式研磨机中采用的处理方法可以是分批法或连续法。
待填充到振动式研磨机中的棒是杆状研磨介质，优选每根棒具有如多边形的截面形状；例如四方形或六边形、环形、椭圆形等。
待填充到振动式研磨机中的棒各自具有优选0.5至200毫米、更优选1至100毫米、再更优选5至50毫米的外径。棒各自的长度没有特别限制，只要该棒短于研磨机容器的长度。当棒的尺寸落入上述指定范围时，可以获得所需的研磨力，并可以在不污染纤维素粉末(否则由向其中混入的棒的碎片而导致)的情况下有效地使该纤维素消晶化。
如球和棒的介质在研磨机中的填充比依据使用的振动式研磨机的种类而改变，优选10至97％，更优选15至95％。当填充比落入上述指定范围时，含纤维素的原材料与该介质之间接触的频率提高，并可以在不阻碍研磨介质运动的情况下提高其研磨效率。本文中使用的“填充比”指的是介质的表观体积对研磨机体积的比。
研磨机中的处理时间随研磨机的种类以及例如球和棒的介质的种类、尺寸和填充比而改变，因此没有特殊限制。从降低纤维素结晶度的角度来看，处理时间优选为0.01至72小时，更优选0.01至50小时，再更优选0.05至20小时，进一步优选0.1至10小时。研磨机中的处理温度也没有特殊限制，从防止热劣化变质的角度看，优选为5至250℃，更优选10至200℃。
当进行上述处理方法时，可以由该含纤维素的原材料有效地制造纤维素I型结晶度为33％或更低的消晶化纤维素。此外，在使用研磨机处理时，可以在干燥条件下处理含纤维素的原材料，而不会令研磨的材料粘附到研磨机内部。
考虑到当该消晶化纤维素用作工业原材料时良好的化学反应性和良好的使用性能，所得的消晶化纤维素的平均粒径优选为25至150微米，优选30至100微米。特别是平均粒径为25微米或更大的消晶化纤维素在与例如水的液体接触时可以防止形成所谓的“不溶的团块或粉末”。
为了在本发明中有效地进行研磨和消晶化，送入研磨机中的含纤维素的原材料的体积密度优选为100千克/立方米或更高，更优选120千克/立方米或更高，再更优选150千克/立方米或更高。当含纤维素的原材料的体积密度为100千克/立方米或更高时，含纤维素的原材料具有合适的体积，由此具有改善的使用性能。此外，在此情况下，可以提高装入研磨机的原材料的量，由此提高研磨机的处理能力。另一方面，考虑到良好的使用性能和良好的生产能力，送入研磨机的含纤维素的原材料的体积密度的上限优选为500千克/立方米或更少，更优选400千克/立方米或更少，再更优选350千克/立方米或更少。由此观点看来，送入研磨机的含纤维素的原材料的体积密度优选为100至500千克/立方米，更优选120至400千克/立方米，再更优选150至350千克/立方米。
考虑到研磨用材料在研磨机中的有效分散，送入研磨机的含纤维素的原材料的平均粒径优选为0.01至1毫米。当含纤维素的原材料具有1毫米或更小的平均粒径时，送入研磨机的研磨用材料可以在研磨机中有效分散，并可以在不需要延长时间的情况下研磨至所需粒径。另一方面，考虑到良好的生产能力，送入研磨机的含纤维素的原材料的平均粒径的下限优选为0.01毫米或更大。由此观点看来，送入研磨机的含纤维素的原材料的平均粒径更优选为0.01至0.7毫米，再更优选0.05至0.5毫米。同时，可以通过下面的实施例中描述的方法测量前述体积密度和平均粒径。
[研磨前的预处理]
在本发明中，优选对送入前述研磨机中的含纤维素的原材料施以预处理。例如，采用挤出机处理该含纤维素的原材料，由此可以调节含纤维素的原材料的体积密度和平均粒径至落入优选范围内。
在将含纤维素的原材料装入挤出机前，优选将该材料粗研磨为碎片。粗研磨碎片的尺寸优选为1至50毫米，更优选1至30毫米。当使用尺寸为1至50毫米的粗研磨碎片状的含纤维素的原材料时，可以以有效方式容易地进行挤出机处理，由此降低研磨所需负荷。
可以用粉碎机或旋转切割机粗研磨该含纤维素的原材料。当使用旋转切割机时，可以通过改变其中使用的筛子的筛目尺寸控制所得的粗研磨材料的尺寸。该筛子的筛目尺寸优选为1至50毫米，更优选1至30毫米。当使用筛目尺寸为1毫米或更大的筛子时，可以获得具有合适的蓬松性(bulkiness)的粗研磨材料，由此提高其使用性能。当使用筛目尺寸为50毫米或更小的筛子时，该含纤维素的原材料具有适于后继研磨处理的尺寸，由此降低了研磨的负荷。
当用挤出机处理含纤维素的原材料(优选粗研磨的含纤维素的原材料)时，可以向该含纤维素的原材料施以压缩剪切力以破坏纤维素的晶体结构，并将含纤维素的原材料研磨成粉末。
在对其施以压缩剪切力以机械研磨该含纤维素的原材料的方法中，如果采用通常用于传统技术的冲击型研磨机，例如切割式研磨机、锤磨机、销棒研磨机等，研磨的材料容易产生絮凝，并因此具有极高的蓬松性，导致不好的使用性能和基于重量的处理能力的降低。另一方面，用挤出机研磨的含纤维素的原材料表现出所需的蓬松性和平均粒径，由此提高其使用性能。
挤出机可以是单螺杆型或双螺杆型。考虑到提高输送容量等，这些装置中优选使用双螺杆挤出机。
作为双螺杆挤出机，可以使用传统上已知的双螺杆挤出机，其中两根螺杆可旋转地插入缸体(cylinder)中。该双螺杆挤出机中两根螺杆的旋转方向可以相同或相反。考虑到提高输送容量等，该螺杆优选以相同的方向旋转。
挤出机中螺杆的啮合可以是完全啮合型、部分啮合型和脱离啮合型中的任一种。考虑到提高处理能力等，完全啮合型或部分啮合型是优选的。
考虑到向含纤维素的原材料施加强的压缩剪切力，该挤出机优选在其各自的螺杆的任何部分装有所谓的捏合盘部分(kneading disksegment)。
该捏合盘部分由多个捏合盘构成，所述多个捏合盘连续结合排列，同时它们的位置以恒定相位(例如以90°的间隔)偏置，并且能够通过强行令原材料经过捏合盘之间或捏合盘与缸体之间的狭窄缝隙，利用螺杆的旋转向含纤维素的原材料施加非常强的剪切力。该螺杆优选具有使得捏合盘部分和螺杆部分彼此交替排列的结构。在该双螺杆挤出机中，两根螺杆优选在结构上彼此相同。
采用挤出机处理时，优选的是，将含纤维素的原材料，优选粗研磨的含纤维素的原材料，装入挤出机中并在其中连续处理。处理时采用的剪切速率优选为10秒-1或更高，更优选20至30,000秒-1，再更优选50至3,000秒-1。当剪切速率为10秒-1或更高时，可以有效地进行含纤维素的原材料的研磨。其它处理条件没有特别限制。处理温度优选为5至200℃。
使含纤维素的原材料经过挤出机以获得充分效果的次数可以为仅一次(通过)。考虑到降低含纤维素的原材料的结晶度和聚合程度，如果一次通过的处理不令人满意，优选2次或更多次通过。同样，考虑到良好的生产能力，含纤维素的原材料经过该挤出机的次数优选为1至10次(通过)。当重复经过挤出机时，原材料中所含的粗颗粒被研磨，由此获得粒径变化小的粉末状的含纤维素的原材料。考虑到高生产能力，当2次或更多次通过时，可以串联排列多个挤出机。
[使用例如纤维素酶的酶糖化]
由于通过前述处理制造的消晶化纤维素具有低结晶度，该纤维素通过采用纤维素酶的酶促处理可以容易地高效率地形成葡萄糖与例如纤维二糖或纤维三糖的低聚糖的混合物。考虑到糖化产品在糖化后经受乙醇发酵或乳酸发酵，优选进行糖化以形成单糖。本文中使用的术语“纤维素酶”指的是水解纤维素的β-1，4-葡聚糖的糖苷键的酶，并且总体上指的是包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的酶。当例如木聚糖酶的半纤维素酶与纤维素酶结合作用时，可以提高糖化效率。
