CN101893625A - C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,属于试剂盒及其检测方法领域,由PBS缓冲液、PEG、抗体致敏胶乳、稳定剂、表面活性剂组成,首先采用抗体制备技术,筛选出高特异高亲和力的CRP抗体,然后采用胶乳微粒增强技术,通过特殊的化学交联剂把该抗体连接到自己合成的聚苯乙烯胶乳颗粒的表面,制备成体积扩大了近百倍具有免疫活性的免疫胶乳,本发明试剂盒能快速有效稳定的检测出人血清中C-反应蛋白(CRP)的含量,及时发现人体中的心血管疾病和炎症。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测用试剂盒,尤其涉及到一种用于测定人血清中C-反应蛋白(CRP)含量的C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒。
背景技术
近年研究发现,心血管疾病患者体内常常伴有持续的低水平的炎症,CRP为急性期蛋白的一种,在机体出现炎症时,CRP在数小时内迅速升高,CRP含量愈多,表明病变活动度愈高,炎症恢复过程中,若CRP呈阳性,预示仍有突然出现临床症状的可能性,病变消退时又迅速降到正常水平,临床实验表明,CRP作为一种炎症标记物和心血管疾患的相关性要远远高于其他已知的项目,因此对低水平的CRP的检测已经发展成为衡量患者心血管疾病危险性的重要指标。
发明内容
本发明提供了一种采用胶乳微粒增强技术,改造传统的免疫透射法试剂的C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,适用于各种类型的半自动、全自动临床生化分析仪,用于测定人血清中C-反应蛋白(CRP)含量,具有检测灵敏度高、稳定性高等优异性能。
本发明所采用的技术方案如下:C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,主要流程包括:CRP抗体检验,纯化蛋白,蛋白修饰,胶乳的合成,包被与封闭,增浊剂配置,分装;首先采用抗体制备技术,筛选出高特异高亲和力的CRP抗体,然后采用胶乳微粒增强技术,通过特殊的化学交联剂把该抗体连接到自己合成的聚苯乙烯胶乳颗粒的表面,制备成体积扩大了近百倍具有免疫活性的免疫胶乳,从而提高反应的灵敏度及检测结果的准确度。
本发明试制的关键步骤如下:
1、纯化蛋白:
1.1将血清用0.2M醋酸溶液1∶1稀释;缓慢搅拌下滴加血清和醋酸总体积X0.025ml的辛酸,室温下搅拌30min;缓慢搅拌下滴加上清和PBS总体积X0.818ml的饱和硫酸铵,室温搅拌30min;10000rpm离心10min,弃上清,以沉淀形式保存于-20℃。
1.2在进行层析纯化之前,先将上述沉淀物取出,用生理盐水复溶,测定蛋白含量,以280nm波长比色,读出OD值,除以IgG的消光系数1.4后得到蛋白含量,单位为mg/ml。
1.3将蛋白用生理盐水稀释到10mg/ml左右后方能上柱;打开用于层析的sephacryls-300柱,把上面的生理盐水吸净后,将蛋白溶液沿壁轻轻加入;待蛋白溶液全部进入柱床后,用生理盐水洗净壁上残留,然后轻轻加入生理盐水至高于柱床表面3cm处,盖上层析柱上盖,拧紧并打开进水管道,用分部收集器收集;将收集到的蛋白溶液在紫外分光光度计280nm波长下进行检测读取OD值。
1.4整个蛋白分离过程呈现第一个为小峰,第二个为大峰(主峰),主峰高度与二峰之间的谷底高度OD值的比值≥2为正常;合并主峰(IgG峰)≥2的部分,混匀,用生理盐水做适当倍数稀释,测定计算蛋白含量,计算公式为:OD值*稀释倍数/1.4,计算结果即为该溶液的IgG浓度。
2、蛋白修饰:根据蛋白含量20mg,用分析天平称取EDC66mg,将EDC加入到待修饰的蛋白溶液中。
3、胶乳的合成:水浴箱内加入纯化水1500ml,加入过硫酸钾1.65g,SDS16ml,搅拌器内充氮,搅拌溶解不少于6小时,再加入150ml苯乙烯,用脱脂棉过滤。
4、包被、封闭:
4.1量取胶乳400ml(16胶乳),置高速离心机上离心:12000rpm离心,35分钟;
4.2弃上清,留沉淀,沉淀物用生理盐水分散至800ml;
4.3将已修饰的蛋白溶液加入到胶乳溶液中混匀,置磁力搅拌器搅拌;
4.4将已包被好的胶乳,置告高速离心机,12000rpm离心,25分钟;
4.5弃上清,留沉淀,沉淀物用1%牛血清白蛋白2000ml,封闭,重复1次,2~8℃保存待用,用PB4000ml清洗,重复4次,12000rpm离心,取沉淀用胶乳稀释液稀释到2000ml;
4.6调整灵敏度,加胶乳稀释液,稀释成胶乳工作液;
4.7置冷库2-8℃保存。
5、增浊剂配置:
5.1配置0.02M的磷酸缓冲溶液;
