CN101855354A - 合成增加量的葡糖胺聚糖的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及合成增加量的葡糖胺聚糖的植物细胞和植物，和用于制备此类植物的方法，以及在这些植物细胞或植物的帮助下制备葡糖胺聚糖的方法。此处，相比较于野生型植物细胞或野生型植物，根据本发明的植物细胞或经遗传修饰的植物具有葡糖胺聚糖合酶活性以及额外增加的葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶活性和增加的UDP-N-乙酰基-葡糖胺焦磷酸化酶活性。本发明还涉及包含具有增加的葡糖胺聚糖合成的植物细胞的组合物。

Description

合成增加量的葡糖胺聚糖的植物
本发明涉及合成增加量的葡糖胺聚糖的植物细胞和植物，和制备此类植物的方法，还有在这些植物细胞或植物的帮助下制备葡糖胺聚糖的方法。此处，相比较于野生型植物细胞或野生型植物，根据本发明的植物细胞或经遗传修饰的植物具有葡糖胺聚糖合酶活性以及额外增加的葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶活性和增加的UDP-N-乙酰基-葡糖胺焦磷酸化酶活性。本发明还涉及包含具有增加的葡糖胺聚糖合成的植物细胞的组合物。
蛋白聚糖是一类糖蛋白，尤其是软骨的主要成份并且具有由重复的二糖单元组成的附着于核心蛋白质上的葡糖胺聚糖。重复的二糖单元其功能在于通过特征性的碳水化合物结合序列共价附着到核心蛋白质上。根据二糖单元的组成，尤其是在葡糖胺聚糖乙酰肝素/硫酸肝素、硫酸角质素硫酸和软骨素/皮肤素之间进行区分，其二糖单元各包含为葡糖胺或葡糖胺衍生物的分子。
乙酰透明质酸是另一种葡糖胺聚糖，也具有作为其二糖单元组分之一的葡糖胺衍生物(N-乙酰基-葡糖胺)，但其在自然界中不附着到蛋白质上。除了乙酰透明质酸，所提及的葡糖胺聚糖是天然硫酸化聚合物。在这些物质中，硫酸根在二糖单元的多个原子或取代基处引入，使得所提及的物质不是单一的聚合物，而是总结于各总称下的聚合物集合。正在讨论的聚合物集合的每一分子可能在硫酸化程度和具有硫酸根的单体的位置上有所不同。
乙酰透明质酸是天然产生的、无分支的、线性粘多糖(葡糖胺聚糖)，其由交替的葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-葡糖胺(GlcNAc)分子组成。乙酰透明质酸的基本结构单元由二糖葡糖醛酸-β-1，3-N-乙酰基-葡糖胺组成。在乙酰透明质酸中，这些重复单元经β-1，4键相互附着。在药剂学中，经常使用术语透明质酸。由于在大部分情况中乙酰透明质酸作为多聚阴离子而不是游离酸存在，所以在下文中，优选使用术语乙酰透明质酸，但各术语应理解为均包含两种分子形式。
乙酰透明质酸具有不一般的物理化学特性，例如聚合电解质的特性、粘弹性特性、结合水的高能力、凝胶形成的特性，除此之外乙酰透明质酸的其他特性都描述于Lapcik等的综述文章中(1998，Chemical Reviews98(8)，2663-2684)。
乙酰透明质酸是脊椎动物胞外结缔组织和体液的组分。在人中，透明质酸由所有体细胞尤其是间充质细胞的细胞膜合成，并广泛存在于身体当中，尤其在结缔组织、细胞外基质、脐带、关节液、软骨组织、皮肤和眼的玻璃体中具有高浓度(Bernhard Gebauer，1998，Inaugural-Dissertation，Virchow-Klinikum Medizinische
Figure GPA00001136225700021
Charitéder Humboldt
Figure GPA00001136225700022
zu Berlin；Fraser等，1997，Journal of Internal Medicine 242，27-33)。
近来，还在动物非脊椎动物有机体(软体动物)中发现了乙酰透明质酸(Volpi和Maccari，2003，Biochimie 85，619-625)。
此外，由于乙酰透明质酸是非免疫原性物质，一些人类致病性革兰氏阳性细菌(链球菌属(Streptococcus)A和C)和革兰氏阴性细菌(巴斯德菌属(Pasteurella))合成乙酰透明质酸作为菌表多糖，其保护这些细菌免受宿主免疫系统的攻击。
感染小球藻属(Chlorella)的单细胞绿藻的病毒赋予单细胞绿藻在被所述病毒感染后合成乙酰透明质酸的能力，一些这类病毒作为内共生体存在于草履虫(Paramecium)种中(Graves等，1999，Virology 257，15-23)。然而，合成乙酰透明质酸的能力不是用于表征正在讨论的藻类的特征。藻类合成乙酰透明质酸的能力由基因组中具有编码乙酰透明质酸合酶的序列的病毒感染所介导(DeAngelis，1997，Science 278，1800-1803)。
乙酰透明质酸合成的催化受单个膜整合或膜结合的酶乙酰透明质酸合酶的影响。
将合成的乙酰透明质酸分子穿过细胞质膜转移到细胞周围培养基中的机制仍未完全阐明。初期的假说认为穿过细胞膜的转运受乙酰透明质酸合酶本身的影响。然而，更近期的结果显示乙酰透明质酸分子穿过细胞质膜的转运经负责该运动的转运蛋白质通过能量依赖运输发生。因此，通过突变来产生链球菌属菌株，在所述突变中活性转运蛋白的合成被抑制。这些菌株比相应的野生型细菌菌株合成更少的乙酰透明质酸(Ouskova等，2004，Glycobiology 14(10)，931-938)。在人成纤维细胞中，可证明在特异性抑制已知转运蛋白的试剂的帮助下可以将所产生的乙酰透明质酸的量以及乙酰透明质酸合酶的活性降低(Prehm和Schumacher，2004，BiochemicalPharmacology 68，1401-1410)。如果在植物中确实存在转运乙酰透明质酸的转运蛋白质，那么其中量是未知的。
乙酰透明质酸的不一般特性提供了在多个领域，例如药剂学、化妆品工业、食品和饲料生产、在技术应用(例如润滑剂)等中应用的广泛可能性。目前使用乙酰透明质酸的最重要的应用就是在医学和化妆品领域(例如见Lapcik等，1998，Chemical Reviews 98(8)，2663-2684，Goa和Benfield，1994，Drugs 47(3)，536-566)。
在医学领域，含乙酰透明质酸的产品目前用于关节病的关节内治疗和用于眼的眼外科中。乙酰透明质酸还用于治疗赛马中的关节疾病。此外，乙酰透明质酸是一些眼鼻用药(rhinologics)的组分，其例如以滴眼剂和nasalia的形式用于润湿干燥粘膜。注射用的含乙酰透明质酸的溶液用作镇痛药和抗风湿剂。在创伤愈合中使用包含乙酰透明质酸或衍生化的乙酰透明质酸的药膏。对于皮肤学，含乙酰透明质酸的凝胶埋植剂用于在整形外科中矫正皮肤畸形。
对于药理学应用，优选使用具有高分子量的乙酰透明质酸。
在化妆品药物中，乙酰透明质酸制剂是最适合的皮肤填充材料。通过注射乙酰透明质酸有限时间，可以使皱纹平滑或增加嘴唇的体积。
在化妆品产品中，尤其是在皮肤乳液和洗液中，由于其高结合水的能力，常使用乙酰透明质酸作为增湿剂。
此外，含乙酰透明质酸的制剂也作为所谓的营养制品(食品添加剂)来出售，其也可用于动物中(例如狗、马)用以预防和减轻关节病。
目前从动物组织(鸡冠)中分离或使用细菌培养物发酵来制备商业化目的的乙酰透明质酸。
US 4,141,973描述了从鸡冠或脐带中分离乙酰透明质酸的方法。除了乙酰透明质酸，动物组织(例如鸡冠、脐带)也包含其他与乙酰透明质酸相关的粘多糖，例如硫酸软骨素(chondrotin sulfate)、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和肝素。此外，动物有机体包含蛋白质(hyaladherins)，所述蛋白质与乙酰透明质酸特异性结合并且对于有机体中大多数不同功能，例如肝中乙酰透明质酸的降解、乙酰透明质酸作为细胞迁移的前导结构的功能、内吞作用的调节、细胞表面上乙酰透明质酸的锚定或乙酰透明质酸网络的形成是必需的(Turley，1991，Adv DrugDelivery Rev 7，257ff.；Laurent和Fraser，1992，FASEB J.6，183ff.；Stamenkovic和Aruffo，1993，Methods Enzymol.245，195ff；Knudson和Knudson，1993，FASEB 7，1233ff.)。
用于细菌产生乙酰透明质酸的链球菌属菌株全部是对人致病的细菌。在培养过程中，这些细菌还产生释放到培养基中的(致热性的)外毒素和溶血素(链球菌溶血素，尤其是α溶血素和β溶血素)Kilian，M.：Streptococcus and Enterococcus.出自Medical Microbiology.Greenwood，D.；Slack，RCA；Peutherer，J.F.(编辑).第16章.Churchill Livingstone，Edinburgh，UK：第174-188页，2002，ISBN 0443070776)。这使纯化和分离在链球菌菌株帮助下制备的乙酰透明质酸变得更加困难。尤其是对于药物应用，制剂中外毒素和溶血素的存在是个问题。
US 4,801,539描述了通过诱变处理后的细菌菌株(Streptococcuszooedemicus)的发酵来制备乙酰透明质酸。所用的诱变处理细菌菌株不再合成β溶血素。所获的产率为每升培养基3.6g乙酰透明质酸。
EP 0694616描述了培养Streptococcus zooedemicus或马链球菌(Streptococcus equi)的方法，其中在所用的培养条件下，合成了增量的乙酰透明质酸而不产生链球菌溶血素。所获的产率为每升培养基3.5g乙酰透明质酸。
在培养过程中，链球菌属菌株向培养基中释放酶透明质酸酶，其结果是在该生产体系中，在纯化过程中也降低了分子量。透明质酸酶阴性的链球菌属菌株的用途或制备乙酰透明质酸的方法(其中在培养过程中抑制了透明质酸酶的产生)描述于US 4,782,046中。所获产率至多每升培养基2.5g乙酰透明质酸，并且所获的最高平均分子量为3.8×106Da，介于2.4×106至4.0×106的分子量分布中。
US 20030175902和WO 03054163描述了在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中在来自类马链球菌(Streptococcus equisimilis)的乙酰透明质酸合酶的异源表达的帮助下制备乙酰透明质酸。为实现足量乙酰透明质酸的产生，除了异源表达乙酰透明质酸合酶之外，还需要在芽孢杆菌(Bacillus)细胞中同时表达UDP葡糖脱氢酶。US 20030175902和WO 03 054163没有描述在枯草杆菌帮助下的生产中所获的乙酰透明质酸的绝对量。所获的最高平均分子量约为4.2×106。然而，该平均分子量仅获自重组芽孢杆菌菌株中，其中将编码来自类马链球菌的乙酰透明质酸合酶基因的基因和编码来自枯草芽孢杆菌的UDP葡糖脱氢酶的基因整合入在amyQ启动子调控下的枯草芽孢杆菌基因组中，其中同时失活枯草芽孢杆菌内源cxpY基因(其编码细胞色素P450氧化酶)。Chien和Lee(2007，Biotechnol.Prog.Online publication，ASAP Article 10.1021/bp070036w，S8756-7938(07)00036-7)描述了多种的重组枯草芽孢杆菌菌株。已转化有编码乙酰透明质酸合酶的核酸序列和编码UDP葡糖脱氢酶的核酸序列的菌株合成最高1.14g/l的乙酰透明质酸。除转化有刚刚提及的核酸序列外还转化了编码透明颤菌属(Vitreoscilla)血红蛋白的核酸序列的菌株合成1.8g/l的乙酰透明质酸。
WO 06 032538描述了转化有编码乙酰透明质酸合酶的核酸分子的转基因植物。清楚地表明了在正在讨论的植物中乙酰透明质酸的合成。
WO 05 012529描述了使用编码来自小球藻感染病毒的乙酰透明质酸合酶的核酸分子转化的转基因烟草植株的产生。在WO 05 012529中，一方面使用编码小球藻病毒菌株CVH1的乙酰透明质酸合酶的核酸序列，另一方面使用编码小球藻病毒菌株CVKA1的乙酰透明质酸合酶的核酸序列来转化烟草植株。仅用编码分离自小球藻病毒菌株CVKA1的乙酰透明质酸合酶的核酸转化的植物能证明乙酰透明质酸的合成。对于转化有编码分离自小球藻病毒菌株CVH1的乙酰透明质酸合酶的核酸转化的烟草植株，不可能在相应的转基因植物中检测到乙酰透明质酸的合成。WO 05 012529中唯一产乙酰透明质酸的转基因烟草植株所合成的乙酰透明质酸的量表述为每ml测定体积中约4.2μg的乙酰透明质酸，考虑到对于进行所述实验的描述，其对应于约每克植物材料鲜重最高12μg乙酰透明质酸的量。
WO 2007 039314描述了具有乙酰透明质酸合酶活性和额外增加的谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的转基因植物。这些植物相比于仅具有乙酰透明质酸合酶活性的植物合成了增加量的乙酰透明质酸。由这些烟草植株合成的乙酰透明质酸的最大量为用于测定的每克植物材料鲜重的约0.03％(见WO 2007 039316中的图5)。
WO 2007 039316描述了与野生型植物相比具有乙酰透明质酸合酶活性以及额外增加的谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性和增加的UDP葡萄糖脱氢酶(UDP-Glc-DH)活性的转基因植物。这些植物相比于具有乙酰透明质酸合酶活性以及同时具有蛋白质(具有GFAT活性)的活性的植物合成了增加量的乙酰透明质酸。由这些烟草植株合成的乙酰透明质酸的最大量为用于测定的每克植物材料鲜重的0.2％(见WO 2007039316中的图6)。
此外，WO 2007 039316包含了蛋白质列表，所述蛋白质能在植物细胞中表达以在植物细胞中进一步增加合成的乙酰透明质酸的量。WO 2007039316中提出的蛋白质为酶的随机列表，所述酶在多种有机体中参与了UDP-GlcNAc的合成。列于WO 2007 039316中的蛋白质具有多种酶功能。WO 2007 039316未给予说明列出的酶当在转基因植物中表达时是否可能确实增加乙酰透明质酸的含量或哪一种酶能确实增加乙酰透明质酸的含量。
由软骨素合酶从UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-N-乙酰基-半乳糖胺(UDP-GalNAc)(UDP-N-乙酰基-葡糖胺(UDP-GlcNAc)的表异构物)开始来催化软骨素/皮肤素([β-1，4)]-[葡糖醛酸-β-1，4-N-乙酰半乳糖胺]n)的二糖链的合成(Kitagawa等，2001，J Biol Chem 276(42)，38721-38726)。通过表异构酶，软骨素的葡糖醛酸分子可转化为艾杜糖醛酸。如果超过10％的葡糖醛酸分子以艾杜糖醛酸存在，则聚合物称为皮肤素。随后经其他酶催化在二糖链的软骨素或皮肤素的多个位置上引入硫酸根，导致硫酸软骨素/皮肤素的形成。此处，硫酸化程度因分子不同而不同。
有时候，已将硫酸软骨素作为治疗骨关节炎的潜在有效化合物来讨论(Clegg等，2006，The New England Journal of Medicine 354(8)，795-808)。
肝素/乙酰肝素合酶从UDP-GlcA和UDP-GlcNAc开始催化肝素/乙酰肝素(heparosans)二糖链([α-1，4]-[葡糖醛酸-β-1，4-葡糖胺]n或[α-1，4]-[艾杜糖醛酸-α-1，4-葡糖胺]n)的合成(DeAngelis和White，2004，J.Bacteriology 186(24)，8529-8532)。heparosans的葡糖醛酸分子可通过表异构酶转化为艾杜糖醛酸。在乙酰肝素二糖链多个位置上引入硫酸根随后由其他酶催化，导致肝素或硫酸乙酰肝素的形成。硫酸肝素比硫酸乙酰肝素具有显著更多的硫酸根替代。硫酸肝素具有约90％的艾杜糖醛酸分子，而在硫酸乙酰肝素中葡糖醛酸分子占优势(Gallagher等，1992，Int.J.Biochem 24，553-560)。如在硫酸软骨素/硫酸皮肤素的情况中以及硫酸肝素/硫酸乙酰肝素的情况下，硫酸化程度因分子不同而不同。
尤其使用硫酸肝素作为抗凝血剂，例如用于预防和治疗血栓形成。
目前，通过从动物组织中分离来制备硫酸软骨素/硫酸皮肤素和硫酸肝素/硫酸乙酰肝素。硫酸软骨素主要从牛软骨(cartillage)或鲨鱼软骨(cartillage)中分离，而硫酸肝素/硫酸乙酰肝素从猪肠或牛肺中分离。由于硫酸软骨素/硫酸皮肤素和硫酸肝素/硫酸乙酰肝素的二糖链不具有统一的硫酸化结构，因此难以获得相同的特定产物。因此，产物通常为具有不同程度硫酸化的分子的混合物。
如早已描述，葡糖胺聚糖，例如硫酸软骨素或硫酸肝素/硫酸乙酰肝素目前从动物组织中分离。除了所需物质外，这些组织还包含其他葡糖胺聚糖。如完全可能的话，分离各葡糖胺聚糖是困难且昂贵的。此外，当使用从动物组织中分离的葡糖胺聚糖时，可在人中导致疾病的病原微生物和/或其他物质例如BSE或禽流感病原体对动物组织的潜在污染形成了问题。在患者中，使用被动物蛋白质污染的医学制剂可导致人体不期望的免疫反应(对于乙酰透明质酸制剂见例如US 4,141,973)，尤其是如果患者对动物蛋白质过敏。
此外，从动物粗原料中制备的物质对于一些生活方式是无法接受的，例如对于素食者或koscher食物制品。
从动物组织中分离葡糖胺聚糖的另一个问题实际在于，由于动物组织还包含葡糖胺聚糖降解酶，因此葡糖胺聚糖的分子量常常在纯化过程中下降。
可从动物组织中以令人满意的质量和纯度获得的葡糖胺聚糖的量(产率)是很低的(例如来自鸡冠的乙酰透明质酸：0.079％w/w，EP 0144019，US4,782,046)，这意味着需要加工大量的动物组织。
由于必须在密闭无菌的容器内并在昂贵的可控培养条件下发酵细菌，因此通过细菌菌株发酵产生葡糖胺聚糖成本很高(乙酰透明质酸见例如US4,897,349)。此外，可通过细菌菌株发酵产生的葡糖胺聚糖的量受每种情况中存在的生产装置的限制。此处，还必须考虑到作为物理定则的结果，不能将发酵罐建成具有非常大的培养体积。此处可特别要提及的是，如果可确保，仅用高额的技术消费才可确保在大发酵罐中有效生产所需的培养基与从外部填料的物质(例如细菌必需的营养源、调节pH值的试剂、氧气)的均质混合。
植物在天然状态下不产生葡糖胺聚糖，例如乙酰透明质酸、硫酸肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素或硫酸软骨素/硫酸皮肤素。天然出现的植物自身在其基因组中不具有编码催化葡糖胺聚糖合成的蛋白质的任何核酸，并且，尽管已描述并表征了大量植物碳水化合物，迄今为止还不可能在未感染的天然植物细胞中检测到任何提及的葡糖胺聚糖(Graves等，1999，Virology 257，15-23)。
WO 98 35047(US 6,444,878)描述了在植物细胞中合成GlcNAc的代谢途径，其中葡糖胺经多个连续酶催化反应步骤形成代谢物GlcNAc、N-乙酰基-葡糖胺6-磷酸和N-乙酰基-葡糖胺1-磷酸并转化为UDP-GlcNAc。在更高浓度下，葡糖胺6-磷酸对植物细胞是有毒性的(WO 98 35047)。
描述的植物备选代谢途径包括果糖6-磷酸和葡糖胺反应产生葡糖胺6-磷酸，其随后经多步连续酶催化反应步骤形成代谢物葡糖胺1-磷酸和N-乙酰基-葡糖胺1-磷酸并转化为UDP-GlcNAc(Mayer等，1968，PlantPhysiol.43，1097-1107)。
迄今为止，仍不清楚植物中合成UDP-GlcNAc的代谢途径中应修饰哪一种蛋白质活性以使植物合成增加量的葡糖胺聚糖。
因此，本发明的目标是提供用于在植物中制备有效量的葡糖胺聚糖的备选方法和过程。
通过权利要求中涉及的实施方案实现该目标。
令人惊奇的是，已发现包含编码葡糖胺聚糖合酶的核酸分子和额外包含编码具有葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶活性的蛋白质的外来核酸分子和编码具有单功能UDP-N-乙酰基-葡糖胺焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物较(仅)具有葡糖胺聚糖合酶活性的植物细胞或植物产生显著更高量的葡糖胺聚糖。
因此，本发明涉及包含编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物，其特征在于所述经遗传修饰的植物细胞或所述经遗传修饰的植物还包含编码具有葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶活性的蛋白质的外来核酸分子和编码具有单功能UDP-N-乙酰基-葡糖胺焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子。
由于必须在密闭无菌的容器内并在昂贵的可控培养条件下发酵细菌，因此通过细菌菌株发酵产生葡糖胺聚糖伴随着高成本(见例如US4,897,349)。此外，可通过细菌菌株发酵产生的葡糖胺聚糖的量受每种情况中生产装置的限制。例如目前市售乙酰透明质酸的高价格说明这种葡糖胺聚糖虽然具有特定特性(例如粘弹性，结合水的高容量)，但不适合于工业应用。
因此，与产生葡糖胺聚糖的已知方法相比，根据本发明的植物细胞和根据本发明的植物提供这样的优点，与仅包含葡糖胺聚糖合酶活性的植物细胞或植物相比它们合成了增加量的葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)。
此处，根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物的遗传修饰可以是导致编码葡糖胺合酶的外来核酸分子及编码具有葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶活性的蛋白质的外来核酸分子及编码具有单功能UDP-N-乙酰基-葡糖胺焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子整合到植物细胞或植物的任何遗传修饰。
在本发明的上下文中，术语“葡糖胺聚糖合酶”理解为从底物UDP葡糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-N-乙酰基-己糖醛胺(aldohexsosamine)(UDP-AldohexNAc)合成葡糖胺聚糖的蛋白质。葡糖胺聚糖的催化根据下文的一般反应方案发生：
nUDP-GlcA+nUDP-AldohexNAc→[GlcA-GlcNAc]n+2nUDP
优选地，上文反应顺序中制备的UDP-N-乙酰基-己糖醛胺为UDP-N-乙酰基-葡糖胺或UDP-N-乙酰基-半乳糖胺。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物，其中编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子编码乙酰透明质酸合酶或软骨素合酶或肝素/heparosan合酶。
在本发明的上下文中，术语“乙酰透明质酸合酶”(EC 2.4.1.212)理解为从底物UDP葡糖醛酸(UDP-GlcA)和UDPN-乙酰基-葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成乙酰透明质酸的蛋白质。乙酰透明质酸的合成根据下文的反应方案催化：
nUDP-GlcA+nUDP-GlcNAc→β-1，4-[GlcA-β-1，3-GlcNAc]n+2nUDP
可将迄今已研究的乙酰透明质酸合酶划分为两组：I类乙酰透明质酸合酶和II类乙酰透明质酸合酶(DeAngelis，1999，CMLS，Cellular andMolecular Life Sciences 56，670-682)。
来自脊椎动物的乙酰透明质酸合酶经鉴定到的同功酶进一步进行区分。多个同功酶以其鉴定的顺序用阿拉伯数字来指代(例如hsHAS1、hsHAS2、hsHAS3)。
已描述了编码乙酰透明质酸合酶的核酸分子和相应的蛋白质序列，尤其是以下生物：兔(Oryctolagus cuniculus)ocHas2(EMBL AB055978.1，US20030235893)、ocHas3(EMBL AB055979.1，US 20030235893)；狒狒(Papioanubis)paHas1(EMBL AY463695.1)；非洲爪蛙(Xenopus laevis)xlHas1(EMBL M22249.1，US 20030235893)、xlHas2(DG42)(EMBLAF168465.1)、xlHas3(EMBL AY302252.1)；人(Homo sapiens)hsHAS1(EMBL D84424.1，US 20030235893)、hsHAS2(EMBL U54804.1，US20030235893)、hsHAS3(EMBL AF232772.1，US 20030235893)；小鼠(Musmusculus)mmHas1(EMBL D82964.1，US 20030235893)、mmHAS2(EMBLU52524.2，US 20030235893)、mmHas3(EMBL U86408.2，US20030235893)；牛(Bos taurus)btHas2(EMBL AJ004951.1，US20030235893)；鸡(Gallus gallus)ggHas2(EMBL AF106940.1，US20030235893)；大鼠(Rattus norvegicus)rnHas 1(EMBL AB097568.1，Itano等，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)、rnHas2(EMBLAF008201.1)；rnHas 3(NCBI NM_172319.1，Itano等，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)、马(Equus caballus)ecHAS2(EMBL AY056582.1，GI：23428486)、猪(Sus scrofa)sscHAS2(NCBI NM_214053.1，GI：47522921)、sscHas 3(EMBLAB159675)、斑马鱼(Danio rerio)brHas1(EMBL AY437407)、brHas2(EMBL AF190742.1)brHas3(EMBLAF190743.1)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)pmHas(EMBLAF036004.2)；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spHas(EMBL，L20853.1，L21187.1，US 6,455,304，US 20030235893)；马链球菌seHas(EMBL AF347022.1，AY173078.1)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)suHasA(EMBL AJ242946.2，US 20030235893)、似马链球菌(Streptococcusequisimilis)seqHas(EMBL AF023876.1，US 20030235893)；硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)ssHAS(US 20030235893)、Sulfolobustokodaii stHas(AP000988.1)、小球藻病毒1(Paramecium bursariaChlorella virus 1)，cvHAS(EMBL U42580.3，PB42580，US 20030235893)。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其中编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子的特征在于其编码乙酰透明质酸合酶。正在讨论的编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子优选为编码病毒乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子。优选地，编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子编码感染藻类的病毒的乙酰透明质酸合酶。
关于藻类感染病毒，编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子优选编码小球藻感染病毒(Paramecium bursaria Chlorella virus)的乙酰透明质酸合酶，尤其优选为小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶并特别优选为H1菌株的小球藻病毒的乙酰透明质酸合酶。
优选地，编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子的特征在于其编码乙酰透明质酸合酶，所述乙酰透明质酸合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 2中显示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子的特征在于其编码具有SEQID NO 2中显示的氨基酸序列的乙酰透明质酸合酶。
在其他实施方案中，编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子与SEQ IDNO 1或SEQ ID NO 3中显示的核酸序列具有至少70％、优选至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子的特征在于其具有SEQ ID NO 3中的核酸序列或特征在于外来核酸分子序列由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中显示的核酸序列有所不同。
2004年8月25日，包含编码小球藻病毒乙酰透明质酸合酶的合成核酸分子的质粒IC 341-222根据布达佩斯条约以编号DSM16664保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，德国，不伦瑞克，Mascheroder Weg 1b，38124。显示于SEQ ID NO 2中的氨基酸序列可来源于整合至质粒IC 341-222中的核酸序列的编码区并编码小球藻病毒乙酰透明质酸合酶。
因此，本发明还涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其中编码乙酰透明质酸合酶的核酸分子的特征在于其编码蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列可来源于插入至质粒DSM16664中的核酸序列的编码区，或特征在于其编码蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列与可来源于插入至质粒DSM16664中的核酸序列的编码区的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。
本发明还涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其中编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子的特征在于它是整合至质粒DSM16664中的乙酰透明质酸合酶编码核酸序列，或者特征在于它与整合至质粒DSM16664中的核酸序列具有至少70％、优选至少80％、优选至少90％、尤其优选至少95％并且特别优选至少98％的同一性。
在本发明的上下文中，术语“软骨素合酶”(EC 2.4.1.175，EC 1.4.1.226)理解为蛋白质或由两个蛋白质组成的蛋白质复合体，其从底物UDP葡糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-N-乙酰基-半乳糖胺(UDP-GalNAc)合成软骨素。软骨素合成根据下文的反应方案催化：
nUDP-GlcA+nUDP-GalNAc→β-1，4-[GlcA-β-1，3-GalNAc]n+2nUDP
在一些生物体中，由两个不同蛋白质组成的软骨素合酶酶复合体催化附着在蛋白聚糖上的软骨素分子的延伸。两个蛋白质中的一个蛋白质N-乙酰基氨基半乳糖基转移酶II(EC 2.4.1.175)经β-1，4-附着向软骨素分子添加N-乙酰基-半乳糖胺单体，第二个蛋白质N-乙酰基氨基半乳糖基蛋白聚糖3-β葡糖苷酸基转移酶(EC 2.4.1.226)经β-1，3-附着向软骨素分子添加葡糖醛酸单体。然而，本领域技术人员也熟悉双功能蛋白质，在所述双功能蛋白质中，单个蛋白质向软骨素分子添加N-乙酰基-半乳糖胺单体以及葡糖醛酸单体。
在其他优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其中编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子的特征在于其编码软骨素合酶。
本发明的优选实施方案涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其中编码软骨素合酶的外来核酸分子编码向软骨素分子附加N-乙酰基-半乳糖胺单体以及葡糖醛酸单体的双功能软骨素合酶。
在本发明的上下文中，术语“双功能软骨素合酶”理解为其中N-乙酰基氨基半乳糖基转移酶II(EC 2.4.1.175)活性以及乙酰氨基半乳糖基蛋白聚糖3-β葡糖苷酸基转移酶(EC 2.4.1.226)活性存在于一个分子中的蛋白质。
例如，已从细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli)US2003109693、EP 1283259)中描述了编码单功能软骨素合酶的核酸分子和源于其的氨基酸序列。
例如，已从哺乳动物中(例如人WO 03012099、US 2005048604、US2006052335、NCBI acc.No：BC046247.1，BC023531.2；Kitagawa等，2001，J.Biol.Chem.276(42)，38721-38726)或Pasteurella multicoda中(US2003104601、EMBL acc.No：AF195517，DeAngelis和Padgett-McCue，2000，J.Biol.Chem.275(31)，24124-24129)描述了编码双功能软骨素合酶的核酸分子和源于其的氨基酸序列。
编码软骨素合酶的外来核酸分子优选为编码细菌软骨素合酶，优选编码来自巴斯德菌属的软骨素合酶，尤其优选编码来自出血败血性巴斯德菌的软骨素合酶的外来核酸分子。
优选地，编码软骨素合酶的外来核酸分子的特征在于其编码软骨素合酶，所述软骨素合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 5中显示的氨基酸序列具有至少70％、优选为至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码软骨素合酶的外来核酸分子的特征在于它编码具有SEQ ID NO 5中显示的氨基酸序列的软骨素合酶。
在其他实施方案中，编码软骨素合酶的外来核酸分子与SEQ ID NO 4中显示的核酸序列具有至少70％、优选为至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码软骨素合酶的核酸分子的特征在于它具有SEQ ID NO 4中所示的核酸序列或特征在于外来核酸分子序列由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO 4中所示的核酸序列有所不同。
在本发明的上下文中，术语“肝素/乙酰肝素合酶”或“heparosan合酶”(EC 2.4.1.224、EC 2.4.1.225)理解为从底物UDP葡糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-N-乙酰基-葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成肝素/乙酰肝素的蛋白质或由两个蛋白质组成的酶复合体。肝素/乙酰肝素的合成根据下文的反应方案催化：
nUDP-GlcA+nUDP-GlcNAc→α-1，4-[GlcA-beta-1，4-GlcNAc]n+2nUDP
例如，已从细菌中(出血败血性巴斯德菌EMBL acc.Nos：AF425591、AF439804、AY292199、AY292200、US 20030099967，大肠杆菌EMBL acc.No：X77617.1)或人中(NCBI acc.Nos：BC001174.1，NM_207122.1)描述了编码肝素/乙酰肝素合酶的核酸分子和来源于其的氨基酸序列。
在一些生物体中，由两种不同蛋白质组成的肝素/乙酰肝素合酶酶复合体催化附着在蛋白聚糖的肝素/乙酰肝素分子的延伸。两个蛋白质中的一个蛋白质葡糖苷酸基-N-乙酰基葡糖胺基蛋白聚糖4-α-N-葡糖胺基转移酶(EC 2.4.1.224)经β-1，4-附着向肝素/乙酰肝素分子添加N-乙酰基-葡糖胺单体，第二个蛋白质N-乙酰基-葡糖胺基蛋白聚糖4-β-葡糖苷酸基(glucoronosyl)转移酶(EC 2.4.1.225)经β-1，3-附着向肝素/乙酰肝素分子添加葡糖醛酸单体。然而，本领域技术人员也熟悉双功能蛋白质，在所述双功能蛋白质中，单个蛋白质向肝素/乙酰肝素分子添加N-乙酰基-葡糖胺单体以及葡糖醛酸单体。例如已在人中(Busse和Kusche-Gullberg，2003，J.Biol.Chem.278(42)，41333-41337)或巴斯德菌属中(DeAngelis和White，2004，J.Bacteriology 186(24)，8529-8532)描述了此类双功能肝素/乙酰肝素合酶。具有肝素/乙酰肝素合酶活性的双功能蛋白质具有分类为EC编号2.4.1.224的酶的活性以及分类为EC编号2.4.1.225的酶的活性。
在其他实施方案中，本发明涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其中编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子的特征在于它编码肝素/乙酰肝素合酶。
本发明的优选实施方案涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其中编码肝素/乙酰肝素合酶的外来核酸分子编码向肝素/乙酰肝素分子附加N-乙酰基-葡糖胺单体以及葡糖醛酸单体的双功能肝素/乙酰肝素合酶。
编码肝素/乙酰肝素合酶的外来核酸分子优选为编码细菌肝素/乙酰肝素合酶，优选编码来自巴斯德菌属的肝素/乙酰肝素合酶，尤其优选编码来自出血败血性巴斯德菌的肝素/乙酰肝素合酶的外来核酸分子。
优选地，编码肝素/乙酰肝素合酶的外来核酸分子的特征在于它编码肝素/乙酰肝素合酶，所述肝素/乙酰肝素合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 7中显示的氨基酸序列具有至少70％、优选为至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码肝素/乙酰肝素合酶的外来核酸分子的特征在于它编码具有SEQ ID NO 7中显示的氨基酸序列的肝素/乙酰肝素合酶。
在其他实施方案中，编码肝素/乙酰肝素合酶的外来核酸分子与SEQID NO 6中显示的核酸序列具有至少70％、优选为至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码肝素/乙酰肝素合酶的核酸分子的特征在于它具有SEQ ID NO 6中所示的核酸序列或特征在于外来核酸分子的序列由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO 6中所示的核酸序列有所不同。
在本发明的上下文中，术语“葡糖胺磷酸N-乙酰基转移酶(乙酰-CoA：D葡糖胺磷酸N-乙酰基转移酶或GlcN-P乙酰基转移酶)”(EC 2.3.1.4)理解为从底物D葡糖胺磷酸(GlcN-P)和乙酰CoA(AcCoA)合成N-乙酰基-D葡糖胺磷酸(GlcNAc-P)的蛋白质。N-乙酰基-葡糖胺6-磷酸的合成根据下文的反应方案催化：
GlcN-P+AcCoA→GlcNAc-P+CoASH
在所示的反应方程式中，底物GlcN-P可以是葡糖胺1-磷酸(GlcN-1-P)或葡糖胺6-磷酸(GlcN-6-P)。
在正在讨论用于合成UDP-N-乙酰基-葡糖胺的代谢途径中，所研究的细菌和真核生物间的根本差异在于正在讨论的代谢途径不同的中间产物用作乙酰化反应的底物。在细菌生物中，通过具有GlcN-1-P乙酰转移酶(EC2.3.1.157)活性的蛋白质进行GlcN-1-P的乙酰化(Gehring等，1996，Biochemistry 35，579-585)，而在真核动物或真菌中通过具有葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.4)活性的蛋白质催化GlcN-6-P的乙酰化(Milewski等，2006，Yeast 23，1-14，在Wiley InterScience中在线发表，DOI：10.1002./yea.1337)。因此，在不同生物中使用不同的底物和不同的蛋白质来合成UDP-GlcNAc。