对糖化中使用的纤维素酶和半纤维素酶没有特别限制，可以使用纤维素酶的市售产品和来自于动物、植物和微生物的那些。纤维素酶的例子包括来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶产品，如Celluclast 1.5L(Novozymes的产品)；来自Bacillus sp.KSM-N145菌株(FERM P-19727)的纤维素酶；来自Bacillussp.KSM-N252(FERMP-17474)、Bacillussp.KSM-N115(FERM P-19726)、Bacillus sp.KSM-N440(FERM P-19728)、Bacillus sp.KSM-N659(FERM P-19730)等的菌株的纤维素酶；来自于绿色木霉(Trichoderma viride)、棘孢曲霉(Aspergillus acleatus)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、耐热梭状芽孢杆菌(Clostridium stercorarium)、约休梭状芽孢杆菌(Clostridium josui)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、纤维素分解酶(Acremonium cellulolyticus)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和特异腐质霉(Humicola insolens)的纤维素酶混合物；和来自于极端嗜热球古菌(Pyrococcus horikoshii)的耐热纤维素酶。其中，优选使用来自里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)或特异腐质霉(Humicola insolens)的纤维素酶(例如Celluclast 1.5L(Novozymes的产品)、TP-60(Meiii Seika Kaisha，Ltd.的产品)或Ultraflo L(Novozymes的产品))，由此有效地制造糖类。
半纤维素酶的例子包括来自于Bacillus sp.KSM-N546(FERMP-19729)的木聚糖酶；来自于黑曲霉(Aspergillus niger)、绿色木霉(Trichoderma viride)、特异腐质霉(Humicola insolens)和嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)的木聚糖酶；以及来自于Thermomyces属、Aureobasidium属、Streptomyces属、Clostridium属、Thermotoga属、Thermoascus属、Caldocellum属和Thermomonospora属的木聚糖酶。或者，也可以使用前述纤维素酶混合物中所含并具有半纤维素酶活性的酶。
这些酶可以单独使用，更优选地，酶可以结合使用，以便更有效地制造糖类。通过向这些酶中加入特定的纤维素酶，如β-葡糖苷酶，可以提高糖类生产的效率。加入到这些酶中的β-葡糖苷酶的例子包括来自于黑曲霉(Aspergillus niger)的酶(例如，Novozyme 188(Novozymes的产品)或β-葡糖苷酶(Megazyme的产品))和来自于里氏木霉(Trichoderma reesei)和青霉菌(Penicillium emersonii)的酶。
根据通过预处理获得的消晶化纤维素的结晶度和所用的酶，可以适当地选择通过进行前述处理制造的消晶化纤维素的纤维素酶介导的糖化过程的反应条件。例如，当使用Celluclast 1.5L(Novozymes的产品)作为纤维素酶，并使用来自于纸浆且结晶度为0％的纤维素作为底物时，将Celluclast 1.5L加入到0.5至20％(w/v)底物的悬浮液中，以便将酶的浓度调节为0.001至15％(v/v)(按蛋白质计为0.00017至2.5％)，并在pH调节为2至10(优选根据使用的酶的类型适当地选择pH值，并且在Celluclast 1.5L的情况下pH值优选为3至7，特别优选接近5)的缓冲液中，在10至90℃的反应温度下(优选根据使用的酶的类型适当地选择温度，并且在Celluclast 1.5L的情况下优选在20至70℃下、特别优选在大约50℃下进行该反应)进行该酶促反应30分钟至5天，更优选0.5天至3天，由此制造糖类。
实施例
通过下列方法测量消晶化纤维素或含纤维素的原材料的平均粒径、体积密度和X射线衍射强度、以及原材料的纤维素含量。在下列条件下进行纤维素的糖化，例如消晶化纤维素的糖化。
(1)测量平均粒径
采用可获自Horiba，Ltd.的激光衍射/散射型粒径分布测量装置“LA-920”测量该平均粒径。测量时，在测量其粒径前对样品施以超声处理1分钟，随后用水作为分散介质，在25℃下测量样品的平均直径。
(2)测量体积密度
采用可获自Hosokawa Micron Corporation的“Powder Tester”测量体积密度。测量时，使样品通过斜道落到正振动的筛子上，并在标准容器(容量为100毫升)中接收以测量容器中样品的重量，并由测量的值计算其体积密度。
(3)测量X射线衍射强度
按照上面的计算式(1)，由样品的X射线衍射强度计算其纤维素I型结晶度，所述X射线衍射强度采用可获自Rigaku Corporation的“Rigaku RINT 2500VC X射线衍射仪”在下列条件下测得。
测量条件：
X射线源：Cu/Kα-辐射；管电压：40kV；管电流：120mA；测量范围：2θ＝5至45°。通过压缩成各自具有320平方毫米面积和1毫米厚度的小球制备待测量的样品。X射线扫描速度为10°/分钟。
(4)测量水含量
采用可获自Kett Electric Laboratory的红外线水分测定仪“FD-610”在150℃下测量水含量。
(5)测量纤维素含量
对每个磨碎的含纤维素的原材料样品用乙醇-苯溶剂混合物(1∶1)施以索氏萃取6小时，并用乙醇进一步萃取4小时。萃取的样品在真空中在60℃下干燥。向干燥的样品(2.5克)中加入水(150毫升)、氯化钠(1.0克)和乙酸(0.2毫升)，混合物在70至80℃下加热一小时。随后，重复进行氯化钠和乙酸的加入和加热3至4次，直到样品的颜色被除去。所得白色残余物通过玻璃过滤器(1G-3)过滤，接着依次用冷水和丙酮洗涤。产品在105℃下干燥，直到其重量达到恒定值，随后测量残余物的重量。基于下式计算纤维素含量：
纤维素含量(重量％)＝[残余物重量(克)/收集的样品量(克)]×100
(6)糖化反应
在下列条件下进行酶存在下的糖化反应。具体而言，将适量的底物(纤维素粉末或消晶化纤维素)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)(含有100mM的柠檬酸盐缓冲液(pH：5.0)和30微克/毫升四环素(防腐剂)，并在实施例2-1和2-2与对比例2-1中放置在加盖螺纹管(No.3，
21×45毫米，Maruemu Corporation的产品)中，或在其它实施例和对比例中放置在加盖螺纹管(No.5，
27×55毫米，MaryemuCorporation的产品)中)中。随后，向悬浮液中加入适量的酶，混合物用恒温振荡器(型号：BR-15CF，TAITEC Corporation的产品)在50℃下以150rpm摇振并搅拌，使得反应进行6至75小时。反应完全后，通过离心(17,000xg，5分钟)将反应混合物分为沉淀物和上清液。通过下面描述的苯酚-硫酸法、DNS法或HPLC法定量测定干燥的沉淀物的重量和上清液中释放的糖类或还原糖类的量。作为对照，以相同的方式分析未反应的酶促反应混合物。
