CN101875694A

CN101875694A - TNFα的抗体及其用途

Info

Publication number: CN101875694A
Application number: CN2009100832011A
Authority: CN
Inventors: 常永生; 方福德; 董学雨; 左瑾
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS; Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2009-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2029-04-28
Also published as: CN101875694B

Abstract

本发明涉及TNFα的抗体及其用途。通过对TNFα的抗体的互补决定区进行突变，发现了高亲和力的TNFα的抗体互补决定区及全长抗体。高亲和力的TNFα的抗体可用于制备治疗TNFα介导的疾病的药物。本发明抗体在5μg剂量水平时，小鼠的存活率在70％以上。

Description

TNFα的抗体及其用途

技术领域

本发明涉及TNFα(肿瘤坏死因子alpha)的抑制剂及其用途。具体而言，本发明涉及TNFα的抗体的互补决定区、该抗体以及它们在制备治疗TNFα介导的疾病的药物中的用途。

背景技术

机体主要由单核细胞和巨噬细胞表达和分泌TNFα(肿瘤坏死因子alpha)，成熟形式的TNFα是由单链分子量为17kD的多肽组成的三聚体。TNFα诱发炎症，导致组织损伤。现研究表明TNFα介导了多种疾病，包括自体免疫性疾病、器官移植排斥、感染、脓毒血症、肿瘤等。

由于TNFα的各种伤害性的生理作用，筛选和鉴定TNFα的抑制剂可用于治疗TNFα诱发的各种疾病，而单克隆抗体是目前非常理想的TNFα活性抑制剂。目前，市场上已有三种TNFα的生物抑制剂在临床上用于治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、克罗恩病(又称局限性肠炎或节段性肠炎)、银屑病、幼年特发性关节炎、溃疡性结肠炎等多种免疫性疾病。这三种抑制剂分别是infiiximab、etanercept、adalimumab，其中adalimumab是Abbott所开发的人源性抗体(US.PatentNo.6090382)，该抗体是通过筛选和鉴定一个巨大的人源抗体噬菌体显示文库所得。

众所周知，单克隆抗体是由两条重链和两条轻链通过二硫键连接组成，而重链和轻链分别由可变区和恒定区构成，其中可变区包括3个高变区和4框架区，高变区也就是CDR区，(即互补决定区，complementarity-determining regions)，抗体的特异性由可变区决定，抗体和抗原的亲合力也是由可变区所决定，尤其是CDR区影响抗体抗原的亲合力，而抗体亲合力的大小直接决定了抗体的抑制效果。

筛选和鉴定人源抗体噬菌体文库而获得治疗性单克隆抗体是一种常用的方法，但是其缺陷是该方法鉴定的单克隆抗体的亲合力不够高，无法用于临床。并且全长的治疗性单克隆抗体必须使用哺乳动物细胞表达，生产成本很高。因此存在降低生产成本，增加抗体对TNFα的亲合力，提高治疗效果的需要。

发明内容

本发明通过抗体噬菌体显示技术通过模拟机体内CDR区氨基酸自然突变而提高对抗体TNFα亲合力。

本发明一方面提供一种TNFα的抗体或该抗体的抗原结合部分，包括轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3，所述轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3的氨基酸序列选自以下群组SEQ ID NO：1-6、SEQ ID NO：7-12、SEQ ID NO：13-18、SEQ ID NO：19-24、SEQ ID NO：25-30、SEQ ID NO：31-36、SEQID NO：37-42、SEQ ID NO：43-48、SEQ ID NO：49-54、SEQ ID NO：55-60、或SEQ IDNO：61-66。具体而言，本发明提供的一种TNFα的抗体或该抗体的功能活性片段(例如CDR)的组合，该抗体包括6个特异性CDR区(即轻链CDR1、CDR2、CDR3和重链CDR1、CDR2、CDR3)。

另一方面，本发明还提供编码上述抗体或该抗体的抗原结合部分的多核苷酸。由于密码子的简并性，本发明提供的多核苷酸可有多种并可根据表达需要根据宿主密码子偏好性选择相应的序列。优选地，本发明中对应序列为SEQ ID NO：67-72、SEQ ID NO：73-78、SEQ ID NO：79-84、SEQ ID NO：85-90、SEQ ID NO：91-96、SEQID NO：97-102、SEQ ID NO：103-108、SEQ ID NO：109-114、SEQ ID NO：115-120、SEQ ID NO：121-126或SEQ ID NO：127-132。

优选地，本发明的TNFα的抗体或该抗体的抗原结合部分的轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3的氨基酸序列为SEQ ID NO：55-60。

