CN101864481A - 用于苹果枝干轮纹病抗性基因检测的scar分子标记方法 - Google Patents
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Abstract
用于苹果枝干轮纹病抗性基因检测的SCAR分子标记方法，它涉及一种基因分子标记方法。不仅可以用来对亲本材料的抗轮纹病遗传基础进行鉴别，也可以对杂交后代进行早期的选择，从而加速苹果抗轮纹病育种的进程。例如，对本研究的杂交组合来说，可淘汰1/2非r1r1基因型的个体，这也极大地降低了人力物力的消耗。另外，该标记还可为进一步克隆抗轮纹病基因和基因转移提供方法和物质基础，也可为苹果抗轮纹病的遗传规律研究和分子标记遗传连锁图的构建提供科学依据。
Description
技术领域：
本发明涉及一种基因分子标记方法，特别是涉及一种用于苹果枝干轮纹病抗性基因的分子标记方法、脱氧核糖核酸(DNA)片段的序列以及作为检测苹果枝干轮纹病抗性基因的PCR探针(寡聚核苷酸引物序列)，属于植物基因工程领域。
背景技术：
苹果为世界性重要的水果，且在我国栽培面积和产量均处于首位。苹果枝干轮纹病是目前我国苹果生产上危害严重、发生普遍的病害之一，是由轮纹病菌(Botryosphaeria berengerianaf.sp.piricola)侵染苹果枝干而引起的。其主要症状是在枝干表面形成许多瘤状突起，突起边缘产生裂缝，似马鞍状，造成树皮粗糙。轮纹病主要危害主干、主枝，严重时也可危害侧枝及小枝。轮纹病斑一般较浅，多造成树势衰弱。在弱树及弱枝上，有时病斑也可深达木质部，导致枝干枯死。近年来，随着主栽品种的更迭，质优但感病的品种栽培面积不断扩大，该病的发生与危害日趋严重，成为苹果生产上的突出问题。目前该病还没有有效的防治办法，另外，化学防治还会影响到使用者的身体健康，并导致一系列的环境问题。因此，利用苹果资源自身的抗性基因，通过杂交育种来培育抗病新品种是解决该问题的根本途径。但通过杂交育种的方法，选育出抗轮纹病新品种的周期较长，因为杂种树的田间发病症状一般要等到盛果期才能观察到明显的症状。这就造成人力、物力、时间上的大量耗费而育种效率低的结果。然而，DNA分子标记技术不仅可以作为性状早期选择的手段，而且也可以作为种质鉴定的辅助手段，大大提高育种效率。我们通过田间杂交群体对苹果枝干轮纹病的抗性分离情况分析表明，该抗病性是受两对隐性基因控制的质量性状。
随机扩增多态性DNA(RAPD)是一项分子标记技术，具有快速、简便、成本低、多态性检测丰富、不需同位素示踪和安全可靠的特点，在分子生物学研究领域及植物育种方面得到广泛的应用，并取得明显成效。将RAPD标记转换成SCAR标记，是解决其稳定性，并适应大规模样品分析的理想途径。
发明内容：
本发明目的是提供一种用于苹果枝干轮纹病抗性基因检测的SCAR分子标记方法，它能解决传统杂交育种中周期长、效率低的问题。采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，对苹果品种间杂交F1代杂种树进行研究，寻找与苹果枝干轮纹病抗性基因连锁的DNA分子标记，研究它的DNA序列组成，合成寡聚核苷酸引物，发展应用成检测苹果枝干轮纹病抗性基因的探针，用于抗枝干轮纹病育种的早期筛选与鉴定。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：a.以苹果品种舞姿、短枝富士及其F1代杂种88株，其中抗病11株，感病77株为试材，分离提取并纯化基因组DNA；b.采用RAPD技术，用多个随机引物在F1代杂种及亲本DNA上进行扩增，筛选与抗病/感病性状相关的多态性标记，分析标记的分离特点及其与性状遗传规律相吻合情况。c.用玻璃珠DNA胶回收试剂盒，从琼脂糖凝胶中回收目标DNA片段；d.用美国Promega公司的pGEM-T载体连接回收的DNA片段；e.转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，用酶切鉴定法判断克隆片段是否正确；f.将阳性克隆的菌液送测序公司测序；g.获得目标DNA片段即RAPD标记片段实际长度及其序列；h.根据序列的碱基组成，人工设计并合成一对该序列的特异寡核苷酸引物；i.对原杂交组合双亲及F1代杂种的基因组DNA进行PCR特异扩增；j.获得特异扩增的多态性DNA片段，即SCAR标记，可用于检测与苹果枝干轮纹病抗性基因相关的基因型。
附图说明：
图1是本发明获得的目标DNA片段即RAPD标记序列示意图；
图2是本发明依据的亲本与后代之间的遗传模式示意图；
图3是本发明的实验结果图。
具体实施方式：