(7)通过苯酚-硫酸法(Text of Bioengineering Experiment(生物工程实验教科书)，Baifu-kan)定量测定糖类
每种上清液(0.1毫升)适当地用离子交换水稀释，并向稀释的上清液中加入5％(w/w)苯酚溶液(0.1毫升)，接着混合。进一步向其中加入硫酸(0.5毫升)，接着充分混合。所得混合物在室温下静置20分钟，并通过比色法在490纳米波长处分析。通过用葡萄糖作为标准糖类获得的校准曲线，计算上清液中所含的总糖量。
(8)通过DNS法(“Determination ofreducing sugar(还原糖的测定)”，Experimental Biochemistry，Gakkai Shuppan Center)定量测定糖类
将适量的每种上清液加入到DNS溶液(1毫升)(0.5％的3，5-二硝基水杨酸、30％的四水合酒石酸钾钠、和1.6％的氢氧化钠)中，混合物在100℃下加热5分钟以显色。冷却后，通过比色法在535纳米的波长处分析混合物。通过用葡萄糖作为标准糖类获得的校准曲线，计算上清液中所含的还原糖的量。注意，由于某些类型的生成的糖类表现出不等于葡萄糖的显色强度，测定的还原糖量可能不同于通过HPLC测定的值。
(9)通过HPLC法定量测定糖类
采用DX500色谱系统(Dionex Corporation的产品)(柱：CarboPacPAl(Dionex Corporation，4×250毫米)和检测器：ED40脉冲电流分析检测器)进行测量。使用下列洗脱液：(A)100mM氢氧化钠溶液，(B)含有1M乙酸钠的100mM氢氧化钠溶液，和(C)超纯水。在线性梯度条件下进行糖分析：A 10％-C 90％(注入时)和A 95％-B 5％(0至15分钟)。0.01％(w/v)葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的产品)、木糖(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、木二糖(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和纤维二糖(Seikagaku Corporation的产品)作为标样。
(10)定量测定蛋白质
使用DC蛋白定量试剂盒(Bio-Rad Laboratories的产品)，通过使用牛血清清蛋白作为标准蛋白质获得的校准曲线，计算蛋白质的重量。
制造例1-1
[粉碎机处理]
采用可获自Meikoshokai Co.，Ltd.的粉碎机“MSX2000-IVP440F”切割作为含纤维素的原材料的木浆板[可获自Borregaard的“Blue BearUltra Ether”，尺寸：800毫米×600毫米×1.5毫米；结晶度：81％；纤维素含量：96重量％；水含量：7重量％]，以制备尺寸为大约10毫米×5毫米×1.5毫米的切碎的纸浆。
[振动式研磨机处理]
将所得的切碎的纸浆(100克)装入可获自Chuo Kakohki Co.，Ltd.的振动式研磨机“MB-1”(总装载容量：3.5升)，并在将16根各自具有圆形截面、25毫米直径和218毫米长度的不锈钢棒放置在该振动式研磨机中(填充比：49％)的条件下，以8毫米的振幅和1,200cpm圆形转速在其中处理3小时。使用振动式研磨机处理后获得的消晶化纤维素具有80微米的平均粒径。同时，所得的消晶化纤维素的温度因处理时产生的热而高至85℃。
处理完成后，没有观察到纸浆粘附在振动式研磨机的内壁表面和底部上。将由此获得的消晶化纤维素从振动式研磨机中取出，并对其进行平均粒径和X射线衍射强度的测量。由测量的X射线衍射强度计算该该消晶化纤维素的结晶度。结果显示在表1-1中。
制造例1-2
[挤出机处理]
以2千克/小时的进料速率将切碎的纸浆(已经由与制造例1-1中所用相同的木浆板通过与制造例1-1中所用的相同方法获得)装入可获自Suehiro EPM Corporation的双螺杆挤出机“EA-20”中，并在冷却水由外部流经的同时，以660秒-1的剪切速率和300rpm的螺杆转速令其从其中经过一次(一次通过)。同时，使用的双螺杆挤出机是完全啮合和单向旋转类型的，其中分两行排列的螺杆各自装有螺杆直径为40毫米的螺杆部分和由彼此以90°间隔偏移的12块捏合盘的组合构成的捏合盘部分，这两根螺杆具有相同的构造。此外，双螺杆挤出机中的温度因处理时产生的热而升高至30至70℃。
结果，证实了挤出机处理后获得的纸浆具有121微米的平均粒径和254千克/立方米的体积密度。
[振动式研磨机处理]
以类似于制造例1-1中采用的方式对通过挤出机处理而获得的纸浆施以振动式研磨，由此制造消晶化纤维素。粉碎完成后，没有观察到纸浆粘附在该振动式研磨机的内壁表面和底部上。结果显示在表1-1中。
制造例1-3
重复与制造例1-2中描述的相同的程序，除了将13根各自具有圆形截面、30毫米直径和218毫米长度的不锈钢棒装填到该振动式研磨机中(填充比：57％)并运行该振动式研磨机1小时，由此获得消晶化纤维素。结果显示在表1-1中。
制造例1-4
重复与制造例1-2中描述的相同的程序，除了将14根不锈钢棒装填到该振动式研磨机中(填充比：62％)，由此获得消晶化纤维素。结果显示在表1-1中。
制造例1-5
重复与制造例1-2中描述的相同的程序，除了将8根各自具有36毫米直径和218毫米长度的不锈钢棒装填到该振动式研磨机中(填充比：51％)，并运行该振动式研磨机1小时，由此获得消晶化纤维素。结果显示在表1-1中。
制造例1-6
重复与制造例1-2中描述的相同的程序，除了将11根各自具有30毫米直径和218毫米长度的不锈钢棒装填到该振动式研磨机中(填充比：48％)，并运行该振动式研磨机3小时，由此获得消晶化纤维素。结果显示在表1-1中。
[表1]
表1-1
*1：双螺杆挤出机处理后纸浆的平均粒径或体积密度
*2：振动式研磨机处理后是否存在粘附在该振动式研磨机中的纸浆
*3：振动式研磨机处理后获得的消晶化纤维素的平均粒径
对比制造例1-1
进行如制造例1-1中所述的相同的粉碎机处理以获得切碎的纸浆。接着，将所得的切碎的纸浆(100克)装入可获自Nitto Kagaku Co.，Ltd.的滚磨机“Pot Mill ANZ-51S”(装载容量：1.0升；装入的10毫米φ氧化锆球：1.8千克；填充比：53％)中，并用该滚磨机在100rpm的转速下处理48小时。证实了纸浆没有粉化，仍基本保持着切碎的状态。通过上述方法由其测得的X射线衍射强度计算获得的纸浆的结晶度。结果显示在表1-2中。
对比制造例1-2
进行如制造例1-1中所述的相同的粉碎机处理以获得切碎的纸浆。接着，将所得的切碎的纸浆(500克)装入可获自Dalton Co.，Ltd.的切割研磨机“POWER MILL P-02S Model”中，并在3,000rpm的转速下在其中处理0.5小时。结果，所得的研磨的产品絮凝，由此未能获得消晶化纤维素。结果显示在表1-2中。
对比制造例1-3
进行如制造例1-1中所述的相同的粉碎机处理以获得切碎的纸浆。接着，将所得的切碎的纸浆(500克)装入可获自Dalton Co.，Ltd.的锤磨机“SAMPLE-MILL”中，并在13,500rpm的转速下在其中处理0.5小时。结果，所得的研磨的产品絮凝，由此未能获得消晶化纤维素。
结果显示在表1-2中。
对比制造例1-4