令人惊奇的是，已发现与现有技术(WO 2007 023682)中公开内容不同，不可能通过向植物细胞中引入编码具有GlcN-P乙酰转移酶活性的蛋白质的任何核酸分子来在植物细胞中增加合成的葡糖胺聚糖的量。当然，已发现引入外来核酸分子(其编码具有乙酰化GlcN-1-P的GlcN-P乙酰转移酶活性的蛋白质(例如来自大肠杆菌的glmu))不能导致植物细胞或植物合成的葡糖胺聚糖量的增加。因此，对于根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物而言外来核酸分子编码具有GlcN-P乙酰转移酶(其使用GlcN-6-P作为乙酰化反应的底物并因此是具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质(EC 2.3.1.4))活性的蛋白质是至关重要。相反，编码具有GlcN-1-P乙酰转移酶活性(EC 2.3.1.157)(其使用GlcN-1-P用于乙酰化反应的)的蛋白质的外来核酸分子不适合于产生根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物。
此外，已发现具有外来核酸分子的植物细胞或植物不能合成显著更高量的葡糖胺聚糖，所述外来核酸分子编码葡糖胺6-磷酸变位酶(GlcN-6-P变位酶)(其催化GlcN-6-P向GlcN-1-P异构化)。
在本发明的上下文中，术语“葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶(乙酰CoA：D葡糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶或GlcN-6-P乙酰转移酶)”(EC 2.3.1.4)应理解为从底物D-葡糖胺6-磷酸(GlcN-6-P)和乙酰CoA(AcCoA)合成N-乙酰基-D-葡糖胺6-磷酸(GlcNAc-6-P)的蛋白质。N-乙酰基-葡糖胺6-磷酸的合成根据下文的反应方案催化：
GlcN-6-P+AcCoA→GlcNAc-6-P+CoASH
具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的功能形式为同质二聚体。单体的三级结构具有中心核区。该核区由具有五条逆平行链(β链1-5)(其由四条α螺旋环绕)和第六条β链(β-6链)的β折叠片结构组成。在同质二聚体的形成过程中，亚基的β-6链与其他各个亚基相应的β-6链间具有相互作用。
SEQ ID No 9(EMBL acc.No：AB017626.1)中显示的氨基酸序列编码具有来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质。在SEQ ID No 9中显示的氨基酸序列中，7-11位氨基酸形成β-1链，13-26位氨基酸形成α-1链，37-47位氨基酸形成α-2链，62-69位氨基酸形成β-2链，74-86位氨基酸形成β-3链，92-103位氨基酸形成β-4链，111-125位氨基酸形成α-3链，130-136位氨基酸形成β-5链，139-146位氨基酸形成α-3链以及154-159位氨基酸形成β-6链。SEQ ID No 9中显示的序列中的β-4链中存在的氨基酸Glu(98位)、Asp(99位)和IIe(100位)与底物AcCoA相互作用，它们将它的羰基键极化并且稳定由AcCoA和GlcN-6-P以及GlcN-6-P乙酰转移酶组成的四聚反应中间产物中的AcCoA的氧原子的负电荷。SEQ ID No 9中显示的序列中的氨基酸Tyr(143位)稳定了待将切除的CoA分子的硫醇盐阴离子。SEQ ID No 9中显示的序列中的氨基酸Leu(133位)支持了反应催化过程中的这些相互作用。在反应催化过程中，GlcN-6-P结合在同质二聚体的单体间形成的袋之中，β-6链的氨基酸残基参与了其形成。在反应催化过程中，SEQ ID No9中显示的序列中的氨基酸Asp(134位)增加了GlcN-6-P氨基的亲核性(Milewski等，2006，在线发表于Wiley InterScience，www.interscience.wiley.com，DOI：10.1002/yea.1337)。参与正在讨论的反应催化的具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的其他氨基酸描述于Peneff等(2004，J.Biological Chemistry 276(19)，16328-16334，图1)。
也可以在来自其他生物的编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的氨基酸序列中鉴定出此处以示例性方式指出的参与催化反应的酿酒酵母氨基酸序列中的氨基酸。例如，这些是来自白色念珠菌(Candidaalbicans)(EMBL acc.No：AB017627.1)的编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸Glu88、Asp80、Ile90、Asp124和Tyr133。
已描述了编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的核酸分子和相应的蛋白质序列，尤其来自以下生物：酿酒酵母(EMBL acc.No：AB017626.1)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(EMBL acc.No：AB017629.1)、白色念珠菌(EMBL acc.No：AB017627.1)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(EMBL CDS acc.No：BAE62756.1)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(NCBI acc.No：NM_073253.4，EMBL CDS acc.No：BAA63497.1，CAA044531.1)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(EMBL CDS acc..No：AAL13916.1)、Xenopus traopicalis(EMBL acc.No：CR760021.2)、小鼠(EMBL CDS acc.No：BAE39886.1)、人(EMBL CDSacc.No：BAC03482.1)、猩猩(Pongo pygmaeus)(EMBL CDS acc.No：CR858996.1)、Acanthamoeba polyphaga mimivirus(EMBL CDS acc.No：AAV50586.1)。尽管如已描述的，参与催化反应的氨基酸残基在来自多种生物的具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质中是保守的，但在一些情况下它们的序列相互间具有非常低的同一性。因此，来自酿酒酵母的编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的氨基酸序列(EMBL acc.No：AB017626.1)与来自白色念珠菌的相应序列(EMBL acc.No：AB017627.1)仅具有44％的同一性并且与来自裂殖酵母的相应序列(EMBL acc.No：AB017629.1)甚至仅具有25％的同一性(Milewski等，2006，在线发表于Wiley InterScience，www.interscience.wiley.com，DOI：10.1002/yea.1337)。尽管在正在讨论的氨基酸序列相互间同一性低，所有上文提及的编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的序列均适合于产生根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物。
根据本发明，编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶酶活性的蛋白质的外来核酸分子可来自任何生物；优选地，所述核酸分子来自真菌、动物或植物，尤其优选来自真菌并特别优选来自酿酒酵母。
优选地，编码GlcN-6-P乙酰转移酶的外来核酸分子的特征在于它编码GlcN-6-P乙酰转移酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO 9中显示的氨基酸序列具有至少70％、优选为至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的外来核酸分子的特征在于它编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质，所述蛋白质具有SEQ ID NO 9中显示的氨基酸序列。
在其他实施方案中，编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的外来核酸分子与SEQ ID NO 8中显示的核酸序列具有至少70％、优选为至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码GlcN-6-P乙酰转移酶的核酸分子的特征在于它具有SEQ ID NO 8中显示的核酸序列或特征在于所述外来核酸分子序列由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO 8中所示的核酸序列有所不同。
在本发明的上下文中，术语“UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(2-乙酰胺基-2-脱氧-d-葡萄糖1-磷酸尿苷酰转移酶)(EC 2.7.7.23)”理解为从底物尿苷三磷酸(UTP)和N-乙酰基-D-葡糖胺1-磷酸(GlcNAc-1-P)合成UDP-N-乙酰基-葡糖胺(UDP-GlcNAc)的蛋白质。UDP-GlcNAc的合成根据下文的反应方案催化：
Figure GPA00001136225700211
具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的原核生物蛋白质通常为双功能蛋白质，其除了上文显示的反应(EC 2.7.7.23)外，还具有葡糖胺1-磷酸乙酰转移酶(GlcN-1-P乙酰转移酶，EC 2.3.1.157)的功能，即它们催化葡糖胺1-磷酸(GlcN-1-P)向N-乙酰基-葡糖胺1-磷酸(GlcNAc-1-P)的N-乙酰基化(GlcN-1-P+AcCoA→GlcNAc-1-P+CoASH)(Gehring等，1996，Biochemistry 35，579-585)。相反，具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的真核生物蛋白质为仅催化上述反应(
Figure GPA00001136225700212
Figure GPA00001136225700213
)的单功能蛋白质(Mio等，1998，J.Biol.Chem.273(23)，14392-14397)。
在本发明的上下文中，术语“具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的单功能蛋白质”理解为催化上文描述的针对具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的反应(
Figure GPA00001136225700214
)的蛋白质。具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的单功能蛋白质不(额外)具有催化GlcN-1-P向GlcNAc-1-P乙酰化的活性。因此，将具有GlcNAc焦磷酸化酶活性的单功能蛋白质分类在EC编号2.7.7.23中，而具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的双功能蛋白质具有分类在EC编号2.7.7.23中的酶的活性以及分类在EC编号2.3.1.157中的酶的活性。
令人惊奇的是，已发现与现有技术中的公开内容(例如WO 2007023682)不同的是，具有编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性和GlcN-1-P乙酰转移酶活性的双功能蛋白质(例如glmU aus大肠杆菌，EC2.7.7.23和EC 2.3.1.157)的外来核酸分子的根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物不能合成增加量的葡糖胺聚糖。因此，编码UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的外来核酸分子编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(EC 2.7.7.23)活性的单功能蛋白质对于根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物是必需的。因此，编码UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的外来核酸分子不应该编码蛋白质，其除了刚提及的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性外还具有额外的GlcN-1-P乙酰转移酶(EC 2.3.1.157)活性。因此，它优选为真核来源的外来核酸分子。此外，令人惊奇的是，已发现与现有技术中的公开内容(例如WO 2007 023682)不同的是，乙酰葡糖胺磷酸变位酶(GlcNAc-P变位酶，EC 5.4.2.3)的表达以及具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的表达和具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的表达不会导致植物细胞或植物中葡糖胺聚糖量的进一步增加。
编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的单功能蛋白质的氨基酸序列包含在蛋白质间高度保守的氨基酸残基。编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的真核蛋白质的氨基酸序列在每种情况下具有蛋白质间保守的三个结构域。第一个结构域的共有序列为GlyGlyGlnXxxThrArgLeuGlyXxxXxxXxxProLysGly(SEQ ID No 11中显示的序列的111-124位氨基酸)，第二个结构域的共有序列为Pro(Asp或Asn)GlyAsn(Gly或Ala)GlyXxxXxxXxxAla(SEQ ID No 11中显示的序列的219-228位氨基酸)并且第三个结构域的共有序列为LysXxxGluXxxPheXxxPheAspXxxPhe(SEQ ID No 11中显示的序列的377-386位氨基酸)，其中Xxx为任何氨基酸。具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的原核蛋白质(例如glmU aus大肠杆菌，EMBL acc.No：EAY46949.1)具有与来自真核生物中相应蛋白质的第一个结构域相似的保守结构域(GlyXxxGlyThr(Arg或Ser)XxxXxxXxxXxxProLys)。对于真核蛋白质的第二个或第三个结构域，在原核蛋白质中未发现相应的结构域。(Mok和Edwards，2000，J.Biol.Chem.280(47)，39363-39372)
SEQ ID No 11中显示的氨基酸序列中的氨基酸Gly(112位)、Gly(114位)、Thr(115位)、Arg(116位)、Pro(122位)和Lys(123位)在编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的一级序列中是保守的。SEQ ID No 11中显示的氨基酸序列中的氨基酸Gly(112位)、Arg(116位)或Lys(123位)的替换导致近乎失活的蛋白质。相反，SEQ ID No 11中显示的氨基酸序列中的氨基酸Gly(114位)、Thr(115位)或Pro(122位)的替换仅显示了正在讨论的蛋白质活性的降低。因此，SEQ ID No 11中显示的氨基酸序列中的氨基酸Gly(112位)、Arg(116位)和Lys(123位)是在具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质中具有催化功能的氨基酸(Mio等，1998，J.Biol.Chem.273(23)，14392-14397)。
在编码来自肠贾第鞭毛虫(Giardia intestinales)的具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的氨基酸序列中(EMBL acc.No：AAM54702.1)，氨基酸Gly(108位)对应于SEQ ID No 11中显示的序列的氨基酸Gly(112位)。编码来自肠贾第鞭毛虫的具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸Gly(108位)经氨基酸Ala的替换也导致了蛋白质活性的几乎完全降低(Mok和Edwards，2005，J.Biol.Chem.280(47)，39363-39372)。编码来自人的具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的氨基酸序列(EMBL acc.No：BAA31202.1)中的氨基酸Gly(111位)(其对应于SEQ ID No 11中显示的序列中的氨基酸Gly(112位))的替换也导致了活性的几乎完全降低(Wang-Gillam等，2000，J.Biol.Chem.275(2)，1433-1438)。
编码来自人的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的蛋白质(EMBL acc.No：BAA31202)中的氨基酸Gly(222位)和来自肠贾第鞭毛虫的相应蛋白质(EMBL acc.No：AAM54702.1)中的相应氨基酸Gly(210位)的替换在两种情况下均同样导致了活性的几乎完全丧失，这说明所述氨基酸同样为参与了催化的氨基酸(Mok和Edwards，2005，J.Biol.Chem.280(47)，39363-39372)。编码来自人的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的蛋白质(EMBLacc.No：BAA31202)中的氨基酸Gly(224位)的替换导致了蛋白质活性相当大但不完全的丧失，并且氨基酸Pro(222位)的替换仅导致了活性轻微下降。从中推断出SEQ ID No 11中显示的序列的氨基酸Gly(221位)和Gly(223位)参与了UTP的识别，并且在SEQ ID No 11中显示的序列的氨基酸Gly(111位)和Gly(112位)(在各自一级序列中保守)参与了结合GlcNAc-1-P(Wang-Gillam等，2000，J.Biol.Chem.275(2)，1433-1438)。
已描述了编码具有上文提及特性的具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶单功能活性的蛋白质的核酸分子和相应蛋白质序列，尤其是在以下生物中：肠贾第鞭毛虫(Giardia intestinales)(EMBL acc.No：AAM54702.1)、酿酒酵母(EMBL acc.No：X79380.1，NCBI protein ID：accession No：CAA557927)、白色念珠菌(NCBI acc.No：XM_715480.1)、Pichia stipitis(NCBI acc.No：XM_001385151.1)、小鼠(NCBI acc.No：NM_133806.4)、Canis lupus(NCBI acc.No：XM_844774.1)；牛(NCBI acc.No：NM_001046404.1)、Xenopus tropicalis(NM_001011142.1)、非洲爪蛙(Xenopus laevis)(NCBI acc.No：BC077836.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)(NCBI acc.No：NM_102845.4)、Danio rerio(NCBI acc.No：NM_212621.1)、人(NCBI acc.No：NM_003115.3，EMBL acc.No.：BAA31202.1)。
根据本发明，编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶活性的蛋白质的外来核酸分子可来自任何真核生物；优选地，所述核酸分子来自真菌、动物或植物，尤其优选来自真菌，特别优选来自酿酒酵母。
优选地，编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子的特征在于它编码UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，其氨基酸序列与SEQ IDNO 11中显示的氨基酸序列具有至少70％、优选为至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子的特征在于它编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的且具有SEQ ID NO 11中显示的氨基酸序列的蛋白质。
在其他实施方案中，编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子与SEQ ID NO 10中显示的核酸序列具有至少70％、优选为至少80％、优选至少90％、尤其优选为至少95％并且特别优选为至少98％的同一性。在尤其优选的实施方案中，编码UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的核酸分子的特征在于它具有SEQ ID NO 10中显示的核酸序列或特征在于所述外来核酸分子序列由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO 10中所示的核酸序列有所不同。
在本发明的上下文中，术语“外来核酸分子”理解为分子，其不天然存在于相应的野生型植物细胞中或不天然存在于野生型植物细胞中具体的空间排布中或其定位于野生型植物细胞的基因组中其天然不存在的位点上。
优选地，外来核酸分子为包含不同元件的重组分子，所述元件的组合或特异的空间排列不天然存在于植物细胞中。
在本发明的上下文中，术语“重组核酸分子”理解为包含不同核酸分子(其不以在重组核酸分子中存在的组合天然存在)的核酸分子。因此，重组核酸分子除了包含编码葡糖胺聚糖合酶和/或具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和/或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子之外，还包含不与所述核酸分子存在天然组合的核酸序列。以在重组核酸分子上与编码葡糖胺聚糖合酶和/或具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和/或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子组合存在的所述额外核酸分子可以是任何序列。例如，它们可以是植物基因组核酸序列。额外的核酸序列优选为调控序列(启动子、终止信号、增强子)，尤其优选为在植物组织中有活性的调控序列，特别优选为在植物组织中有活性的组织特异性调控序列。用于产生重组核酸分子的方法为本领域技术人员所知并且包括基因工程方法，例如通过连接来结合核酸分子、遗传重组或核酸分子的从头合成(例如见Sambrok等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第三版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.ISBN：0879695773，Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons；第五版(2002)，ISBN：0471250929)。
本发明优选的实施方案涉及根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物，其中外来核酸分子稳定整合到植物细胞或植物的基因组中。
其基因组中(稳定)整合了外来核酸分子或者其基因组中整合了多个外来核酸分子的经遗传修饰的植物细胞和经遗传修饰的植物可以与野生型植物细胞和野生型植物区分开来，尤其是通过它们分别包含野生型植物细胞和野生型植物中天然不存在的外来核酸分子的事实，或因为此分子整合到根据本发明的经遗传修饰的植物细胞基因组或根据本发明的经遗传修饰的植物基因组这样的位点上，(其分别整合到在野生型植物细胞和野生型植物中不发生的位点上，即整合在不同的基因组环境中)的事实而区分开来，所述外来核酸分子编码葡糖胺聚糖合酶和/或具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和/或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质。此外，此类根据本发明的经遗传修饰的植物细胞和根据本发明的经遗传修饰的植物可分别与非遗传修饰的野生型植物细胞和非遗传修饰的野生型植物区分开来，因为如果适当时除了包含天然存在于野生型植物细胞或野生型植物中的该分子的拷贝外，还包含整合到其基因组中的至少一个拷贝的外来核酸分子。如果引入根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物中的外来核酸分子是早已天然存在于野生型植物细胞或野生型植物中的分子的额外拷贝，根据本发明的经遗传修饰的植物细胞和根据本发明的经遗传修饰的植物可分别与野生型植物细胞和野生型植物区分开来，尤其是通过该额外拷贝/这些额外拷贝分别定位在野生型植物细胞基因组和野生型植物基因组中非天然存在的位点的事实区分开来。
可通过遗传方法和/或分子生物学方法来证实核酸分子向植物细胞或植物的基因组中的整合。核酸分子向植物细胞的基因组或植物基因组中的稳定整合的特征在于在已遗传了所述核酸分子的后代中，稳定整合的核酸分子所处于的基因组环境与亲代中的基因组环境相同。使用本领域技术人员已知的方法，尤其是在RFLP分析(限制性片段长度多态性)的DNA印迹分析(Nam等，1989，The Plant Cell 1，699-705；Leister和Dean，1993，The Plant Journal 4(4)，745-750)，利用基于PCR的方法，例如，扩增片段中长度差异的分析(扩增片段长度多态性，AFLP)(Castiglioni等，1998，Genetics 149，2039-2056；Meksem等，2001，Molecular Genetics andGenomics 265，207-214；Meyer等，1998，Molecular and General Genetics259，150-160)或使用采用限制性内切酶切割扩增片段(切割扩增多态性序列，CAPS)(Konieczny和Ausubel，1993，The Plant Journal 4，403-410；Jarvis等，1994，Plant Molecular Biology 24，685-687；Bachem等，1996，ThePlant Journal 9(5)，745-753)的帮助下来证实植物细胞的基因组中或植物的基因组中核酸序列的稳定整合的存在。
在本发明的上下文中，术语“野生型植物细胞”理解为植物细胞，其作为用于产生根据本发明的经遗传修饰的植物细胞的起始材料，即除去引入的遗传修饰和导致的编码葡糖胺聚糖合酶和/或具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和/或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子的整合外，它们的遗传信息对应于根据本发明的经遗传修饰的植物细胞的遗传信息。
在本发明的上下文中，术语“野生型植物”理解为植物，其作为用于产生根据本发明的经遗传修饰的植物的起始材料，即除去引入的遗传修饰和导致的编码葡糖胺聚糖合酶和/或具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和/或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子的整合外，它们的遗传信息对应于根据本发明的经遗传修饰的植物的遗传信息。
在本发明的上下文中，术语“基因组”理解为存在于植物细胞中的全部遗传物质。对于本领域的技术人员已知的是，除了细胞核外，其他区室(例如质体、线粒体)也包含遗传物质。
可获得向植物宿主细胞中(稳定)整合核酸分子的大量技术。这些技术包括使用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)用t-DNA作为转化方法的植物细胞转化、原生质体融合、注射、DNA电穿孔术、通过生物射弹轰击方法引入DNA和其他选项(综述见于“Transgenic Plants”，Leandro编辑，Humana Press2004，ISBN 1-59259-827-7)。
已深入研究并在EP 120516；Hoekema，IN：The Binary Plant VectorSystem Offsetdrukkerij Kanters B.V.Alblasserdam(1985)，第五章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46和An等EMBO J.4，(1985)，277-287详尽地描述了农杆菌介导植物细胞转化的用途。对于马铃薯的转化，例如见Rocha-Sosa等，EMBO J.8，(1989)，29-33)，对于番茄植株的转化例如见US5,565,347。
也已描述了使用基于农杆菌转化的载体转化单子叶植物(Chan等，Plant Mol.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等，Science in China 33，(1990)，28-34；Wilmink等，Plant Cell Reports11，(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner和Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。用于转化单子叶植物的备选系统为使用生物射弹轰击方法的转化(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104，(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，Plant Mol.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)、原生质体转化、部分透化处理细胞的电穿孔术、使用玻璃纤维引入DNA。具体而言，已在文献中数次描述了玉米的转化(参考，例如，WO95/06128、EP0513849、EP0465875、EP0292435；Fromm等，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon Kamm等，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等，Biotechnology11(1993)，194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。也已描述了其他牧草的转化，例如柳枝稷(Panicum virgatum，Somleva等，2002Crop Science 42：2080-2087；Richards等，2001，Plant Cell Reporters20，48-54)或甘蔗(Bower和Birch，1992，Plant Journal 2(3)，409-416；Bower等，1996 Molecular Breeding 2，239-249；Arencibia等，1998，Transgenic Research 7，213-222)或黍(Casas等，1993，PNAS 90，11212-11216；US 6,369,298)。
还已描述了其他谷类物种的成功转化，例如大麦(Wan和Lemaux，s.o.；Ritala等，s.o.；Krens等，Nature 296，(1982)，72-74)和小麦(Nehra等，PlantJ.5，(1994)，285-297；Becker等，1994，Plant Journal 5，299-307)。所有上述方法均适合于本发明的上下文中。
与现有技术相比，根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物提供的优势在于它们比仅具有葡糖胺聚糖合酶活性的植物产生更高量的葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)。由于从具有更高葡糖胺聚糖含量的植物中分离葡糖胺聚糖复杂度更低并且更节省成本，因此这允许以很少的花费来生产葡糖胺聚糖。此外，与现有技术中描述的植物相比，使用根据本发明的经遗传修饰的植物需要更少的栽种面积来生产葡糖胺聚糖。这使得提供甚至用于工业应用的足够量的葡糖胺聚糖成为可能，而由于葡糖胺聚糖的缺乏和高价格目前工业应用上是不使用它的。小球藻属的病毒感染植物生物体不适合于产生相对大量的葡糖胺聚糖(乙酰透明质酸)。在生产葡糖胺聚糖(乙酰透明质酸)中，病毒感染的藻类具有葡糖胺聚糖合酶所需的基因不能稳定整合至它们的基因组中的劣势(Van Etten和Meints，1999，Annu.Rev.Microbiol.53，447-494)，因此，对于生产葡糖胺聚糖(乙酰透明质酸)，不得不重复进行病毒感染。因此，不可能分离到连续合成所需品质和数量的葡糖胺聚糖(乙酰透明质酸)的独立小球藻细胞。此外，在病毒感染的小球藻中，葡糖胺聚糖(乙酰透明质酸)仅在有限的时期内产生，并因为病毒引起的裂解，在感染仅约8小时后藻类会被杀死(Van Etten等，2002，Arch Virol 147，1479-1516)。相反，本发明提供根据本发明的经遗传修饰的植物细胞和根据本发明的经遗传修饰的植物具有可以不受限地以无性或有性方式来繁殖并且它们持续产生葡糖胺聚糖(乙酰透明质酸)的优势。
在WO 05 012529中描述的具有编码乙酰透明质酸合酶的核酸分子的转基因植物合成相对少量的葡糖胺聚糖(乙酰透明质酸)。相反，本发明提供根据本发明的经遗传修饰的植物细胞和根据本发明的经遗传修饰的植物合成显著更高量的葡糖胺聚糖的优势。
因此，本发明还提供合成葡糖胺聚糖的根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物。
在优选的实施方案中，根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物合成选自软骨素、肝素/类肝素和乙酰透明质酸的葡糖胺聚糖。
为了测定根据本发明的经遗传修饰的植物中与鲜重相关的葡糖胺聚糖含量，优选使用植物整个地上部分材料，即除了根之外的所有植物部分。
可通过分离它们合成的葡糖胺聚糖并确定其结构来鉴定合成葡糖胺聚糖的根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物。由于植物组织具有不含任何葡糖胺聚糖的优势，可使用简易快速的分离方法来证明在根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物中葡糖胺聚糖的存在。由于植物组织还具有不含任何葡糖胺聚糖降解酶的优势，可使用简易快速的分离方法来证明在根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物中葡糖胺聚糖的存在。为此，将水加到待检测的植物组织中，随后将植物组织机械粉碎(例如在砂磨机、Warring Blender、液汁提取机等的帮助下)。需要时，然后可向悬浮液中加入更多的水，并随后通过离心去除细胞碎片和水不溶性组分。例如，可使用与相关葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)特异性结合的蛋白质来证实离心后获得的上清液中葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)的存在。
用于不同葡糖胺聚糖的基于免疫学试剂的此类检测试剂盒(ELISA)为本领域技术人员所知并且可通过商业途径获得(例如用于肝素检测试剂盒：Lifespan Technologies，2401 Foothill Drive，Salt Lake City，UT84109-1405，产品号：K-2100)。
例如在US 5,019,498中描述了在特异性结合乙酰透明质酸的蛋白质的帮助下检测乙酰透明质酸的方法。US 5,019,498中描述的进行该方法的检测试剂盒可通过商业途径获得(例如来自Corgenix，Inc.，Colorado，USA，产品号029-001的透明质酸(HA)检测试剂盒；也见于一般方法第四项)。
例如在免疫学方法的帮助下检测软骨素(Mizuguchi等，2003，Nature423，443-448)。
也可使用其他分析方法，例如IR、NMR或质谱来确认离心上清液中葡糖胺聚糖的存在。
由于已观察到随着根据本发明的植物发育的时间，葡糖胺聚糖积累于植物组织中，所以尤其优选在收获正在研究的植物时或在收获前(一或两)天来测定根据本发明的经遗传修饰的植物中与鲜重相关的葡糖胺聚糖含量。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其特征在于与仅具有编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物相比，或与具有编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子但不具有编码具有UDP-GlcNAc乙酰转移酶活性的外来核酸分子和不具有编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物相比，它们产生增加量的葡糖胺聚糖。
优选地，与(仅)具有葡糖胺聚糖合酶活性的相应经遗传修饰的植物细胞或相应经遗传修饰的植物相比，就根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物中植物材料鲜重产生的葡糖胺聚糖的量增加至少1.2倍，优选至少1.4倍，尤其优选至少1.6倍并且特别优选至少1.8倍。为了测定与根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物中植物材料鲜重相关的葡糖胺聚糖含量的增加，优选使用在根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物分别与(仅)具有葡糖胺聚糖合酶活性的相应的植物细胞或植物相比，其中用植物细胞或植物的等量材料(例如叶、块茎)进行比较，其中在相同条件下培养从中获取该材料的所述植物细胞或植物，并且其中将比较具有可比较年龄(发育阶段)的植物材料的葡糖胺聚糖含量。例如，植物的幼叶不应与不同植物的老叶相比较。同样适用于植物整个地上部分的葡糖胺聚糖含量的测定。待用于比较的植物应已在可比较的条件下培养并且具有相同的发育阶段。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物每克植物材料鲜重(FW)合成至少160μg、优选为至少180μg、尤其优选为至少200μg、特别优选为至少225μg并且最优选为至少250μg的葡糖胺聚糖。
在其他实施方案中，根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物每克植物材料鲜重(FW)合成最多450μg、优选为最多400μg、尤其优选为最多300μg、特别优选为最多280μg并且最优选为最多260μg的葡糖胺聚糖。
在本发明的其他实施方案中，根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物分别为合成葡糖胺聚糖的绿色陆生植物的植物细胞或绿色陆生植物。
在本发明的上下文中，术语“绿色陆生植物(有胚植物)”理解为如在Strasburger，“Lehrbuch der Botanik”[Textbook of Botany]，第34版，Spektrum Akad.Verl.，1999，(ISBN 3-8274-0779-6)中所定义的。
