CN101869778A - 复合GMA/ZrO2共聚物微球及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及复合GMA/ZrO2共聚物微球及其制备与应用。本发明微球的粒径为120～400μm，内核组分为ZrO2，外壳组分为GMA与DVB，微球中，ZrO2的质量百分含量为0.5～14％，GMA的质量百分含量为50～70％，余量为DVB。本发明通过将含有GMA、DVB、表面改性的ZrO2、BPO、甲苯与正庚烷的聚合相与含有明胶和氯化钠的分散相水溶液混合，加热固化成微球后；再以微球为载体，在NaH、KI和Bu4NBr存在的条件下固载β-CD，得到复合GMA/ZrO2共聚物微球。本发明微球球形规则，密度大，耐酸碱和亲水性好，可作为扩张床吸附基质，应用于从石榴皮提取物中分离纯化石榴皮多酚。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合GMA/ZrO2共聚物微球及其制备方法与该共聚物微球在天然产物(石榴皮多酚)分离纯化中的应用。
背景技术
扩张床吸附(Expanded Bed Adsorption，EBA)技术是上世纪九十年代发展起来的一种新型蛋白质分离纯化技术。它能直接从发酵液、细胞培养液或匀浆液中捕获目标产物，集固液分离、浓缩和初期纯化于一个单元操作之中。这既减少了操作步骤，提高了产品收率，也降低了纯化费用和资金投入，被誉为近些年来出现的第一个新的单元操作。扩张床吸附技术综合了填充床和流化床的优点，同时克服了填充床和流化床自身的一些缺陷。吸附基质依靠液体逆流运动在床层中保持悬浮状态，同时其自身具有一定的密度和粒径分布，因此能够在扩张床中形成稳定的分级床层，满足吸附要求。
开发合适的扩张床吸附基质是扩张床技术应用的关键之一。应用于扩张床技术的吸附基质主要分核壳型和均质型两类：前者由一个或多个相对集中的颗粒组成内核，采用亲水性材料包裹高密度的惰性材料，如琼脂糖-石英砂、琼脂糖-不锈钢、葡聚糖-二氧化硅、纤维素-二氧化钛等；后者采用高密度的大孔匀质材料，整体上不具有明显的核壳结构，如多孔玻璃、多孔氟化二氧化锆、多孔陶瓷-聚丙烯酰胺等。合成共聚物微球作为基质在固定床层析中已得到广泛的应用，但其作为扩张床吸附基质发挥效用还鲜见报道。目前扩张床基质已成功地应用于包涵体、单克隆抗体、大肠杆菌匀浆、酵母细胞匀浆、枯草杆菌培养液、酵母培养液以及动物组织产物的提取，但尚未见关于扩张床基质在天然产物分离纯化中应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核壳型复合GMA/ZrO2共聚物微球及其制备方法以及该共聚物微球作为扩张床吸附基质在石榴皮提取物分离纯化石榴皮多酚中的应用。
本发明所提供的复合GMA/ZrO2共聚物微球为核壳复合结构，内核的组分为ZrO2，外壳的组分为甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA与二乙烯苯DVB，微球中，ZrO2的质量百分含量为0.5～14％，GMA的质量百分含量为50～70％，余量为DVB；共聚物微球的粒径分布范围为120～400μm。
本发明所提供的复合GMA/ZrO2共聚物微球的制备方法，包括以下步骤：
1)将ZrO2、甲苯与硬脂酸按质量比3～1∶20∶1混合，搅拌升温至85～95℃反应3～5h，烘干，得到表面改性的ZrO2；
2)将氯化钠和明胶加入去离子水中，升温至55～65℃，加热搅拌0.5～1.5h，得到含有氯化钠和明胶的分散相水溶液，分散相水溶液中氯化钠和明胶的质量分数分别为2～10％和0.5～3％；
3)将步骤1)制得的表面改性的ZrO2与单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、交联剂二乙烯苯(DVB)、引发剂过氧化苯甲酰(BPO)和致孔剂(甲苯与正庚烷)混合，搅拌得到聚合相溶液，其中，ZrO2的用量为GMA质量的1～15％，GMA与DVB的体积比为10～1∶1，BPO的用量为GMA质量的0.5～1.5％，致孔剂的用量为GMA体积的50～150％，致孔剂中，正庚烷的用量为甲苯体积的10～75％；