再一方面，本发明通过噬菌体显示技术突变adalimumab的CDR区氨基酸，其中轻链CDR1、CDR2、CDR3和重链CDR1、CDR2、CDR3中各有一个氨基酸被其他氨基酸取代，从而获得了11个比D2E7亲合力更高的克隆，所述11个克隆中轻链CDR1、CDR2、CDR3和重链CDR1、CDR2、CDR3的序列分别为SEQ IDNO：1-6、SEQ ID NO：7-12、SEQ ID NO：13-18、SEQ ID NO：19-24、SEQ ID NO：25-30、SEQ ID NO：31-36、SEQ ID NO：37-42、SEQ ID NO：43-48、SEQ ID NO：49-54、SEQID NO：55-60和SEQ ID NO：61-66。

在抗体的CDR区确定后，本领域技术人员可根据现有技术构建含有本发明中CDR区的抗体。例如，本发明提供轻链可变区序列为SEQ ID NO：133，重链可变区序列为SEQ ID NO：134的TNFα的抗体，其包括序列为SEQ ID NO：55-60的CDR区(见图5)，也可使用本发明其他组CDR区替换上述序列中对应CDR区而获得该组的全长抗体。此外，本领域技术人员理解，本发明中的全长抗体中重链恒定区可以是gamma1、gamma2、gamma3或gamma4，轻链的恒定区可以是kappa或lamda，而不影响其功能。本发明的抗体也包括这些保留本发明所述CDR区而替换其他序列所获得的抗体。

本发明也提供编码轻链可变区序列为SEQ ID NO：133，重链可变区序列为SEQID NO：134的TNFα的抗体的多核苷酸。由于密码子的简并性，本发明提供的多核苷酸可有多种并可根据表达需要根据宿主密码子偏好性选择相应的序列。优选地，所述多核苷酸轻链可变区序列为SEQ ID NO：136，重链可变区序列为SEQ IDNO：137。

另一方面，本发明还提供上述抗体在制备治疗TNFα介导的疾病的药物中的用途。

TNFα介导的疾病包括炎症和组织损伤。

具体地，所述疾病包括自体免疫性疾病、器官移植排斥、感染、脓毒血症和肿瘤等。

所述的疾病也包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、克罗恩病、银屑病、幼年特发性关节炎和溃疡性结肠炎等。

本发明提供的TNFα的抗体或该抗体的抗原结合部分，增强了对TNFα的亲合力，可以进一步提高抑制TNFα的能力，使用更低剂量的抗体即可达到相同的治疗效果，实现治疗目的，大大减轻病人治疗费用，具有重要的经济价值和社会意义。

附图说明

图1：根据D2E7的重链和轻链以及接头(linker)序列人工合成完整的核酸序列的顺序图。

图2：1B7号克隆噬菌体显示OD450nm吸光度值与野生型D2E7的比较。

图3：1B7和D2E7中和TNFα活性的比较，显示波长570nm，参考波长630nm的OD值。

图4：全长的1B7和D2E7抗体体内中和TNFα活性，显示小鼠存活率。

图5：轻链可变区序列为SEQ ID NO：133(图5A)，重链可变区序列为SEQ IDNO：134(图5B)的TNFα的抗体氨基酸序列结构图(氨基酸以单个字母表示)，其包括序列为SEQ ID NO：55-60的CDR区(方框内序列并加粗)，也可使用本发明其他组CDR区替换上述序列中对应CDR区而获得该组的全长抗体。

具体实施方式

术语说明：除非另有说明，本发明中使用的术语具有本领域公知的含义。

抗原：是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本能力是免疫原性和反应原性。最常见的抗原分子是大分子蛋白质，在本发明中，TNFα即作为抗原。

抗体：抗体是免疫系统用来鉴别和抑制外源物质的蛋白质复合体。抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。

互补决定区(complementarity-determining region，CDR)：整个抗体分子可分为恒定区和可变区(V区)两部分。重链和轻链的V区分别称为V_H和V_L。V区中，某些位置的氨基酸的组成和排列顺序变化频率更高，这些区域称为高变区(hypervariable region，HVR)。V_H和V_L各有三个高变区，V_H和V_L的三个高变区共同组成抗原结合部位，该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，故高变区又称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)，分别称为CDR1、CDR2、CDR3。