本具体实施方式采用以下技术方案：a.以苹果品种舞姿、短枝富士及其F1代杂种(88株，其中抗病11株，感病77株)为试材，分离提取并纯化基因组DNA；b.采用RAPD技术，用上海Sangon公司的随机引物180个，进行F1代杂种及亲本DNA的扩增。其中，引物S389(5’TGCGAGAGTC 3’)扩增出的大小约为1700碱基对的片段在11株抗病个体中均表现为缺失，而在77株感病个体中有34株也表现为缺失(即缺失个体约占感病个体总数的3/7)，这与受两对独立分配基因控制的性状遗传规律相吻合。即这是一个与其中一对基因位点相关的基因标记。由于该片段也在亲本品种短枝富士上出现，而在舞姿上表现缺失，因此，可推测出亲本及其后代的基因型；c.用玻璃珠DNA胶回收试剂盒(上海Sangon公司)，按照试剂盒说明书的指导，从琼脂糖凝胶中回收目标DNA片段；d.用美国Promega公司的pGEM-T载体连接回收的DNA片段，具体操作根据说明书的指示进行；e.转化大肠杆菌DH5α(采用热击法)，提取质粒DNA(碱裂解法)，于37℃电热恒温箱中保温3小时，进行酶切，然后将酶切产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳法进行检测；f.对鉴定为阳性克隆的菌液送测序公司测序；g.获得目标DNA片段实际长度为1679碱基对的全部碱基组成及其序列；h.根据序列的碱基组成，人工设计并合成一对该序列的特异寡核苷酸引物：5’TGC GAG AGT CAA TGT ACA ATA G 3’和5’TGC GAG AGT CGA TGA AGT TGA A 3’；i.对原杂交组合双亲及F1代杂种的基因组DNA进行PCR特异扩增；j.获得特异扩增的多态性DNA片段，即SCAR标记在感病基因型R1r1的个体中出现，而在抗病基因型r1r1的个体中缺失，可用于检测与与苹果枝干轮纹病抗性基因之一r1相关的基因型R1r1(感病)与r1r1(抗病)，从而达到鉴别隐性纯合基因型r1r1个体的目的。
1.本发明中所用的RAPD-PCR扩增及产物鉴定方法
a.PCR反应体系
总反应体积为25μL，其中：DNA模板50ng；10碱基随机引物0.4μmol/L；Taq酶1.0U；dNTPs 0.2mmol/L；MgCl22.5mmol/L。反应混合物用15μL矿物油覆盖。
b.PCR扩增程序
PCR仪为PTC-200型。先在94℃预变性4min，然后按照94℃变性30s→37℃退火35s→72℃延伸90s的程序进行40个循环，最后在72℃延伸5min。
c.产物检测
扩增产物经1.3％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5微克/毫升)电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，电压为4-5V/cm，电泳时间为1.5小时，于凝胶成像系统中观察照相。
2.本发明中所用的SCAR-PCR扩增及产物鉴定方法
a.PCR反应体系
总反应体积为25μL，其中：DNA模板50ng；引物各0.2μmol/L；Taq酶1.0U；dNTPs 0.2mmol/L；MgCl2 2.5mmol/L。反应混合物用15μL矿物油覆盖。
b.PCR扩增程序：
PCR仪为PTC-200型。先在94℃预变性4min，然后按照94℃变性30s→64℃退火30s→72℃延伸1min的程序进行25个循环，最后在72℃延伸5min。
c.产物检测：
扩增产物经1.3％琼脂糖凝胶(加入溴化乙锭0.5微克/毫升)电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，电压为4-5V/cm，电泳时间为50min，于凝胶成像系统中观察照相。
本具体实施方式不仅可以用来对苹果亲本材料的抗轮纹病遗传基础进行鉴别，也可以对杂交后代进行早期的选择，从而加速苹果抗轮纹病育种的进程。例如，对本研究的杂交组合来说，可淘汰1/2非r1r1基因型的个体，这也极大地降低了人力物力的消耗。另外，该标记还可为进一步克隆抗轮纹病基因和基因转移提供方法和物质基础，也可为苹果抗轮纹病的遗传规律研究和分子标记遗传连锁图的构建提供科学依据。
Claims (4)
1.用于苹果枝干轮纹病抗性基因检测的SCAR分子标记方法，其特征在于：a.以苹果品种舞姿、短枝富士及其F1代杂种(88株，其中抗病11株，感病77株)为试材，分离提取并纯化基因组DNA；b.采用RAPD技术，用上海Sangon公司的随机引物180个，进行F1代杂种及亲本DNA的扩增。其中，引物S389(5’TGCGAGAGTC 3’)扩增出的大小约为1700碱基对的片段在11株抗病个体中均表现为缺失，而在77株感病个体中有34株也表现为缺失(即缺失个体约占感病个体总数的3/7)，这与受两对独立分配基因控制的性状遗传规律相吻合。即这是一个与其中一对基因位点相关的基因标记。由于该片段也在亲本品种短枝富士上出现，而在舞姿上表现缺失，因此，可推测出亲本及其后代的基因型；c.用玻璃珠DNA胶回收试剂盒(上海Sangon公司)从琼脂糖凝胶中回收目标DNA片段；d.用美国Promega公司的pGEM-T载体连接回收的DNA片段；e.转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，并于37℃电热恒温箱中保温3小时，进行酶切；f.对鉴定为阳性克隆的菌液送测序公司测序；g.获得目标DNA片段即RAPD标记片段实际长度为1679碱基对的全部碱基组成及其序列；h.根据序列的碱基组成，人工设计并合成一对该序列的特异寡核苷酸引物；i.对原杂交组合双亲及F1代杂种的基因组DNA进行SCAR-PCR特异扩增；j.获得特异扩增的多态性DNA片段，即SCAR标记，可用于检测与与苹果枝干轮纹病抗性基因之一r1相关的基因型R1r1(感病)与r1r1(抗病)，从而达到鉴别隐性纯合基因型r1r1个体的目的。
2.根据权利要求1所述的用于苹果枝干轮纹病抗性基因检测的SCAR分子标记方法，其特征在于获得RAPD标记片段实际长度为1679碱基对的DNA序列：
TGCGAGAGTCAATGTACAATAGGGATTGATGTATGCTAACTTGAGTCAATGTCCCTAGAATAGAGA.