本发明的优选实施方案涉及是多细胞生物的根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物。因此，该实施方案涉及不来自于单细胞植物(原生生物)或不是原生生物的植物细胞或植物。
原则上根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物可以分别是任何植物物种，即单子叶植物和双子叶植物的植物细胞或植物。它们优选为农作物植物，即由人培养用于为人或动物提供食物或用于产生生物量目的和/或制备用于技术、工业目的的物质的植物(例如玉米、稻、小麦、苜蓿、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、番茄、柳枝稷(Panicum virgatum)、西米、绿豆、豌豆、高粱、胡萝卜、茄子、萝卜、油菜、大豆、花生、黄瓜、南瓜、甜瓜、韭菜、大蒜、卷心菜、菠菜、红薯、芦笋、西葫芦、莴苣、洋蓟、甜玉米、防风草、鸦葱、菊芋、香蕉、甜菜、甘蔗、甜菜根、绿花椰菜、卷心菜、洋葱、黄甜菜、蒲公英、草莓、苹果、杏、李、桃、葡萄藤、花椰菜、芹菜、bell peppers、swede、大黄)。尤其优选为玉米、甘蔗、红薯或粟糖(sugar millet)，非常特别优选为番茄或马铃薯植物。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其中编码蛋白质的外来核酸分子的特征在于与编码基源生物的各个蛋白质的核酸分子的密码子相比外来核酸分子的密码子被修饰。特别优选地，已将外来核酸分子的密码子修饰使得它们适合于其基因组中整合了或待整合它们的植物细胞或植物的密码子使用频率。
由于遗传密码的简并性，氨基酸可由一个或更多个密码子编码。在不同生物中，编码氨基酸的密码子以不同频率使用。将编码核酸序列的密码子与其基因组中将整合待表达序列的植物细胞或植物中密码子使用频率相适应可有助于在特定植物细胞或植物中增加翻译正在讨论的蛋白质的量和/或提高正在讨论的mRNA的稳定性。可由本领域技术人员针对编码特定氨基酸的特定密码子的频率通过测定正在讨论的生物中尽可能多的编码核酸序列来测定正在讨论的植物细胞或植物中密码子的使用频率。特定生物的密码子使用频率为本领域技术人员所知并且可使用计算机程序以简易快速的方式测定。合适的计算机程序是对公众开放的并且尤其是互联网免费提供的(例如http://gcua.schoedl.de/；http://www.kazusa.or.jp/codon/；http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html)。
可通过体外诱变或优选地通过基因序列的从头合成来使编码核酸序列的密码子适应于其基因组将整合待表达序列的植物细胞或植物中的密码子使用频率。用于核酸序列从头合成的方法为本领域技术人员所知。例如可通过开始合成单一核酸寡核苷酸、将其与互补的寡核苷酸杂交使得它们形成DNA双链，并随后将单一双链寡核苷酸连接以获得所需核酸来进行从头合成。还可以将包括与向特定目的生物使用的密码子频率相适应的核酸序列的从头合成交给提供该服务的公司(例如Entelechon GmbH，Regensburg，Germany)。
在本发明的上下文中，术语“同一性”指核酸分子的编码区全长或编码蛋白质的氨基酸全长上至少60％的序列相同、尤其为至少70％、优选为至少80％、尤其优选为至少90％并且特别优选为至少95％相同。在本发明的上下文中，术语“同一性”理解为与其他蛋白质/核酸的相同氨基酸/核苷酸的数目(同一性)，以百分比表示。优选地，在计算机程序的帮助下通过将其他蛋白质/核酸与SEQ ID NO 2中提供的氨基酸序列相比较来测定与具有乙酰透明质酸合酶活性的蛋白质相关的同一性，并通过与SEQ IDNO 1或SEQ ID NO 3中提供的核酸序列相比较来测定与编码具有乙酰透明质酸合酶活性的蛋白质的核酸分子相关的同一性，通过与SEQ ID NO 5中显示的氨基酸序列相比较来测定与具有软骨素合酶活性的蛋白质相关的同一性或者通过与SEQ ID NO 4中显示的核酸序列相比较来测定与编码具有软骨素合酶活性的蛋白质的核酸分子相关的同一性，通过与SEQ IDNO 7中显示的氨基酸序列相比较来测定与具有肝素/heparosan合酶活性的蛋白质相关的同一性或者通过与SEQ ID NO 6中显示的核酸序列相比较来测定与编码具有肝素/heparosan合酶活性的蛋白质的核酸分子相关的同一性，通过与SEQ ID NO 9中显示的氨基酸序列相比较来测定与具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质相关的同一性或者通过与SEQ IDNO 8中显示的核酸序列相比较来测定与编码具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的核酸分子相关的同一性，通过与SEQ ID NO 11中提供的氨基酸序列相比较来测定与具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质相关的同一性或者通过与SEQ ID NO 10中显示的核酸序列相比较来测定与编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子相关的同一性。如果用于彼此比较的序列长度不同，那么通过测定较短序列与较长序列共有氨基酸数目的同一性百分比来测定同一性。优选地，使用已知且公开可得的计算机程序ClustalW(Thompson等，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)来测定同一性。经Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson(@EMBL-Heidelberg.DE)，European Molecular BiologyLaboratory，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，Germany使ClustalW成为公开可用的。还可以从不同的互联网页上下载ClustalW，尤其是从IGBMC(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404Illkirch Cedex，France；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和从EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及所有EBI(EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB101SD，UK)的镜像互联网页上下载。
优选地，使用1.8版本的ClustalW计算机程序来测定本发明上下文中描述的蛋白质与其他蛋白质间的同一性。此处，需将参数按如下设定：KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
优选地，使用1.8版本的ClustalW计算机程序来测定例如本发明上下文中描述的核酸分子的核苷酸序列与其他核酸分子的核苷酸序列间的同一性。此处，需将参数按如下设定：KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIX：IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS：未加权。
此外，同一性表示正在讨论的核酸分子或由其编码的蛋白质间功能和/或结构的等同。与上文描述的分子同源的核酸分子以及这些分子的代表性衍生物通常为代表具有相同生物学功能的修饰的这些分子的变异。它们可以是天然存在的变异，例如来自其他物种的序列，或突变，其中这些突变可能以天然方式发生或通过定向突变来引入。此外，变异可以是合成产生的序列。等位变体可以是天然发生的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。衍生物的特殊形式例如为核酸分子，其由于遗传密码的简并性而与本发明上下文中描述的核酸分子有所不同。
由不同核酸分子衍生物编码的蛋白质具有某些共有特征。
这些例如可以是生物学活性、底物特异性、分子量、免疫学反应性、构象等等。
本发明还提供了根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其特征在于整合到植物细胞或植物的基因组中的编码葡糖胺聚糖合酶和编码具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和/或编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子与植物细胞中起始转录的调节元件(启动子)相连接。这些可以是同源或异源启动子。启动子可以是组成型的、组织特异的、发育特异的或受外部因素调节的(例如在应用化学底物后，在非生物因素，如热和/或寒冷、干旱、疾病等的作用下)。此处，整合到根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物的基因组中的编码葡糖胺聚糖合酶或具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子在每种情况下可以与相同的启动子结合，或不同启动子可与各条序列相结合。此处，两个或三个不同启动子可以任何组合存在，在每种情况下与根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物中编码葡糖胺聚糖合酶或具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的相关外来核酸分子相结合。
本发明的优选实施方案涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物，其中选自编码葡糖胺聚糖合酶或具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子中的至少一个外来核酸分子、尤其优选为至少两个外来核酸分子、特别优选为三个外来核酸分子与组织特异的启动子相连接。优选的组织特异启动子为特异地在植物块茎、果实或种子细胞或叶中起始转录的启动子。
通常，在植物细胞中具有活性的每一启动子均适合于表达编码葡糖胺聚糖合酶或具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子。
此处，可选择启动子使得表达为组成型的或仅在特定组织中、在植物特定的发育时间点上或在由外界因素决定的时间点上表达。关于植物和关于待表达的核酸分子，启动子可以是同源的或异源的。
例如，合适的启动子为用于组成型表达的花椰菜花叶病毒的35S RNS启动子或来自玉米的泛素启动子(Christensen和Quail，1996，TransgenicResearch 5(3)，213-218)、来自黍的高粱醇溶蛋白启动子(De Rose等，1996，Plant Molecular Biology 321029-1035；Mishra等，2007，Molecular BiologyReports在线：2February 2007，DOI：10.1007/s11033-007-9056-8)或洋丁香属(Cestrum)YLCV启动子(Yellow Leaf Curling Virus；WO 0173087；Stavolone等，2003，Plant Mol.Biol.53，703-713)、马铃薯中用于块茎特异表达的patatingen启动子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29或番茄果实特异的启动子，例如来自番茄的多聚半乳糖醛酸酶启动子(Montgomery等，1993，Plant Cell 5，1049-1062)或来自番茄的E8启动子(Metha等，2002，Nature Biotechnol.20(6)，613-618)或来自桃的ACC氧化酶启动子(Moon和Callahan，2004，J.Experimental Botany 55(402)，1519-1528)或确保仅在光合活性组织中表达的启动子，例如ST-LS1启动子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等人，EMBO J.8(1989)，2445-2451)或来自小麦的用于胚乳特异表达的HMWG启动子、来自玉米的USP启动子、菜豆蛋白启动子、玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等，Plant Mol.Biol.15(1990)，81-93)，谷蛋白启动子(Leisy等，Plant Mol.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等，FEBS Lett.383(1996)，213-218)或shrunken-1启动子(Werr等，EMBO J.4(1985)，1373-1380)。然而，也可使用仅在由外部因素决定的时间点上具有活性的启动子(例如见WO 9307279)。此处特别感兴趣的是容许简单诱导的热激蛋白启动子。此外可以使用种子特异性启动子，例如来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子，其确保在蚕豆和其他植物中的种子特异性表达(Fiedler等，Plant Mol.Biol.22(1993)，669-679；等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。
使用藻类感染病毒基因组中存在的启动子也适合于在植物中表达核酸序列(Mitra等，1994，Biochem.Biophys Res Commun 204(1)，187-194；Mitra和Higgins，1994，Plant Mol Biol 26(1)，85-93，Van Etten等，2002，Arch Virol 147，1479-1516)。
在本发明的上下文中，术语“组织特异性的”理解为将现象(例如转录起始)基本限定在特定组织中的涵义。
在本发明的上下文中，术语“块茎、果实或种子细胞”理解为存在于块茎、果实或种子中的所有细胞。
在本发明的上下文中，术语“同源启动子”理解为天然存在于用于产生根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物的植物或植物细胞中(与植物细胞或植物同源)的启动子或在从中分离序列的生物中调节基因表达调节(与待表达的核酸分子同源)的启动子。
在本发明的上下文中，术语“异源启动子”理解为不天然存在于用于产生根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物的植物细胞或植物(与植物细胞或植物异源)的启动子或在其中分离待表达的核酸序列的生物中不天然存在的用于调节所述核酸序列的表达(与待表达的核酸分子异源)的启动子。
还存在用于向核酸分子的mRNA转录物上添加多聚A尾的终止序列(多聚腺苷酸信号)。认为多聚A尾用于稳定转录物。在文献中描述了此类元件(参考Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)并且在需要时进行交换。
还可以在启动子和编码区或编码蛋白质的外来核酸分子间存在内含子序列。此类内含子序列可在植物中促使表达稳定并增加表达(Callis等，1987，Genes Devel.1，1183-1200；Luehrsen和Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93；Rethmeier等，1997；Plant Journal 12(4)，895-899；Rose和Beliakoff，2000，Plant Physiol.122(2)，535-542；Vasil等，1989，PlantPhysiol.91，1575-1579；XU等，2003，Science in China Series C Vol.46 No.6，561-569)。例如，合适的内含子序列是来自玉米的sh1基因的第一个内含子、来自玉米的多泛素基因1的第一个内含子、来自稻的EPSPS基因的第一个内含子或来自拟南芥的PAT1基因的前两个内含子。
本发明还涉及包含根据本发明的经遗传修饰的植物细胞的植物。通过从根据本发明的经遗传修饰的植物细胞的再生来产生此类植物。
在其他实施方案中，本发明涉及根据本发明的经遗传修饰的植物的可收获植物部分，如果实、贮藏根和其他根、花、芽、枝条、叶或茎，优选种子、果实或块茎，这些可收获部分包含根据本发明的经遗传修饰的植物细胞。
在本发明的优选实施方案中，根据本发明的可收获植物部分是包含本发明经遗传修饰的植物细胞的根据本发明的经遗传修饰的植物的可加工或可消耗部分。
在本发明的上下文中，术语“可加工部分”应理解为用于制备粮食或饲料的植物部分，其用作工业过程的原材料来源，制备药剂的原材料来源或制备化妆品产品的原材料来源。
在本发明的上下文中，术语“可消耗部分”应理解为用作人类食物或动物饲料的植物部分。
本发明还涉及包含本发明经遗传修饰的植物细胞的根据本发明的经遗传修饰的植物的繁殖材料。
此处，术语“繁殖材料”包含适合经无性途径或有性途径产生后代的植物的那些成分。适合无性繁殖的是例如，切割、愈伤组织培养、根茎或块茎，但还有例如原生质体和细胞培养物。通过有性过程方式产生的繁殖材料包括，例如果实、种子、幼苗等。所述繁殖材料优选采取块茎、果实或种子的形式。
优选地，本发明涉及包含葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)的根据本发明的繁殖材料或根据本发明的植物的可收获部分。尤其优选地，根据本发明的繁殖材料或根据本发明的植物的可收获部分是合成葡糖胺聚糖的根据本发明的繁殖材料或根据本发明的植物的可收获部分。优选地，所述葡糖胺聚糖是软骨素、肝素/乙酰肝素、乙酰透明质酸，尤其优选为乙酰透明质酸。
在本发明的上下文中，术语“马铃薯植物”或“马铃薯”应理解为茄属(Solanum)的植物种，尤其是茄属的块茎产生种，并尤其是马铃薯(Solanum tuberosum)。
在本发明的上下文中，术语“番茄植物”或“番茄”应理解为表示番茄属(Lycopersicon)的植物种，尤其是番茄(Lycopersicon esculentum)。
本发明的其他优势是根据本发明的经遗传修饰的植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分比仅包含编码葡糖胺合酶的外来核酸分子的植物包含更多的葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)。因此，根据本发明的经遗传修饰的植物不仅特别适合用作可从其中分离葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)的原材料，也可直接用作粮食/饲料，或用于制备具有预防或治疗特征(例如用于骨关节炎预防，US 6,607,745)的粮食/饲料。由于根据本发明的经遗传修饰的植物比仅具有编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子的植物具有更高的葡糖胺聚糖含量，此类粮食/饲料的制备需要更少量的根据本发明的经遗传修饰的植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分。如果根据本发明的经遗传修饰的植物的可消耗部分例如直接作为所谓的“营养制品”被消耗，则甚至可通过摄取相对少量的物质实现积极效果。这尤其在制备动物饲料中具有特殊重要性，因为具有太高植物成分含量的动物饲料不适合用作多种动物种类的饲料。
由于葡糖胺聚糖，尤其是乙酰透明质酸结合水的高能力，根据本发明的经遗传修饰的植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分当产生固体化粮食/饲料时还具有需要更少浓缩剂的优势。因此，例如，果冻的制备需要更少的糖，其与对健康的额外积极影响相关。在需要天然植物材料脱水的粮食/饲料的产生中，使用根据本发明的经遗传修饰的植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分的优势在于这样的事实，需要从正在讨论的植物材料中去除更少的水，导致更低的生产成本，并因更温和的生产方法(例如更少的和/或更短的热量输入)致使正在讨论的粮食/饲料的营养价值提高。因此，例如，在番茄浆的生产中，需要引入更少的能量以达到期望的粘度。
本发明还提供用于产生植物的方法，其包括
a)遗传修饰的植物细胞，其中所述遗传修饰包括以下步骤i到iii
i)向植物细胞中引入编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子
ii)向植物细胞中引入编码葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶的外来核酸分子
iii)向植物细胞中引入编码UDP-N-乙酰基-葡糖胺焦磷酸化酶的外来核酸分子
其中可以任何顺序进行步骤i到iii，或同时进行单独的步骤i到iii或其的任何组合，
b)从来自步骤a)i和/或a)ii和/或a)iii的植物细胞再生植物；
c)适当时，使用根据步骤b)的植物再生另外的植物，其中，适当时，从步骤b)或c)的植物中分离植物细胞，并重复方法步骤a)到c)直至产生具有编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子和编码具有葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶活性的蛋白质的外来核酸分子以及编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子的植物。
用于产生植物的根据本发明方法的优选实施方案涉及产生植物的方法，其包括
a)遗传修饰植物细胞，其中所述遗传修饰包括单独或同时进行的以下任何顺序的步骤i到iii，或以下步骤i到iii的任何组合
i)向植物细胞中引入编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子
ii)向植物细胞中引入编码葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶的外来核酸分子
iii)向植物细胞中引入编码UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的外来核酸分子
b)从包含根据以下步骤的遗传修饰的植物细胞中再生植物
i)a)i
ii)a)ii
iii)a)iii
iv)a)i和a)ii，
v)a)i和a)iii，
vi)a)ii和a)iii，或
vii)a)i和a)ii和a)iii
c)根据以下步骤向植物的植物细胞中引入遗传修饰并再生植物
i)根据步骤a)ii的b)i遗传修饰，
ii)根据步骤a)iii的b)i遗传修饰，
iii)根据步骤a)ii的b)i遗传修饰，和同时根据步骤a)iii的遗传修饰，
iv)根据步骤a)i的b)ii遗传修饰，
v)根据步骤a)iii的b)ii遗传修饰，
vi)根据步骤a)i的b)ii遗传修饰，和同时根据步骤a)iii的遗传修饰，
vii)根据步骤a)i的b)iii遗传修饰，
viii)根据步骤a)ii的b)iii遗传修饰，
ix)根据步骤a)i的b)iii遗传修饰，和同时根据步骤a)ii的遗传修饰，
x)根据步骤a)iii的b)iv遗传修饰，
xi)根据步骤a)ii的b)v遗传修饰，或
xii)根据步骤a)i的b)vi遗传修饰
d)根据以下步骤向植物的植物细胞中引入遗传修饰并再生植物
i)根据步骤a)iii的c)i遗传修饰，
ii)根据步骤a)ii的c)ii遗传修饰，
iii)根据步骤a)iii的c)iv遗传修饰，
iv)根据步骤a)ii的c)v遗传修饰，
v)根据步骤a)ii的c)vii遗传修饰，
vi)根据步骤a)i的c)vii遗传修饰，或
vii)根据步骤a)ii的c)ix遗传修饰
e)适当时在根据任何步骤b)vii c)iii、c)vi、c)x、c)xi、c)xii或根据任何步骤d)i到d)vii的植物的帮助下进一步产生植物。
根据本发明用于产生植物的方法步骤a)，为了引入外来核酸分子可使用任何可得的方法。用于转化植物细胞的多种方法早已在上文得到描述，并在此处可以相应方式应用。如果不是同时进行而是连续进行用于产生植物的根据本发明方法的步骤a)的方法步骤，可使用相同或不同方法用于各转化步骤。
可通过本领域技术人员已知的方法实现用于产生植物的根据本发明方法的步骤b)和适当时步骤c)和d)的植物再生(例如描述于“Plant CellCulture Protocols“，1999，R.D.Hall编辑，Humana Press，ISBN0-89603-549-2)。
例如可通过无性繁殖(例如经过切割、块茎或经过愈伤组织培养和完整植株的再生)或通过有性繁殖进行用于产生植物的根据本发明方法的进一步植物的产生(根据方法，根据步骤c)或步骤e))。此处，有性繁殖优选以可控方式进行，即具有某些性质的所选植物彼此杂交并繁殖。优选进行选择，以便所述进一步的植物(根据方法，其根据步骤c)或步骤e)产生)具有在前述步骤中引入的外来核酸分子。
在用于产生植物的根据本发明的方法中，可同时或以连续步骤并以任何组合进行产生根据本发明经遗传修饰的植物细胞的遗传修饰。可以使用其中还未引入外来核酸分子的野生型植物和野生型植物细胞，或可以使用早已经过遗传修饰并早已向其中引入一个或更多外来核酸分子的植物细胞或植物。
在用于产生植物的根据本发明方法的步骤a)中，在向植物细胞或植物中引入外来核酸分子的遗传修饰中，所述外来核酸分子可以是单个核酸分子或多个核酸分子。因此，编码葡糖胺聚糖合酶或编码具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶的酶活性的蛋白质或编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的酶活性的蛋白质的外来核酸分子可一起存在于单个核酸分子上，或者提及的外来核酸分子中的两个可以任何可能组合一起存在于单个核酸分子上并且第三个外来核酸分子存在于另一核酸分子上，或者所有三个提及的外来核酸分子可存在于各单独的核酸分子上。
早已在上文中结合根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物描述了外来核酸分子或重组核酸分子的优选性质，并且在用于产生植物的根据本发明方法的实践中相应地应用它们。
在其他优选实施方案中，用于产生植物的根据本发明的方法用于产生根据本发明的经遗传修饰的的植物。
本发明还提供通过本发明方法获得的植物，所述方法用于产生合成乙酰透明质酸的植物。
本发明还涉及用于产生葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)的方法，其包括从根据本发明的经遗传修饰的植物细胞、根据本发明的经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获植物部分或通过用于产生植物的根据本发明方法获得的植物或这些植物的部分提取葡糖胺聚糖的步骤。优选地，此方法也包括在提取葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)之前收获根据本发明的经遗传修饰的植物细胞、根据本发明的经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获植物部分、根据本发明的可加工植物部分的步骤，并尤其优选地还包括在收获之前培养根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物的步骤。
与细菌或动物组织相反，植物组织没有葡糖胺聚糖降解酶(例如透明质酸酶)。因此，如上文早已描述，使用相对简单的方法从植物组织中提取葡糖胺聚糖是可能的。如果需要，可使用本领域技术人员已知的方法，如利用乙醇重复沉淀来进一步纯化含有葡糖胺聚糖的植物细胞或组织的上述水溶性提取物。在一般方法第3项中描述了用于纯化乙酰透明质酸的优选方法。
早已描述用于从根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物中提取葡糖胺聚糖的方法也适合于从根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获植物部分或通过用于制备合成乙酰透明质酸的植物的本发明方法获得的植物或这些植物的部分中分离葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)。
本发明还提供根据本发明的经遗传修饰的植物细胞、根据本发明的经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获植物部分或通过用于产生制备葡糖胺聚糖的植物的本发明方法可获得的植物的用途。
本发明还涉及包含根据本发明的经遗传修饰的植物细胞的组合物。此处，因为植物细胞已经例如通过加工而被破坏，所以无论它们是完整的还是不再完整的，细胞是无形的。所述组合物优选为粮食或饲料，药物产品或化妆品产品。
本发明优选提供包含根据本发明的经遗传修饰的植物细胞、根据本发明的经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获植物部分或可通过本发明方法获得的植物的组分，并包含重组核酸分子的组合物，其中所述重组核酸分子的特征在于它们包含编码葡糖胺聚糖合酶和具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶酶活性的蛋白质以及具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶活性的蛋白质的核酸分子。
外来核酸分子稳定整合到植物细胞或植物的基因组中导致所述外来核酸分子在整合到植物细胞或植物基因组后其侧翼为植物基因组核酸序列。
因此，在优选的实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于根据本发明组合物中存在的重组核酸分子侧翼为植物基因组核酸序列。
此处，所述植物基因组核酸序列可以是在用于制备所述组合物的植物细胞或植物的基因组中天然存在的任何序列。
在根据本发明的组合物中存在的重组核酸分子可以是单个核酸分子或不同的重组核酸分子，其中编码葡糖胺聚糖合酶(例如乙酰透明质酸合酶)和具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质以及具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子存在于一个核酸分子中，或者是那些其中在单独核酸分子中存在所述核酸分子。编码葡糖胺聚糖合酶(例如乙酰透明质酸合酶)或编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质或编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子可以一起存在于单个重组核酸分子上，或所提及的核酸分子中任何可能组合的两个核酸分子可一起存在于单个重组核酸分子上并且第三个核酸分子可以存在于另一重组核酸分子上，或者所有三个所提及的核酸分子在每一种情况下存在于各单独的重组核酸分子上。根据编码葡糖胺聚糖合酶(例如乙酰透明质酸合酶)或编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质或编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸分子在根据本发明组合物中如何存在，它们侧翼可以是相同的或不同的植物基因组核酸序列。
可使用本领域技术人员已知的方法证明根据本发明的所述组合物包含的重组核酸分子，所述方法如，基于杂交的方法，或优选地使用基于PCR(聚合酶链式反应)的方法。
如上文早已提及，可以使用根据本发明的经遗传修饰的植物细胞、根据本发明的经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获植物部分，或通过根据本发明方法可获得的植物来制备粮食或饲料。然而，在不必提取葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)的情况下也可以作为原材料用于工业应用。因此，例如，根据本发明经遗传修饰的的植物或根据本发明经遗传修饰的植物的部分可应用于农业培养领域中以实现土壤增加的水结合。此外，根据本发明经遗传修饰的的植物或根据本发明经遗传修饰的植物细胞可用于制备干燥剂(例如当航运湿敏性项目使用)或作为液体吸收剂(例如在尿布中或用于吸附泄露的水性液体)。对于此类应用，需要时可以使用根据本发明的完整的经遗传修饰的的植物、根据本发明的经遗传修饰的植物的部分或粉碎的(例如研碎的)根据本发明的经遗传修饰的植物或根据本发明的植物部分。适合于其中使用研碎植物或植物细胞的应用尤其是含有葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)的植物部分，但仅含有低比例的水。这些优选为谷类植物(玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、西米或高粱)的谷粒。因为根据本发明经遗传修饰的的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物比仅具有一种编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子的植物具有更高的葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)含量，所以当使用根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物时，与这些相比需要使用较少的材料用于工业领域。
本发明还提供用于制备根据本发明组合物的方法，其中使用根据本发明的经遗传修饰的植物细胞、根据本发明的经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获植物部分，或通过用于制备植物的根据本发明方法可获得的植物。用于制备根据本发明组合物的方法优选为用于制备粮食或饲料的方法，用于制备药物产品的方法或用于制备化妆品产品的方法。
用于制备粮食或饲料的方法为本领域技术人员所知。用于在工业领域使用根据本发明经遗传修饰的的植物或根据本发明的植物部分的方法也为本领域技术人员所知，并尤其包括粉碎或碾碎根据本发明经遗传修饰的的植物或根据本发明的植物部分；然而，它们不仅限于此。在上文中早已经描述了源于使用根据本发明的物质的一些优势，所述根据本发明的物质用于制备粮食/饲料或用于工业领域中。
用于制备组合物的本发明方法尤其优选为用于制备包含葡糖胺聚糖(例如乙酰透明质酸)的组合物的方法。
本发明也提供可通过用于制备根据本发明组合物的方法获得的组合物。
本发明还涉及根据本发明的经遗传修饰的植物细胞、根据本发明的经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获植物部分或可通过本发明产生植物的方法获得的植物用于制备根据本发明的组合物的用途。优选根据本发明的经遗传修饰的植物细胞、根据本发明的经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获植物部分或可通过本发明产生植物的方法获得的植物用于制备粮食或饲料，用于制备药物产品或化妆品产品的用途。
序列描述
SEQ ID NO 1：编码来自小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的核酸序列。
SEQ ID NO 2：来自小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的氨基酸序列。所示氨基酸序列可源自SEQ ID NO 1。
SEQ ID NO 3：编码来自小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的合成核酸序列。以适合于植物细胞中的密码子使用的方式来合成所示的序列密码子。所示的核酸序列编码具有显示于SEQ ID No 2中的氨基酸序列的蛋白质。
SEQ ID NO 4：编码具有来自多杀巴斯德氏菌的软骨素合酶活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 5：具有来自多杀巴斯德氏菌的软骨素合酶活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可源自SEQ ID NO 4。
SEQ ID NO 6：编码具有来自多杀巴斯德氏菌的heparosan合酶活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 7：具有来自多杀巴斯德氏菌的heparosan合酶活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可源自SEQ ID NO 6。
SEQ ID NO 8：编码具有来自酿酒酵母的GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 9：具有来自酿酒酵母的GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可源自SEQ ID NO 8。
SEQ ID NO 10：编码具有来自酿酒酵母的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 11：具有来自酿酒酵母的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可源自SEQ ID NO 10。
SEQ ID NO 12：包含来YLCV启动子、限制性位点、自农杆菌的ocs终止子的多腺苷酸化信号序列和来自农杆菌的nos终止子的多腺苷酸化信号序列的表达盒的核酸序列。
SEQ ID NO 13：用于制备MCS(“多克隆位点”)的合成寡核苷酸。
SEQ ID NO 14：用于制备MCS(“多克隆位点”)的合成寡核苷酸。
SEQ ID NO 15：用于PCR反应的引物。
SEQ ID NO 16：用于PCR反应的引物。
SEQ ID NO 17：用于PCR反应的引物。
SEQ ID NO 18：用于PCR反应的引物。
SEQ ID NO 19：用于PCR反应的引物。
SEQ ID NO 20：用于PCR反应的引物。
SEQ ID NO 21：编码具有来自大肠杆菌的GlcN-1-P变位酶活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 22：具有来自大肠杆菌的GlcN-1-P变位酶活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可源自SEQ ID NO 21。
SEQ ID NO 23：用作PCR引物的合成寡核苷酸。
SEQ ID NO 24：用作PCR引物的合成寡核苷酸。
SEQ ID NO 25：编码具有来自大肠杆菌的葡糖胺1-磷酸乙酰转移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶双功能活性的蛋白质的核酸序列(glmu)。
SEQ ID NO 26：具有来自大肠杆菌的葡糖胺1-磷酸乙酰转移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶双功能活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可源自SEQ ID NO 25。
SEQ ID NO 27：用于PCR反应的引物。
SEQ ID NO 28：用于PCR反应的引物。
SEQ ID NO 29：编码具有来自酿酒酵母的乙酰葡糖胺磷酸(GlcN-P)变位酶活性的蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO 30：来自酿酒酵母的具有乙酰葡糖胺磷酸变位酶活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可源自SEQ ID NO 30。
一般方法
下文描述了可使用的与本发明相关的方法。这些方法是特定的实施方案；然而，本发明不限于这些方法。本领域技术人员已知的是可以通过修饰所描述的方法和/或由备选方法或备选方法的部分替代个别方法或方法的部分的相同方式进行本发明。
1.转化马铃薯植株
如在Rocha-Sosa等(EMBO J.8，(1989)，23-29)描述的在农杆菌的帮助下转化马铃薯植株。
2.使用乙酰透明质酸作为示例从植物组织中分离葡糖胺聚糖