进行如制造例1-1中所述的相同的粉碎机处理以获得切碎的纸浆。接着，将所得的切碎的纸浆(500克)装入可获自Hosokawa MicronCorporation的销棒研磨机“KOLLOPLEX”中，并在13,000rpm的转速下在其中处理0.25小时。结果，所得的研磨的产品絮凝，由此未能获得消晶化纤维素。结果显示在表1-2中。
对比制造例1-5
重复制造例1-1中所述的相同程序，由此制造切碎的纸浆。随后，以类似于制造例1-2的方式，对切碎的纸浆施以双螺杆挤出机处理，但是不进行研磨处理，由此获得粉末状纸浆。通过前述分析方法，测量所得的粉末状纸浆的平均粒径和X射线衍射强度。由测量的X射线衍射强度计算获得的产品的结晶度。结果显示在表1-2中。
[表2]
表1-2
*1：研磨处理后纸浆的平均粒径
制造例1-7至1-10
通过制造例1-1中描述的方法并在制造例1-1中描述的条件下对含纤维素的材料(无木浆纸(制造例1-7，纤维素含量：83重量％，水含量：5.7重量％)、瓦楞纸板(制造例1-8，纤维素含量：84重量％，水含量：7.2重量％)、报纸(制造例1-9，纤维素含量：83重量％，水含量：7.7重量％)、和谷壳(制造例1-10，纤维素含量：60重量％，水含量：13.6重量％))进行粉碎机处理，然后通过制造例1-2中描述的方法并在制造例1-2中描述的条件下进行挤出机处理。在挤出机处理后获得的含纤维素材料的性质如下：(制造例1-7)无木浆纸，平均粒径71微米/体积密度274千克/立方米；(制造例1-8)瓦楞纸板，平均粒径93微米/体积密度216千克/立方米；(制造例1-9)报纸，平均粒径61微米/体积密度303千克/立方米；和(制造例1-10)谷壳，平均粒径85微米/体积密度380千克/立方米。
这些材料通过制造例1-6中描述的方法并在制造例1-6中描述的条件下进一步施以振动式研磨机处理，由此制造消晶化纤维素。其性质如下：(制造例1-7)无木浆纸，结晶度0％/平均粒径42微米，(制造例1-8)瓦楞纸板，结晶度0％/平均粒径48微米，(制造例1-9)报纸，结晶度0％/平均粒径55微米，和(制造例1-10)谷壳，结晶度0％/平均粒径48微米。
制造例1-11至1-12
[剪除的枝条的粗研磨处理]
作为含纤维素的原材料，道旁树的棒状、剪除的枝条(日本樱花(Prunus yedoensis)、乌冈栎(Quercus phillyraeoides)、樟脑树、麻栎(Quercus acutissima)和凌霄花(Campsis grandiflora))的混合物(制造例1-11)(φ：10毫米×300毫米，纤维素含量：67重量％，水含量：12重量％)，和柑橘树的棒状、剪除的枝条(制造例1-12)(φ：10毫米×500毫米，纤维素含量：64重量％，水含量：22重量％)采用塑料研磨机(型号：JC-2，Morita Seiki Kogyo Co.，Ltd.的产品)进行研磨，由此制造该材料的碎片(大约2毫米×3毫米×1毫米)。随后，制造的路旁树碎片和柑橘树的剪除的枝条的碎片用干燥机干燥至水含量分别为2.3重量％和3.5重量％。柑橘树的剪除的枝条的碎片发现具有224千克/立方米的体积密度。
[剪除的枝条的振动式研磨机处理]
由此制造的剪除的枝条的碎片通过制造例1-6中描述的方法和在制造例1-6中描述的条件下进一步施以振动式研磨机处理，由此制造消晶化纤维素。其性质如下：(制造例1-11)路旁树的枝条，结晶度0％/平均粒径49微米，和(制造例1-12)柑橘树，结晶度0％/平均粒径44微米。
对比制造例1-6至1-11
制造例1-7至1-10的含纤维素的原材料以相同的方式施以粉碎机处理和挤出机处理。制造例1-11的路旁树剪除的枝条和制造例1-12的柑橘树剪除的枝条也用塑料研磨机以相同的方式施以粗研磨处理，但是不施以振动式研磨机处理。由此，得到粉末状和切碎的纤维素产品。其性质如下：(对比制造例1-6)无木浆纸，结晶度71％/平均粒径71微米；(对比制造例1-7)瓦楞纸板，结晶度71％/平均粒径93微米；(对比制造例1-8)报纸，结晶度56％/平均粒径61微米；(对比制造例1-9)谷壳，结晶度47％/平均粒径85微米；(对比制造例1-10)路旁树剪除的枝条，结晶度51％/尺寸2毫米×3毫米×1毫米；和(对比制造例1-11)柑橘树剪除的枝条，结晶度46％/尺寸2毫米×3毫米×1毫米。
实施例1-1和对比例1-1
在实施例1-1中，对通过挤出机处理和采用制造例1-6中的棒介质的振动式研磨机处理制备的消晶化纤维素(结晶度：0％，粒径：57微米)用纤维素酶标准样品(Celluclast 1.5L，Novozymes的产品)施以糖化反应。同样地，在对比例1-1中，通过对比制造例1-5中的挤出机处理制造的粉末状纸浆(结晶度：76％，粒径：156微米)经历相同的反应。将消晶化纤维素或粉末状纸浆(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)(含有100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、3％(v/v)Celluclast1.5L(按蛋白质计0.5％)和30微克/毫升四环素)中，并使该混合物在50℃下反应18小时、26小时和42小时，在此过程中摇振并搅拌该混合物。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原类(按葡萄糖计)的量。结果显示在表1-3中。
[表3]
表1-3
实施例1-2至1-4和对比例1-2至1-4
在实施例1-2至1-4中，在前述的制造例1-6的条件下制备消晶化纤维素(实施例1-2至1-4：结晶度0％/平均粒径57微米)。在对比例1-2至1-4中，使用对比制造例1-5中制备的粉末状纸浆产品(对比例1-2至1-4：结晶度76％/平均粒径156微米)。每个样品使用纤维素酶标准样品(Celluclast 1.5L，Novozymes的产品)施以糖化反应。将每个消晶化纤维素和粉末状纸浆产品(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并令混合物在50℃下反应6小时、24小时、48小时和72小时，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用下列酶促反应混合物：(实施例1-2和对比例1-2)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、3％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.5％)和30微克/毫升四环素)；(实施例1-3和对比例1-3)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、1.5％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.25％)和30微克/毫升四环素)；以及(实施例1-4和对比例1-4)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、0.6％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.1％)和30微克/毫升四环素)。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表1-4中。
[表4]
表1-4
实施例1-5