本发明中所有的氨基酸序列和多核苷酸序列可以通过本领域公知的方法人工合成。

实施例1

材料和方法：

重组人肿瘤坏死因子TNFα购自PeprotechAsia(Remcombinant HumanTNF-α，Cat：300-01A)。

噬菌体显示试剂盒购自Amersham Bioscience(Recombinant phage antibodysystem，Cat：27-9401-01)。

D2E7重链序列见SEQ ID NO：151。D2E7轻链序列见SEQ ID NO：152。

重链和轻链之间的接头序列(SEQ ID NO：138)：

5’-GGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCA-3’，编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：135)：5’-(Gly₄Ser)₃-3’，共15个氨基酸。

首先根据D2E7的重链和轻链以及接头(linker)序列，按照以下顺序人工合成完整的核酸序列：(V_H)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接头序列-(V_L)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(D2E7scFv)，见图1。

其次合成引物，通过PCR将CDR区每个氨基酸的序列突变(突变的方法参照以下文章：1，John De Kruif，et al.J Mol Biol，1995，248，97-105；2，Resi B.Gerstner，et al.J Mol Biol，2002，321，851-862；Felix F Fajdos，et al.J Mol Biol，2002，320，415-428)。

突变方法简单的说，就是合成多条突变引物，每条引物只突变一个CDR区内的任意一个氨基酸，任何一个氨基酸突变均是随即突变(合成5条突变引物用于突变重链CDR1区，合成17条突变引物用于突变重链CDR2区，合成12条突变引物用于突变重链CDR3区，合成11条突变引物用于突变轻链CDR1区，合成7条突变引物用于突变轻链CDR2区，合成9条突变引物用于突变轻链链CDR3区。)。所以使用该种突变方法，最终所得的全长序列中将在每个CDR区突变一个氨基酸，和野生型D2E7序列相比，我们得到的每个完整的序列将共突变6个氨基酸。

突变CDR区以及筛选和鉴定高亲合力的突变克隆方法和步骤：

1，以D2E7 scFv为模板，在次基础上，5条用于突变重链CDR1区的引物所构成的各种突变组合得到重链突变CDR1的文库(MHCDR1文库)。

2，以MHCDR1文库为模板，在次基础上，17条用于突变重链CDR2区的引物所构成的各种突变组合得到重链突变的CDR1CDR2的文库(MHCDR1CDR2文库)；

3，以MHCDR1CDR2文库为模板，在次基础上，12条用于突变重链CDR3区的引物所构成的各种突变组合得到重链突变的CDR1CDR2CDR3的文库(MHCDR1CDR2CDR3文库)；

4，将步骤3来源的PCR产物使用Sfi I和Not I酶切，回收酶切产物；

5，将pCANTAB5E使用相同的Sfi I和Not I酶切，回收酶切产物；

6，将步骤十和步骤十一来源的核酸连接(T4DNA ligase，Promega产品)，16℃，过夜连接；

7，将连接过夜的产物通过电转方式，转染大肠杆菌TG1，得到MHCDR1CDR2CDR3细菌文库；

8，用M13K07辅助噬菌体感染MHCDR1CDR2CDR3细菌文库，30℃，扩增过夜，得到的噬菌体上清用PEG沉淀，重悬后的噬菌体待用；

9，以TNFα作为抗原，固定到Maxisorp Star(Nunc产品)，37℃，1小时；

10，制备的噬菌体结合固定的抗原TNFα，室温，结合1小时；

11，结合的噬菌体用triethylamine洗脱，并重新感染TG1细菌，37℃，1小时，铺上2YTAG平板；

12，挑单个TG1菌落，再次用M13K07辅助噬菌体感染细菌，30℃，扩增过夜，得到的噬菌体上清用于噬菌体Elisa(抗原为TNFα，检测用HRP偶链的抗M13噬菌体抗体检测，TMB过氧化合物作为底物，检测450nm吸光度)；

13，以野生型D2E7的噬菌体作为对照，保留比野生型D2E7的噬菌体Elisa值更高的克隆；

14，抽提这些亲和力更高的克隆的质粒，混合在一起作为模板；

15，以步骤14来源的质粒为模板，在次基础上，11条用于突变轻链CDR1区的引物所构成的各种突变组合得到轻链突变CDR1的文库(MLCDR1文库)。

16，以MLCDR1文库为模板，在次基础上，7条用于突变轻链CDR2区的引物所构成的各种突变组合得到轻链突变CDR1CDR2的文库(MLCDR1CDR2文库)。

17，以MLCDR1CDR2文库为模板，在次基础上，9条用于突变轻链CDR3区的引物所构成的各种突变组合得到轻链突变CDR1CDR2CDR3的文库(MLCDR1CDR2CDR3文库)。