为了检测乙酰透明质酸的存在并测定植物组织中乙酰透明质酸的含量，如下操作植物材料：向约0.3g植物材料中加入200μl水(去矿物质的，导电率≥18MΩ)，并在实验室用丁字球磨机(MM200，来自Retsch，Germany)(以30Hz进行30秒)中粉碎混合物。随后再加入800μl水(去矿物质的，导电率≥18MΩ)，并将混合物充分混合(例如使用Vortex混合器)。通过在16000×g离心5分钟从上清液中分离细胞碎片和不溶性组分。为了测定植物整个地上部分中的乙酰透明质酸的量，从培养基质上约1cm至3cm处切除植株的地上部分，切成小片并随后如一般方法第3项中描述的用Warring搅拌器粉碎。为了测定乙酰透明质酸含量，可随后从所获的离心上清液中取等分试样(见一般方法第3项)。
3.使用乙酰透明质酸作为示例纯化葡糖胺聚糖
加入水之后(在每种100g植物材料的情况下，约100ml水，去矿物质，导电率≥18MΩ)，将粉碎的植物材料或植株的整个地上部分在Warring搅拌器中以最高速粉碎约30秒。随后使用茶叶滤网去除细胞碎片。将已去除的细胞碎片在300ml水(去矿物质，导电率≥18MΩ)中重悬浮并再次使用茶叶滤网去除。将所获的两份悬浮液(100ml+300ml)合并并在13000×g下离心15分钟。向所获的离心上清液中加入NaCl直至已达到1％的终浓度。当NaCl已溶入溶液中后，通过加入两倍体积的乙醇并随后充分混合并在-20℃下孵育过夜进行沉淀。随后将混合物在13000×g下离心15分钟。经该离心后将所获的沉淀物溶于100ml缓冲液中(50mM TrisHCl，pH 8、1mM CaCl2)并随后加入蛋白酶K至100μg/ml的终浓度并在42℃下孵育该溶液2小时。随后在95℃下孵育10分钟。再一次向该溶液加入NaCl直至已达到1％的终浓度。当NaCl已溶于溶液后，通过加入两倍体积的乙醇、充分混合并在-20℃下孵育约96小时进行沉淀。随后在13000×g下离心15分钟。经该离心后将所获的沉淀物溶于30ml水中(去矿物质，导电率≥18MΩ)，并再一次加入NaCl至终浓度为1％。通过加入两倍体积的乙醇、充分混合并在-20℃孵育过夜进行另一次沉淀。将在随后以13000×g离心15分钟所获的沉淀物溶于20ml水(去矿物质，导电率≥18MΩ)中。
通过离心过滤进行进一步纯化。为此，在每种情况下将5ml溶解的沉淀物加至膜滤器上(CentriconAmicon，孔径10 000NMWL，产品号UCF8 010 96)，并以2200×g离心样品直至滤器上仅剩余约3ml溶液。随后再进行两次，每次将3ml水(去矿物质，导电率≥18MΩ)加入膜上的溶液中并每次在相同条件下再离心直至最终滤器上仅剩余约3ml溶液。将离心过滤后仍存在于膜上的溶液去除，并用约1.5ml水(去矿物质，导电率≥18MΩ)重复冲洗膜(三至五次)。将仍存在于膜上的所有溶液及从冲洗所获的溶液合并，加入NaCl至终浓度为1％，当NaCl溶于溶液后，加入两倍体积的乙醇，将样品混合并在-20℃下过夜保存以获得沉淀。将随后在13000×g离心15分钟后所获的沉淀溶于4ml水(去矿物质，导电率≥18MΩ)中并随后冻干(在0.37mbar的压力下在来自Christ，Osterode，Germany的冻干仪Christ Alpha 1-4上进行24小时)。
4.乙酰透明质酸的检测和乙酰透明质酸含量的测定
按照生产商说明书使用商品化检测(来自Corgenix，Inc.，Colorado，USA，产品号029-001的透明质酸(HA)检测试剂盒)检测乙酰透明质酸，因此通过将所述说明书合并于此作为参考。检测原理基于特异性结合乙酰透明质酸(HABP)的蛋白质的存在并与酶联免疫吸附测定相似地操作，其中颜色反应指示了所检测样品中乙酰透明质酸的含量。在使用检测试剂盒中包含的确定量的乙酰透明质酸的校准曲线的帮助下来测定乙酰透明质酸的值。因此，对于乙酰透明质酸的定量测定，待测定的样品应该以处于所指明的极限之内的浓度使用(例如：正在讨论的样品的稀释或用更少的水从植物组织中提取乙酰透明质酸均基于是否超过或未达到该极限)。
在平行批次中，首先对待测定样品的等分试样进行透明质酸酶消化并随后使用商业化检测(来自Corgenix，Inc.，Colorado，USA，产品号029-001的透明质酸(HA)检测试剂盒)检测。使用400μl的在透明质酸酶缓冲液(0.1M磷酸氢二钾缓冲液，pH 5.3；150mM NaCl)中的植物提取物，通过加入了5μg(～3单位)的透明质酸酶(来自Sigma，产品号H2251的III型透明质酸酶)并在37℃温育30分钟来进行透明质酸酶消化。
每种情况下在1∶10的稀释中，随后所有样品均用于测定乙酰透明质酸含量。
5.GFAT活性的测定
如在Rachel等(1996，J.Bacteriol.178(8)，2320-2327)中所描述来测定具有GFAT活性的蛋白质的活性。
为了区分蛋白质是否具有GFAT-1或GFAT-2活性，使用在Hu等(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)中描述的方法。
实施例
1.制备植物表达质粒IR 47-71
质粒pBinAR是双元载体质粒pBin19(Bevan，1984，Nucl Acids Res 12：8711-8721)的衍生物，其如下构建：
从质粒pDH51(Pietrzak等，1986Nucleic Acids Res.14，5858)中分离包含花椰菜花叶病毒35S启动子6909-7437位核酸的长度为529bp的片段作为EcoR I/Kpn I片段，并且连接至pUC18多接头的EcoR I和Kpn I限制位点之间。以该方式形成了质粒pUC18-35S。使用限制性内切核酸酶Hind III和Pvu II，从质粒pAGV40(Herrera-Estrella等，1983Nature，303，209-213)分离包括Ti质粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBO Journal 3，835-846)的T-DNA的章鱼碱合酶基因(基因3)的多聚腺苷酸信号(3′末端)(11749-11939位核酸)的长度为192bp的片段。将Sph I接头加入到Pvu II限制位点后，将所述片段连接至pUC18-35S的Sph I和Hind III限制位点中间。这形成了质粒pA7。此处，使用EcoR I和Hind III取出包含35S启动子和Ocs终止子的整个多接头并将其连接至适当切割的载体pBin19中。这产生了植物表达载体pBinAR(
Figure GPA00001136225700521
和Willmitzer，1990，Plant Science 66，221-230)。
将来自马铃薯(Solanum tuberosum)的patatin基因B33的启动子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)作为Dra I片段(-1512-+14位核酸)连接至Sst I切割的载体pUC19中，已使用T4-DNA聚合酶将该载体末端平端化。这产生了质粒pUC19-B33。使用EcoR I和Sma I从该质粒中取出B33启动子并连接至适合的限制性载体pBinAR中。这产生了植物表达载体pBinB33。
为了便于进一步的克隆步骤，扩展了MCS(多克隆位点)。为此，合成了两条互补的寡核酸，在95℃加热5分钟，缓慢冷却至室温以获得良好的退火并将其克隆至pBinB33的Sal l和Kpnl限制位点中。用于此目的的寡核酸显示于SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14中。所获质粒命名为IR47-71。
2.制备植物表达载体pBinARHyg
使用限制性内切核酸酶EcoR I和Hind III从pA7中取出包含35S启动子、Ocs终止子和整个多克隆位点的片段并克隆至载体pBIBHyg(Becker，1990，Nucleic Acids Res.18，203)中，已使用相同的限制性内切核酸酶切割该载体。所获质粒命名为pBinARHyg。
3.制备克隆载体IC 317-204
使用限制性内切核酸酶Xho I和Hind III，从质粒IR 47-71中分离包含ocs终止子的核酸片段并将其克隆至载体pBlueScript KS(来自Stratagene，产品号212207)中，已使用相同的限制性内切核酸酶切割该载体。所获质粒命名为IC 306-204。
使用限制性内切核酸酶Bam HI和Eco RI从质粒IR 47-71中分离包含B33启动子的核酸片段并将其克隆至载体pBlueScript KS(来自Stratagene，产品号212207)中，已使用相同的限制性内切核酸酶切割该载体。所获质粒命名为IC 314-204。
使用限制性内切核酸酶Bam HI从IC 306-204中分离OCS终止子并将其克隆至质粒IC 314-204中，已使用相同的限制性内切核酸酶切割该质粒。所获质粒命名为IC 317-204。
4.合成核酸分子
a)合成编码来自小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的核酸分子
通过Medigenomix GmbH(Munich，德国)合成编码小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的核酸序列并克隆至来自Invitrogen的载体pCR2.1(产品号K2000-01)中。所获质粒命名为IC 323 215。编码来自小球藻病毒1的HAS蛋白质的合成核酸序列，其显示于SEQ ID NO 3中。最初分离自小球藻病毒1的对应核酸序列显示于SEQ ID NO 1中。
b)合成包含YLCV启动子和MCS、nos终止子和ocs终止子的核酸序列
通过Entelechon GmbH合成包含YLCV启动子(Stavolone等，PlantMolecular Biology 53：703-713，2003)和包含限制位点Sac I和Sma I的MCS(“多克隆位点”)、nos终止子和ocs终止子的核酸序列并克隆至来自Invitrogen的载体pCR4Topo(产品号K4510-20)中。所获质粒命名为IC389-337。合成核酸序列显示于SEQ ID NO 12中。
5.分离核酸分子
a)分离并克隆具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的编码核酸序列
通过PCR从酿酒酵母中分离编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的核酸序列(gna1)并克隆至来自Invitrogen的载体pCR 2.1(产品号K4510-20)中。PCR反应条件如下：
1.步骤：5分钟94℃，
2.步骤：45秒，94℃，
3.步骤：45秒，59℃，
4.步骤：45秒，72℃，
5.步骤：10分钟，72℃
6.步骤：4℃
将步骤2至步骤4重复35次，并该操作随后继续进行步骤5。
50μl反应批量(reaction batch)包含缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 9.0、50mM KCl和3mM MgSO4)、每种情况下500nM的扩增引物(显示于SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16中)、10μl Q溶液(包含于Qiagen，产品号206143中)、每种情况下0.2mM脱氧核糖核酸、0.5μl Taq DNA聚合酶(Invitrogen，产品号：11304-011)和作为模板的250ng酵母基因组DNA。使用来自Eppendorf的Mastercycler进行PCR(Prod.NR.5331 000.010)。
从酿酒酵母中分离的编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的核酸序列显示于SEQ ID NO 8中。
在将所获片段克隆至载体pCR 2.1中并测序确认后，使用限制性内切核酸酶Kpn I和Xba I分离正在讨论的来自酿酒酵母的编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的核酸序列并克隆至载体pA7中，已使用相同的限制性内切核酸酶切割该载体。所获质粒命名为IC 298-204。
b)分离并克隆编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸序列
通过PCR从酿酒酵母中分离编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸序列(qri)并克隆至来自Invitrogen的载体pCR 2.1(产品号K2000-01)中。PCR反应条件如下：
1.步骤：5分钟94℃，
2.步骤：45秒，94℃，
3.步骤：45秒，59℃，
4.步骤：45秒，72℃，
5.步骤：30分钟，72℃
6.步骤：4℃
将步骤2至步骤4重复35次，并该操作随后继续进行步骤5。
50μl反应批量包含缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 9.0、50mM KCl和3mM MgSO4)、每种情况下500nM的扩增引物(显示于SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18中)、10μl Q溶液(包含于Qiagen，产品号：206143中)、每种情况下0.2mM脱氧核糖核酸、0.5μl Taq DNA聚合酶(Invitrogen，产品号：11304-011)和作为模板的250ng酵母基因组DNA(Invitrogen产品号40802)。使用来自Eppendorf的Mastercycler(产品号5331 000.010)进行PCR。
从酿酒酵母中分离的编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸序列显示于SEQ ID NO 10中。
在将所获片段克隆至载体pCR 2.1中并测序确认后，使用限制性内切核酸酶Kpn I和Xba I分离来自酿酒酵母的所述编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸序列并克隆至载体pA7中，已使用相同的限制性内切核酸酶切割该载体。所获质粒命名为IC 303-204。
c)分离并克隆编码具有GlcNAc-P变位酶活性的蛋白质的核酸序列
通过PCR从酿酒酵母中分离编码具有乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶活性的蛋白质的核酸序列(pcm I，EC 5.4.2.3)并克隆至来自Invitrogen的载体pCR 2.1(产品号K2000-01)中。PCR反应条件如下：
1.步骤：5分钟94℃，
2.步骤：45秒，94℃，
3.步骤：45秒，59℃，
4.步骤：45秒，72℃，
5.步骤：30分钟，72℃
6.步骤：4℃
将步骤2至步骤4重复35次，并该操作随后继续进行步骤5。
50μl反应批量包含缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 9.0、50mM KCl和3mM MgSO4)、每种情况下500nM的扩增引物(显示于SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28中)、10μl Q溶液(包含于Qiagen，产品号：206143中)、每种情况下0.2mM脱氧核糖核酸、0.5μl Taq DNA聚合酶(Invitrogen，产品号：11304-011)和作为模板的250ng酵母基因组DNA(Invitrogen产品号40802)。使用来自Eppendorf的Mastercycler(产品号5331 000.010)进行PCR。
在将所获片段克隆至载体pCR 2.1中并测序确认后，使用限制性内切核酸酶Kpn I和Xba I分离来自酿酒酵母的所述编码具有乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶活性的蛋白质的核酸序列并克隆至载体pA7中，已使用相同的限制性内切核酸酶切割该载体。所获质粒命名为IC 304-204。
d)从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离并克隆编码具有GlcN-1-P变位酶活性的蛋白质的核酸序列
通过PCR分离来自大肠杆菌的编码具有葡糖胺1-磷酸变位酶(GlcN-1-P变位酶)活性的蛋白质的核酸序列(glmm)并克隆至来自Invitrogen的载体pCR 2.1(产品号K2000-01)中。PCR反应条件如下：
1.步骤：5分钟94℃，
2.步骤：45秒，94℃，
3.步骤：45秒，59℃，
4.步骤：45秒，72℃，
5.步骤：30分钟，72℃
6.步骤：4℃
将步骤2至步骤4重复35次，并该操作随后继续进行步骤5。
50μl反应批量包含缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 9.0、50mM KCl和3mM MgSO4)、每种情况下500nM的扩增引物(显示于SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20中)、10μl Q溶液(包含于Qiagen，产品号：206143中)、每种情况下0.2mM脱氧核糖核酸、0.5μl Taq DNA聚合酶(Invitrogen，产品号：11304-011)和作为模板的250ng大肠杆菌基因组DNA。使用来自Eppendorf的Mastercycler(产品号5331 000.010)进行PCR。
从大肠杆菌中分离的编码具有葡糖胺1-磷酸变位酶活性的蛋白质的核酸序列显示于SEQ ID NO 21中。
在将所获片段克隆至载体pCR 2.1中并测序确认后，使用限制性内切核酸酶Kpn I和Xba I分离来自大肠杆菌的所述编码具有GlcN-1-P变位酶活性的蛋白质的核酸序列并克隆至载体pA7中，已使用相同的限制性内切核酸酶切割该载体。所获质粒命名为IC 300-204。
e)从大肠杆菌中分离并克隆编码具有GlcN-1-P乙酰转移酶和UDP-GlcNAc-1-P焦磷酸化酶双功能活性的蛋白质的核酸序列
通过PCR从大肠杆菌中分离编码具有葡糖胺1-磷酸乙酰转移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的双功能蛋白质的核酸序列(qlmu)并克隆至来自Invitrogen的载体pCR 2.1(产品号K2000-01)中。PCR反应条件如下：
1.步骤：5分钟94℃，
2.步骤：45秒，94℃，
3.步骤：45秒，59℃，
4.步骤：45秒，72℃，
5.步骤：30分钟，72℃
6.步骤：4℃
将步骤2至步骤4重复35次，并该操作随后继续进行步骤5。
50μl反应批量包含缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 9.0、50mM KCl和3mM MgSO4)、每种情况下500nM的扩增引物(显示于SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24中)、10μl Q溶液(包含于Qiagen，产品号：206143中)、每种情况下0.2mM脱氧核糖核酸、0.5μl Taq DNA聚合酶(Invitrogen，产品号：11304-011)和作为模板的250ng大肠杆菌基因组DNA。使用来自Eppendorf的Mastercycler(产品号5331 000.010)进行PCR。
从大肠杆菌中分离的编码具有葡糖胺1-磷酸乙酰转移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶双功能活性的蛋白质的核酸序列显示于SEQ IDNO 25中。
在将所获片段克隆至载体pCR 2.1中并测序确认后，使用限制性内切核酸酶Kpn I和Xba I从大肠杆菌中分离所述编码具有GlcN-1-P乙酰转移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的双功能蛋白质的核酸序列(glmu)并克隆至载体pA7中，已使用相同的限制性内切核酸酶切割该载体。所获质粒命名为IC 299-204。
6.制备包含来自小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶编码核酸序列的植物表达载体
通过用BamH I和Xho I限制酶切消化从质粒IC 323-215中分离包含乙酰透明质酸合酶编码序列的核酸分子并克隆至质粒IR 47-71的BamH I和Xho I限制位点中。所获植物表达载体命名为IC 341-222。
7.制备包含来自酿酒酵母的具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质的编码核酸序列的植物表达载体IC 351-222
起始质粒为上述植物表达载体pUBI bar(WO 9744472)，其中将来自酵母的gna基因的编码序列克隆至所述植物表达载体pUBI bar的EcoR I和Sda I限制位点。通过EcoR I和Sda I限制酶切消化从质粒IC 298-204中分离来自酵母的gna基因的编码序列。所获载体命名为IC 351-222。
8.制备包含具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的编码核酸序列的植物表达载体IC 392-337
起始质粒为上文中进一步描述的质粒IC 351-222，其中将使用限制性内切核酸酶Eco RI从质粒IC 389-337中分离的YLCV启动子和NOS终止子和OCS终止子的盒克隆至其Eco RI限制位点中。所获载体命名为IC390-337。
通过Sac I和Eco RV限制酶切消化从上述质粒IC 303-204中分离qri基因的编码序列并连接至载体IC 390-337的Sac I和Sma I限制位点中。所获载体命名为IC 391-337。
为了去除多余的OCS终止子，用Aat II消化载体IC 391-337并随后重连接。所获植物表达载体命名为IC 392-337。
9.制备包含来自大肠杆菌的具有GlcN-1-P变位酶活性的蛋白质的编码核酸序列，以及具有GlcN-1-P乙酰转移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶双功能活性的双功能蛋白质的植物表达载体IC 360-237
用于引入来自大肠杆菌的编码具有GlcN-1-P乙酰转移酶和UDP-GlcNAc-1-P焦磷酸化酶双功能活性的蛋白质的核酸序列的起始质粒为上文中进一步描述的质粒IC 299-204，经Eco RI限制酶切消化分离所述质粒的编码序列并克隆至pMCS5载体(MoBiTec GmbH，Prod.No.：pMCS5)的Eco RI限制位点中。所获载体命名为IC 307-204。在下一步中，用限制性内切核酸酶Pme I和Sma I消化载体IC 307-204并重连接。所获载体命名为IC 311-204。随后通过用Bam HI和KpnI限制酶切消化从质粒IC 311-204中分离编码具有GLMU活性的蛋白质的核酸序列并连接至载体IC 312-204的Bam HI和KpnI限制位点中。所获载体命名为IC315-204。通过同时连接包括经Eco RI和Sal I限制酶切消化从质粒pA7中分离的35S启动子片段、经Hind III和Sal I限制酶切消化从IC 309-204中分离的ocs片段和已通过Eco RI限制酶切消化切开的载体IC310-204的三条片段来制备载体IC 312-204。质粒IC310-204为pUC 18载体，其部分MCS已通过Hind III和Ecl 135II限制酶切消化和随后的重连接被去除。通过使用Hind III和Sal I从pA7中分离ocs片段并将其克隆至用Hind III和Sal I消化的pBS KS载体来制备IC 309-204。
通过Eco RI限制酶切消化从质粒IC 315-204中分离35S启动子、来自大肠杆菌的编码具有葡萄糖胺1-磷酸乙酰转移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶双功能活性的蛋白质的核酸序列(qlmu)和ocs终止子，并将其克隆至Ubi Bar载体(WO 9744472)的Eco RI限制位点中。所获载体命名为IC 359-237。
用于引入编码具有GlcN-1-P变位酶活性的蛋白质的核酸序列的起始质粒为上文中进一步描述的质粒IC 299-204，经Sda I和Sma I限制酶切消化分离其编码序列并连接至Ubi bar载体的Sda I和Hpa I限制位点中。所获载体命名为IC 355-222。
通过Spe I和Dra I限制酶切消化从质粒IC 355-222中分离glmm基因的编码序列并将其克隆至IC 359-237质粒的Spe I和Pme I限制位点中。所获载体命名为IC 360-237。
10.制备包含来自酿酒酵母的具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质、具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质以及具有GlcNAc-P变位酶活性的蛋白质的编码核酸序列的植物表达载体IC 393-337
用于引入来自酿酒酵母的编码GlcNAc-P变位酶的核酸序列的起始质粒为上文中进一步描述的质粒IC 304-204，经Eco RI限制酶切消化分离其编码序列并克隆至pMCS5载体(MoBiTec GmbH，Prod.No.：pMCS5)的Eco RI限制位点中。所获载体命名为IC 313-204。在下一步中，经Pme I和Pac I限制酶切消化从载体IC 313-204中分离来自酿酒酵母的编码GlcNAc-P变位酶的核酸序列并克隆至已用Pme I和Pac I消化的载体IC393-337中。所获载体命名为IC 394-337。
用于制备质粒IC 393-337的起始载体为上文进一步描述的质粒IC391-337，其已包含具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的核酸序列。为此，经Pac I和AvrII限制酶切消化分离上文中进一步描述的B33启动子并克隆至已用Pac I和Avr II消化的载体IC 391-337中。所获植物表达载体命名为IC 393-337。
11.马铃薯植株的转化
根据一般方法第一项中描述的方法用植物表达载体IC 341-222转化马铃薯植株，所述载体包含在来自马铃薯的patatin基因B33的启动子调控下的来自小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的编码核酸序列(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)。
转化有质粒IC 341-222的所获马铃薯植株命名为365ES X，其中X表示从转化中独立获得的植株。
将转化后所获的栽培品种命名为365ES X，并分析由正在讨论的植株合成的乙酰透明质酸的量(也见于WO 2006032538)。选择栽培品种365ES13和365ES 74用于下文中描述的转化。
根据一般方法第一项中描述的方法用植物表达载体IC 392-337或IC360-237或IC 394-337转化栽培品种365ES 13和365ES 74的马铃薯植株。
将用质粒IC 392-337转化的栽培品种365ES 13所获的转基因马铃薯植株命名为437ES X，其中X表示从转化中独立获得的植株。
将用质粒IC 392-337转化的栽培品种365ES 74所获的转基因马铃薯植株命名为438ES X，其中X表示从转化中独立获得的植株。
将用质粒IC 360-237转化的栽培品种365ES 13所获的转基因马铃薯植株命名为397ES X，其中X表示从转化中独立获得的植株。
将用质粒IC 360-237转化的栽培品种365ES 74所获的转基因马铃薯植株命名为398ES X，其中X表示从转化中独立获得的植株。
将用质粒IC 393-337转化的栽培品种365ES 13所获的转基因马铃薯植株命名为444ES X，其中X表示从转化中独立获得的植株。
将用质粒IC 393-337转化的栽培品种365ES 74所获的转基因马铃薯植株命名为445ES X，其中X表示从转化中独立获得的植株。
12.分析包含编码乙酰透明质酸合酶和编码具有GlcNAc-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子的马铃薯植株
在温室中，将栽培品种365ES 13、365ES 74、437ES X、438ES X、397ES X、398ES X、444ES X和445ES X的单独植株种植于6cm盆中的土壤里。根据一般方法第3项中描述的方法从7至9周龄植株中收获植株的整个地上部分并处理。使用一般方法第4项中描述的方法并在标准曲线的帮助下通过测定植物提取物的等分试样中所包含的乙酰透明质酸来测定正在讨论的植物提取物中乙酰透明质酸的量。对于测定乙酰透明质酸的量，按1∶10稀释来使用离心后所获的上清。对于选择后的植株，获得以下结果：
  植株名   HA[μg/g fw]
  365ES 74-67   120.9
  365ES 74-68   125.1
  365ES 74-71   129.2
  365ES 74-72   118.2
  365ES 74-79   129.0
  365ES 74-80   140.2
  365ES 74-81   92.7
  365ES 74-82   100.9
  wtDesiree 1   0.2
  wtDesiree 2   -0.2
  wtDesiree 3   2.1
  植株名   HA[μg/g fw]
  365ES 13-221   90.6
  365ES 13-222   57.9
  365ES 13-223   59.0
  365ES 13-224   95.3
  365ES 13-225   84.0
  365ES 13-226   91.7
  365ES 13-227   69.1
  365ES 13-228   76.2
  265ES 13-231   84.3
  365ES 13-232   75.5
表1：正在讨论的植物由仅包含编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子的栽培品种365ES 13和365ES 74的独立选择的转基因植株在整个地上部分所产生的乙酰透明质酸的量(以每克鲜重中的乙酰透明质酸的μg量计)。第一列显示了从中收集材料的植株的名称(“wt Desiree”指栽培品种Désirée未转化的野生型植株)。第2列显示了基于所用的鲜重的乙酰透明质酸的量。
  植株名   HA[μg/g fw]
  438ES 1   183.0
  438ES 5   192.5
  438ES 10   189.5
  438ES 11   168.9
  438ES 13   195.5
  438ES 14   184.3
  植株名   HA[μg/g fw]
  438ES 16   168.9
  438ES 23   231.2
  植株名   HA[μg/g fw]
  437ES 2   105.6
  437ES 3   97.6
  437ES 6   129.4
  437ES 12   103.2
  437ES 13   144.2
  437ES 14   163.7
  437ES 15   128.2
  437ES 16   100.3
  植株名 HA[μg/g fw]
  438ES 25   169.2
  438ES 32   178.6
  438ES 33   173.4
  438ES 41   178.7
  438ES 57   239.4
  438ES 62   172.5
  438ES 64   199.5
  438ES 80   235.4
  438ES 84   189.2
  438ES 85   168.1
  植株名   HA[μg/g fw]
  438ES 88   167.4
  438ES 97   164.4
  438ES 102   160.4
  438ES 108   209.8
  438ES 112   185.9
  植株名   HA[μg/g fw]
  437ES 17   186.3
  437ES 21   100.7
  437ES 23   114.5
  437ES 26   105.1
  437ES 31   102.0
  437ES 34   178.9
  437ES 35   104.4
  437ES 39   98.2
  437ES 40   116.8
  437ES 48   125.1
  437ES 66   146.8
  437ES 69   106.8
  437ES 70   115.4
  植株名   HA[μg/g fw]
  437ES 75   100.3
  437ES 76   125.5
  437ES 79   102.0
  437ES 80   125.7
  437ES 82   135.7
  437ES 95   100.3
  437ES 105   108.8
表2：正在讨论的植物由栽培品种437ES或438ES的独立选择的转基因植株在整个地上部分所产生的乙酰透明质酸的量(以每克鲜重中的乙酰透明质酸的μg量计)。第一列显示了从中收集材料的植株的名称。第2列显示了基于所用的鲜重的乙酰透明质酸的量。
显示的结果说明同时含有编码乙酰透明质酸合酶和编码具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和编码具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子的植株比仅包含编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子的植株合成明显更大量的乙酰透明质酸。
  植株名   HA[μg/g fw]
  397ES 1   4.51
  397ES 2   22.54
  397ES 3   16.27
  397ES 5   10.13
  397ES 6   13.60
  397ES 7   33.62
  397ES 8   19.87
  397ES 9   70.37
  植株名   HA[μg/g fw]
  398ES 1   53.04
  398ES 2   43.64
  398ES 3   130.01
  398ES 4   89.26
  398ES 5   74.35
  398ES 6   55.39
  398ES 7   99.61
  398ES 8   90.82
  植株名   HA[μg/g fw]
  397ES 10   51.91
  397ES 11   78.71
  397ES 12   9.76
  397ES 13   6.62
  397ES 14   32.74
  397ES 16   21.34
  397ES 17   81.90
  397ES 18   33.16
  397ES 19   32.18
  397ES 20   26.67
  397ES 21   63.21
  植株名   HA[μg/g fw]
  397ES 22   2.66
  397ES 24   1.41
  397ES 25   37.27
  397ES 26   20.34
  397ES 27   32.89
  397ES 28   9.89
  397ES 29   8.31
  397ES 30   85.77
  397ES 31   47.44
  397ES 32   53.47
  397ES 33   5.25
  397ES 34   17.10
  397ES 35   16.80
  397ES 36   17.53
  397ES 37   25.90
  397ES 38   7.68
  397ES 39   0.49
  397ES 40   0.85
  397ES 41   14.65
  397ES 42   35.36
  植株名   HA[μg/g fw]
  397ES 43   49.96
  397ES 44   28.78
  397ES 45   18.95
  397ES 46   7.93
  397ES 47   28.28
  397ES 48   13.94
  397ES 49   60.16
  397ES 50   29.77
  植株名   HA[μg/g fw]
  398ES 9   41.80
  398ES 10   79.66
  398ES 11   9.57
  398ES 12   41.24
  398ES 13   89.05
  398ES 14   77.19
  398ES 15   96.96
  398ES 16   84.24
  398ES 17   124.63
  398ES 18   76.19
  植株名   HA[μg/g fw]
  398ES 19   71.45
  398ES 20   46.17
  398ES 21   80.96
  398ES 22   31.25
  398ES 23   87.35
  398ES 24   62.31
  398ES 25   58.98
  398ES 26   71.14
  398ES 27   18.48
  398ES 28   105.85
  398ES 29   12.24
  398ES 30   95.82
  398ES 31   18.43
  398ES 32   109.41
  398ES 33   87.10
  398ES 34   88.30
  398ES 35   97.85
  398ES 36   58.51
  398ES 37   78.51
  398ES 38   99.67
  398ES 39   11.28
  398ES 40   29.12
  植株名   HA[μg/g fw]
  398ES 41   74.15
  398ES 42   22.75
  398ES 43   77.05
  398ES 44   101.34
  398ES 45   57.16
  398ES 46   54.19
  398ES 47   64.35
  398ES 48   60.04
  398ES 49   77.36
  398ES 50   50.84
表3：正在讨论的植物由栽培品种497ES或498ES的独立选择的转基因植株在整个地上部分所产生的乙酰透明质酸的量(以每克鲜重中的乙酰透明质酸的μg量计)。第一列显示了从中收集材料的植株的名称。第2列显示了基于所用的鲜重的乙酰透明质酸的量。
显示的结果说明同时含有编码乙酰透明质酸合酶和编码具有GlcN-P变位酶活性的蛋白质和具有GlcN-1-P乙酰转移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶双功能活性的蛋白质的外来核酸分子的植株比仅包含编码乙酰透明质酸合酶的外来核酸分子的植株不合成明显更大量的乙酰透明质酸。
  植株名   HA[μg/g fw]   植株名 HA[μg/g fw]
  444ES 6   81.06   445ES 1   102.53
  444ES 12   95.89   445ES 6   99.65
  444ES 14   90.76   445ES 7   152.66
  444ES 17   83.20   445ES 8   82.24
  444ES 19   69.18   445ES 9   119.74
  444ES 23   59.45   445ES 12   82.68
  植株名   HA[μg/g fw]   植株名 HA[μg/g fw]
  444ES 27   58.93   445ES 16   102.24
  444ES 35   58.45   445ES 18   86.47
  444ES 37   67.34   445ES 19   103.37
  444ES 41   63.27   445ES 20   96.06
  444ES 43   60.82   445ES 23   116.64
  445ES 24   95.13
  445ES 34   87.24
  445ES 40   81.74
  445ES 42   98.72
  445ES 47   84.41
  445ES 60   86.71
  445ES 135   94.13
表4：正在讨论的植物由栽培品种444ES或445ES的独立选择的转基因植株在整个地上部分所产生的乙酰透明质酸的量(以每克鲜重中的乙酰透明质酸的μg量计)。第一列显示了从中收集材料的植株的名称。第2列显示了基于所用的鲜重的乙酰透明质酸的量。
显示的结果说明同时含有编码乙酰透明质酸合酶和编码具有GlcN-P变位酶活性的蛋白质和具有GlcN-6-P乙酰转移酶的蛋白质和具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子的植株比仅包含编码乙酰透明质酸合酶和具有GlcN-6-P乙酰转移酶活性的蛋白质和具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子的植株不合成明显更大量的乙酰透明质酸。
序列表
 