5.2在1000ml磷酸缓冲溶液中加入1ml吐温-20。
6、分装:用灌装恒流泵按包装规格分装。
本发明所采用的检测技术原理是:将抗体定向锚定在胶乳表面,血清中的CRP与试剂中相应抗体在液相中结合成抗原抗体复合物,产生浊度变化,胶乳试剂可以特异的增大该浊度变化,增大试剂的灵敏度,该浊度变化的高低与样本中CRP的含量成正比,测定该浊度,与标准血清比较,即能得出样本血清中CRP的含量。
本发明由于采用了以上独特的技术方案,本发明具有以下的有益效果:
1、采用了胶乳增强技术的应用创新,解决了传统的免疫透射比浊法不够灵敏和精确的问题,灵敏度更高;
2、进行了工艺方法的创新,生产制备工艺更加简单,解决了传统方法在分离抗体的过程中无法完全去除蛋白酶的问题,使试剂的稳定性大大提高;
3、检测范围更宽,检测的线性范围达到:0.1~30mg/L,r≥0.99。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明:
参照附图1,C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,由PBS缓冲液、PEG、抗体致敏胶乳、稳定剂、表面活性剂组成,其制备主要流程包括:CRP抗体检验,纯化蛋白,蛋白修饰,胶乳的合成,包被与封闭,增浊剂配置,分装;首先采用抗体制备技术,筛选出高特异高亲和力的CRP抗体,然后采用胶乳微粒增强技术,通过特殊的化学交联剂把该抗体连接到自己合成的聚苯乙烯胶乳颗粒的表面,制备成体积扩大了近百倍具有免疫活性的免疫胶乳,从而提高反应的灵敏度及检测结果的准确度。
本发明试制的主要步骤如下:
1、纯化蛋白:
1.1将血清用0.2M醋酸溶液1∶1稀释;缓慢搅拌下滴加血清和醋酸总体积X0.025ml的辛酸,室温下搅拌30min;缓慢搅拌下滴加上清和PBS总体积X0.818ml的饱和硫酸铵,室温搅拌30min;10000rpm离心10min,弃上清,以沉淀形式保存于-20℃。
1.2在进行层析纯化之前,先将上述沉淀物取出,用生理盐水复溶,测定蛋白含量,以280nm波长比色,读出OD值,除以IgG的消光系数1.4后得到蛋白含量,单位为mg/ml。
1.3将蛋白用生理盐水稀释到10mg/ml左右后方能上柱;打开用于层析的sephacryls-300柱,把上面的生理盐水吸净后,将蛋白溶液沿壁轻轻加入;待蛋白溶液全部进入柱床后,用生理盐水洗净壁上残留,然后轻轻加入生理盐水至高于柱床表面3cm处,盖上层析柱上盖,拧紧并打开进水管道,用分部收集器收集;将收集到的蛋白溶液在紫外分光光度计280nm波长下进行检测读取OD值。
1.4整个蛋白分离过程呈现第一个为小峰,第二个为大峰(主峰),主峰高度与二峰之间的谷底高度OD值的比值≥2为正常;合并主峰(IgG峰)≥2的部分,混匀,用生理盐水做适当倍数稀释,测定计算蛋白含量,计算公式为:OD值*稀释倍数/1.4,计算结果即为该溶液的IgG浓度。
2、蛋白修饰:根据蛋白含量20mg,用分析天平称取EDC66mg;将EDC加入到待修饰的蛋白溶液中。
3、胶乳的合成:水浴箱内加入纯化水1500ml,加入过硫酸钾1.65g,SDS 16ml,搅拌器内充氮,搅拌溶解不少于6小时,再加入150ml苯乙烯,用脱脂棉过滤。
4、包被、封闭:
4.1量取胶乳400ml(16胶乳),置高速离心机上离心:12000rpm离心,35分钟;
4.2弃上清,留沉淀,沉淀物用生理盐水分散至800ml;
4.3将已修饰的蛋白溶液加入到胶乳溶液中混匀,置磁力搅拌器搅拌;
4.4将已包被好的胶乳,置告高速离心机,12000rpm离心,25分钟;
4.5弃上清,留沉淀,沉淀物用1%牛血清白蛋白2000ml,封闭,重复1次。2~8℃保存待用,用PB4000ml清洗,重复4次,12000rpm离心,取沉淀用胶乳稀释液稀释到2000ml;
4.6调整灵敏度,加胶乳稀释液,稀释成胶乳工作液;
4.7置冷库2-8℃保存。
5、增浊剂配置:
5.1配置0.02M的磷酸缓冲溶液;
5.2在1000ml磷酸缓冲溶液中加入1ml吐温-20。
6、分装:用灌装恒流泵按包装规格分装。
本发明试剂盒使用日立7060生化分析仪检测的性能评估分别见表1(曲线及质控)、表2(线性)、表3(重复性):
表1
表2
次数 | 低值 | 高值 |
1 | 0.87 | 12.24 |
2 | 0.8 | 13.14 |
3 | 0.88 | 14.91 |
4 | 0.85 | 12.55 |
5 | 0.86 | 14.27 |
6 | 0.82 | 14.87 |
7 | 0.82 | 12.68 |
8 | 0.81 | 11.65 |
9 | 0.85 | 10.78 |
10 | 0.78 | 12.54 |
AV | 0.834 | 12.963 |
SD | 0.032728 | 1.358464 |