18，将步骤17来源的PCR产物使用Sfi I和Not I酶切，回收酶切产物；

19，将pCANTAB5E使用相同的Sfi I和Not I酶切，回收酶切产物；

20，将步骤三十和步骤三十一来源的核酸连接(T4DNA ligase，Promega产品)，16℃，过夜连接；

21，将连接过夜的产物通过电转方式，转染大肠杆菌TG1，得到MLCDR1CDR2CDR3细菌文库；

22，用M13K07辅助噬菌体感染MLCDR1CDR2CDR3细菌文库，30℃，扩增过夜，得到的噬菌体上清用PEG沉淀，重悬后的噬菌体待用；

23，以TNFα作为抗原，固定到Maxisorp Star(Nunc产品)，37℃，1小时；

24，制备的噬菌体结合固定的抗原TNFα，室温，结合1小时；

25，结合的噬菌体用triethylamine洗脱，并重新感染TG1细菌，37℃，1小时，铺上2YTAG平板；

26，挑单个TG1菌落，再次用M13K07辅助噬菌体感染细菌，30℃，扩增过夜，得到的噬菌体上清用于噬菌体Elisa(抗原为TNFα，检测用HRP偶链的抗M13噬菌体抗体检测，TMB过氧化合物作为底物，检测450nm吸光度)；

27，以野生型D2E7的噬菌体作为对照，保留比野生型D2E7的噬菌体Elisa值更高的克隆；

28，抽提亲和力更高的克隆的治疗并测序。

测序结果：

根据上述突变的方法，位于重链和轻链的每个CDR区分别突变一个氨基酸，每个克隆共突变6个氨基酸，而可变区内的框架区序列同D2E7序列完全一致，没有任何突变，采用公知的测序方法测序，结果如下(野生型轻链CDR1、2、3、重链CDR1、2、3的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO：139-144，对应多核苷酸序列见SEQ ID NO：145-150；以下只列出CDR区序列，而与D2E7相同的框架区序列没有列出，其中下面一行为其氨基酸序列，上面一行为其多核苷酸序列)。

共鉴定到11个比D2E7亲合力更高的克隆(每个克隆的LCDR1、2、3和HCDR1、2、3为一组，共11组，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1-6、SEQ ID NO：7-12、SEQ ID NO：13-18、SEQ ID NO：19-24、SEQ ID NO：25-30、SEQ ID NO：31-36、SEQID NO：37-42、SEQ ID NO：43-48、SEQ ID NO：49-54、SEQ ID NO：55-60和SEQ IDNO：61-66。对应的多核苷酸序列为SEQ ID NO：67-72、SEQ ID NO：73-78、SEQ IDNO：79-84、SEQ ID NO：85-90、SEQ ID NO：91-96、SEQ ID NO：97-102、SEQ IDNO：103-108、SEQ ID NO：109-114、SEQ ID NO：115-120、SEQ ID NO：121-126或SEQ ID NO：127-132)。

1：4E6轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTCAGGGCAAGAGAAATTACTTAGCC

R A S Q G K R N Y L A

LCDR2：GCTGCATCCACTTGGCAATCA

A A S T W Q S

LCDR3：CAAAGGTATAACCGTTCGCCGTATACT

Q R Y N R S P Y T

4E6重链CDR序列

HCDR1：GATACGGCCATGCAC

D T A M H

HCDR2：GCTATCACTTGGCATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC

A I T W H S G H I D Y A D S V E G

HCDR3：GTCTCGTACCTTAGCACCGATTCCTCCCTTGACTAT

V S Y L S T D S S L D Y

2：3C9轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTAATGGCATCAGAAATTACTTAGCC

R A S N G I R N Y L A

LCDR2：GCTGCATCCACTTTTCAATCA

A A S T F Q S

LCDR3：CAAAGGTATAACAAGGCACCGTATACT

Q R Y N K A P Y T

3C9重链CDR序列

HCDR1：GATCATGCCATGCAC

D H A M H

HCDR2：GCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATTCGGACTCTGTGGAGGGC

A I T W N S G H I D Y S D S V E G

HCDR3：GTCTCGTACCTTAGCACCGCGGAGTCCCTTGACTAT

V S Y L S T A E S L D Y

3：2F10轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTCAGGGCATCAGAAATTACTTAAGT

R A S Q G I R N Y L S

LCDR2：GCTGCATATACTTTGCAATCA

A A Y T L Q S

LCDR3：CAAAGGTATAACCGTGCACAGTATACT

Q R Y N R A Q Y T

2F10重链CDR序列

HCDR1：GATTATGCCTTTCAC

D Y A F H

HCDR2：GCTATCACTTGGAATAGTGCGCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC

A I T W N S A H I D Y A D S V E G

HCDR3：GTCTCGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTCAGTAT

V S Y L S T A S S L Q Y

4：3D8轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTCAGGGCCTGAGAAATTACTTAGCC

R A S Q G L R N Y L A

LCDR2：GCTGCATCCACTTTGCAACAT

A A S T L Q H

LCDR3：CAAAGGTATAACCGTCCTCCGTATACT

Q R Y N R P P Y T

3D8重链CDR序列

HCDR1：GATCATGCCATGCAC

D H A M H

HCDR2：GCTATCTCGTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC

A I S W N S G H I D Y A D S V E G

HCDR3：GTCCAGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTAT

V Q Y L S T A S S L D Y

5：2C11轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTAATGGCATCAGAAATTACTTAGCC

R A S N G I R N Y L A

LCDR2：GCTGCATCCACTTTGCAACAT

A A S T L Q H

LCDR3：CAAAGGTATAACCGTACGCCGTATACT

Q R Y N R T P Y T

2C11重链CDR序列

HCDR1：GATACTGCCATGCAC

D T A M H

HCDR2：GGTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC

G I T W N S G H I D Y A D S V E G

HCDR3：GTCAATTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTAT

V N Y L S T A S S L D Y

6：D2E7轻链CDR序列

LCDR1：CGGACGAGTCAGGGCATCAGAAATTACTTAGCC

R T S Q G I R N Y L A

LCDR2：GCTGCATCCACTTTGCGGTCA

A A S T L R S

LCDR3：CAAAGGTATAACCGTGCACCGTATTCG

Q R Y N R A P Y S

D2E7重链CDR序列

HCDR1：GATTATGCCATTCAC

D Y A I H

HCDR2：GCTATCACTTGGAATAGTACGCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC

A I T W N S T H I D Y A D S V E G

HCDR3：AATTCGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTAT

N S Y L S T A S S L D Y

7：3B12轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTCAGGGCATCAGAAATTACATTGCC

R A S Q G I R N Y I A

LCDR2：GCTGCAAAGACTTTGCAATCA

A A K T L Q S

LCDR3：CAAAGGTATAACCAGGCACCGTATACT

Q R Y N Q A P Y T

3B12重链CDR序列

HCDR1：GATCAGGCCATGCAC

D Q A M H

HCDR2：GCTATCACTTGGAATAATGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC

A I T W N N G H I D Y A D S V E G

HCDR3：GTCTCGTACCTTAGCACCGGTTCCTCCCTTGACTAT

V S Y L S T G S S L D Y

8：4A6轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTCAGGGCATCAGACAGTACTTAGCC

R A S Q G I R Q Y L A

LCDR2：GCTGCAGAGACTTTGCAATCA

A A E T L Q S

LCDR3：CAAAGGTATGAGCGTGCACCGTATACT

Q R Y E R A P Y T

4A6重链CDR序列

HCDR1：GATTATTCGATGCAC

D Y S M H

HCDR2：GCTATCGCGTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC

A I A W N S G H I D Y A D S V E G

HCDR3：GTCTCGTACAGGAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTAT

V S Y R S T A S S L D Y

9：4D10轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTAAGGGCATCAGAAATTACTTAGCC

R A S K G I R N Y L A

LCDR2：GCTGCATCCACTTCGCAATCA

A A S T S Q S

LCDR3：ACGAGGTATAACCGTGCACCGTATACT

T R Y N R A P Y T

4D10重链CDR序列

HCDR1：GATTATCATATGCAC

D Y H M H

HCDR2：GCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTTCTGAGGGC

A I T W N S G H I D Y A D S S E G

HCDR3：GTCTCGTACCTTAGCACCGCGTCCAAGCTTGACTAT

V S Y L S T A S K L D Y

10：1B7序列：

轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTCAGGAGATCAGAAATTACTTAGCC

R A S Q E I R N Y L A

LCDR2：GCTGCATCCTCGTTGCAATCA

A A S S L Q S

LCDR3：CAAAGGTATGATCGTGCACCGTATACT

Q R Y D R A P Y T

重链CDR序列

HCDR1：CAGTATGCCATGCAC

Q Y A M H

HCDR2：GCTATCACTTGGAATAGTGGTCACCATGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC

A I T W N S G H H D Y A D S V E G

HCDR3：GTCTCGTACCTTCCTACCGCGTCCTCCCTTGACTAT

V S Y L P T A S S L D Y

11：5F4轻链CDR序列

LCDR1：CGGGCAAGTCAGGATATCAGAAATTACTTAGCC

R A S Q D I R N Y L A

LCDR2：GCTGCATCCACTTTTCAATCA

A A S T F Q S

LCDR3：CAAAAGTATAACCGTGCACCGTATACT

Q K Y N R A P Y T

5F4重链CDR序列

HCDR1：CATTATGCCATGCAC

H Y A M H

HCDR2：GCTATCACTTATAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC

A I T Y N S G H I D Y A D S V E G

HCDR3：GTCTCGTACCTTAGCACCGCGGAGTCCCTTGACTAT

V S Y L S T A E S L D Y

噬菌体Elisa结果表明以上11个克隆对TNFα的亲合力比野生型D2E7高，其中编号为1B7的克隆其亲合力最高。

将含有D2E7和1B7表达质粒的TG1菌落在96孔板培养过夜，再用M13K07辅助噬菌体感染细菌，30℃，扩增过夜，得到的噬菌体上清用于噬菌体Elisa(抗原为TNFα，检测用HRP偶链的抗M13噬菌体抗体检测，TMB过氧化合物作为底物，检测450nm吸光度)。1B7号克隆噬菌体显示OD450nm吸光度值大约是野生型D2E7的2倍，见图2。

实施例2

以1B7为例，进一步深入研究了每一个突变氨基酸对其亲合力的影响。和野生型D2E7相比，1B7号克隆在重链和轻链的每一个CDR区均突变了一个氨基酸，共突变了6个氨基酸，将每个突变的氨基酸进行回复突变，即将其突变的氨基酸恢复为野生型的序列，噬菌体Elisa结果表明，重链CDR2区的氨基酸回复(His突变为Ile)突变并不影响抗体的亲合力，但其他5个氨基酸回复突变会影响抗体的亲合力。换句话说，其余的5个氨基酸突变均能提高D2E7的亲合力。

突变方法和噬菌体Elisa方法如上所介绍。

实施例3：全长抗体的表达和纯化

材料和方法：

中国仓鼠卵巢细胞CHO购自ATCC，重组蛋白A rProtein A购自GEHealthcare Bio-Sciences AB(rProtein A Sepharose Fast Flow，Cat：17-1279-03)，蛋白G(Protein G)购自GE Healthcare Bio-Sciences AB(rProtein A Sepharose 4 FastFlow，Cat：17-0618-06)。

全长的抗体，包括重链的可变区和恒定区(人的gamma1、gamma2，gamma3、gamma4区)，轻链的可变区和恒定区(人的kappa或λ区)，通常需要在哺乳动物细胞表达才有治疗活性。常用的的哺乳动物细胞包括CHO、NS0、COS、SP2、293等细胞。抗体的重链和轻链可以在不同的载体分开表达，也可在同一个载体上表达。载体通常需要筛选标记基因，常用的标记基因为dihydrofolate reductase(DHFR)基因(筛选药物为methotrexate)，neo基因(筛选药物为G418)。

构建好的载体可以通过化学转染方法，也可通过电转方法，稳定转染哺乳动物细胞，并在筛选药物的作用下扩增，提高细胞的表达量。

全长的抗体可以通过Protein A或Protein G亲和层析从培养基获得，再经过离子交换层析和分子筛等纯化步骤，抗体纯度可达到药用级别。

实施例4：全长抗体的功能研究

材料和方法：

小鼠成纤维细胞L929购自ATCC(ATCC number CRL-2148)，放线菌素DActinomycin-D购自sigma(Actinomycin-D，Cat：A4262)，3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑MTT购自sigma(hiazolyl Blue TetrazoliumBromide，Cat：M5655)，C57BL/6购自维通利华，氨基半乳糖D-galactosamine购自sigma(D-galactosamine，Cat：G-0500)。

为验证1B7的功能，首先将其重链和轻链的可变区分别连接到哺乳动物细胞抗体表达载体中(重链恒定区为gamma 1，轻链恒定区为kappa，其多核苷酸轻链序列为SEQ ID NO：136，重链序列为SEQ ID NO：137)，质粒电转到CHO细胞，筛选和鉴定到高表达细胞株，在无血清培养基中大量培养后，分离和纯化用于功能研究。