<110>拜尔作物科学股份公司(Bayer CropScience AG)
 
<120>合成增加量的葡糖胺聚糖的植物
 
<130>BCS 07-5007 PCT    
 
<150>EP07116174.9
<151>2007-09-12
 
<150>US60/933,575
<151>2007-09-13
 
<160>30
<170>PatentIn版本3.3
 
<210>1
<211>1707
<212>DNA
<213>小球藻病毒1(Paramecium bursaria Chlorella Virus 1)
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1707)
 
<300>
<308>GenBank/U4258？
<309>1995-12-24
<313>(50903)..(52609)
 
<400>1
 
atg ggt aaa aat ata atc ata atg gtt tcg tgg tac acc atc ata act    48
Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr
1               5                   10                  15
tca aat cta atc gcg gtt gga gga gcc tct cta atc ttg gct ccg gca    96
Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala
            20                  25                  30
att act ggg tat gtt cta cat tgg aat att gct ctc tcg aca atc tgg    144
Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp
        35                  40                  45
gga gta tca gct tat ggt att ttc gtt ttt ggg ttt ttc ctt gca caa    192
Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln
    50                  55                  60
gtt tta ttt tca gaa ctg aac agg aaa cgt ctt cgc aag tgg att tct    240
Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser
65                  70                  75                  80
ctc aga cct aag ggt tgg aat gat gtt cgt ttg gct gtg atc att gct    288
Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala
                85                  90                  95
gga tat cgc gag gat cct tat atg ttc cag aag tgc ctc gag tct gta    336
Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val
            100                 105                 110
cgt gac tct gat tat ggc aac gtt gcc cgt ctg att tgt gtg att gac    384
Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp
        115                 120                 125
ggt gat gag gac gat gat atg agg atg gct gcc gtt tac aag gcg atc    432
Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile
    130                 135                 140
tac aat gat aat atc aag aag ccc gag ttt gtt ctg tgt gag tca gac    480
Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp
145                 150                 155                 160
gac aag gaa ggt gaa cgc atc gac tct gat ttc tct cgc gac att tgt    528
Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys
                165                 170                 175
gtc ctc cag cct cat cgt gga aaa cgg gag tgt ctt tat act ggg ttt    576
Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe
            180                 185                 190
caa ctt gca aag atg gac ccc agt gtc aat gct gtc gtt ctg att gac    624
Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp
        195                 200                 205
agc gat acc gtt ctc gag aag gat gct att ctg gaa gtt gta tac cca    672
Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro
    210                 215                 220
ctt gca tgc gat ccc gag atc caa gcc gtt gca ggt gag tgt aag att    720
Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile
225                 230                 235                 240
tgg aac aca gac act ctt ttg agt ctt ctc gtc gct tgg cgg tac tat    768
Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr
                245                 250                 255
tct gcg ttt tgt gtg gag agg agt gcc cag tct ttt ttc agg act gtt    816
Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val
            260                 265                 270
cag tgc gtt ggg ggg cca ctg ggt gcc tac aag att gat atc att aag    864
Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys
        275                 280                 285
gag att aag gac ccc tgg att tcc cag cgc ttt ctt ggt cag aag tgt    912
Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys
    290                 295                 300
act tac ggt gac gac cgc cgg cta acc aac gag atc ttg atg cgt ggt    960
Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly
305                 310                 315                 320
aaa aag gtt gtg ttc act cca ttt gct gtt ggt tgg tct gac agt ccg    1008
Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro
                325                 330                 335
acc aat gtg ttt cgg tac atc gtt cag cag acc cgc tgg agt aag tcg    1056
Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser
            340                 345                 350
tgg tgc cgc gaa att tgg tac acc ctc ttc gcc gcg tgg aag cac ggt    1104
Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly
        355                 360                 365
ttg tct gga att tgg ctg gcc ttt gaa tgt ttg tat caa att aca tac    1152
Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr
    370                 375                 380
ttc ttc ctc gtg att tac ctc ttt tct cgc cta gcc gtt gag gcc gac    1200
Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp
385                 390                 395                 400
cct cgc gcc cag aca gcc acg gtg att gtg agc acc acg gtt gca ttg    1248
Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu
                405                 410                 415
att aag tgt ggg tat ttt tca ttc cga gcc aag gat att cgg gcg ttt    1296
Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe
            420                 425                 430
tac ttt gtg ctt tat aca ttt gtt tac ttt ttc tgt atg att ccg gcc    1344
Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala
        435                 440                 445
agg att act gca atg atg acg ctt tgg gac att ggc tgg ggt act cgc    1392
Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg
    450                 455                 460
ggt gga aac gag aag cct tcc gtt ggc acc cgg gtc gct ctg tgg gca    1440
Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala
465                 470                 475                 480
aag caa tat ctc att gca tat atg tgg tgg gcc gcg gtt gtt ggc gct    1488
Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala
                485                 490                 495
gga gtt tac agc atc gtc cat aac tgg atg ttc gat tgg aat tct ctt    1536
Gly Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu
            500                 505                  510
tct tat cgt ttt gct ttg gtt ggt att tgt tct tac att gtt ttt att    1584
Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile
        515                 520                 525
gtt att gtg ctg gtg gtt tat ttc acc ggc aaa att acg act tgg aat    1632
Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn
    530                 535                 540
ttc acg aag ctt cag aag gag cta atc gag gat cgc gtt ctg tac gat    1680
Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp
545                 550                 555                 560
gca act acc aat gct cag tct gtg tga                                1707
Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val
                565
 
<210>2
<211>568
<212>PRT
<213>小球藻病毒1
 
<400>2
Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr
1               5                   10                  15
Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala
            20                  25                  30
Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp
        35                  40                  45
Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln
    50                  55                  60
Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg LeuArg Lys Trp Ile Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala
                85                  90                  95
Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val
            100                 105                 110
Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp
        115                 120                 125
Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile
    130                 135                 140
Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys
                165                 170                 175
Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe
            180                 185                 190
Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp
        195                 200                 205
Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro
    210                 215                 220
Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile
225                 230                 235                 240
Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr
                245                 250                 255
Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val
            260                 265                 270
Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys
        275                 280                 285
Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys
    290                 295                 300
Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly
305                 310                 315                 320
Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro
                325                 330                 335
Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser
            340                 345                 350
Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly
        355                 360                 365
Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr
    370                 375                 380
Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp
385                 390                 395                 400
Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu
                405                 410                 415
Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe
            420                 425                 430
Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala
        435                 440                 445
Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg
    450                 455                 460
Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala
465                 470                 475                 480
Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala
                485                 490                 495
Gly Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu
            500                 505                 510
Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile
        515                 520                 525
Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn
    530                 535                 540
Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp
545                 550                 555                 560
Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val
                565
 
<210>3
<211>1707
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>编码小球藻病毒1乙酰透明质酸合酶蛋白质的合成核苷酸序列
 
<400>3
atgggtaaga acattatcat tatggtgtcc tggtacacaa ttattacaag taatctcatc  60
gcagttggtg gtgcatctct tattctcgct ccagctatca ctggatatgt tcttcactgg  120
aacatcgccc tctcaactat ttggggagtt tccgcatatg gtatttttgt tttcgggttc  180
tttttggctc aggttctgtt ctcagagctc aatcgtaaga gactcaggaa gtggattagc  240
cttagaccaa aggggtggaa tgacgttcgt ctcgctgtca ttatcgctgg ctaccgtgaa  300
gatccttaca tgtttcaaaa gtgcttggaa tcagttaggg atagtgatta tggcaacgtc  360
gctagactga tctgtgtgat tgatggagat gaggacgacg atatgaggat ggcagctgtt  420
tataaggcta tctataatga taacattaag aagcctgaat ttgttctttg cgagtctgat  480
gacaaggaag gagaacggat tgattcagat ttctcacgtg atatctgcgt tctccaacct  540
catcgtggga agcgtgaatg tctttataca ggtttccaac tcgccaaaat ggacccatca  600
gtgaacgctg tggttcttat cgatagtgat actgtgctgg agaaagatgc tatcttggag  660
gttgtttacc ctcttgcctg tgatcctgaa attcaagctg tggctggaga gtgcaagatc  720
tggaacacag atactcttct ttctctgctt gtcgcatgga gatattactc cgcattctgt  780
gtggagagga gcgctcaatc ctttttccgt accgttcaat gcgttggtgg tcctttggga  840
gcttacaaaa ttgatatcat caaggagatt aaggacccat ggattagtca aaggtttctt  900
ggtcagaagt gcacttatgg cgatgatcgt agattgacta acgaaatcct tatgaggggc  960
aagaaagtcg tttttactcc atttgctgtc ggatggtctg attcacctac aaatgttttc  1020
cgttatattg tgcaacaaac acgttggagt aagagctggt gtagggagat ctggtacact  1080
ttgttcgctg cttggaagca cgggcttagc ggaatttggc ttgcttttga atgcctttac  1140
cagattacat actttttctt ggtgatctat ttgttttcac gtcttgccgt cgaggctgac  1200
cctagagcac agactgcaac tgtgattgtt tctactacag tcgcacttat taagtgtggc  1260
tatttcagtt ttagagcaaa agatattaga gccttctatt ttgttttgta cacatttgtt  1320
tatttctttt gcatgattcc agctcgtatt accgctatga tgaccttgtg ggacatcgga  1380
tggggaacta gaggtggtaa cgaaaagcct tctgtgggaa caagggtggc cctttgggca  1440
aaacaatatc tcatcgccta catgtggtgg gccgctgtcg ttggtgccgg agtgtactca  1500
atcgttcata actggatgtt tgactggaac tctttgagct atcgtttcgc tcttgtgggt  1560
atttgttctt acattgtttt catcgtgatt gtgctcgttg tgtatttcac tggtaaaatc  1620
acaacctgga atttcactaa acttcaaaag gaattgattg aagacagggt tctgtatgat  1680
gctactacca acgcccagtc agtttaa                                      1707
 
<210>4
<211>2895
<212>DNA
<213>多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2895)
 
<300>
<308>EMBL/AF195517
<309>2000-09-07
<313>(61)..(2955)
 