TTCAATGTTCTCATAAACAGTAAAGGGACATTGTGTTGCAGTGCCTGAATCCAAATGCAAAAATCATGA
GTTGCACGAGGTGTGAAGCATAGGAGGCGTGTGAGTGATAAAAAAATTGAACCAGAAAACAAATACT
GCAACAAAGCGTCTAAATCCGATAAAACCAAATCAGAAAGAGGCATTGCAATGCAATGTCTGAATCTA
TATTAACCTATTCCAAAATATATAAAAAATATGAGAAGGGAGTGTCATTTAAAGTGGGTGTCAGCTATAA
TGATAGATTTTGTAATTTTTGTTTATTTTAAATGCATTTAAGTATCCCGATACATAATTGACCTATTTACAA
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GATCTCGTATAAATACTCGGATGACTCAAATGTAATTATGTAATAAATGAAGGGGCAAATATGTAAAAAT
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AAAGCCTCACTCTCACATTACAAAGCTCTCATCCTCACAATCCTCTCACAAACAGAAAAATACAATATC
AGTGTGGACGTAGCCCAAACATTGGGGTGAACCACAATACATCTTGTGTTCTTTACTTTCTTGCAGATT
CACGATCGGATTTACGTTGTTCCAAGACCCCTCCAGTTTTGTGCATCAACAGATTCTTTACCAAATCAC
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AAGTCTCACAATGTGCTAACAATAATGTGGAATCGAACTTAAGATCTCTCATTTATTAAATGACACATAA
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AGAAATTTAAGATTACCAAATAATTTTAAAAATGAAAGTAATTGAAATAACGAGATTTTATTTTCTAGAAT
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TTGTCCTGTTTAAACAGAAATTCCGTTGTTTGGGAAGAGGTTAGGTCTCTCGGTATCCTGCGCCGCAGA
CATGGCGGCAAAGTTCGCTTTAGGGTCGGAACCGGTGGTGGGTTCGCTCGCACCCTCAAAGAAGAAA
GAGTACAGAGTCACCAACAGGCTCCAAGAGGGCAAGCGGCCCCTATACGCCATCGTTTTCAACTTCAT
CGACTCTCGCA
3.根据权利要求1所述的用于苹果枝干轮纹病抗性基因检测的SCAR分子标记方法，其特征在于根据RAPD标记片段DNA序列的碱基组成，人工设计并合成的特异寡核苷酸引物：5’TGC GAG AGT CAA TGTACA ATA G 3’和5’TGC GAG AGT CGA TGA AGT TGA A 3’。
4.根据权利要求1所述的用于苹果枝干轮纹病抗性基因检测的SCAR分子标记方法，其特征在于SCAR-PCR扩增的反应体系、扩增程序及产物检测：a.PCR反应体系：总反应体积为25μL，其中：DNA模板50ng；引物各0.2μmol/L；Taq酶1.0U；dNTPs 0.2mmol/L；MgCl22.5mmol/L。b.PCR扩增程序：先在94℃预变性4min，然后按照94℃变性30s→64℃退火30s→72℃延伸1min的程序进行25个循环，最后在72℃延伸5min。c.产物检测：扩增产物经1.3％琼脂糖凝胶(加入溴化乙锭0.5微克/毫升)电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，电压为4-5V/cm，电泳时间为50min，于凝胶成像系统中观察照相。
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|---|---|---|---|---|
| CN104480191A (zh) * | 2015-01-13 | 2015-04-01 | 河北农业大学 | 快速鉴定苹果枝干对轮纹病菌抗性的方法 |
| CN106031348A (zh) * | 2015-03-13 | 2016-10-19 | 李保华 | 一套快速检测苹果枝条内轮纹病菌侵染量的简易方法 |
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2009
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|---|---|---|---|---|
| CN104480191A (zh) * | 2015-01-13 | 2015-04-01 | 河北农业大学 | 快速鉴定苹果枝干对轮纹病菌抗性的方法 |
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