一，体外中和TNFα活性

TNFα能诱导小鼠L929细胞凋亡，用以下试验来验证1B7和D2E7中和TNFα活性：

操作流程：

1.将对数生长期的L929细胞50μl按50×10⁴个/孔接种于96孔板中，含4μg/ml的Actinomycin-D(放线菌素D)；

2.将抗体1B7、野生型的D2E7，配制成浓度2×10^-8M，按1/3倍比稀释；

3.将稀释好的抗体100μl与浓度2×10³pg/ml rhTNFα(重组肿瘤坏死因子)50μl混匀37℃孵育30分钟；

4.将孵育后的混合物150μl加入相对应的细胞孔中，将96孔板放入37℃，5％CO₂孵箱中培养18小时；

5.小心吸去100μl上清，加入50μl/孔MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)将96孔板放入37℃，5％CO₂孵箱中培养4小时；

6.加入20％SDS 50μl/孔将96孔板放入37℃，5％CO₂孵箱中培养16小时；

7.用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm分别测各孔OD值。

试验结果图3所示。全长的1B7中和TNFαIC50(半抑制率)所需量大约是野生型全长的D2E7的1/25，换句话说，1B7在体外中和TNFα的能力是D2E7的25倍。

二，体内中和TNFα活性

TNFα和致敏剂D-galactosamine可导致小鼠死亡，TNFα的中和试剂可保护小鼠不致死，为验证1B7在体内中和TNFα活性的能力，按照以下方法测定1B7和D2E7的体内中和TNFα能力。

C57BL/6测抗体保护存活率

1.购SPF级C57BL/6(维通利华)6周龄30只，6只/组，分5组；

2.IP(腹腔注射)0.5ml/只，分别注射PBS、5μgA3、15μgA3、5μgA0、15μgA0；

3.30分钟后IP 0.5ml/只，含有1μg rhTNFα(重组肿瘤坏死因子)和20mgD-galactosamine(氨基半乳糖)；

4.24小时后观察死亡情况。

试验结果如图4。全长的1B7和D2E7抗体体内中和TNFα活性，15μg的抗体均能保护小鼠TNFα致死，但是使用5μg的抗体时，全长的1B7能使小鼠存活率大约达到70％，而全长的D2E7能使小鼠存活率仍然是0。这一结果表明1B7体内中和TNFα的能力远远强于D2E7。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>TNFα的抗体及其用途

<130>890058CG

<160>152

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>11

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<213>人工序列

<400>1

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Gly

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Asp His Ala Met His

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Gly

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<213>人工序列

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Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Glu Ser Leu Asp Tyr

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Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ser

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<213>人工序列

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Ala Ala Tyr Thr Leu Gln Ser

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<213>人工序列

<400>15

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<213>人工序列

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Gly

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<212>PRT

<213>人工序列

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<212>PRT

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Gly Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu

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Gly

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Val Asn Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr

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Arg Thr Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala

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<212>PRT

<213>人工序列

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Ala Ala Ser Thr Leu Arg Ser

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<213>人工序列

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Gly

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Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Ile Ala

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Gly

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<400>107

gctatcactt ggaataatgg tcacatagac tatgcggact ctgtggaggg c 51

<210>108

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>108

gtctcgtacc ttagcaccgg ttcctccctt gactat 36

<210>109

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>109

cgggcaagtc agggcatcag acagtactta gcc 33

<210>110

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>110

gctgcagaga ctttgcaatc a 21

<210>111

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>111

caaaggtatg agcgtgcacc gtatact 27

<210>112

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>112

gattattcga tgcac 15

<210>113

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>113

gctatcgcgt ggaatagtgg tcacatagac tatgcggact ctgtggaggg c 51

<210>114

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>114

gtctcgtaca ggagcaccgc gtcctccctt gactat 36

<210>115

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>115

cgggcaagta agggcatcag aaattactta gcc 33

<210>116

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>116

gctgcatcca cttcgcaatc a 21

<210>117

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>117

acgaggtata accgtgcacc gtatact 27

<210>118

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>118

gattatcata tgcac 15

<210>119

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>119

gctatcactt ggaatagtgg tcacatagac tatgcggact cttctgaggg c 51

<210>120

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>120

gtctcgtacc ttagcaccgc gtccaagctt gactat 36

<210>121

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>121

cgggcaagtc aggagatcag aaattactta gcc 33

<210>122

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>122

gctgcatcct cgttgcaatc a 21

<210>123

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>123

caaaggtatg atcgtgcacc gtatact 27

<210>124

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>124

cagtatgcca tgcac 15

<210>125

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>125

gctatcactt ggaatagtgg tcaccatgac tatgcggact ctgtggaggg c 51

<210>126

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>126

gtctcgtacc ttcctaccgc gtcctccctt gactat 36

<210>127

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>127

cgggcaagtc aggatatcag aaattactta gcc 33

<210>128

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>128

gctgcatcca cttttcaatc a 21

<210>129

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>129

caaaagtata accgtgcacc gtatact 27

<210>130

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>130

cattatgcca tgcac 15

<210>131

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>131

gctatcactt ataatagtgg tcacatagac tatgcggact ctgtggaggg c 51

<210>132

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>132

gtctcgtacc ttagcaccgc ggagtccctt gactat 36

<210>133

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<400>133

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asp Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>134