<400>4
 
atg aat aca tta tca caa gca ata aaa gca tat aac agc aat gac tat    48
Met Asn Thr Leu Ser Gln Ala Ile Lys Ala Tyr Asn Ser Asn Asp Tyr
1               5                   10                  15
gaa tta gca ctc aaa tta ttt gag aag tct gct gaa acc tac ggg cga    96
Glu Leu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Lys Ser Ala Glu Thr Tyr Gly Arg
            20                  25                  30
aaa atc gtt gaa ttc caa att atc aaa tgt aaa gaa aaa ctc tcg acc    144
Lys Ile Val Glu Phe Gln Ile Ile Lys Cys Lys Glu Lys Leu Ser Thr
        35                  40                  45
aat tct tat gta agt gaa gat aaa aaa aac agt gtt tgc gat agc tca    192
Asn Ser Tyr Val Ser Glu Asp Lys Lys Asn Ser Val Cys Asp Ser Ser
    50                  55                  60
tta gat atc gca aca cag ctc tta ctt tcc aac gta aaa aaa tta act    240
Leu Asp Ile Ala Thr Gln Leu Leu Leu Ser Asn Val Lys Lys Leu Thr
65                  70                  75                  80
cta tcc gaa tca gaa aaa aac agt tta aaa aat aaa tgg aaa tct atc    288
Leu Ser Glu Ser Glu Lys Asn Ser Leu Lys Asn Lys Trp Lys Ser Ile
                85                  90                  95
act ggg aaa aaa tcg gag aac gca gaa atc aga aag gtg gaa cta gta    336
Thr Gly Lys Lys Ser Glu Asn Ala Glu Ile Arg Lys Val Glu Leu Val
            100                 105                 110
ccc aaa gat ttt cct aaa gat ctt gtt ctt gct cca ttg cca gat cat    384
Pro Lys Asp Phe Pro Lys Asp Leu Val Leu Ala Pro Leu Pro Asp His
        115                 120                 125
gtt aat gat ttt aca tgg tac aaa aat cga aaa aaa agc tta ggt ata    432
Val Asn Asp Phe Thr Trp Tyr Lys Asn Arg Lys Lys Ser Leu Gly Ile
    130                 135                 140
aag cct gta aat aag aat atc ggt ctt tct att att att cct aca ttt    480
Lys Pro Val Asn Lys Asn Ile Gly Leu Ser Ile Ile Ile Pro Thr Phe
145                 150                 155                 160
aat cgt agc cgt att tta gat ata acg tta gcc tgt ttg gtc aat cag    528
Asn Arg Ser Arg Ile Leu Asp Ile Thr Leu Ala Cys Leu Val Asn Gln
                165                 170                 175
aaa aca aac tac cca ttt gaa gtc gtt gtt gca gat gat ggt agt aag    576
Lys Thr Asn Tyr Pro Phe Glu Val Val Val Ala Asp Asp Gly Ser Lys
            180                 185                 190
gaa aac tta ctt acc att gtg caa aaa tac gaa caa aaa ctt gac ata    624
Glu Asn Leu Leu Thr Ile Val Gln Lys Tyr Glu Gln Lys Leu Asp Ile
        195                 200                 205
aag tat gta aga caa aaa gat tat gga tat caa ttg tgt gca gtc aga    672
Lys Tyr Val Arg Gln Lys Asp Tyr Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Val Arg
    210                 215                 220
aac tta ggt tta cgt aca gca aag tat gat ttt gtc tcg att cta gac    720
Asn Leu Gly Leu Arg Thr Ala Lys Tyr Asp Phe Val Ser Ile Leu Asp
225                 230                 235                 240
tgc gat atg gca cca caa caa tta tgg gtt cat tct tat ctt aca gaa    768
Cys Asp Met Ala Pro Gln Gln Leu Trp Val His Ser Tyr Leu Thr Glu
                245                 250                 255
cta tta gaa gac aat gat att gtt tta att gga cct aga aaa tat gtg    816
Leu Leu Glu Asp Asn Asp Ile Val Leu Ile Gly Pro Arg Lys Tyr Val
            260                 265                 270
gat act cat aat att acc gca gaa caa ttc ctt aac gat cca tat tta    864
Asp Thr His Asn Ile Thr Ala Glu Gln Phe Leu Asn Asp Pro Tyr Leu
        275                 280                 285
ata gaa tca cta cct gaa acc gct aca aat aac aat cct tcg att aca    912
Ile Glu Ser Leu Pro Glu Thr Ala Thr Asn Asn Asn Pro Ser Ile Thr
    290                 295                 300
tca aaa gga aat ata tcg ttg gat tgg aga tta gaa cat ttc aaa aaa    960
Ser Lys Gly Asn Ile Ser Leu Asp Trp Arg Leu Glu His Phe Lys Lys
305                 310                 315                 320
acc gat aat cta cgt cta tgt gat tct ccg ttt cgt tat ttt agt tgc    1008
Thr Asp Asn Leu Arg Leu Cys Asp Ser Pro Phe Arg Tyr Phe Ser Cys
                325                 330                 335
ggt aat gtt gca ttt tct aaa gaa tgg cta aat aaa gta ggt tgg ttc    1056
Gly Asn Val Ala Phe Ser Lys Glu Trp Leu Asn Lys Val Gly Trp Phe
            340                 345                 350
gat gaa gaa ttt aat cat tgg ggg ggc gaa gat gta gaa ttt ggt tac    1104
Asp Glu Glu Phe Asn His Trp Gly Gly Glu Asp Val Glu Phe Gly Tyr
        355                 360                 365
aga tta ttt gcc aaa ggc tgt ttt ttc aga gta att gac ggc gga atg    1152
Arg Leu Phe Ala Lys Gly Cys Phe Phe Arg Val Ile Asp Gly Gly Met
    370                 375                 380
gca tac cat caa gaa cca cct ggt aaa gaa aat gaa aca gac cgc gaa    1200
Ala Tyr His Gln Glu Pro Pro Gly Lys Glu Asn Glu Thr Asp Arg Glu
385                 390                 395                 400
gct ggt aaa agt att acg ctt aaa att gtg aaa gaa aag gta cct tac    1248
Ala Gly Lys Ser Ile Thr Leu Lys Ile Val Lys Glu Lys Val Pro Tyr
                405                 410                 415
atc tat aga aag ctt tta cca ata gaa gat tca cat att cat aga ata    1296
Ile Tyr Arg Lys Leu Leu Pro Ile Glu Asp Ser His Ile His Arg Ile
            420                 425                 430
cct tta gtt tct att tat atc ccc gct tat aac tgt gca aat tat att    1344
Pro Leu Val Ser Ile Tyr Ile Pro Ala Tyr Asn Cys Ala Asn Tyr Ile
        435                 440                 445
caa aga tgt gta gat agt gct ctt aat caa act gtt gtc gat ctc gag    1392
Gln Arg Cys Val Asp Ser Ala Leu Asn Gln Thr Val Val Asp Leu Glu
    450                 455                 460
gtt tgt att tgt aac gat ggt tca aca gat aat acc tta gaa gtg atc    1440
Val Cys Ile Cys Asn Asp Gly Ser Thr Asp Asn Thr Leu Glu Val Ile
465                 470                 475                 480
aat aag ctt tat ggt aat aat cct agg gta cgc atc atg tct aaa cca    1488
Asn Lys Leu Tyr Gly Asn Asn Pro Arg Val Arg Ile Met Ser Lys Pro
                485                 490                 495
aat ggc gga ata gcc tca gca tca aat gca gcc gtt tct ttt gct aaa    1536
Asn Gly Gly Ile Ala Ser Ala Ser Asn Ala Ala Val Ser Phe Ala Lys
            500                 505                 510
ggt tat tac att ggg cag tta gat tca gat gat tat ctt gag cct gat    1584
Gly Tyr Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ser Asp Asp Tyr Leu Glu Pro Asp
        515                 520                 525
gca gtt gaa ctg tgt  tta aaa gaa ttt tta aaa gat aaa acg cta gct    1632
Ala Val Glu Leu Cys Leu Lys Glu Phe Leu Lys Asp Lys Thr Leu Ala
    530                 535                 540
tgt gtt tat acc act aat aga aac gtc aat ccg gat ggt agc tta atc    1680
Cys Val Tyr Thr Thr Asn Arg Asn Val Asn Pro Asp Gly Ser Leu Ile
545                 550                 555                 560
gct aat ggt tac aat tgg cca gaa ttt tca cga gaa aaa ctc aca acg    1728
Ala Asn Gly Tyr Asn Trp Pro Glu Phe Ser Arg Glu Lys Leu Thr Thr
                565                 570                 575
gct atg att gct cac cat ttt aga atg ttt acg att aga gct tgg cat    1776
Ala Met Ile Ala His His Phe Arg Met Phe Thr Ile Arg Ala Trp His
            580                 585                 590
tta acg gat gga ttt aac gaa aat att gaa aac gcc gtg gat tat gac    1824
Leu Thr Asp Gly Phe Asn Glu Asn Ile Glu Asn Ala Val Asp Tyr Asp
        595                 600                 605
atg ttc ctt aaa ctc agt gaa gtt gga aaa ttt aaa cat ctt aat aaa    1872
Met Phe Leu Lys Leu Ser Glu Val Gly Lys Phe Lys His Leu Asn Lys
    610                 615                 620
atc tgc tat aac cgc gta tta cat ggt gat aac aca tcc att aag aaa    1920
Ile Cys Tyr Asn Arg Val Leu His Gly Asp Asn Thr Ser Ile Lys Lys
625                 630                 635                 640
ctc ggc att caa aag aaa aac cat ttt gtt gta gtc aat cag tca tta    1968
Leu Gly Ile Gln Lys Lys Asn His Phe Val Val Val Asn Gln Ser Leu
                645                 650                 655
aat aga caa ggc atc aat tat tat aat tat gac aaa ttt gat gat tta    2016
Asn Arg Gln Gly Ile Asn Tyr Tyr Asn Tyr Asp Lys Phe Asp Asp Leu
            660                 665                 670
gat gaa agt aga aag tat atc ttc aat aaa acc gct gaa tat caa gaa    2064
Asp Glu Ser Arg Lys Tyr Ile Phe Asn Lys Thr Ala Glu Tyr Gln Glu
        675                 680                 685
gaa atg gat att tta aaa gat ctt aaa ctc att caa aat aaa gat gcc    2112
Glu Met Asp Ile Leu Lys Asp Leu Lys Leu Ile Gln Asn Lys Asp Ala
    690                 695                 700
aaa atc gca gtc agt att ttc tat ccc aat aca tta aac ggc tta gtg    2160
Lys Ile Ala Val Ser Ile Phe Tyr Pro Asn Thr Leu Asn Gly Leu Val
705                 710                 715                 720
aaa aaa cta aac aat att att gaa tat aat aaa aat ata ttc gtt att    2208
Lys Lys Leu Asn Asn Ile Ile Glu Tyr Asn Lys Asn Ile Phe Val Ile
                725                 730                 735
att cta cat gtt gat aag aat cat ctt aca cca gac atc aaa aaa gaa    2256
Ile Leu His Val Asp Lys Asn His Leu Thr Pro Asp Ile Lys Lys Glu
            740                 745                 750
ata ttg gct ttc tat cat aag cac caa gtg aat att tta cta aat aat    2304
Ile Leu Ala Phe Tyr His Lys His Gln Val Asn Ile Leu Leu Asn Asn
        755                 760                 765
gac atc tca tat tac acg agt aat aga cta ata aaa act gag gca cat    2352
Asp Ile Ser Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Leu Ile Lys Thr Glu Ala His
    770                 775                 780
tta agt aat att aat aaa tta agt cag tta aat cta aat tgt gaa tac    2400
Leu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Ser Gln Leu Asn Leu Asn Cys Glu Tyr
785                 790                 795                 800
atc att ttt gat aat cat gac agc cta ttc gtt aaa aat gac agc tat    2448
Ile Ile Phe Asp Asn His Asp Ser Leu Phe Val Lys Asn Asp Ser Tyr
                805                 810                 815
gct tat atg aaa aaa tat gat gtc ggc atg aat ttc tca gca tta aca    2496
Ala Tyr Met Lys Lys Tyr Asp Val Gly Met Asn Phe Ser Ala Leu Thr
            820                 825                 830
cat gat tgg atc gag aaa atc aat gcg cat cca cca ttt aaa aag ctg    2544
His Asp Trp Ile Glu Lys Ile Asn Ala His Pro Pro Phe Lys Lys Leu
        835                 840                 845
att aaa acc tat ttt aat gac aat gac tta aga agt atg aat gtg aaa    2592
Ile Lys Thr Tyr Phe Asn Asp Asn Asp Leu Arg Ser Met Asn Val Lys
    850                 855                 860
ggg gca tca caa ggt atg ttt atg aag tat gcg cta ccg cat gag ctt    2640
Gly Ala Ser Gln Gly Met Phe Met Lys Tyr Ala Leu Pro His Glu Leu
865                 870                 875                 880
ctg acg att att aaa gaa gtc atc aca tcc tgc caa tca att gat agt    2688
Leu Thr Ile Ile Lys Glu Val Ile Thr Ser Cys Gln Ser Ile Asp Ser
                885                 890                 895
gtg cca gaa tat aac act gag gat att tgg ttc caa ttt gca ctt tta    2736
Val Pro Glu Tyr Asn Thr Glu Asp Ile Trp Phe Gln Phe Ala Leu Leu
            900                 905                 910
atc tta gaa aag aaa acc ggc cat gta ttt aat aaa aca tcg acc ctg    2784
Ile Leu Glu Lys Lys Thr Gly His Val Phe Asn Lys Thr Ser Thr Leu
        915                 920                 925
act tat atg cct tgg gaa cga aaa tta caa tgg aca aat gaa caa att    2832
Thr Tyr Met Pro Trp Glu Arg Lys Leu Gln Trp Thr Asn Glu Gln Ile
    930                 935                 940
caa agt gca aaa aaa ggc gaa aat atc ccc gtt aac aag ttc att att    2880
Gln Ser Ala Lys Lys Gly Glu Asn Ile Pro Val Asn Lys Phe Ile Ile
945                 950                 955                 960
aat agt ata acg cta                                                2895
Asn Ser Ile Thr Leu
                965
 
<210>5
<211>965
<212>PRT
<213>多杀巴斯德氏菌
<400>5
Met Asn Thr Leu Ser Gln Ala Ile Lys Ala Tyr Asn Ser Asn Asp Tyr
1               5                   10                  15
Glu Leu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Lys Ser Ala Glu Thr Tyr Gly Arg
            20                  25                  30
Lys Ile Val Glu Phe Gln Ile Ile Lys Cys Lys Glu Lys Leu Ser Thr
        35                  40                  45
Asn Ser Tyr Val Ser Glu Asp Lys Lys Asn Ser Val Cys Asp Ser Ser
    50                  55                  60
Leu Asp Ile Ala Thr Gln Leu Leu Leu Ser Asn Val Lys Lys Leu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ser Glu Lys Asn Ser Leu Lys Asn Lys Trp Lys Ser Ile
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Lys Ser Glu Asn Ala Glu Ile Arg Lys Val Glu Leu Val
            100                 105                 110
Pro Lys Asp Phe Pro Lys Asp Leu Val Leu Ala Pro Leu Pro Asp His
        115                 120                 125
Val Asn Asp Phe Thr Trp Tyr Lys Asn Arg Lys Lys Ser Leu Gly Ile
    130                 135                 140
Lys Pro Val Asn Lys Asn Ile Gly Leu Ser Ile Ile Ile Pro Thr Phe
145                 150                 155                 160
Asn Arg Ser Arg Ile Leu Asp Ile Thr Leu Ala Cys Leu Val Asn Gln
                165                 170                 175
Lys Thr Asn Tyr Pro Phe Glu Val Val Val Ala Asp Asp Gly Ser Lys
            180                 185                 190
Glu Asn Leu Leu Thr Ile Val Gln Lys Tyr Glu Gln Lys Leu Asp Ile
        195                 200                 205
Lys Tyr Val Arg Gln Lys Asp Tyr Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Val Arg
    210                 215                 220
Asn Leu Gly Leu Arg Thr Ala Lys Tyr Asp Phe Val Ser Ile Leu Asp
225                 230                 235                 240
Cys Asp Met Ala Pro Gln Gln Leu Trp Val His Ser Tyr Leu Thr Glu
                245                 250                 255
Leu Leu Glu Asp Asn Asp Ile Val Leu Ile Gly Pro Arg Lys Tyr Val
            260                 265                 270
Asp Thr His Asn Ile Thr Ala Glu Gln Phe Leu Asn Asp Pro Tyr Leu
        275                 280                 285
Ile Glu Ser Leu Pro Glu Thr Ala Thr Asn Asn Asn Pro Ser Ile Thr
    290                 295                 300
Ser Lys Gly Asn Ile Ser Leu Asp Trp Arg Leu Glu His Phe Lys Lys
305                 310                 315                 320
Thr Asp Asn Leu Arg Leu Cys Asp Ser Pro Phe Arg Tyr Phe Ser Cys
                325                 330                 335
Gly Asn Val Ala Phe Ser Lys Glu Trp Leu Asn Lys Val Gly Trp Phe
            340                 345                 350
Asp Glu Glu Phe Asn His Trp Gly Gly Glu Asp Val Glu Phe Gly Tyr
        355                 360                 365
Arg Leu Phe Ala Lys Gly Cys Phe Phe Arg Val Ile Asp Gly Gly Met
    370                 375                 380
Ala Tyr His Gln Glu Pro Pro Gly Lys Glu Asn Glu Thr Asp Arg Glu
385                 390                 395                 400
Ala Gly Lys Ser Ile Thr Leu Lys Ile Val Lys Glu Lys Val Pro Tyr
                405                 410                 415
Ile Tyr Arg Lys Leu Leu Pro Ile Glu Asp Ser His Ile His Arg Ile
            420                 425                 430
Pro Leu Val Ser Ile Tyr Ile Pro Ala Tyr Asn Cys Ala Asn Tyr Ile
        435                 440                 445
Gln Arg Cys Val Asp Ser Ala Leu Asn Gln Thr Val Val Asp Leu Glu
    450                 455                 460
Val Cys Ile Cys Asn Asp Gly Ser Thr Asp Asn Thr Leu Glu Val Ile
465                 470                 475                 480
Asn Lys Leu Tyr Gly Asn Asn Pro Arg Val Arg Ile Met Ser Lys Pro
                485                 490                 495
Asn Gly Gly Ile Ala Ser Ala Ser Asn Ala Ala Val Ser Phe Ala Lys
            500                 505                 510
Gly Tyr Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ser Asp Asp Tyr Leu Glu Pro Asp
        515                 520                 525
Ala Val Glu Leu Cys Leu Lys Glu Phe Leu Lys Asp Lys Thr Leu Ala
    530                 535                 540
Cys Val Tyr Thr Thr Asn Arg Asn Val Asn Pro Asp Gly Ser Leu Ile
545                 550                 555                 560
Ala Asn Gly Tyr Asn Trp Pro Glu Phe Ser Arg Glu Lys Leu Thr Thr
                565                 570                 575
Ala Met Ile Ala His His Phe Arg Met Phe Thr Ile Arg Ala Trp His
            580                 585                 590
Leu Thr Asp Gly Phe Asn Glu Asn Ile Glu Asn Ala Val Asp Tyr Asp
        595                 600                 605
Met Phe Leu Lys Leu Ser Glu Val Gly Lys Phe Lys His Leu Asn Lys
    610                 615                 620
Ile Cys Tyr Asn Arg Val Leu His Gly Asp Asn Thr Ser Ile Lys Lys
625                 630                 635                 640
Leu Gly Ile Gln Lys Lys Asn His Phe Val Val Val Asn Gln Ser Leu
                645                 650                 655
Asn Arg Gln Gly Ile Asn Tyr Tyr Asn Tyr Asp Lys Phe Asp Asp Leu
            660                 665                 670
Asp Glu Ser Arg Lys Tyr Ile Phe Asn Lys Thr Ala Glu Tyr Gln Glu
        675                 680                 685
Glu Met Asp Ile Leu Lys Asp Leu Lys Leu Ile Gln Asn Lys Asp Ala
    690                 695                 700
Lys Ile Ala Val Ser Ile Phe Tyr Pro Asn Thr Leu Asn Gly Leu Val
705                 710                 715                 720
Lys Lys Leu Asn Asn Ile Ile Glu Tyr Asn Lys Asn Ile Phe Val Ile
                725                 730                 735
Ile Leu His Val Asp Lys Asn His Leu Thr Pro Asp Ile Lys Lys Glu
            740                 745                 750
Ile Leu Ala Phe Tyr His Lys His Gln Val Asn Ile Leu Leu Asn Asn
        755                 760                 765
Asp Ile Ser Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Leu Ile Lys Thr Glu Ala His
    770                 775                 780
Leu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Ser Gln Leu Asn Leu Asn Cys Glu Tyr
785                 790                 795                 800
Ile Ile Phe Asp Asn His Asp Ser Leu Phe Val Lys Asn Asp Ser Tyr
                805                 810                 815
Ala Tyr Met Lys Lys Tyr Asp Val Gly Met Asn Phe Ser Ala Leu Thr
            820                 825                 830
His Asp Trp Ile Glu Lys Ile Asn Ala His Pro Pro Phe Lys Lys Leu
        835                 840                 845
Ile Lys Thr Tyr Phe Asn Asp Asn Asp Leu Arg Ser Met Asn Val Lys
    850                 855                 860
Gly Ala Ser Gln Gly Met Phe Met Lys Tyr Ala Leu Pro His Glu Leu
865                 870                 875                 880
Leu Thr Ile Ile Lys Glu Val Ile Thr Ser Cys Gln Ser Ile Asp Ser
                885                 890                 895
Val Pro Glu Tyr Asn Thr Glu Asp Ile Trp Phe Gln Phe Ala Leu Leu
            900                 905                 910
Ile Leu Glu Lys Lys Thr Gly His Val Phe Asn Lys Thr Ser Thr Leu
        915                 920                 925
Thr Tyr Met Pro Trp Glu Arg Lys Leu Gln Trp Thr Asn Glu Gln Ile
    930                 935                 940
Gln SerAla Lys Lys Gly Glu Asn Ile Pro Val Asn Lys Phe Ile Ile
945                 950                 955                 960
Asn Ser Ile Thr Leu
                965
 
<210>6
<211>1953
<212>DNA
<213>多杀巴斯德氏菌
 
<220>
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<222>(1)..(1953)
 
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<313>(1)..(1953)
 
<400>6
atg aag gga aaa aaa gag atg act caa att caa ata gct aaa aat cca    48
Met Lys Gly Lys Lys Glu Met Thr Gln Ile Gln Ile Ala Lys Asn Pro
1               5                   10                 15
ccc caa cat gaa aaa gaa aat gaa ctc aac acc ttt caa aat aaa att    96
Pro Gln His Glu Lys Glu Asn Glu Leu Asn Thr Phe Gln Asn Lys Ile
            20                  25                  30
gat agt cta aaa aca act tta aac aaa gac att att tct caa caa act    144
Asp Ser Leu Lys Thr Thr Leu Asn Lys Asp Ile Ile Ser Gln Gln Thr
        35                  40                  45
cta ttg gca aaa cag gac agt aaa cat ccg cta tcc gca tcc ctt gaa    192
Leu Leu Ala Lys Gln Asp Ser Lys His Pro Leu Ser Ala Ser Leu Glu
    50                  55                  60
aac gaa aat aaa ctt tta tta aaa caa ctc caa ttg gtt ctg caa gaa    240
Asn Glu Asn Lys Leu Leu Leu Lys Gln Leu Gln Leu Val Leu Gln Glu
65                  70                  75                  80
ttt aaa aaa ata tat acc tat aat caa gca tta gaa gca aag cta gaa    288
Phe Lys Lys Ile Tyr Thr Tyr Asn Gln Ala Leu Glu Ala Lys Leu Glu
                85                  90                  95
aaa gat aag caa aca aca tca ata aca gat tta tat aat gaa gtc gct    336
Lys Asp Lys Gln Thr Thr Ser Ile Thr Asp Leu Tyr Asn Glu Val Ala
            100                 105                 110
aaa agt gat tta ggg tta gtc aaa gaa acc aac agc gca aat cca tta    384
Lys Ser Asp Leu Gly Leu Val Lys Glu Thr Asn Ser Ala Asn Pro Leu
        115                 120                 125
gtc agt att atc atg aca tct cac aat aca gcg caa ttt atc gaa gct    432
Val Ser Ile Ile Met Thr Ser His Asn Thr Ala Gln Phe Ile Glu Ala
    130                 135                 140
tct att aat tca tta ttg tta caa aca tat aaa aac ata gaa att att    480
Ser Ile Asn Ser Leu Leu Leu Gln Thr Tyr Lys Asn Ile Glu Ile Ile
145                 150                 155                 160
att gta gat gat gat agc tcg gat aat aca ttt gaa att gcc tcg aga    528
Ile Val Asp Asp Asp Ser Ser Asp Asn Thr Phe Glu Ile Ala Ser Arg
                165                 170                 175
ata gcg aat aca aca agc aaa gtc aga gta ttt aga tta aat tca aac    576
Ile Ala Asn Thr Thr Ser Lys Val Arg Val Phe Arg Leu Asn Ser Asn
            180                 185                 190
cta gga act tac ttt gcg aaa aat aca ggc ata tta aaa tct aaa ggt    624
Leu Gly Thr Tyr Phe Ala Lys Asn Thr Gly Ile Leu Lys Ser Lys Gly
        195                 200                 205
gac att att ttc ttt caa gat agt gat gat gta tgt cat cat gaa aga    672
Asp Ile Ile Phe Phe Gln Asp Ser Asp Asp Val Cys His His Glu Arg
    210                 215                 220
ata gaa aga tgt gta aat ata tta tta gct aat aaa gaa act att gct    720
Ile Glu Arg Cys Val Asn Ile Leu Leu Ala Asn Lys Glu Thr Ile Ala
225                 230                 235                 240
gtt cgt tgt gca tac  tca aga cta gca cca gaa aca cag cat atc att    768
Val Arg Cys Ala Tyr Ser Arg Leu Ala Pro Glu Thr Gln His Ile Ile
                245                 250                 255
aaa gtc aat aat atg gat tat aga tta ggt ttt ata acc ttg ggt atg    816
Lys Val Asn Asn Met Asp Tyr Arg Leu Gly Phe Ile Thr Leu Gly Met
            260                 265                 270
cac aaa aaa gta ttt caa gaa att ggt ttc ttc aat tgt acg act aaa    864
His Lys Lys Val Phe Gln Glu Ile Gly Phe Phe Asn Cys Thr Thr Lys
        275                 280                 285
ggc tca gat gat gag ttt ttt cat aga att gcg aaa tat tat gga aaa    912
Gly Ser Asp Asp Glu Phe Phe His Arg Ile Ala Lys Tyr Tyr Gly Lys
    290                 295                 300
gaa aaa ata aaa aat tta ctc ttg ccg tta tac tac aac aca atg aga    960
Glu Lys Ile Lys Asn Leu Leu Leu Pro Leu Tyr Tyr Asn Thr Met Arg
305                 310                 315                 320
gaa aac tct tta ttt act gat atg gtt gaa tgg ata gac aat cat aac    1008
Glu Asn Ser Leu Phe Thr Asp Met Val Glu Trp Ile Asp Asn His Asn
                325                 330                 335
ata ata cag aaa atg tct gat acc aga caa cat tat gca acc ctg ttt    1056
Ile Ile Gln Lys Met Ser Asp Thr Arg Gln His Tyr Ala Thr Leu Phe
            340                 345                 350
caa gcg atg cat aac gaa act gcc tca cat gat ttc aaa aat ctt ttt    1104
Gln Ala Met His Asn Glu Thr Ala Ser His Asp Phe Lys Asn Leu Phe
        355                 360                 365
caa ttc cct cgt att tac gac gcc tta cca gta cca caa gaa atg agt    l152
Gln Phe Pro Arg Ile Tyr Asp Ala Leu Pro Val Pro Gln Glu Met Ser
    370                 375                 380
aag ttg tcc aat cct aag att cct gtt tat atc aat att tgt tct att    1200
Lys Leu Ser Asn Pro Lys Ile Pro Val Tyr Ile Asn Ile Cys Ser Ile
385                 390                 395                 400
ccc tca aga ata gcg caa tta caa cgt att atc ggc ata cta aaa aat    1248
Pro Ser Arg Ile Ala Gln Leu Gln Arg Ile Ile Gly Ile Leu Lys Asn
                405                 410                 415
caa tgt gat cat ttt cat att tat ctt gat ggc tat gta gaa atc cct    1296
Gln Cys Asp His Phe His Ile Tyr Leu Asp Gly Tyr Val Glu Ile Pro
            420                 425                 430
gac ttc ata aaa aat tta ggt aat aaa gca acc gtt gtt cat tgc aaa    1344
Asp Phe Ile Lys Asn Leu Gly Asn Lys Ala Thr Val Val His Cys Lys
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gat aaa gat aac tcc att aga gat aat ggc aaa ttc att tta ctg gaa    1392
Asp Lys Asp Asn Ser Ile Arg Asp Asn Gly Lys Phe Ile Leu Leu Glu
    450                 455                 460
gag ttg att gaa aaa aat caa gat gga tat  tat ata acc tgt gat gat    1440
Glu Leu Ile Glu Lys Asn Gln Asp Gly Tyr Tyr Ile Thr Cys Asp Asp
465                 470                 475                 480
gac att atc tat cca agc gat tac atc aat acg atg atc aag aag ctg    1488
Asp Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Tyr Ile Asn Thr Met Ile Lys Lys Leu
                485                 490                 495
aat gaa tac gat gat aaa gcg gtt att ggt tta cac ggc att ctc ttt    1536
Asn Glu Tyr Asp Asp Lys Ala Val Ile Gly Leu His Gly Ile Leu Phe
            500                 505                 510
cca agt aga atg acc aaa tat ttt tcg gcg gat aga ctg gta tat agc    1584
Pro Ser Arg Met Thr Lys Tyr Phe Ser Ala Asp Arg Leu Val Tyr Ser
        515                 520                 525
ttc tat aaa cct ctg gaa aaa gac aaa gcg gtc aat gta tta ggt aca    1632
Phe Tyr Lys Pro Leu Glu Lys Asp Lys Ala Val Asn Val Leu Gly Thr
    530                 535                 540
gga act gtt agc ttt aga gtc agt ctc ttt aat caa ttt tct ctt tct    1680
Gly Thr Val Ser Phe Arg Val Ser Leu Phe Asn Gln Phe Ser Leu Ser
545                 550                 555                 560
gac ttt acc cat tca ggc atg gct gat atc tat ttc tct ctc ttg tgt    1728
Asp Phe Thr His Ser Gly Met Ala Asp Ile Tyr Phe Ser Leu Leu Cys
                565                 570                 575
aag aaa aat aat att ctt cag att tgt att tca aga cca gca aac tgg    1776
Lys Lys Asn Asn Ile Leu Gln Ile Cys Ile Ser Arg Pro Ala Asn Trp
            580                 585                 590
cta acg gaa gat aat aga gac agc gaa aca ctc tat cat caa tat cga    1824
Leu Thr Glu Asp Asn Arg Asp Ser Glu Thr Leu Tyr His Gln Tyr Arg
        595                 600                 605
gac aat  gat gag caa caa act cag ctg atc atg gaa aac ggt cca tgg   1872
Asp Asn Asp Glu Gln Gln Thr Gln Leu Ile Met Glu Asn Gly Pro Trp
    610                 615                 620
gga tat tca agt att tat cca tta gtc aaa aat cat cct aaa ttt act    1920
Gly Tyr Ser Ser Ile Tyr Pro Leu Val Lys Asn His Pro Lys Phe Thr
625                 630                 635                 640
gac ctt atc ccc tgt tta cct ttt tat ttt tta                        1953
Asp Leu Ile Pro Cys Leu Pro Phe Tyr Phe Leu
                645                 650
<210>7
<211>651
<212>PRT
<213>多杀巴斯德氏菌
 