以下列方式采用DX500色谱系统(Dionex Corporation)(柱：CarboPac Pal(Dionex Corporation，4×250毫米)和检测器：ED40脉冲电流分析检测器)分析实施例1-2中获得的糖化混合物(反应时间：72小时)的上清液。使用下列洗脱液：(A)100mM氢氧化钠溶液，(B)含有1M乙酸钠的100mM氢氧化钠溶液，和(C)超纯水。
在线性梯度条件下进行糖分析：A 10％-C 90％(注入时)和A 95％-B5％(0至15分钟)。0.01％(w/v)葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的产品)、木糖(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、木二糖(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)和纤维二糖(Seikagaku Corporation的产品)作为标样。标样的保留时间如下：葡萄糖(大约5.5分钟)、木糖(大约6.5分钟)、木二糖(大约14分钟)和纤维二糖(大约14.5分钟)。每种糖化混合物的上清液稀释100倍，并注射等分试样(10微升)。
结果显示在表1-5中。
[表5]
表1-5
实施例1-6至1-11
在制造例1-6中采用的条件下制备的消晶化纤维素(结晶度0％/平均粒径57微米)使用纤维素酶标准样品(TP-60，Meiji Seika Kaisha，Ltd.的产品，650毫克蛋白质/克)(实施例1-6至1-8)或(Ultraflo L，Novozymes的产品，50毫克蛋白质/毫升)(实施例1-9至1-11)施以糖化反应。将每个消晶化纤维素(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并使混合物在50℃下反应24小时、48小时和72小时，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用下列酶促反应混合物：(实施例1-6)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、0.83％(w/v)TP-60(按蛋白质计0.54％)和30微克/毫升四环素)；(实施例1-7)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、0.42％(w/v)TP-60(按蛋白质计0.28％)和30微克/毫升四环素)；(实施例1-8)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、0.17％(w/v)TP-60(按蛋白质计0.11％)和30微克/毫升四环素)；(实施例1-9)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、10％(v/v)Ultraflo L(按蛋白质计0.5％)和30微克/毫升四环素)；(实施例1-10)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、5％(v/v)Ultraflo L(按蛋白质计0.25％)和30微克/毫升四环素)；以及(实施例1-11)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、2％(v/v)Ultraflo L(按蛋白质计0.1％)和30微克/毫升四环素)。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表1-6中。
[表6]
表1-6
实施例1-12和1-13
在实施例1-12和1-13中，在制造例1-6中采用的条件下制备的消晶化纤维素(结晶度0％/平均粒径57微米)使用纤维素酶标准样品(Celluclast 1.5L，Novozymes的产品)(实施例1-12)或(Celluclast 1.5L与Novozyme 188(β-葡糖苷酶)，Novozymes的产品)(实施例1-13)施以糖化反应。将每个消晶化纤维素(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并使混合物在50℃下反应6小时、24小时、48小时和75小时，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用下列酶促反应混合物：(实施例1-12)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、0.6％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.1％)和30微克/毫升四环素)和(实施例1-13)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、0.6％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.1％)、0.03％(v/v)Novozyme 188(按蛋白质计0.0075％)和30微克/毫升四环素)。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表1-7中。
[表7]
表1-7
实施例1-14和1-15
以类似于实施例1-5的方式采用DX500色谱系统(DionexCorporation)分析实施例1-12和1-13中获得的糖化混合物的上清液(反应时间：75小时)。结果显示在表1-8中。
[表8]
表1-8
实施例1-16至1-18和对比例1-5至1-7
在实施例1-16至1-18中，使用制造例1-7至1-9中制造的消晶化纤维素((实施例1-16)无木浆纸，结晶度0％/平均粒径42微米，(实施例1-17)瓦楞纸板，结晶度0％/平均粒径48微米，和(实施例1-18)报纸，结晶度0％/平均粒径55微米)。在对比例1-5至1-7中，使用对比制造例1-6至1-8中制造的粉末状纤维素((对比例1-5)无木浆纸，结晶度71％/平均粒径71微米，(对比例1-6)瓦楞纸板，结晶度71％/平均粒径93微米，和(对比例1-7)报纸，结晶度56％/平均粒径61微米)。在该实施例和对比例中，每个纤维素产品用纤维素酶标准产品(Celluclast 1.5L，Novozymes的产品)施以糖化反应。将每个消晶化纤维素和粉末状纤维素(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并使混合物在50℃下反应6小时、24小时、48小时和72小时，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用下列酶促反应混合物：(实施例1-16和1-17以及对比例1-5和1-6)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、1.5％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.25％)和30微克/毫升四环素和(实施例1-18和对比例1-7)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、12％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计2％)和30微克/毫升四环素。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表1-9中。
