CN101880702B - 一种采用产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵生产谷胱甘肽的方法，在发酵培养基中加入蛋白水解物、复合维生素B，并将无机硫源改为有机硫源而大幅提高谷胱甘肽产量的方法。本发明采用产朊假丝酵母为谷胱甘肽生产菌株，其在含有蛋白水解物、复合维生素和有机硫的发酵培养基中谷胱甘肽的产量可达7～10g/L，还原型大于98％。本发明的优点是在其它培养条件相同的情况下谷胱甘肽产量大幅提高，生产成本大幅降低，将改变谷胱甘肽依赖进口的局面。

Description

一种采用产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明涉及一种采用产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的方法。

技术背景

谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽化合物，是生物体内一种重要的生理活性物质，特别对维持生物体内氧化还原环境起到十分重要的作用。谷胱甘肽是属于含有巯基的、小分子肽类物质，具有两种重要的抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽分子结构中半胱氨酸上的巯基为其活性基团(故谷胱甘肽常简写为G-SH)，易与碘乙酸、芥子气(一种毒气)、铅、汞、砷等重金属盐络合，而具有了整合解毒作用。谷胱甘肽(尤其是肝细胞内的谷胱甘肽)具有非常重要的生理作用就是整合解毒作用，能与某些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、重金属)等结合，参与生物转化作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。它在临床医药、食品工业、运动营养上的应用不断增加，需求量不断增加。在临床上谷胱甘肽用于治疗和预防肿瘤、肝炎及肝损伤、解毒、辐射病及辐射防护、抗过敏、改善某些疾病的病程和症状、养颜美容护肤、增加视力及眼科疾病和抗衰老等作用。在内分泌调节的治疗中效果明显，并具有改善性功能、消除疲劳及抑制艾滋病病毒的作用。作为一抗氧化剂在现代食品加工业中广范使用，并能增强食品营养价值，改善食品风味。

谷胱甘肽的另一主要生理作用是作为体内一种重要的抗氧化剂，它能够清除掉人体内的自由基，清洁和净化人体内环境污染，从而增进了人的身心健康。由于还原型谷胱甘肽本身易受某些物质氧化，所以它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能。人体红细胞中谷胱甘肽的含量很多，这对保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态，防止溶血保护红细胞免遭氧化性破坏具有重要意义，而且还可以保护血红蛋白不受过氧化氢氧化、自由基等氧化从而使它持续正常在发挥运输氧的能力。红细胞中部分血红蛋白在过氧化氢等氧化剂的作用下，其中二价铁氧化为三价铁，使血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而失去了带氧能力。还原型谷胱甘肽既能直接与过氧化氢等氧化剂结合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能够将高铁血红蛋白还原为血红蛋白，提高体内血红蛋白的含量。

另外，维生素C也是体内一种重要的抗氧化剂。由于维生素C能可逆地加氢或脱氢，故维生素C在体内许多氧化还原反应中有重要作用。例如，许多酶的活性基团是巯基(-SH)，维生素C能够维持-SH处于还原状态而保持酶的活性；维生素C可以使氧化型谷胱甘肽转变为还原型谷胱甘肽(GSH)，使机体代谢产生的过氧化氢(H2O2)还原；维生素C还可保护维生素A、E及某些B族维生素免受氧化。因此，运用谷胱甘肽时，与维生素C并用，能够提高其功效。

GSH对于放射线、放射性药物或由于抗肿瘤药物引起的白细胞减少等症状能起到保护作用。GSH能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促其排出体外，起到中和解毒作用。SH还可保护细胞膜，使之免遭氧化性破坏，防止红细胞溶血及促进高铁血红蛋白的还原，对缺氧血症、恶心及肝脏疾病引起的不适具有缓解作用。最新研究还表明，GSH能够纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用，还可防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化能力并使皮肤产生光泽，另外，GSH在治疗眼角膜病及改善性功能方面也有很好作用。谷胱甘肽具有的广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用，随着肽类物质研究的不断深入，肽类物质具有的神奇功能不断发现，对人体的健康事业发挥越来越大的作用.