<400>7
Met Lys Gly Lys Lys Glu Met Thr Gln Ile Gln Ile Ala Lys Asn Pro
1               5                   10                  15
Pro Gln His Glu Lys Glu Asn Glu Leu Asn Thr Phe Gln Asn Lys Ile
            20                  25                  30
Asp Ser Leu Lys Thr Thr Leu Asn Lys Asp Ile Ile Ser Gln Gln Thr
        35                  40                  45
Leu Leu Ala Lys Gln Asp Ser Lys His Pro Leu Ser Ala Ser Leu Glu
    50                  55                  60
Asn Glu Asn Lys Leu Leu Leu Lys Gln Leu Gln Leu Val Leu Gln Glu
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Phe Lys Lys Ile Tyr Thr Tyr Asn Gln Ala Leu Glu Ala Lys Leu Glu
                85                  90                  95
Lys Asp Lys Gln Thr Thr Ser Ile Thr Asp Leu Tyr Asn Glu Val Ala
            100                 105                 110
Lys Ser Asp Leu Gly Leu Val Lys Glu Thr Asn Ser Ala Asn Pro Leu
        115                 120                 125
Val Ser Ile Ile Met Thr Ser His Asn Thr Ala Gln Phe Ile Glu Ala
    130                 135                 140
Ser Ile Asn Ser Leu Leu Leu Gln Thr Tyr Lys Asn Ile Glu Ile Ile
145                 150                 155                 160
Ile Val Asp Asp Asp Ser Ser Asp Asn Thr Phe Glu Ile Ala Ser Arg
                165                 170                 175
Ile Ala Asn Thr Thr Ser Lys Val Arg Val Phe Arg Leu Asn Ser Asn
            180                 185                 190
Leu Gly Thr Tyr Phe Ala Lys Asn Thr Gly Ile Leu Lys Ser Lys Gly
        195                 200                 205
Asp Ile Ile Phe Phe Gln Asp Ser Asp Asp Val Cys His His Glu Arg
    210                 215                 220
Ile Glu Arg Cys Val Asn Ile Leu Leu Ala Asn Lys Glu Thr Ile Ala
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Val Arg Cys Ala Tyr Ser Arg Leu Ala Pro Glu Thr Gln His Ile Ile
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His Lys Lys Val Phe Gln Glu Ile Gly Phe Phe Asn Cys Thr Thr Lys
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Gly Ser Asp Asp Glu Phe Phe His Arg Ile Ala Lys Tyr Tyr Gly Lys
    290                 295                 300
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Pro Ser Arg Ile Ala Gln Leu Gln Arg Ile Ile Gly Ile Leu Lys Asn
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<210>8
<211>480
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(477)
 
<300>
<308>GenBanh/AY558564
<309>2007-04-24
<313>(1)..(477)
 
<400>8
atg agc tta ccc gat gga ttt tat ata agg cga atg gaa gag ggg gat    48
Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp
1               5                   10                  15
ttg gaa cag gtc act gag acg cta aag gtt ttg acc acc gtg ggc act    96
Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr
            20                  25                  30
att acc ccc gaa tcc ttc agc aaa ctc ata aaa tac tgg aat gaa gcc    144
Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala
        35                  40                  45
aca gta tgg aat gat aac gaa gat aaa aaa ata atg caa tat aac ccc    192
Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro
    50                  55                  60
atg gtg att gtg gac aag cgc acc gag acg gtt gcc gct acg ggg aat    240
Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn
65                  70                  75                  80
atc atc atc gaa aga aag atc att cat gaa ctg ggg cta tgt ggc cac    288
Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His
                85                  90                  95
atc gag gac att gca gta aac tcc aag tat cag ggc caa ggt ttg ggc    336
Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly
            100                 105                 110
aag ctc ttg att gat caa ttg gta act atc ggc ttt gac tac ggt tgt    384
Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys
        115                 120                 125
tat aag att att tta gat tgc gat gag aaa aat gtc aaa ttc tat gaa    432
Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu
    130                 135                 140
aaa tgt ggg ttt agc aac gca ggc gtg gaa atg caa att aga aaa tag    480
Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys
145                 150                 155
 
<210>9
<211>159
<212>PRT
<213>酿酒酵母
 
<400>9
Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp
1               5                   10                  15
Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr
            20                  25                  30
Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala
        35                  40                  45
Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro
    50                  55                  60
Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn
65                  70                  75                  80
Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His
                85                  90                  95
Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly
            100                 105                 110
Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys
        115                 120                 125
Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu
    130                 135                 140
Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys
145                 150                 155
 
<210>10
<211>1434
<212>DNA
<213>酿酒酵母
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1431)
 
<300>
<308>GenBank/X79380
<309>2005-04-18
<313>(3261)..(4694)
 
<400>10
 
atg act gac aca aaa cag cta ttc att gaa gcc gga caa agt caa ctt    48
Met Thr Asp Thr Lys Gln Leu Phe Ile Glu Ala Gly Gln Ser Gln Leu
1               5                   10                  15
ttc cac aat tgg gaa agc ttg tct cgc aaa gac caa gaa gaa ttg ctt    96
Phe His Asn Trp Glu Ser Leu SerArg Lys Asp Gln Glu Glu Leu Leu
            20                  25                  30
tca aac ctg gag caa ata tct tcc aag agg tcc cct gca aaa cta ctg    144
Ser Asn Leu Glu Gln Ile Ser Ser Lys Arg Ser Pro Ala Lys Leu Leu
        35                  40                  45
gaa gac tgt caa aat gct att aaa ttc tca cta gct aac tct tct aag    192
Glu Asp Cys Gln Asn Ala Ile Lys Phe Ser Leu Ala Asn Ser Ser Lys
    50                  55                  60
gat act ggc gtc gaa att tca cca ttg ccc cct act tcg tac gag tcg    240
Asp Thr Gly Val Glu Ile Ser Pro Leu Pro Pro Thr Ser Tyr Glu Ser
65                  70                  75                  80
ctt att ggc aac agt aag aaa gaa aat gaa tac tgg cgt tta ggc ctt    288
Leu Ile Gly Asn Ser Lys Lys Glu Asn Glu Tyr Trp Arg Leu Gly Leu
                85                  90                  95
gaa gct att ggc aag ggt gaa gtc gca gtg att tta atg gct ggc gga    336
Glu Ala Ile Gly Lys Gly Glu Val Ala Val Ile Leu Met Ala Gly Gly
            100                 105                 110
caa ggt acg cgg tta gga tcc tct caa cca aag ggc tgt tac gac att    384
Gln Gly Thr Arg Leu Gly Ser Ser Gln Pro Lys Gly Cys Tyr Asp Ile
        115                 120                 125
gga ttg cct tct aag aaa tct ctt ttt caa att caa gct gaa aag ttg    432
Gly Leu Pro Ser Lys Lys Ser Leu Phe Gln Ile Gln Ala Glu Lys Leu
    130                 135                 140
atc agg ttg caa gat atg gta aag gac aaa aag gta gaa att cct tgg    480
Ile Arg Leu Gln Asp Met Val Lys Asp Lys Lys Val Glu Ile Pro Trp
145                 150                 155                 160
tat att atg aca tca ggc ccc act aga gcg gct act gag gca tac ttt    528
Tyr Ile Met Thr Ser Gly Pro Thr Arg Ala Ala Thr Glu Ala Tyr Phe
                165                 170                 175
caa gaa cac aat tat ttt ggc ttg aat aaa gaa caa att acg ttc ttc    576
Gln Glu His Asn Tyr Phe Gly Leu Asn Lys Glu Gln Ile Thr Phe Phe
            180                 185                 190
aac cag gga acc ctg cct gcc ttt gat tta acc ggg aag cat ttc cta    624
Asn Gln Gly Thr Leu Pro Ala Phe Asp Leu Thr Gly Lys His Phe Leu
        195                 200                 205
atg aaa gac cca gta aac cta tct caa tca cca gat gga aat ggt gga    672
Met Lys Asp Pro Val Asn Leu Ser Gln Ser Pro Asp Gly Asn Gly Gly
    210                 215                 220
ctc tac cgt gcc atc aag gaa aac aag ttg aac gaa gac ttt gat agg    720
Leu Tyr Arg Ala Ile Lys Glu Asn Lys Leu Asn Glu Asp Phe Asp Arg
225                 230                 235                 240
aga gga atc aag cat gtt tac atg tac tgt gtc gat aat gtc cta tct    768
Arg Gly Ile Lys His Val Tyr Met Tyr Cys Val Asp Asn Val Leu Ser
                245                 250                 255
aaa atc gca gac cct gta ttt att ggt ttt gcc atc aag cat ggc ttc    816
Lys Ile Ala Asp Pro Val Phe Ile Gly Phe Ala Ile Lys His Gly Phe
            260                 265                 270
gaa ctg gcc acc aaa gcc gtt aga aag aga gat gcg cat gaa tca gtt    864
Glu Leu Ala Thr Lys Ala Val Arg Lys Arg Asp Ala His Glu Ser Val
        275                 280                 285
ggg tta att gct act aaa aac gag aaa cca tgt gtc ata gaa tat tct    912
Gly Leu Ile Ala Thr Lys Asn Glu Lys Pro Cys Val Ile Glu Tyr Ser
    290                 295                 300
gaa att tcc aat gaa ttg gct gaa gca aag gat aaa gat ggc tta tta    960
Glu Ile Ser Asn Glu Leu Ala Glu Ala Lys Asp Lys Asp Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
aaa cta cgc gca ggc aac att gta aat cat tat tac cta gtg gat tta    1008
Lys Leu Arg Ala Gly Asn Ile Val Asn His Tyr Tyr Leu Val Asp Leu
                325                 330                 335
cta aaa cgt gat ttg gat cag tgg tgt gag aat atg cca tat cac att    1056
Leu Lys Arg Asp Leu Asp Gln Trp Cys Glu Asn Met Pro Tyr His Ile
            340                 345                 350
gcg aag aag aaa att cca gct tat gat agt gtt acc ggc aag tac act    1104
Ala Lys Lys Lys Ile Pro Ala Tyr Asp Ser Val Thr Gly Lys Tyr Thr
        355                 360                 365
aag cct acc gaa cca aac ggt ata aaa tta gag caa ttc ata ttt gat    1152
Lys Pro Thr Glu Pro Asn Gly Ile Lys Leu Glu Gln Phe Ile Phe Asp
    370                 375                 380
gtc ttt gac act gta cca ctg aac aag ttt ggg tgc tta gaa gta gat    1200
Val Phe Asp Thr Val Pro Leu Asn Lys Phe Gly Cys Leu Glu Val Asp
385                 390                 395                 400
aga tgc aaa gaa ttt tca cct tta aaa aac ggt cct ggt tct aag aac    1248
Arg Cys Lys Glu Phe Ser Pro Leu Lys Asn Gly Pro Gly Ser Lys Asn
                405                 410                 415
gat aat cct gag acc agc aga cta gca tat ttg aaa cta gga acc tcg    1296
Asp Asn Pro Glu Thr Ser Arg Leu Ala Tyr Leu Lys Leu Gly Thr Ser
            420                 425                 430
tgg ttg gaa gat gca ggc gct att gta aaa gat ggg gta cta gtc gaa    1344
Trp Leu Glu Asp Ala Gly Ala Ile Val Lys Asp Gly Val Leu Val Glu
        435                 440                 445
gtt tcc agc aaa ttg agt tat gca ggt gaa aat cta tcc cag ttc aaa    1392
Val Ser Ser Lys Leu Ser Tyr Ala Gly Glu Asn Leu Ser Gln Phe Lys
    450                 455                 460
ggt aaa gtc ttt gac aga agt ggt ata gta tta gaa aaa taa    1434
Gly Lys Val Phe Asp Arg Ser Gly Ile Val Leu Glu Lys
465                 470                 475
 
<210>11
<211>477
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>11
Met Thr Asp Thr Lys Gln Leu Phe Ile Glu Ala Gly Gln Ser Gln Leu
1               5                   10                  15
Phe His Asn Trp Glu Ser Leu Ser Arg Lys Asp Gln Glu Glu Leu Leu
            20                  25                  30
Ser Asn Leu Glu Gln Ile Ser Ser Lys Arg Ser Pro Ala Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Glu Asp Cys Gln Asn Ala Ile Lys Phe Ser Leu Ala Asn Ser Ser Lys
    50                  55                  60
Asp Thr Gly Val Glu Ile Ser Pro Leu Pro Pro Thr Ser Tyr Glu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Ile Gly Asn Ser Lys Lys Glu Asn Glu Tyr Trp Arg Leu Gly Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Ile Gly Lys Gly Glu Val Ala Val Ile Leu Met Ala Gly Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Arg Leu Gly Ser Ser Gln Pro Lys Gly Cys Tyr Asp Ile
        115                 120                 125
Gly Leu Pro Ser Lys Lys Ser Leu Phe Gln Ile Gln Ala Glu Lys Leu
    130                 135                 140
Ile Arg Leu Gln Asp Met Val Lys Asp Lys Lys Val Glu Ile Pro Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Met Thr Ser Gly Pro Thr Arg Ala Ala Thr Glu Ala Tyr Phe
                165                 170                 175
Gln Glu His Asn Tyr Phe Gly Leu Asn Lys Glu Gln Ile Thr Phe Phe
            180                 185                 190
Asn Gln Gly Thr Leu Pro Ala Phe Asp Leu Thr Gly Lys His Phe Leu
        195                 200                 205
Met Lys Asp Pro Val Asn Leu Ser Gln Ser Pro Asp Gly Asn Gly Gly
    210                 215                 220
Leu Tyr Arg Ala Ile Lys Glu Asn Lys Leu Asn Glu Asp Phe Asp Arg
225                 230                 235                 240
Arg Gly Ile Lys His Val Tyr Met Tyr Cys Val Asp Asn Val Leu Ser
                245                 250                 255
Lys Ile Ala Asp Pro Val Phe Ile Gly Phe Ala Ile Lys His Gly Phe
            260                 265                 270
Glu Leu Ala Thr Lys Ala Val Arg Lys Arg Asp Ala His Glu Ser Val
        275                 280                 285
Gly Leu Ile Ala Thr Lys Asn Glu Lys Pro Cys Val Ile Glu Tyr Ser
    290                 295                 300
Glu Ile Ser Asn Glu Leu Ala Glu Ala Lys Asp Lys Asp Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
Lys Leu Arg Ala Gly Asn Ile Val Asn His Tyr Tyr Leu Val Asp Leu
                325                 330                 335
Leu Lys Arg Asp Leu Asp Gln Trp Cys Glu Asn Met Pro Tyr His Ile
            340                 345                 350
Ala Lys Lys Lys Ile Pro Ala Tyr Asp Ser Val Thr Gly Lys Tyr Thr
        355                 360                 365
Lys Pro Thr Glu Pro Asn Gly Ile Lys Leu Glu Gln Phe Ile Phe Asp
    370                 375                 380
Val Phe Asp Thr Val Pro Leu Asn Lys Phe Gly Cys Leu Glu Val Asp
385                 390                 395                 400
Arg Cys Lys Glu Phe Ser Pro Leu Lys Asn Gly Pro Gly Ser Lys Asn
                405                 410                 415
Asp Asn Pro Glu Thr Ser Arg Leu Ala Tyr Leu Lys Leu Gly Thr Ser
            420                 425                 430
Trp Leu Glu Asp Ala Gly Ala Ile Val Lys Asp Gly Val Leu Val Glu
        435                 440                 445
Val Ser Ser Lys Leu Ser Tyr Ala Gly Glu Asn Leu Ser Gln Phe Lys
    450                 455                 460
Gly Lys Val Phe Asp Arg Ser Gly Ile Val Leu Glu Lys
465                 470                 475
 
<210>12
<211>919
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>包含YLCV启动子、克隆位点、ocs-终止信号和nos-终止信号序列的重组核酸序列
 
<220>
<221>启动子
<222>(8)..(352)
<223>YLCV启动子序列
<220>
<221>多腺苷酸化信号
<222>(366)..(663)
<223>来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的ocs基因的多腺苷酸化信号
 
<220>
<221>多腺苷酸化信号
<222>(664)..(872)
<223>来自根瘤农杆菌的nos基因的多腺苷酸化信号
 
<400>12
gaattcctgg cagacaaagt ggcagacata ctgtcccaca aatgaagatg gaatctgtaa  60
aagaaaacgc gtgaaataat gcgtctgaca aaggttaggt cggctgcctt taatcaatac  120
caaagtggtc cctaccacga tggaaaaact gtgcagtcgg tttggctttt tctgacgaac  180
aaataagatt cgtggccgac aggtgggggt ccaccatgtg aaggcatctt cagactccaa  240
taatggagca atgacgtaag ggcttacgaa ataagtaagg gtagtttggg aaatgtccac  300
tcacccgtca gtctataaat acttagcccc tccctcattg ttaagggagc aagagctcgc  360
ccgggatctc gaatcacgcg ttctaggatc cgaagcagat cgttcaaaca tttggcaata  420
aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt  480
gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt  540
ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg  600
cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc gggaagatct  660
cgagacgtcg ggacaatcag taaattgaac ggagaatatt attcataaaa atacgatagt  720
aacgggtgat atattcatta gaatgaaccg aaaccggcgg taaggatctg agctacacat  780
gctcaggttt tttacaacgt gcacaacaga attgaaagca aatatcatgc gatcataggc  840
gtctcgcata tctcattaaa gcagggcatg cctgtttaaa cattaattaa acctaggtga  900
cgtctaaaag ggcgaattc                                               919
 
<210>13
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>13
tcgacaggcc tggatcctta attaaactag tctcgaggag ctcggtac    48
 
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>14
cgagctcctc gagactagtt taattaagga tccaggcctg             40
 
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>15
cttaattaat agttgacgaa cggaagctg                        29
 
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>16
agcatgcttg cagaccgtca ttagg                            25
 
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>17
aaagtgcttc ataagtagct caaaca                           26
 
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>18
aacaccagat cgaactgcaa                                              20
 
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>19
ccgccttttt agccagttat c                                            21
 
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>20
ccactctgtc tgcaaaggaa                                              20
 
<210>21
<211>1338
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1338)
 
<300>
<308>GenBank /AY616604
<309>2006-08-18
<313>(1)..(1338)
 
<400>21
 
atg agt aat cgt aaa tat ttc ggt acc gat ggg att cgt ggt cgt gta    48
Met Ser Asn Arg Lys Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Gly Arg Val
1               5                   10                  15
ggg gat gcg ccg atc aca cct gat ttt gtg ctt aag ctg ggt tgg gcc    96
Gly Asp Ala Pro Ile Thr Pro Asp Phe Val Leu Lys Leu Gly Trp Ala
            20                  25                  30
gcg ggt aaa gtg ctg gcg cgc cac ggc tcc cgt aag att att att ggt    144
Ala Gly Lys Val Leu Ala Arg His Gly Ser Arg Lys Ile Ile Ile Gly
        35                  40                  45
aaa gac acg cgt att tct ggc tat atg ctg gag tca gca ctg gaa gcg    192
Lys Asp Thr Arg Ile Ser Gly Tyr Met Leu Glu Ser Ala Leu Glu Ala
    50                  55                  60
ggt ctg gcg gca gcg ggc ctt tcc gca ctc ttc act ggc ccg atg cca    240
Gly Leu Ala Ala Ala Gly Leu Ser Ala Leu Phe Thr Gly Pro Met Pro
65                  70                  75                  80
aca ccg gcc gtg gct tat ctg acg cgt acc ttc cgc gca gag gcc gga    288
Thr Pro Ala Val Ala Tyr Leu Thr Arg Thr Phe Arg Ala Glu Ala Gly
                85                  90                  95
att gtg ata tct gca tcg cat aac ccg ttc tac gat aat ggc att aaa    336
Ile Val Ile Ser Ala Ser His Asn Pro Phe Tyr Asp Asn Gly Ile Lys
            100                 105                 110
ttc ttc tct atc gac ggc acc aaa ctg ccg gat gcg gta gaa gag gcc    384
Phe Phe Ser Ile Asp Gly Thr Lys Leu Pro Asp Ala Val Glu Glu Ala
        115                 120                 125
atc gaa gcg gaa atg gaa aag gag atc agc tgc gtt gat tcg gca gaa    432
Ile Glu Ala Glu Met Glu Lys Glu Ile Ser Cys Val Asp Ser Ala Glu
    130                 135                 140
ctg ggt aaa gcc agc cgt atc gtt gat gcc gcg ggt cgc tat atc gag    480
Leu Gly Lys Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Ala Gly Arg Tyr Ile Glu
145                 150                 155                 160
ttt tgc aaa gcc acg ttc ccg aac gaa ctt agc ctc agt gaa ctg aag    528
Phe Cys Lys Ala Thr Phe Pro Asn Glu Leu Ser Leu Ser Glu Leu Lys
                165                 170                 175
att gtg gtg gat tgt gca aac ggt gcg act tat cac atc gcg ccg aac    576
Ile Val Val Asp Cys Ala Asn Gly Ala Thr Tyr His Ile Ala Pro Asn
            180                 185                 190
gtg ctg cgc gaa ctg ggg gcg aac gtt atc gct atc ggt tgt gag cca    624
Val Leu Arg Glu Leu Gly Ala Asn Val Ile Ala Ile Gly Cys Glu Pro
        195                 200                 205
aac ggt gta aac atc aat gcc gaa gtg ggg gct acc gac gtt cgc gcg    672
Asn Gly Val Asn Ile Asn Ala Glu Val Gly Ala Thr Asp Val Arg Ala
    210                 215                 220
ctc cag gct cgt gtg ctg gct gaa aaa gcg gat ctc ggt att gcc ttc    720
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Glu Lys Ala Asp Leu Gly Ile Ala Phe
225                 230                 235                 240
gac ggc gat ggc gat  cgc gtg att atg gtt gac cat gaa ggc aat aaa    768
Asp Gly Asp Gly Asp Arg Val Ile Met Val Asp His Glu Gly Asn Lys
                245                 250                 255
gtc gat ggc gat cag atc atg tat atc atc gcg cgt gaa ggt ctt cgt    816
Val Asp Gly Asp Gln Ile Met Tyr Ile Ile Ala Arg Glu Gly Leu Arg
            260                 265                 270
cag ggc cag ctg cgt ggt ggc gct gtg ggt aca ttg atg agc aac atg    864
Gln Gly Gln Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Thr Leu Met Ser Asn Met
        275                 280                 285
ggg ctt gaa ctg gcg ctg aaa cag tta gga att cca ttt gcg cgc gcg    912
Gly Leu Glu Leu Ala Leu Lys Gln Leu Gly Ile Pro Phe Ala Arg Ala
    290                 295                 300
aaa gtg ggt gac cgc tac gta ctg gaa aaa atg cag gag aaa ggc tgg    960
Lys Val Gly Asp Arg Tyr Val Leu Glu Lys Met Gln Glu Lys Gly Trp
305                 310                 315                 320
cgt atc ggt gca gag aat tcc ggt cat gtg atc ctg ctg gat aaa act    1008
Arg Ile Gly Ala Glu Asn Ser Gly His Val Ile Leu Leu Asp Lys Thr
                325                 330                 335
act acc ggt gac ggc atc gtt gct ggc ttg cag gtg ctg gcg gcg atg    1056
Thr Thr Gly Asp Gly Ile Val Ala Gly Leu Gln Val Leu Ala Ala Met
            340                 345                 350
gca cgt aac cat atg agc ctg cac gac ctt tgc agc ggc atg aaa atg    1104
Ala Arg Asn His Met Ser Leu His Asp Leu Cys Ser Gly Met Lys Met
        355                 360                 365
ttc ccg cag att ctg gtt aac gta cgt tac acc gca ggt agc ggc gat    1152
Phe Pro Gln Ile Leu Val Asn Val Arg Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Asp
    370                 375                 380
cca ctt gag cat gag tca gtt aaa gcc gtg acc gca gag gtt gaa gct    1200
Pro Leu Glu His Glu Ser Val Lys Ala Val Thr Ala Glu Val Glu Ala
385                 390                 395                 400
gcg ctg ggc aac cgt gga cgc gtg ttg ctg cgt aaa tcc ggc acc gaa    1248
Ala Leu Gly Asn Arg Gly Arg Val Leu Leu Arg Lys Ser Gly Thr Glu
                405                 410                 415
ccg tta att cgc gtg atg gtg gaa ggc gaa gac gaa gcg cag gtg act    1296
Pro Leu Ile Arg Val Met Val Glu Gly Glu Asp Glu Ala Gln Val Thr
            420                 425                 430
gaa ttt gca cac cgc atc gcc gat gca gta aaa gcc gtt taa            1338
Glu Phe Ala His Arg Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala Val
        435                 440                 445
<210>22
<211>445
<212>PRT
<213>大肠杆菌
 
<400>22
 
Met Ser Asn Arg Lys Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Gly Arg Val
1               5                   10                  15
Gly Asp Ala Pro Ile Thr Pro Asp Phe Val Leu Lys Leu Gly Trp Ala
            20                  25                  30
Ala Gly Lys Val Leu Ala Arg His Gly Ser Arg Lys Ile Ile Ile Gly
        35                  40                  45
Lys Asp Thr Arg Ile Ser Gly Tyr Met Leu Glu Ser Ala Leu Glu Ala
    50                  55                  60
Gly Leu Ala Ala Ala Gly Leu Ser Ala Leu Phe Thr Gly Pro Met Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Ala Val Ala Tyr Leu Thr Arg Thr Phe Arg Ala Glu Ala Gly
                85                  90                  95
Ile Val Ile Ser Ala Ser His Asn Pro Phe Tyr Asp Asn Gly Ile Lys
            100                 105                 110
Phe Phe Ser Ile Asp Gly Thr Lys Leu Pro Asp Ala Val Glu Glu Ala
        115                 120                 125
Ile Glu Ala Glu Met Glu Lys Glu Ile Ser Cys Val Asp Ser Ala Glu
    130                 135                 140
Leu Gly Lys Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Ala Gly Arg Tyr Ile Glu
145                 150                 155                 160
Phe Cys Lys Ala Thr Phe Pro Asn Glu Leu Ser Leu Ser Glu Leu Lys
                165                 170                 175
Ile Val Val Asp Cys Ala Asn Gly Ala Thr Tyr His Ile Ala Pro Asn
            180                 185                 190
Val Leu Arg Glu Leu Gly Ala Asn Val Ile Ala Ile Gly Cys Glu Pro
        195                 200                 205
Asn Gly Val Asn Ile Asn Ala Glu Val Gly Ala Thr Asp Val Arg Ala
    210                 215                 220
Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Glu Lys Ala Asp Leu Gly Ile Ala Phe
225                 230                 235                 240
Asp Gly Asp GIy Asp Arg Val Ile Met Val Asp His Glu Gly Asn Lys
                245                 250                 255
Val Asp Gly Asp Gln Ile Met Tyr Ile Ile Ala Arg Glu Gly Leu Arg
            260                 265                 270
Gln Gly Gln Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Thr Leu Met Ser Asn Met
        275                 280                 285
Gly Leu Glu Leu Ala Leu Lys Gln Leu Gly Ile Pro Phe Ala Arg Ala
    290                 295                 300
Lys Val Gly Asp Arg Tyr Val Leu Glu Lys Met Gln Glu Lys Gly Trp
305                 310                 315                 320
Arg Ile Gly Ala Glu Asn Ser Gly His Val Ile Leu Leu Asp Lys Thr
                325                 330                 335
Thr Thr Gly Asp Gly Ile Val Ala Gly Leu Gln Val Leu Ala Ala Met
            340                 345                 350
Ala Arg Asn His Met Ser Leu His Asp Leu Cys Ser Gly Met Lys Met
        355                 360                 365
Phe Pro Gln Ile Leu Val Asn Val Arg Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Asp
    370                 375                 380
Pro Leu Glu His Glu Ser Val Lys Ala Val Thr Ala Glu Val Glu Ala
385                 390                 395                 400
Ala Leu Gly Asn Arg Gly Arg Val Leu Leu Arg Lys Ser Gly Thr Glu
                405                 410                 415
Pro Leu Ile Arg Val Met Val Glu Gly Glu Asp Glu Ala Gln Val Thr
            420                 425                 430
Glu Phe Ala His Arg Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala Val
        435                 440                 445
 