[表9]
表1-9
实施例1-19至1-21和对比例1-8至1-10
在实施例1-19至1-21中，使用消晶化纤维素((实施例1-19)谷壳，结晶度0％/平均粒径48微米，(实施例1-20)路旁树的剪除的枝条，结晶度0％/平均粒径49微米，和(实施例1-21)柑橘树的枝条，结晶度0％/平均粒径44微米，制造例1-10至1-12中制造)。在对比例1-8至1-10中，使用粉末状和切碎的纤维素((对比例1-8)谷壳，结晶度47％/平均粒径85微米，(对比例1-9)路旁树的剪除的枝条，结晶度51％/尺寸2毫米×3毫米×1毫米，和(对比例1-10)柑橘树的剪除的枝条，结晶度46％/尺寸2毫米×3毫米×1毫米，对比制造例1-9至1-11中制造)。在该实施例和对比例中，每个纤维素产品用纤维素酶标准产品(Celluclast 1.5L，Novozymes的产品)施以糖化反应。将每个消晶化纤维素或粉末状纤维素(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并使混合物在50℃下反应3天，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用的酶促反应混合物为100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、3％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.5％)和30微克/毫升四环素。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表1-10中。
[表10]
表1-10
由表1-1和1-2，证实了根据制造例1-1至1-6的制造消晶化纤维素的方法能够以有效的方式制造具有降低的结晶度的消晶化纤维素，并因此与对比制造例1-1至1-5相比具有优异的生产能力。此外，由制造例1-1和对比制造例1-1之间的比较可以证实，根据本发明的使用棒作为振动式研磨机的研磨介质的方法能够以有效的方式制造其结晶度降低为0％的消晶化纤维素。与对比制造例1-2至1-5中制造的那些相比，发现制造例1-1至1-6中制造的消晶化纤维素具有合适的平均粒径。
由表1-3和1-4可以清楚地看出，实施例1-1至1-4中显示的本发明的制造糖类的方法与对比例1-1至1-4相比表现出更高的生产能力。由表1-5可以清楚地看出，制造的糖类主要由葡萄糖构成。由此，本发明的方法可用于生产通过发酵制造乙醇或乳酸的原材料。由表1-6可以清楚地看出，可以有效地制造糖类，而不管该方法中使用的酶产品的类型。同样，由表1-7和1-8可以清楚地看出，向纤维素酶产品中加入β-葡糖苷酶可以更有效地制造糖类。由表1-9和1-10可以清楚地看出，本发明的制造糖类的方法对多种纤维素材料是有效的；也就是说，不仅对纸浆，也对纸张材料，如无木浆纸、瓦楞纸板和报纸；植物壳，如谷壳；以及木材。
制造例2-1
对与制造例1-1中使用的相同的木浆板施以与制造例1-1中使用的相同的粉碎机处理，并施以与制造例1-2中使用的相同的挤出机处理。使用的双螺杆挤出机的温度因处理过程中产生的热而升高至30至70℃。处理后的纸浆具有120微米的平均粒径和219千克/立方米的体积密度。随后，将所得的纸浆(130克)装入可获自Igarashi Kikai Co.，Ltd.的间歇式搅拌槽研磨机“Sand Grinder“(装载容量：800毫升；充填的5毫米φ氧化锆珠：720克；填充比：25％；搅拌桨叶直径：70毫米)。在冷却水流经该容器的夹套的同时，在2,000rpm的搅拌速度下进行研磨处理2.5小时，由此获得消晶化纤维素。
研磨处理完成后，没有观察到纸浆粘附在搅拌槽研磨机的内壁表面或底部上。将由此获得的消晶化纤维素从该搅拌槽研磨机中取出，并通过筛目尺寸为75微米的筛子，由此获得作为筛下产品的117克消晶化纤维素(基于装入的材料，相应于90重量％)。通过前述方法测量所得的筛下产品的平均粒径，并由测量的X射线衍射强度计算其结晶度。结果显示在表2-1中。
制造例2-2
重复与制造例2-1中描述的相同程序，除了用可获自Chuo KakohkiCo.，Ltd.的间歇式的振动式研磨机“MB-1”(装载容量：2.8升；充填的20毫米φ氧化锆球：7.6千克；填充比：80％)取代间歇式搅拌槽研磨机，并将作为含纤维素的原材料的纸浆(200克)装入该研磨机中，并在20Hz的振动频率和8毫米的总振幅下在其中处理4小时，由此获得消晶化纤维素。研磨处理完成后，没有观察到纸浆粘附在该振动式研磨机的内壁表面或底部上。使由此获得的消晶化纤维素通过筛目尺寸为75微米的筛子，由此获得142克消晶化纤维素的筛下产品(基于装入的含纤维素的原材料，相应于71重量％)。通过前述方法测量所得的筛下产品的平均粒径，并由测量的X射线衍射强度计算消晶化纤维素的结晶度。结果显示在表2-1中。
制造例2-3
重复与制造例2-1中描述的相同程序，除了用可获自Nitto KagakuCo.，Ltd.的振动式研磨机“Pot Mill ANZ-51S”(装载容量：1.0升；充填的10毫米φ氧化锆球：1.8千克；填充比：53％)取代该间歇式搅拌槽研磨机，并将作为含纤维素的原材料的纸浆(100克)装入该研磨机中，并在100rpm的转速下在其中处理48小时，由此获得消晶化纤维素。研磨处理完成后，没有观察到纸浆粘附在该振动式研磨机的内壁表面或底部上。使由此获得的消晶化纤维素通过筛目尺寸为75微米的筛子，由此获得63克消晶化纤维素的筛下产品(基于装入的含纤维素的原材料，相应于63重量％)。通过前述方法测量所得的筛下产品的平均粒径，并由测量的X射线衍射强度计算消晶化纤维素的结晶度。结果显示在表2-1中。
[表11]
表2-1
*1：双螺杆挤出机处理后纸浆的平均粒径或体积密度
*2：研磨机处理后是否存在粘附在该研磨机内壁上的纸浆
*3：研磨机处理后获得的通过75微米筛的消晶化纤维素的筛下产品的重量
对比制造例2-1
重复与制造例2-1中描述的相同程序，除了对纸浆施以粉碎机处理并随后施以双螺杆挤出机处理，但是不进行研磨机处理，由此获得粉末状纸浆。通过前述方法测量所得的粉末状纸浆的体积密度和平均粒径。由测量的X射线衍射强度计算获得的产品的结晶度。结果显示在表2-2中。
对比制造例2-2
进行与制造例2-1中描述的相同的粉碎机处理以获得切碎的纸浆。接着，在没有预先对纸浆施以挤出机处理的情况下，将所得的切碎的纸浆装入间歇式搅拌槽研磨机。但是，由于其高蓬松性，能够装入研磨机中的切碎的纸浆量仅为65克，是制造例2-1中装入的纸浆的一半。装料完成后，用间歇式搅拌槽研磨机在与制造例2-1中所用相同的条件下对切碎的纸浆施以处理，由此获得粉末状纸浆。结果，证实了在该处理后，观察到纸浆粘附在搅拌槽研磨机的底部上。由此获得的粉末状纸浆通过筛目尺寸为75微米的筛子，由此获得作为筛下产物的16.9克粉末状纸浆(基于装入的材料，相应于26.0重量％)。通过前述方法测量所得的筛下产物的平均粒径，并由测量的X射线衍射强度计算产品的结晶度。结果显示在表2-2中。
对比制造例2-3