4)将步骤2)制得的分散相溶液与步骤3)制得的聚合相溶液按体积比1.5～5∶1混合，在55～65℃条件下搅拌反应0.5～1.5h，而后继续搅拌升温至85～95℃反应6～10h固化、洗涤、干燥，得到GMA/ZrO2共聚物微球，再将GMA/ZrO2共聚物微球加入到N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中溶胀；
5)将β-环糊精(β-CD)溶于DMF中并加入氢化钠(NaH)后，常温下搅拌反应至无氢气放出为止，得到澄清透明的β-CD钠盐溶液，其中，DMF的用量为β-CD质量的2～5倍，NaH的加入量为β-CD质量的0.1～0.5％；
6)将溶胀后的GMA/ZrO2共聚物微球加入步骤5)中制备的β-CD钠盐溶液中，并加入碘化钾(KI)与四丁基溴化铵(Bu4NBr)，其中，β-CD钠盐溶液的用量为GMA/ZrO2共聚物微球质量的5～15倍，KI与Bu4NBr的用量均为β-CD钠摩尔数的1.5～3倍，50～80℃加热搅拌反应10～15h，而后加入质量浓度为25～40％的NaOH溶液，并滴加环氧氯丙烷(EPH)和去离子水，50～80℃继续加热搅拌反应2～5h，其中，NaOH溶液的加入量为β-CD钠盐溶液体积的20～50％，EPH和去离子水的加入量均为NaOH溶液体积的10～30％，最后加入盐酸溶液调节体系至pH＝6～8后，抽滤、洗涤、烘干，得到复合GMA/ZrO2共聚物微球。
本发明采用悬浮聚合法，通过GMA骨架的空间网状结构将ZrO2颗粒紧密包埋其中，防止ZrO2的泄漏，起到了增加微球密度的作用，且保留了GMA骨架的大孔结构、亲水性和反应活性，因此，本发明所提供的复合GMA/ZrO2共聚物微球可作为扩张床吸附基质，用于从石榴皮提取物中分离纯化石榴皮多酚，具体步骤如下：
1)用复合GMA/ZrO2共聚物微球装填扩张床柱，并用浓度为0.01～0.05mol/L，pH为5～8的磷酸盐缓冲溶液平衡吸附层析柱1～2h后，将稀释后的石榴皮提取物上柱；
2)吸附结束后，用去离子水洗涤柱体至洗涤液在紫外检测中于275nm处无吸收峰；
3)用浓度为40～80％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱体积为4～10倍柱体积，分离提纯出石榴皮多酚。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明复合GMA/ZrO2共聚物微球形状规则，有利于扩张床操作的稳定；密度较大(密度为1.1～1.6g/cm3)，可以满足扩张床操作高处理量的要求；密度和粒径大小可以调节，能适应扩张床操作的不同需求；pH值使用范围广、化学性质稳定，能够满足扩张床操作在位清洗的要求；作为扩张床吸附基质，用于从石榴皮提取物中分离纯化石榴皮多酚时，分离速度快，生物相容性好，在天然产物分离纯化方面具有广泛的应用前景。
2)本发明复合GMA/ZrO2共聚物微球原料毒性低，环境污染小，成本低廉，制备工艺简单，易于控制和放大生产。
以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下述实施例中所使用的ZrO2颗粒的粒径为20-40nm。
实施例1
1)将17.5g ZrO2、400ml甲苯和17.5g硬脂酸混合，搅拌升温至95℃反应3h，烘干，得到表面改性的ZrO2；
2)于装有搅拌器、冷凝管和温度计的1L的三口烧瓶中加入1.25g明胶、5g氯化钠和250ml去离子水，升温至55℃搅拌1.5h；
3)将1g表面改性的ZrO2加入到含有100ml GMA、10ml DVB、0.5g BPO、45.5ml甲苯和4.5ml正庚烷的混合溶液中，搅拌得到稳定分散的聚合相溶液；
4)将步骤3)得到的聚合相溶液加入到步骤2)得到的分散相溶液中，调节搅拌转速至300rpm，维持转速不变，55℃下反应1.5h后，升温至85℃保温10h，固化得到白色微球，热水洗涤，丙酮抽提除去致孔剂，真空干燥至恒重，得到共聚物微球，并将60g共聚物微球加入到干燥的DMF中溶胀；
5)将50g β-CD溶解于DMF中加入0.05g NaH，常温下于普通摇床中搅拌反应至无氢气放出时为止；
6)将步骤4)中溶胀好的共聚物微球投入步骤5)中的β-CD钠盐溶液中，并加入11g KI与16.5g Bu4NBr，于50℃的水浴摇床中搅拌反应10h，而后加入125ml 25％NaOH溶液，并滴加12.5ml EPH和12.5ml去离子水后，于50℃的水浴摇床中继续搅拌反应2h，最后加入盐酸溶液调节体系pH＝6.5后，抽滤、固体产物先用DMF淋洗，再用热水洗涤直至洗涤液在紫外光谱检测中无吸收峰，筛分得到粒径分布为160～325μm，密度为1.09g/cm3的复合GMA/ZrO2共聚物微球；