<211>121

<212>PRT

<213>人工序列

<400>134

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gln Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His His Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>135

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<400>135

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210>136

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<400>136

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcaagtca ggagatcaga aattacttag cctggtatca gcaaaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatcctcgt tgcaatcagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaagg tatgatcgtg caccgtatac ttttggccag 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210>137

<211>363

<212>DNA

<213>人工序列

<400>137

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ccggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcgg cctctggatt cacctttgat cagtatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct atcacttgga atagtggtca ccatgactat 180

gcggactctg tggagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggat acggccgtat attactgtgc gaaagtctcg 300

taccttccta ccgcgtcctc ccttgactat tggggccaag gtaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210>138

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>138

ggtggaggcg gttcaggtgg aggcggttca ggtggaggcg gttca 45

<210>139

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<400>139

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210>140

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<400>140

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210>141

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>141

Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210>142

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<400>142

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210>143

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<400>143

Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu

1 5 10 15

Gly

<210>144

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>144

Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>145

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>145

cgggcaagtc agggcatcag aaattactta gcc 33

<210>146

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>146

gctgcatcca ctttgcaatc a 21

<210>147

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>147

caaaggtata accgtgcacc gtatact 27

<210>148

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>148

gattatgcca tgcac 15

<210>149

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>149

gctatcactt ggaatagtgg tcacatagac tatgcggact ctgtggaggg c 51

<210>150

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>150

gtctcgtacc ttagcaccgc gtcctccctt gactat 36

<210>151

<211>363

<212>DNA

<213>人工序列

<400>151

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ccggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcgg cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct atcacttgga atagtggtca catagactat 180

gcggactctg tggagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggat acggccgtat attactgtgc gaaagtctcg 300

taccttagca ccgcgtcctc ccttgactat tggggccaag gtaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210>152

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<400>152

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcaagtca gggcatcaga aattacttag cctggtatca gcaaaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaagg tataaccgtg caccgtatac ttttggccag 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

Claims

1.一种TNFα的抗体或该抗体的抗原结合部分，包括轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3，其特征在于，所述轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3的氨基酸序列选自以下群组SEQ ID NO：1-6、SEQ ID NO：7-12、SEQ ID NO：13-18、SEQ ID NO：19-24、SEQ ID NO：25-30、SEQ ID NO：31-36、SEQID NO：37-42、SEQ ID NO：43-48、SEQ ID NO：49-54、SEQ ID NO：55-60或SEQ IDNO：61-66。

2.编码如权利要求1所述抗体或该抗体的抗原结合部分的多核苷酸，其序列选自以下群组SEQ ID NO：67-72、SEQ ID NO：73-78、SEQ ID NO：79-84、SEQ IDNO：85-90、SEQ ID NO：91-96、SEQ ID NO：97-102、SEQ ID NO：103-108、SEQ IDNO：109-114、SEQ ID NO：115-120、SEQ ID NO：121-126或SEQ ID NO：127-132。

3.根据权利要求1所述的抗体或该抗体的抗原结合部分，其特征在于，其轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3的氨基酸序列为SEQ ID NO：55-60。

4.根据权利要求3所述的抗体或该抗体的抗原结合部分，其特征在于，其轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3的氨基酸序列中各有一个氨基酸被其他氨基酸取代。

5.根据权利要求1所述的抗体或该抗体的抗原结合部分，其特征在于其轻链可变区序列为SEQ ID NO：133，重链可变区序列为SEQ ID NO：134。

6.编码如权利要求5所述的的抗体或该抗体的抗原结合部分的多核苷酸，其轻链可变区序列为SEQ ID NO：136，重链可变区序列为SEQ ID NO：137。

7.如权利要求1、3、4、5任意一项所述的的抗体或该抗体的抗原结合部分在制备治疗TNFα介导的疾病的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，所述的疾病包括炎症和组织损伤。

9.根据权利要求7所述的用途，所述的疾病包括自体免疫性疾病、器官移植排斥、感染、脓毒血症和肿瘤。

10.根据权利要求7所述的用途，所述的疾病包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、克罗恩病、银屑病、幼年特发性关节炎和溃疡性结肠炎。