第一个谷胱甘肽制备专利发表在1938年，隋后各国科学家对它的生产开发进行了大量研究。总的说来生产谷胱甘肽的方法有萃取法、化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。萃取法是从含GSH的动植物中提取。由于含量太低此方法没有实际应用价值。化学合成法曾用于早期GSH生产，但工艺复杂，得到的产品为混旋体，分离困难，产品纯度不高。酶转化法目前还处于实验室研究阶段。在目前的4种方法中微生物发酵法最具有潜力。

微生物发酵法生产GSH在我国研究主要是从上世纪90年代开始的，取得了一些成绩，但国内发酵水平一直停留在2～3g/L，如：中国专利CN200710036925.1公开的发酵法合成谷胱甘肽的方法。虽然中国专利CN200810019761.6一种谷胱甘肽的发酵工艺，也公开了利用经过基因工程改造甲醇利用型酵母生产谷胱甘肽的方法，谷胱甘肽产量可以达到6.6g/L，但与国际水平7～10g/L(日本协和发酵)还有较大的距离。

发明内容

本发明提供一种产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽GSH的方法，其在含有蛋白水解物为10～20g/L的发酵培养基中，以产朊假丝酵母Candidautilis(Henneberg)Lodder & Kreger-van Rij作为菌种发酵65～75小时，即可得到还原型大于98％，产量为7～10g/L的谷胱甘肽。

并当发酵生长10～20小时后，滴加复合维生素B和含硫氨基酸，加入量分别为0.5～1g/L，及1～2g/L，至发酵终止前8小时停止滴加。

本发明所述的发酵培养基的组成如下：葡萄糖70g，酵母提取物20g，蛋白水解物20g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，三氯化铁0.01g，水1000ml，pH 6.0～7.0。

所述蛋白水解物包括但不限于植物水解蛋白、动物水解蛋白。

所述的复合维生素B包含但不限于B1、B2、B6、叶酸，其浓度为0.05-0.1g/L。优选的复合维生素B由B1、B2、B6、叶酸组成，其比例为B1∶B2∶B6∶叶酸＝2∶0.2∶0.1∶1。

所述的含硫氨基酸包括但不限于L-蛋氨酸、L-半胱氨酸，其浓度为0.01-0.02g/L。

发酵培养温度28～32℃，发酵罐中培养基的溶解氧不低于20％。

决定发酵成败的因素有三：菌种、培养基和培养条件，这三者相互依存。发明人在对生产菌种进行选育和培养条件研究的同时，重点对培养基进行了研究，在发酵培养基中加入蛋白水解物，并在发酵过程中滴加复合维生素B及含硫氨基酸。

本发明采用药典推荐菌种：产朊假丝酵母(Candida utilis(Henneberg)Lodder & Kreger-van Rij)作为发酵菌种。

本发明使用斜面、种子、发酵培养基及培养方法如下：

斜面培养基：12Brix  麦芽汁1000ml

蛋白胨4g  琼脂16～20g

pH自然

种子培养基：葡萄糖30g  蛋白胨20g  酵母浸提物20g

水1000ml  pH 6.5～7.2

发酵培养基：葡萄糖70g  酵母提取物20g  蛋白水解物20g

磷酸二氢钾0.5g  硫酸镁0.5g  三氯化铁0.01g

水1000ml  pH 6.0～7.0

摇瓶种子培养：斜面种子挖块接种于种子培养基中，28-32℃培养16-24小时，摇床转速200-220rpm。菌浓度大于15％(3000rpm 10分钟)、PH约5.5-6.2，无杂菌污染。此种子可接种于发酵摇瓶或接种于二级种子瓶或种子罐。