7)用制得的复合GMA/ZrO2共聚物微球装填扩张床柱，装填高度为10cm，用0.01mol/L，pH＝8的磷酸盐缓冲液在线性流速为280cm/h，扩张率为2.1的条件下，平衡吸附层析柱1h后，将稀释后的石榴皮提取物上样，吸附结束后，用去离子水洗涤4个柱体积，至洗涤液在紫外光谱仪275nm无吸收峰，按照固定床模式用浓度为50％～70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱体积为9个柱体积，得到的石榴皮多酚经HPLC检测纯度为65.46％。
实施例2
1)将52.5g ZrO2、400ml甲苯和17.5g硬脂酸混合，搅拌升温至85℃反应5h，烘干，得到表面改性的ZrO2；
2)于装有搅拌器、冷凝管和温度计的1L的三口烧瓶中加入7.5g明胶、25g氯化钠和250ml去离子水，升温至65℃搅拌0.5h；
3)将16g表面改性的ZrO2加入到含有100ml GMA、100ml DVB、1.5g BPO、85ml甲苯和65ml正庚烷的混合溶液中，搅拌得到稳定分散的聚合相溶液；
4)将步骤3)得到的聚合相溶液加入到步骤2)得到的分散相溶液中，调节搅拌转速至500rpm，维持转速不变，65℃下反应0.5h，升温至95℃保温6h，固化得到白色微球，热水洗涤，丙酮抽提除去致孔剂，真空干燥至恒重，得到共聚物微球；并将30g共聚物微球加入到干燥的DMF中溶胀；
5)将50g β-CD溶解于DMF中并加入0.375g NaH，常温下于普通摇床中搅拌反应至无氢气放出时为止；
6)将步骤4)中溶胀好的共聚物微球投入步骤5)中的β-CD钠盐溶液中，并加入22g KI与33g Bu4NBr，于80℃的水浴摇床中搅拌反应15h，而后加入50ml 40％NaOH溶液，并滴加15ml EPH和15ml去离子水后，于80℃的水浴摇床中继续搅拌反应5h，最后加入盐酸溶液调节体系pH＝7.8后，抽滤、固体产物先用DMF淋洗，再用热水洗涤直至洗涤液在紫外光谱检测中无吸收峰，筛分得到粒径分布为120～380μm，密度为1.56g/cm3的复合GMA/ZrO2共聚物微球；
8)用制得的复合GMA/ZrO2共聚物微球装填扩张床柱，装填高度为15cm，用0.05mol/L，pH＝5的磷酸盐缓冲液在线性流速为370cm/h，扩张率为2.4的条件下，平衡吸附层析柱2h后，将稀释后的石榴皮提取物上样，吸附结束后，用去离子水洗涤4个柱体积，至洗涤液在紫外光谱仪275nm无吸收峰，按照固定床模式用浓度为50～70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱体积为7个柱体积，得到的石榴皮多酚经HPLC检测纯度为68.75％。
实施例3
1)将35g ZrO2、400ml甲苯和17.5g硬脂酸混合，搅拌升温至90℃反应4h，烘干，得到表面改性的ZrO2；
2)于装有搅拌器、冷凝管和温度计的1L的三口烧瓶中加入3.75g明胶、12.5g氯化钠和250ml去离子水，升温至60℃搅拌1h；
3)将12g表面改性的ZrO2加入到含有100ml GMA、40ml DVB、1.2g BPO、62.5ml甲苯和62.5ml正庚烷的混合溶液中，搅拌得到稳定分散的聚合相溶液；
4)将步骤3)得到的聚合相溶液加入到步骤2)得到的分散相溶液中，调节搅拌转速至400rpm，维持转速不变，60℃下反应1h后，升温至90℃保温8h，固化得到白色微球，热水洗涤，丙酮抽提除去致孔剂，真空干燥至恒重，得到共聚物微球；并将50g共聚物微球加入到干燥的DMF中溶胀；
5)将50g β-CD溶解于DMF中加入0.2g NaH，常温下于普通摇床中搅拌反应至无氢气放出时为止；
6)将步骤4)中溶胀好的共聚物微球投入步骤5)中的β-CD钠盐溶液中，并加入12g KI与20g Bu4NBr，于70℃的水浴摇床中搅拌反应15h，而后加入75ml 40％NaOH溶液，并滴加18ml EPH和18ml去离子水后，于70℃的水浴摇床中继续搅拌反应4h，最后加入盐酸溶液调节体系pH＝7后，抽滤、固体产物先用DMF淋洗，再用热水洗涤直至洗涤液在紫外光谱检测中无吸收峰，筛分得到粒径分布为150～355μm，密度为1.39g/cm3的复合GMA/ZrO2共聚物微球；