CV | 3.92% | 1.05% |
表3
下面就本发明试剂盒与日本协和同类试剂盒通过罗式COBUS全自动生化分析仪使用情况作性能比较,比较参数见表4:
由上表可知本发明的试剂盒4与进口试剂相关性良好,且非常稳定。
本试剂盒的计算方法为:多点标准定标法,以第一管吸光度值作为试剂空白值,每一样本的最终ABS值计算公式为:吸光度值-试剂空白值;要坐标纸上绘制“浓度-吸光度”标准曲线;样本测得的最终ABS值参照标准曲线,得出最终浓度值。
本试剂盒的正常参考值:正常人群<2.1mg/L,危险人群>3mg/L,2.1~3mg/L为临界水平。
本发明制备的试剂盒的主要技术指标:线性范围:0.1~30mg/L,r≥0.99;准确度:X±2SD;精密度:批内精密度CV≤5%批间相对极差≤10%。
本发明制备的试剂盒的储存方式:2~8℃试剂避光储存,夏季运输注意冷藏,不得冷冻。
Claims (6)
1.C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,由PBS缓冲液、PEG、抗体致敏胶乳、稳定剂、表面活性剂组成,其特征在于:采用抗体制备技术,筛选出高特异高亲和力的CRP抗体,然后采用胶乳微粒增强技术,通过特殊的化学交联剂把该抗体连接到自己合成的聚苯乙烯胶乳颗粒的表面,制备成体积扩大了近百倍具有免疫活性的免疫胶乳,其制备的主要步骤包括:纯化蛋白,蛋白修饰,胶乳的合成,包被、封闭,增浊剂配置,分装。
2.根据权利要求1所述的C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,其特征在于:所述的纯化蛋白,其步骤为:将血清用0.2M醋酸溶液1∶1稀释,缓慢搅拌下滴加血清和醋酸总体积X0.025ml的辛酸,室温下搅拌30min,缓慢搅拌下滴加上清和PBS总体积X0.818ml的饱和硫酸铵,室温搅拌30min,10000rpm离心10min,弃上清,以沉淀形式保存于-20℃;将沉淀物用生理盐水复溶,测定蛋白含量,以280nm波长比色,读出OD值,除以IgG的消光系数1.4后得到蛋白含量;将蛋白用生理盐水稀释到10mg/ml左右后方能上柱,打开用于层析的sephacryls-300柱,把上面的生理盐水吸净后,将蛋白溶液沿壁轻轻加入,待蛋白溶液全部进入柱床后,用生理盐水洗净壁上残留,然后轻轻加入生理盐水至高于柱床表面3cm处,盖上层析柱上盖,拧紧并打开进水管道,用分部收集器收集,将收集到的蛋白溶液在紫外分光光度计280nm波长下进行检测读取OD值,整个蛋白分离过程呈现第一个为小峰,第二个为大峰(主峰),主峰高度与二峰之间的谷底高度OD值的比值≥2为正常,合并主峰(IgG峰)≥2的部分,混匀,用生理盐水做适当倍数稀释,测定计算蛋白含量,计算公式为:OD值*稀释倍数/1.4,计算结果即为该溶液的IgG浓度。
3.根据权利要求1所述的C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,其特征在于:所述的蛋白修饰,其步骤为:根据蛋白含量20mg,用分析天平称取EDC66mg,将EDC加入到待修饰的蛋白溶液中。
4.根据权利要求1所述的C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,其特征在于:所述的胶乳的合成,其步骤为:水浴箱内加入纯化水1500ml,加入过硫酸钾1.65g,SDS16ml,搅拌器内充氮,搅拌溶解不少于6小时,再加入150ml苯乙烯,用脱脂棉过滤。
5.根据权利要求1所述的C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,其特征在于:所述的增浊剂配置,其步骤为:配置0.02M的磷酸缓冲溶液,在1000ml磷酸缓冲溶液中加入1ml吐温-20。
6.根据权利要求1所述的C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒,其特征在于:所述的包被、封闭,其步骤为:量取胶乳400ml(16胶乳),置高速离心机上离心:12000rpm离心,35分钟;弃上清,留沉淀,沉淀物用生理盐水分散至800ml;将已修饰的蛋白溶液加入到胶乳溶液中混匀,置磁力搅拌器搅拌;将已包被好的胶乳,置告高速离心机,12000rpm离心,25分钟;弃上清,留沉淀,沉淀物用1%牛血清白蛋白2000ml,封闭,重复1次,2~8℃保存待用,用PB4000ml清洗,重复4次,12000rpm离心,取沉淀用胶乳稀释液稀释到2000ml;调整灵敏度,加胶乳稀释液,稀释成胶乳工作液;置冷库2-8℃保存。
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