摇瓶发酵培养：500ml摇瓶内装发酵培养基60-70ml，接种量3-5％(V/V)，28-32℃培养65-75小时，摇床转速200-220rpm。在培养时间10-20小时滴加复合维生素B，其浓度0.05-0.1g/L，最终加量0.5-1g/L；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸，其浓度0.01-0.02g/L，最终加量1-2g/L。放瓶前8小时不再滴加。

发酵罐培养：50L发酵罐内装30L发酵培养基，用二级种子，接种量3-5％(V/V)，28-32℃培养65-75小时，发酵罐转速350-500rpm。在培养时间10-20小时滴加复合维生素B，其浓度0.05-0.1g/L，最终加量0.5-1g/L；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸其浓度0.01-0.02g/L，最终加量1-2g/L。在放罐前8小时不再滴加。

GSH是一种重要的化合物在临床上及食品工业中有着广泛的用途，并随着对它的深入研究用途会更加广泛。但我国GSH发酵水平一直没有根本的突破，目前仍从日本进口。本专利通过在发酵培养基中加入蛋白水解物并在发酵过程中滴加特定比例的复合维生素B、含硫氨基酸，极大地提高了GSH产量，这将改变长期依赖进口的状况。对我国医药和食品工业的发展均具有重大的意义。

我们的创新点在于：通过对培养基的大量研究，发现产朊假丝母在培养条件不变情况下(如培养温度、溶解氧、发酵时间)在培养基中加入蛋白水解物、复合维生素及含硫氨基酸，发酵水平可达7～10g/L。目前我国药用GSH全部依赖进口，而每年需求量30～50吨。我们的发明可以改变依赖进口的局面。

以下的具体实施方式是对本发明的进一步详细说明，但并非对本发明的限制，任何基于本发明实质内容作出的变形都属于本发明保护的范围。

具体实施方式

1.菌种：产朊假丝酵母(Candida utilis(Henneberg)Lodder&Kreger-van Rij)

2.培养基

斜面培养基：12Brix  麦芽汁1000ml

蛋白胨4g  琼脂16～20g

pH自然

种子培养基：葡萄糖30g  蛋白胨20g  酵母浸提物20g

水1000ml  pH 6.5～7.2

发酵培养基：葡萄糖70g  酵母提取物20g  蛋白水解物20g

磷酸二氢钾0.5g  硫酸镁0.5g  三氯化铁0.01g  水1000ml

pH 6.0～7.0

3.种子培养：斜面种子挖块接种于种子培养基中，28-32℃培养16-24小时，摇床转速200-220rpm。收集菌体(3000rpm 10分钟)，菌浓大于15％(V/V)、pH约5.5-6.2，无杂菌污染。此种子可接种于发酵摇瓶或接种于二级种子瓶或种子罐。

4.摇瓶发酵培养：500ml摇瓶内装发酵培养基60-70ml，接种量3-5％(V/V)，28～32℃培养65-75小时，摇床转速200-220rpm。在培养时间10-20小时滴加复合维生素B，其浓度0.05-0.1g/L，最终加量0.5-1g/L；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸，其浓度0.01-0.02g/L，最终加量1-2g/L。在放瓶前8小时不再滴加。

5.发酵罐培养：50L发酵罐内装30L发酵培养基，接种量3-5％(V/V)，28～32℃培养65～75小时，发酵罐转速350-500rpm。在培养时间10-20小时滴加复合维生素B，其浓度0.05-0.1g/L，最终加量0.5-1g/L；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸，其浓度0.01-0.02g/L，最终加量1-2g/L.在放罐前8小时不再滴加.