进行与制造例2-1中描述的相同的粉碎机处理以获得切碎的纸浆。接着，在没有预先对纸浆施以挤出机处理的情况下，将所得的切碎的纸浆(500克)装入可获自Dalton Co.，Ltd.的切割研磨机“POWER MILLP-02S Model”，并在3,000rpm的转速下在其中处理0.5小时。获得的纸浆是体积密度为33千克/立方米的絮凝重物形式。接着，将絮凝的纸浆装入间歇式搅拌槽研磨机中。但是，因其高蓬松性，能够装入该研磨机中的絮凝的纸浆的量仅为30克。装料完成后，用间歇式搅拌槽研磨机在与制造例2-1中所用相同的条件下对絮凝的纸浆施以处理，由此获得粉末状纸浆。结果，证实了在该处理后，没有观察到纸浆粘附在搅拌槽研磨机内部。由此获得的粉末状纸浆通过筛目尺寸为75微米的筛子，由此获得作为筛下产物的23.4克粉末状纸浆(基于装入的材料，相应于78.0重量％)。通过前述方法测量所得的筛下产物的平均粒径，并由测量的X射线衍射强度计算产品的结晶度。结果显示在表2-2中。
[表12]
表2-2(1/2)
*1：双螺杆挤出机处理后纸浆的平均粒径或体积密度
*2：切割研磨机处理后纸浆的体积密度
*3：研磨机处理后是否存在粘附在研磨机内壁上的纸浆
*4：研磨机处理后获得的通过75微米筛的消晶化纤维素的筛下产品的重量
表2-2(2/2)
*3：研磨机处理后是否存在粘附在研磨机内壁上的纸浆
*4：研磨机处理后获得的通过75微米筛的消晶化纤维素的筛下产品的重量
制造例2-4至2-8
取代纸浆，通过制造例2-1描述的方法和条件对含纤维素的材料(无木浆纸(制造例2-4，纤维素含量：83重量％，水含量：5.7重量％)、瓦楞纸板(制造例2-5，纤维素含量：84重量％，水含量：7.2重量％)、报纸(制造例2-6，纤维素含量：83重量％，水含量：7.7重量％)、稻草(制造例2-7，纤维素含量：55重量％，水含量：8.0重量％)、杂志(制造例2-8，纤维素含量：60重量％，水含量：4.5重量％))施以粉碎机处理和挤出机处理。挤出机处理后获得的含纤维素的材料的性质如下：(制造例2-4)无木浆纸，平均粒径71微米/体积密度274千克/立方米；(制造例2-5)瓦楞纸板，平均粒径93微米/体积密度216千克/立方米；(制造例2-6)报纸，平均粒径61微米/体积密度303千克/立方米；(制造例2-7)稻草，平均粒径82微米/体积密度339千克/立方米；和(制造例2-8)杂志，平均粒径72微米/体积密度431千克/立方米。
这些材料通过制造例2-1中描述的方法和条件进一步施以间歇式搅拌槽研磨机处理，由此制造消晶化纤维素。其性质如下：(制造例2-4)无木浆纸，结晶度0％/平均粒径50微米，(制造例2-5)瓦楞纸板，结晶度0％/平均粒径28微米，(制造例2-6)报纸，结晶度0％/平均粒径32微米，(制造例2-7)稻草，结晶度2％/平均粒径27微米，和(制造例2-8)杂志，结晶度4％/平均粒径24微米。
对比制造例2-4
将用作含纤维素的原材料的制造例2-7的稻草(纤维素含量：55重量％；水含量：8.0重量％)通过制造例2-1所述的方法和条件施以粉碎机处理和挤出机处理。但是，没有进行间歇式搅拌槽研磨机处理，由此获得粉末状纤维素(稻草，结晶度54％/平均粒径82微米)。
实施例2-1至2-2和对比例2-1
在实施例2-1中，在制造例2-1中制造的消晶化纤维素(结晶度0％/平均粒径43微米)用作底物。在实施例2-2中，使用与制造例2-1中采用的相同方式制造的消晶化纤维素(结晶度30％/平均粒径46微米)，除了研磨机处理时间由2.5小时变为30分钟。在对比例2-1中，使用市售的粉末状纤维素产品(KC Flock，Nippon Paper Chemicals Co.，Ltd.的产品，结晶度76％，粒径26微米)。使用纤维素酶标准样品(Celluclast 1.5L，Novozymes的产品)对每个样品施以糖化反应。将每个消晶化纤维素和粉末状纸浆产品(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并使该混合物在50℃下反应24小时、48小时和72小时，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用的酶促反应混合物为100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、1％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.17％)和30微克/毫升四环素。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。测量干燥的沉淀物的重量。通过苯酚-硫酸法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表2-3中。
[表13]
表2-3
实施例2-3至2-5和对比例2-2至2-4
在实施例2-3至2-5中，在前述制造例2-1的条件下制备消晶化纤维素(结晶度0％/平均粒径43微米)。在对比例2-2至2-4中，使用在对比制造例2-1中制备的粉末状纸浆产品(结晶度76％/平均粒径156微米)。使用纤维素酶标准样品(Celluclast 1.5L，Novozymes的产品)对每个样品施以糖化反应。将消晶化纤维素或粉末状纸浆产品(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并使该混合物在50℃下反应6小时、24小时、48小时和72小时，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用下列酶促反应混合物：(实施例2-3和对比例2-2)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、3％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.5％)和30微克/毫升四环素；(实施例2-4和对比例2-3)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、1.5％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.25％)和30微克/毫升四环素；和(实施例2-5和对比例2-4)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、0.6％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.1％)和30微克/毫升四环素。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表2-4中。
[表14]
表2-4
实施例2-6
以下列方式采用DX500色谱系统(Dionex Corporation)(柱：CarboPac Pal(Dionex Corporation，4×250毫米)和检测器：ED40脉冲电流分析检测器)分析实施例2-3中获得的糖化混合物的上清液(反应时间：72小时)。使用下列洗脱液：(A)100mM氢氧化钠溶液，(B)含有1M乙酸钠的100mM氢氧化钠溶液，和(C)超纯水。
在线性梯度条件下进行糖分析：A 10％-C 90％(注入时)和A 95％-B5％(0至15分钟)。0.01％(w/v)葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、木糖(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、木二糖(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和纤维二糖(Seikagaku Corporation)作为标样。标样的保留时间如下：葡萄糖(大约5.5分钟)、木糖(大约6.5分钟)、木二糖(大约14分钟)和纤维二糖(大约14.5分钟)。每种糖化混合物的上清液稀释100倍，并注射等分试样(10微升)。结果显示在表2-5中。