<210>23
<21l>20
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>23
attacccggc cagaatcact    20
 
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>24
gtcaggacgc gtatgttgaa                                               20
     <210>25
<211>1371
<212>DNA
<213>大肠杆菌
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1368)
 
<300>
<308>GenBank/AP009048.1
<309>2007-05-19
<313>(3721481)..(3722851)
 
<400>25
atg ttg aat aat gct atg agc gta gtg atc ctt gcc gca ggc aaa ggc    48
Met Leu Asn Asn Ala Met Ser Val Val Ile Leu Ala Ala Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
acg cgc atg tat tcc gat ctt ccg aaa gtg ctg cat acc ctt gcc ggg    96
Thr Arg Met Tyr Ser Asp Leu Pro Lys Val Leu His Thr Leu Ala Gly
            20                  25                  30
aaa gcg atg gtt cag cat gtc att gat gct gcg aat gaa tta ggc gca    144
Lys Ala Met Val Gln His Val Ile Asp Ala Ala Asn Glu Leu Gly Ala
        35                  40                  45
gcg cac gtt cac ctg gtg tac ggt cac ggc ggc gat ctg cta aaa cag    192
Ala His Val His Leu Val Tyr Gly His Gly Gly Asp Leu Leu Lys Gln
    50                  55                  60
gcg ctg aaa gac gac aac ctt aac tgg gtg ctt cag gca gag cag ctg    240
Ala Leu Lys Asp Asp Asn Leu Asn Trp Val Leu Gln Ala Glu Gln Leu
65                  70                  75                  80
ggt acg ggt cat gca atg cag cag gcc gca cct ttc ttt gcc gat gat    288
Gly Thr Gly His Ala Met Gln Gln Ala Ala Pro Phe Phe Ala Asp Asp
                85                  90                  95
gaa gac att tta atg ctc tac ggc gac gtg ccg ctg atc tct gtc gaa    336
Glu Asp Ile Leu Met Leu Tyr Gly Asp Val Pro Leu Ile Ser Val Glu
            100                 105                 110
aca ctc cag cgt ctg cgt gat gct aaa ccg cag ggt ggc att ggt ctg    384
Thr Leu Gln Arg Leu Arg Asp Ala Lys Pro Gln Gly Gly Ile Gly Leu
        115                 120                 125
ctg acg gtg aaa ctg gat gat ccg acc ggt tat gga cgt atc acc cgt    432
Leu Thr Val Lys Leu Asp Asp Pro Thr Gly Tyr Gly Arg Ile Thr Arg
    130                 135                 140
gaa aac ggc aaa gtt acc ggc att gtt gag cac aaa gat gcc acc ggc    480
Glu Asn Gly Lys Val Thr Gly Ile Val Glu His Lys Asp Ala Thr Gly
145                 150                 155                 160
gag cag cgt cag att cag gag atc aac acc ggc att ctg att gcc aac    528
Glu Gln Arg Gln Ile Gln Glu Ile Asn Thr Gly Ile Leu Ile Ala Asn
                165                 170                 175
ggc gca gat atg aaa cgc tgg ctg gcg aag ctg acc aac aat aat gct    576
Gly Ala Asp Met Lys Arg Trp Leu Ala Lys Leu Thr Asn Asn Asn Ala
            180                 185                 190
cag ggc gaa tac tac atc acc gac att att gcg ctg gcg tat cag gaa    624
Gln Gly Glu Tyr Tyr Ile Thr Asp Ile Ile Ala Leu Ala Tyr Gln Glu
        195                 200                 205
ggg cgt gaa atc gtc gcc gtt cat ccg caa cgt tta agc gaa gta gaa    672
Gly Arg Glu Ile Val Ala Val His Pro Gln Arg Leu Ser Glu Val Glu
    210                 215                 220
ggc gtg aat aac cgc ctg caa ctc tcc cgt ctg gag cgt gtt tat cag    720
Gly Val Asn Asn Arg Leu Gln Leu Ser Arg Leu Glu Arg Val Tyr Gln
225                 230                 235                 240
tcc gaa cag gct gaa aaa ctg ctg tta gca ggc gtt atg ctg cgc gat    768
Ser Glu Gln Ala Glu Lys Leu Leu Leu Ala Gly Val Met Leu Arg Asp
                245                 250                 255
cca gcg cgt ttt gat ctg cgt ggt acg cta act cac ggg cgc gat gtt    816
Pro Ala Arg Phe Asp Leu Arg Gly Thr Leu Thr His Gly Arg Asp Val
            260                 265                 270
gaa att gat act aac gtt atc atc gag ggc aac gtg act ctc ggt cat    864
Glu Ile Asp Thr Asn Val Ile Ile Glu Gly Asn Val Thr Leu Gly His
        275                 280                 285
cgc gtg aaa att ggc acc ggt tgc gtg att aaa aac agc gtg att ggc    912
Arg Val Lys Ile Gly Thr Gly Cys Val Ile Lys Asn Ser Val Ile Gly
    290                 295                 300
gat gat tgc gaa atc agt ccg tat acc gtt gtg gaa gat gcg aat ctg    960
Asp Asp Cys Glu Ile Ser Pro Tyr Thr Val Val Glu Asp Ala Asn Leu
305                 310                 315                 320
gca gcg gcc tgt acc att ggc ccg ttt gcc cgt ttg cgt cct ggt gct    1008
Ala Ala Ala Cys Thr Ile Gly Pro Phe Ala Arg Leu Arg Pro Gly Ala
                325                 330                 335
gag ttg ctg gaa ggt gct cac gtc ggt aac ttc gtt gag atg aaa aaa    1056
Glu Leu Leu Glu Gly Ala His Val Gly Asn Phe Val Glu Met Lys Lys
            340                 345                 350
gcg cgt ctg ggt aaa ggc tcg aaa gct ggt catctg act tac ctg ggc    1104
Ala Arg Leu Gly Lys Gly Ser LysAla Gly His Leu Thr Tyr Leu Gly
        355                 360                 365
gat gcg gaa att ggc gat aac gtt aac atc ggc gcg gga acc att acc    1152
Asp Ala Glu Ile Gly Asp Asn Val Asn Ile Gly Ala Gly Thr Ile Thr
    370                 375                 380
tgc aac tac gat ggt gcg aat aaa ttt aag acc att atc ggc gac gat    1200
Cys Asn Tyr Asp GlyAla Asn Lys Phe Lys Thr Ile Ile Gly Asp Asp
385                 390                 395                 400
gtg ttt gtt ggt tcc gac act cag ctg gtg gcc ccg gta aca gta ggc    1248
Val Phe Val Gly Ser Asp Thr Gln Leu Val Ala Pro Val Thr Val Gly
                405                 410                 415
aaa ggc gcg acc att gct gcg ggt aca act gtg acg cgt aat gtc ggc    1296
Lys Gly Ala Thr Ile Ala Ala Gly Thr Thr Val Thr Arg Asn Val Gly
            420                 425                 430
gaa aat gca tta gct atc agc cgt gtg ccg cag act cag aaa gaa ggc    1344
Glu Asn Ala Leu Ala Ile Ser Arg Val Pro Gln Thr Gln Lys Glu Gly
        435                 440                 445
tgg cgt cgt ccg gta aag aaa aag tga                                1371
Trp Arg Arg Pro Val Lys Lys Lys
    450                 455
 
<210>26
<211>456
<212>PRT
<213>大肠杆菌
 
<400>26
 
Met Leu Asn Asn Ala Met Ser Val Val Ile Leu Ala Ala Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Thr Arg Met Tyr Ser Asp Leu Pro Lys Val Leu His Thr Leu Ala Gly
            20                  25                  30
Lys Ala Met Val Gln His Val Ile Asp Ala Ala Asn Glu Leu Gly Ala
        35                  40                  45
Ala His Val His Leu Val Tyr Gly His Gly Gly Asp Leu Leu Lys Gln
    50                  55                  60
Ala Leu Lys Asp Asp Asn Leu Asn Trp Val Leu Gln Ala Glu Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gly Thr Gly His Ala Met Gln Gln Ala Ala Pro Phe Phe Ala Asp Asp
                85                  90                  95
Glu Asp Ile Leu Met Leu Tyr Gly Asp Val Pro Leu Ile Ser Val Glu
            100                 105                 110
Thr Leu Gln Arg Leu Arg Asp Ala Lys Pro Gln Gly Gly Ile Gly Leu
        115                 120                 125
Leu Thr Val Lys Leu Asp Asp Pro Thr Gly Tyr Gly Arg Ile Thr Arg
    130                 135                 140
Glu Asn Gly Lys Val Thr Gly Ile Val Glu His Lys Asp Ala Thr Gly
145                 150                 155                 160
Glu Gln Arg Gln Ile Gln Glu Ile Asn Thr Gly Ile Leu Ile Ala Asn
                165                 170                 175
Gly Ala Asp Met Lys Arg Trp Leu Ala Lys Leu Thr Asn Asn Asn Ala
            180                 185                 190
Gln Gly Glu Tyr Tyr Ile Thr Asp Ile Ile Ala Leu Ala Tyr Gln Glu
        195                 200                 205
Gly Arg Glu Ile Val Ala Val His Pro Gln Arg Leu Ser Glu Val Glu
    210                 215                 220
Gly Val Asn Asn Arg Leu Gln Leu Ser Arg Leu Glu Arg Val Tyr Gln
225                 230                 235                 240
Ser Glu Gln Ala Glu Lys Leu Leu Leu Ala Gly Val Met Leu Arg Asp
                245                 250                 255
Pro Ala Arg Phe Asp Leu Arg Gly Thr Leu Thr His Gly Arg Asp Val
            260                 265                 270
Glu Ile Asp Thr Asn Val Ile Ile Glu Gly Asn Val Thr Leu Gly His
        275                 280                 285
Arg Val Lys Ile Gly Thr Gly Cys Val Ile Lys Asn Ser Val Ile Gly
    290                 295                 300
Asp Asp Cys Glu Ile Ser Pro Tyr Thr Val Val Glu Asp Ala Asn Leu
305                 310                 315                 320
Ala Ala Ala Cys Thr Ile Gly Pro Phe Ala Arg Leu Arg Pro Gly Ala
                325                 330                 335
Glu Leu Leu Glu Gly Ala His Val Gly Asn Phe Val Glu Met Lys Lys
            340                 345                 350
Ala Arg Leu Gly Lys Gly Ser Lys Ala Gly His Leu Thr Tyr Leu Gly
        355                 360                 365
Asp Ala Glu Ile Gly Asp Asn Val Asn Ile Gly Ala Gly Thr Ile Thr
    370                 375                 380
Cys Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Ile Gly Asp Asp
385                 390                 395                 400
Val Phe Val Gly Ser Asp Thr Gln Leu Val Ala Pro Val Thr Val Gly
                405                 410                 415
Lys Gly Ala Thr Ile Ala Ala Gly Thr Thr Val Thr Arg Asn Val Gly
            420                 425                 430
Glu Asn Ala Leu Ala Ile Ser Arg Val Pro Gln Thr Gln Lys Glu Gly
        435                 440                 445
Trp Arg Arg Pro Val Lys Lys Lys
    450                 455
 
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>27
ggcaaaggtc agcagtaagc      20
 
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>28
tcaagcagat gccttaacgt g    21
 
<210>29
<211>1674
<212>DNA
<213>酿酒酵母
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1671)
 
<400>29
 
atg aag gtt gat tac gag caa ttg tgc aaa ctc tac gat gac acg tgc    48
Met Lys Val Asp Tyr Glu Gln Leu Cys Lys Leu Tyr Asp Asp Thr Cys
1               5                   10                  15
cgc acaaag aat gtg cag ttc agt tac ggt acg gcc gga ttc aga acg     96
Arg Thr Lys Asn Val Gln Phe Ser Tyr Gly ThrAla Gly Phe Arg Thr
            20                  25                  30
ctg gcc aag aat ttg gat acg gtg atg ttc agt act ggt ata ctg gcg    144
Leu Ala Lys Asn Leu Asp Thr Val Met Phe Ser Thr Gly Ile Leu Ala
        35                  40                  45
gtt ctc agg tcg ctg aag ctt cag ggt cag tat gtg ggg gtg atg atc    192
Val Leu Arg Ser Leu Lys Leu Gln Gly Gln Tyr Val Gly Val Met Ile
    50                  55                  60
acg gcg tcg cac aac cca tac cag gac aac ggg gtc aag atc gtg gaa    240
Thr Ala Ser His Asn Pro Tyr Gln Asp Asn Gly Val Lys Ile Val Glu
65                  70                  75                  80
cca gac gga tcg atg ctt ttg gcc aca tgg gag cca tat gcc atg cag    288
Pro Asp Gly Ser Met Leu Leu Ala Thr Trp Glu Pro Tyr Ala Met Gln
                85                  90                  95
ttg gcc aat gcg gcc tct ttt gcc act aat ttt gaa gaa ttt cgt gtt    336
Leu Ala Asn Ala Ala Ser Phe Ala Thr Asn Phe Glu Glu Phe Arg Val
            100                 105                 110
gag ttg gcc aag ctg att gaa cac gaa aag att gat ttg aat aca acc    384
Glu Leu Ala Lys Leu Ile Glu His Glu Lys Ile Asp Leu Asn Thr Thr
        115                 120                 125
gtc gtg cct cac atc gtg gtt ggg aga gac tct agg gaa agt agt cca    432
Val Val Pro His Ile Val Val Gly Arg Asp Ser Arg Glu Ser Ser Pro
    130                 135                 140
tac ttg ctg cgc tgc ttg act tcc tcc atg gcc agc gtc ttc cac gcg    480
Tyr Leu Leu Arg Cys Leu Thr Ser Ser Met Ala Ser Val Phe His Ala
145                 150                 155                 160
caa gtt ttg gac cta ggc tgt gtc act acg cct caa ttg cat tac att    528
Gln Val Leu Asp Leu Gly Cys Val Thr Thr Pro Gln Leu His Tyr Ile
                165                 170                 175
act gat ttg tcc aac agg cgg aaa ctg gaa gga gac aca gcg cca gtt    576
Thr Asp Leu Ser Asn Arg Arg Lys Leu Glu Gly Asp Thr Ala Pro Val
            180                 185                 190
gcc aca gaa cag gac tac tat tcg ttc ttt ata gga gcc ttc aac gag    624
Ala Thr Glu Gln Asp Tyr Tyr Ser Phe Phe Ile Gly Ala Phe Asn Glu
        195                 200                 205
ctc ttc gcc acg tat cag ctg gag aag agg ctg tct gtc cca aaa ttg    672
Leu Phe Ala Thr Tyr Gln Leu Glu Lys Arg Leu Ser Val Pro Lys Leu
    210                 215                 220
ttc ata gac aca gcc aat ggt atc ggt ggt cca cag ttg aaa aaa cta    720
Phe Ile Asp Thr Ala Asn Gly Ile Gly Gly Pro Gln Leu Lys Lys Leu
225                 230                 235                 240
ctg gcc tcc gaa gat tgg gac gtg cca gcg gag caa gtt gag gta atc    768
Leu Ala Ser Glu Asp Trp Asp Val Pro Ala Glu Gln Val Glu Val Ile
                245                 250                 255
aac gac agg tcc gat gtt cca gaa ctg ttg aat ttt gaa tgc ggt gcg    816
Asn Asp Arg Ser Asp Val Pro Glu Leu Leu Asn Phe Glu Cys Gly Ala
            260                 265                 270
gat tat gtg aag act aac cag aga tta ccc aag ggt ctt tct cca tcc    864
Asp Tyr Val Lys Thr Asn Gln Arg Leu Pro Lys Gly Leu Ser Pro Ser
        275                 280                 285
tcg ttt gat tcg cta tat tgc tcc ttt gat ggt gac gca gac agg gtt    912
Ser Phe Asp Ser Leu Tyr Cys Ser Phe Asp Gly Asp Ala Asp Arg Val
    290                 295                 300
gtg ttc tac tat gtc gac tca gga tca aaa ttt cat ttg ttg gat ggt    960
Val Phe Tyr Tyr Val Asp Ser Gly Ser Lys Phe His Leu Leu Asp Gly
305                 310                 315                 320
gac aaa att tcc act ttg ttt gca aag ttc ttg tct aaa caa cta gaa    1008
Asp Lys Ile Ser Thr Leu Phe Ala Lys Phe Leu Ser Lys Gln Leu Glu
                325                 330                 335
ttg gca cac cta gaa cat tct ttg aag att ggt gtt gtg caa act gcc    1056
Leu Ala His Leu Glu His Ser Leu Lys Ile Gly Val Val Gln Thr Ala
            340                 345                 350
tat gca aac ggc agt tcc acc gct tac ata aaa aat acg ttg cac tgt    1104
Tyr Ala Asn Gly Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Lys Asn Thr Leu His Cys
        355                 360                 365
ccc gtg tct tgc act aag aca ggt gtt aaa cac ttg cat cat gaa gct    1152
Pro Val Ser Cys Thr Lys Thr Gly Val Lys His Leu His His Glu Ala
    370                 375                 380
gcc act cag tac gat att ggc att tat ttc gaa gca aat gga cat ggt    1200
Ala Thr Gln Tyr Asp Ile Gly Ile Tyr Phe Glu Ala Asn Gly His Gly
385                 390                 395                 400
acg att ata ttc agc gaa aaa ttt cat cga act atc aaa tct gaa tta    1248
Thr Ile Ile Phe Ser Glu Lys Phe His Arg Thr Ile Lys Ser Glu Leu
                405                 410                 415
tcc aag tcc aag tta aat ggt gat acg tta gct ttg aga act ttg aag    1296
Ser Lys Ser Lys Leu Asn Gly Asp Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Lys
            420                 425                 430
tgt ttc tct gaa ttg att aat cag acc gtg gga gat gct att tca gac    1344
Cys Phe Ser Glu Leu Ile Asn Gln Thr Val Gly Asp Ala Ile Ser Asp
        435                 440                 445
atg ctt gct gtc ctt gct act ttg gcg att ttg asa atg tcg cca atg    1392
Met Leu Ala Val Leu Ala Thr Leu Ala Ile Leu Lys Met Ser Pro Met
    450                 455                 460
gat tgg gat gaa gag tat act gat ttg ccc aac aag ctg gtt aag tgc    1440
Asp Trp Asp Glu Glu Tyr Thr Asp Leu Pro Asn Lys Leu Val Lys Cys
465                 470                 475                 480
atc gtt cct gat agg tca att ttc caa acc acg gac cag gaa aga aas    1488
Ile Val Pro Asp Arg Ser Ile Phe Gln Thr Thr Asp Gln Glu Arg Lys
                485                 490                 495
ttg ctc aat cca gtg ggg ttg caa gac aag ata gat ctt gtg gta gcc    1536
Leu Leu Asn Pro Val Gly Leu Gln Asp Lys Ile Asp Leu Val Val Ala
            500                 505                 510
aag tat ccc atg gga aga agc ttt gtc aga gcc agt ggt acg gag gat    1584
Lys Tyr Pro Met Gly Arg Ser Phe Val Arg Ala Ser Gly Thr Glu Asp
        515                 520                 525
gcg gtg agg gtt tat gcg gaa tgt aag gac tcc tct aag tta ggt caa    1632
Ala Val Arg Val Tyr Ala Glu Cys Lys Asp Ser Ser Lys Leu Gly Gln
    530                 535                 540
ttt tgt gac gaa gtg gtg gag cac gtt aag gca tct gct tga            1674
Phe Cys Asp Glu Val Val Glu His Val Lys Ala Ser Ala
545                 550                 555
 
<210>30
<21l>557
<212>PRT
<213>酿酒酵母
 
<400>30
Met Lys Val Asp Tyr Glu Gln Leu Cys Lys Leu Tyr Asp Asp Thr Cys
1               5                   10                  15
Arg Thr Lys Asn Val Gln Phe Ser Tyr Gly Thr Ala Gly Phe Arg Thr
            20                  25                  30
Leu Ala Lys Asn Leu Asp Thr Val Met Phe Ser Thr Gly Ile Leu Ala
        35                  40                  45
Val Leu Arg Ser Leu Lys Leu Gln Gly Gln Tyr Val Gly Val Met Ile
    50                  55                  60
Thr Ala Ser His Asn Pro Tyr Gln Asp Asn Gly Val Lys Ile Val Glu
65                  70                  75                  80
Pro Asp Gly Ser Met Leu Leu Ala Thr Trp Glu Pro Tyr Ala Met Gln
                85                  90                  95
Leu Ala Asn Ala Ala Ser Phe Ala Thr Asn Phe Glu Glu Phe Arg Val
            100                 105                 110
Glu Leu Ala Lys Leu Ile Glu His Glu Lys Ile Asp Leu Asn Thr Thr
        115                 120                 125
Val Val Pro His Ile Val Val Gly Arg Asp Ser Arg Glu Ser Ser Pro
    130                 135                 140
Tyr Leu Leu Arg Cys Leu Thr Ser Ser Met Ala Ser Val Phe His Ala
145                 150                 155                 160
Gln Val Leu Asp Leu Gly Cys Val Thr Thr Pro Gln Leu His Tyr Ile
                165                 170                 175
Thr Asp Leu Ser Asn Arg Arg Lys Leu Glu Gly Asp Thr Ala Pro Val
            180                 185                 190
Ala Thr Glu Gln Asp Tyr Tyr Ser Phe Phe Ile Gly Ala Phe Asn Glu
        195                 200                 205
Leu Phe Ala Thr Tyr Gln Leu Glu Lys Arg Leu Ser Val Pro Lys Leu
    210                 215                 220
Phe Ile Asp Thr Ala Asn Gly Ile Gly Gly Pro Gln Leu Lys Lys Leu
225                 230                 235                 240
Leu Ala Ser Glu Asp Trp Asp Val Pro Ala Glu Gln Val Glu Val Ile
                245                 250                 255
Asn Asp Arg Ser Asp Val Pro Glu Leu Leu Asn Phe Glu Cys Gly Ala
            260                 265                 270
Asp Tyr Val Lys Thr Asn Gln Arg Leu Pro Lys Gly Leu Ser Pro Ser
        275                 280                 285
Ser Phe Asp Ser Leu Tyr Cys Ser Phe Asp Gly Asp Ala Asp Arg Val
    290                 295                 300
Val Phe Tyr Tyr Val Asp Ser Gly Ser Lys Phe His Leu Leu Asp Gly
305                 310                 315                 320
Asp Lys Ile Ser Thr Leu Phe Ala Lys Phe Leu Ser Lys Gln Leu Glu
                325                 330                 335
Leu Ala His Leu Glu His Ser Leu Lys Ile Gly Val Val Gln Thr Ala
            340                 345                 350
Tyr Ala Asn Gly Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Lys Asn Thr Leu His Cys
        355                 360                 365
Pro Val Ser Cys Thr Lys Thr Gly Val Lys His Leu His His Glu Ala
    370                 375                 380
Ala Thr Gln Tyr Asp Ile Gly Ile Tyr Phe Glu Ala Asn Gly His Gly
385                 390                 395                 400
Thr Ile Ile Phe Ser Glu Lys Phe His Arg Thr Ile Lys Ser Glu Leu
                405                 410                 415
Ser Lys Ser Lys Leu Asn Gly Asp Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Lys
            420                 425                 430
Cys Phe Ser Glu Leu Ile Asn Gln Thr Val Gly Asp Ala Ile Ser Asp
        435                 440                 445
Met Leu Ala Val Leu Ala Thr Leu Ala Ile Leu Lys Met Ser Pro Met
    450                 455                 460
Asp Trp Asp Glu Glu Tyr Thr Asp Leu Pro Asn Lys Leu Val Lys Cys
465                 470                 475                 480
Ile Val Pro Asp Arg Ser Ile Phe Gln Thr Thr Asp Gln Glu Arg Lys
                485                 490                 495
Leu Leu Asn Pro Val Gly Leu Gln Asp Lys Ile Asp Leu Val Val Ala
            500                 505                 510
Lys Tyr Pro Met Gly Arg Ser Phe Val Arg Ala Ser Gly Thr Glu Asp
        515                 520                 525
Ala Val Arg Val Tyr Ala Glu Cys Lys Asp Ser Ser Lys Leu Gly Gln
    530                 535                 540
Phe Cys Asp Glu Val Val Glu His Val Lys Ala Ser Ala
545                 550                 555

Claims (10)

1.包含编码葡糖胺聚糖合酶的外来核酸分子的经遗传修饰的植物细胞，其中所述植物细胞还包含编码具有葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶活性的蛋白质的外来核酸分子以及编码具有单功能UDP-N-乙酰基-葡糖胺焦磷酸化酶活性的蛋白质的外来核酸分子。
2.包含权利要求1的经遗传修饰的植物细胞的植物。
3.权利要求2的植物的繁殖材料，其包含权利要求1的经遗传修饰的植物细胞。
4.权利要求2的植物的可收获植物部分，其包含权利要求1的经遗传修饰的植物细胞。
5.产生植物的方法，其包括：
a)遗传修饰植物细胞，其中所述遗传修饰包括下文的步骤i到iii
i)向植物细胞中引入编码具有葡糖胺聚糖合酶活性的蛋白质的核酸分子
ii)向植物细胞中引入编码具有葡糖胺6-磷酸乙酰转移酶活性的蛋白质的核酸分子
iii)向植物细胞中引入编码具有UDP-N-乙酰基-葡糖胺焦磷酸化酶单功能活性的蛋白质的核酸分子
b)从来自步骤a)i和/或a)ii和/或a)iii的植物细胞再生植物；
c)适当时，使用步骤b)的植物产生进一步的植物，
其中可以任何顺序进行步骤a)i到a)iii，或者可同时独立地进行步骤a)i到a)iii，或者同时进行步骤a)i到a)iii的任何组合，并且适当时，可向根据步骤b)或c)获得的植物的植物细胞中引入步骤a)i到a)iii的缺少的外来核酸分子。
6.用于产生葡糖胺聚糖的方法，其包括从权利要求1的经遗传修饰的植物细胞、权利要求2的植物、权利要求3的繁殖材料、权利要求4的可收获植物部分或通过权利要求5的方法获得的植物中提取葡糖胺聚糖的步骤。
7.权利要求1的经遗传修饰的植物细胞、权利要求2的植物、权利要求3的繁殖材料、权利要求4的可收获植物部分或通过权利要求5的方法获得的植物用于产生葡糖胺聚糖的用途。
8.包含权利要求1的经遗传修饰的植物细胞的组合物。
9.用于制备包含葡糖胺聚糖的组合物的方法，其包括使用权利要求1的经遗传修饰的植物细胞、权利要求2的植物、权利要求3的繁殖材料、权利要求4的可收获植物部分或通过权利要求5的方法获得的植物。
10.权利要求1的经遗传修饰的植物细胞、权利要求2的植物、权利要求3的繁殖材料、权利要求4的可收获植物部分或通过权利要求5的方法获得的植物用于制备权利要求8的组合物的用途。
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