6.发酵液GSH的测定

取一定量发酵液加5倍量甲醇，超声波处理40分钟，离心，上清液注入高效液相色谱仪测定GSH含量。

本发明的发酵培养基中的蛋白水解物，可以自己制备，也可以使用市售的动物或植物蛋白胨，本发明优选的蛋白水解物为鱼胶原多肽(成都海康生物技术有限公司生产)或植物水解蛋白(HVP)(郑州天通食品配料有限公司生产)。

实施例1

按照说明书所述的GSH发酵条件，在摇瓶发酵培养的培养基中不加蛋白水解物，不滴加复合维生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸的实验结果：

GSH产率26.0mg/L/h；

GSH含量2.0g/L

还原型GSH85％。

实施例2

按照说明书所述的GSH发酵条件，在摇瓶发酵培养的培养基中加入蛋白水解物20g/L(其中动物蛋白水解物10g/L，植物蛋白水解物10g/L)，滴加复合维生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸2g/L的实验结果：

GSH产率129.0mg/L/h；

GSH含量9.7g/L

还原型GSH为98.6％。

实施例3

按照说明书所述的GSH发酵条件，在摇瓶发酵培养的培养基中不加蛋白水解物，滴加复合维生素B1g/L及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸加量2g/L的实验结果：

GSH产率45.0mg/L/h；

GSH含量3.5g/L

还原型GSH为96％。

实施例4

按照说明书所述的GSH发酵条件，在摇瓶发酵培养的培养基中只加入动物蛋白水解物20g/L，滴加复合维生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸2g/L的实验结果：

GSH产率122.0mg/L/h；

GSH含量9.1g/L

还原型GSH为98.3％。

实施例5

按照说明书所述的GSH发酵条件，在摇瓶发酵培养的培养基中只加入植物蛋白水解物20g/L，滴加复合维生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸2g/L的实验结果：

GSH产率120.0mg/L/h；

GSH含量9.0g/L

还原型大于98.2％。

实施例6

按照说明书所述的GSH发酵条件，在摇瓶发酵培养的培养基中加入蛋白水解物20g/L，但不滴加复合维生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸的实验结果：

GSH产率59.0mg/L/h；

GSH含量5.1g/L

还原型GSH为96％。

实施例7

按照说明书所述的GSH发酵条件，在50L发酵罐发酵培养的培养基中不加蛋白水解物，不滴加复合维生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸的实验结果：

GSH产率39.0mg/L/h；

GSH含量3.0g/L

还原型为86.5％。

实施例8

按照说明书所述的GSH发酵条件，在50L发酵罐发酵培养的培养基中加入蛋白水解物20g/L(其中动物蛋白水解物10g/L，植物蛋白水解物10g/L)，滴加复合维生素B1g/L及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸2g/L的实验结果：

GSH产率130.0mg/L/h；

GSH含量9.8g/L

还原型GSH为99％。

综上所述，本发明的发酵方法可以大幅提高终产物中谷胱甘肽的产量，可大大降低谷胱甘肽的成本，为我国医药和食品工业生产提供成本低廉的原料。

Claims (1)

1.一种微生物发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于：包含如下步骤

1）种子培养: 将斜面生长的产朊假丝酵母（Candida utilis） (Henneberg) Lodder & Kreger-van Rij接种于种子培养基中，28-32℃培养16-24小时，摇床转速200-220rpm，3000rpm 10分钟离心收集菌体，制备成菌浓度大于15％（V/V），pH 5.5-6.2的菌液备用；

2）发酵培养：将步骤1）的菌液接种至含有蛋白水解物的发酵培养基中,接种量3-5%（V/V），28-32℃培养65-75小时，在培养时间10-20小时时滴加复合维生素B ，其最终加量0.5-1g/L；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸，其最终加量1-2g/L；终止发酵前8小时停止滴加；得到还原型大于98％，产量为 7~10g/L的谷胱甘肽；

发酵培养基的组成如下： 葡萄糖70g，酵母提取物20g，蛋白水解物20g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，三氯化铁0.01g，水1000ml ，pH 6.0~7.0；所述蛋白水解物包括植物水解蛋白或动物水解蛋白；发酵培养基中的溶解氧不低于20% ；

所述的复合维生素B由B1、B2、B6、叶酸组成，其比例为B1:B2:B6:叶酸=2:0.2:0.1:1，浓度为0.05-0.1g/L；

所述L-蛋氨酸或L-半胱氨酸的浓度为0.01-0.02g/L。