8)用制得的复合GMA/ZrO2共聚物微球装填扩张床柱，装填高度为10cm，用0.01mol/L，pH＝6.8的磷酸盐缓冲液在线性流速为330cm/h，扩张率为2.2的条件下，平衡吸附层析柱1h后，将稀释后的石榴皮提取物上样，吸附结束后，用去离子水洗涤4个柱体积，至洗涤液在紫外光谱仪275nm无吸收峰，按照固定床模式用浓度为50％～70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱体积为8个柱体积，得到的石榴皮多酚经HPLC检测纯度为66.93％。
Claims (3)
1.一种复合GMA/ZrO2共聚物微球，其特征在于，所述的共聚物微球为核壳复合结构，内核的组分为ZrO2，外壳的组分为甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA与二乙烯苯DVB，微球中，ZrO2的质量百分含量为0.5～14％，GMA的质量百分含量为50～70％，余量为DVB；共聚物微球的粒径分布范围为120～400μm。
2.一种复合GMA/ZrO2共聚物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将ZrO2、甲苯与硬脂酸按质量比3～1∶20∶1混合，搅拌升温至85～95℃反应3～5h，烘干，得到表面改性的ZrO2；
2)将氯化钠和明胶加入去离子水中，升温至55～65℃，加热搅拌0.5～1.5h，得到含有氯化钠和明胶的分散相水溶液，分散相水溶液中氯化钠和明胶的质量分数分别为2～10％和0.5～3％；
3)将步骤1)制得的表面改性的ZrO2与单体甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA、交联剂二乙烯苯DVB、引发剂过氧化苯甲酰BPO和致孔剂甲苯与正庚烷混合，搅拌得到聚合相溶液，其中，ZrO2的用量为GMA质量的1～15％，GMA与DVB的体积比为10～1∶1，BPO的用量为GMA质量的0.5～1.5％，致孔剂的用量为GMA体积的50～150％，致孔剂中，正庚烷的用量为甲苯体积的10～75％；
4)将步骤2)制得的分散相溶液与步骤3)制得的聚合相溶液按体积比1.5～5∶1混合，在55～65℃条件下搅拌反应0.5～1.5h，而后继续搅拌升温至85～95℃反应6～10h固化、洗涤、干燥，得到GMA/ZrO2共聚物微球，再将GMA/ZrO2共聚物微球加入到N，N-二甲基甲酰胺DMF中溶胀；
5)将β-环糊精β-CD溶于DMF中并加入氢化钠NaH后，常温下搅拌反应至无氢气放出为止，得到澄清透明的β-CD钠盐溶液，其中，DMF的用量为β-CD质量的2～5倍，NaH的加入量为β-CD质量的0.1～0.5％；
6)将溶胀后的GMA/ZrO2共聚物微球加入步骤5)中制备的β-CD钠盐溶液中，并加入碘化钾KI与四丁基溴化铵Bu4NBr，其中，β-CD钠盐溶液的用量为GMA/ZrO2共聚物微球质量的5～15倍，KI与Bu4NBr的用量均为β-CD钠摩尔数的1.5～3倍，50～80℃加热搅拌反应10～15h，而后加入质量浓度为25～40％的NaOH溶液，滴加环氧氯丙烷EPH和去离子水，50～80℃继续加热搅拌反应2～5h，其中，NaOH溶液的加入量为β-CD钠盐溶液体积的20～50％，EPH和去离子水的加入量均为NaOH溶液体积的10～30％，最后加入盐酸溶液调节体系至pH＝6～8后，抽滤、洗涤、烘干，得到复合GMA/ZrO2共聚物微球。
3.一种复合GMA/ZrO2共聚物微球的应用，其特征在于，所述的复合GMA/ZrO2共聚物微球作为扩张床吸附基质，用于从石榴皮提取物中分离纯化石榴皮多酚，具体步骤如下：
1)用复合GMA/ZrO2共聚物微球装填扩张床柱，并用浓度为0.01～0.05mo l/L，pH为5～8的磷酸盐缓冲溶液平衡吸附层析柱1～2h后，将稀释后的石榴皮提取物上柱；
2)吸附结束后，用去离子水洗涤柱体至洗涤液在紫外检测中于275nm处无吸收峰；
3)用浓度为40～80％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱体积为4～10倍柱体积，分离提纯出石榴皮多酚。
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