[表15]
表2-5
实施例2-7至2-9和对比例2-5至2-7
在实施例2-7至2-9中，使用制造例2-4至2-6中制造的消晶化纤维素((实施例2-7)无木浆纸，结晶度0％/平均粒径50微米，(实施例2-8)瓦楞纸板，结晶度0％/平均粒径28微米，和(实施例2-9)报纸，结晶度0％/平均粒径32微米)。在对比例2-5至2-7中，使用对比制造例1-6至1-8中制造的粉末状纤维素((对比例2-5)无木浆纸，结晶度71％/平均粒径71微米，(对比例2-6)瓦楞纸板，结晶度71％/平均粒径93微米，和(对比例2-7)报纸，结晶度56％/平均粒径61微米)。在该实施例和对比例中，使用纤维素酶标准产品(Celluclast 1.5L，Novozymes)对每个纤维素产品施以糖化反应。将每个消晶化纤维素和粉末状纤维素(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并使该混合物在50℃下反应6小时、24小时、48小时和72小时，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用下列酶促反应混合物：(实施例2-7和2-8与对比例2-5和2-6)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、1.5％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.25％)和30微克/毫升四环素；以及(实施例2-9和对比例2-7)100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、12％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计2％)和30微克/毫升四环素。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表2-6中。
[表16]
表2-6
实施例2-10和对比例2-8
在实施例2-10中，使用制造例2-7中获得的消晶化纤维素(稻草，结晶度2％/平均粒径27微米)。在对比例2-8中，使用对比制造例2-4中获得的粉末状纤维素(稻草，结晶度54％/平均粒径82微米)。在该实施例和对比例中，使用纤维素酶标准产品(Celluclast 1.5L，Novozymes)对每个纤维素产品施以糖化反应。将消晶化纤维素或粉末状纤维素(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并使该混合物在50℃下反应3天，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用的酶促反应混合物为100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH：5.0)、3％(v/v)Celluclast1.5L(按蛋白质计0.5％)和30微克/毫升四环素。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表2-7中。
[表17]
表2-7
实施例2-11和2-12
在实施例2-11和2-12中，使用制造例2-6和2-8中制造的消晶化纤维素((实施例2-11)报纸，结晶度0％/平均粒径32微米和(制造例2-12)杂志，结晶度4％/平均粒径24微米)。在该实施例中，使用纤维素酶标准产品(Celluclast 1.5L，Novozymes)对每个纤维素产品施以糖化反应。将消晶化纤维素或粉末状纤维素(0.15克)悬浮在酶促反应混合物(3毫升)中，并使该混合物在50℃下反应3天，在此过程中摇振并搅拌该混合物。使用下列酶促反应混合物：(实施例2-11)100mM乙酸盐缓冲剂(pH：3.5)、3％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.5％)和30微克/毫升四环素；和(实施例2-12)200mM乙酸盐缓冲剂(pH：3.5)、3％(v/v)Celluclast 1.5L(按蛋白质计0.5％)和30微克/毫升四环素。反应完成后，反应混合物通过离心分离为沉淀物和上清液。通过DNS法定量测定释放到上清液中的还原糖(按葡萄糖计)的量。结果显示在表2-8中。
[表18]
表2-8
由表2-1和2-2，证实了根据制造例2-1至2-3的制造消晶化纤维素的方法能够以有效的方式制造具有降低的结晶度的消晶化纤维素，并因此与对比制造例2-1至2-3和1-1至1-4相比具有优异的生产能力。此外，与对比制造例2-1中制造的那些相比，发现由制造例2-1至2-3中制造的消晶化纤维素具有合适的平均粒径。
由表2-3和2-4可以清楚地看出，实施例2-1至2-5中显示的本发明的制造糖类的方法与对比例2-1至2-4相比表现出更高的生产能力。由表2-5可以清楚地看出，制造的糖类主要由葡萄糖构成。由此，本发明的方法可用于生产通过发酵制造乙醇或乳酸的原材料。由表2-6、2-7和2-8可以清楚地看出，本发明的制造糖类的方法对多种纤维素材料是有效的；也就是说，不仅对纸浆，也对纸张材料，如无木浆纸、瓦楞纸板、报纸和杂志；以及植物的茎和叶，如稻草。
工业实用性
按照本发明的制造糖类的方法，可以通过预处理由含纤维素的原材料制造具有降低的纤维素I型结晶度的消晶化纤维素。因此，可以通过酶促反应以高生产能力和效率制造糖类。由此制造的糖类可用于，例如，通过发酵或类似方法制造如乙醇和乳酸的物质。
Claims (6)
1.一种制造糖类的方法，包括使消晶化纤维素糖化，所述消晶化纤维素由含纤维素的原材料制得，所述含纤维素的原材料的采用下式(I)算出的纤维素I型结晶度大于33％：
纤维素I型结晶度(％)＝[(I22.6-I18.5)/I22.6]×100 (1)，
其中I22.6是在X射线衍射分析中在22.6°的衍射角2θ处测量的晶格面002面的衍射强度；I18.5是在X射线衍射分析中在18.5°的衍射角2θ处测量的非晶部分的衍射强度，所述方法包括：
使用研磨机处理所述含纤维素的原材料，以将所述纤维素的纤维素I型结晶度降低至33％或更低，由此制备消晶化纤维素，其中从所述含纤维素的原材料中除去水而获得的所述含纤维素的原材料的残余物中的纤维素的含量在20重量％以上，和
使纤维素酶和/或半纤维素酶作用于所述消晶化纤维素，由此糖化所述消晶化纤维素，
其中所述含纤维素的原材料具有100至500千克/立方米的体积密度，以及0.01至1毫米的平均粒径。
2.如权利要求1所述的制造糖类的方法，其中采用研磨机对所述含纤维素的原材料处理0.01至72小时。
3.如权利要求1或2所述的制造糖类的方法，其中所述含纤维素的原材料是已经采用挤出机预处理过的材料。
4.如权利要求3所述的制造糖类的方法，其中所述挤出机是双螺杆挤出机。
5.如权利要求1或2所述的制造糖类的方法，其中所述研磨机是介质类型研磨机。
6.如权利要求1或2所述的制造糖类的方法，其中所述含纤维素的原材料是选自纸浆、纸张、植物的茎或叶、植物壳和木材的至少一种。
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