CN101854956A - 包含超极化13c-醋酸盐的成像介质及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用包含超极化13C-醋酸盐的成像介质的13C-MR检测方法和包含超极化13C-醋酸盐的成像介质。

Description

包含超极化13C-醋酸盐的成像介质及其应用
本发明涉及使用包含超极化13C-醋酸盐的成像介质的13C-MR检测方法和包含超极化13C-醋酸盐的成像介质。
核磁共振(MR)成像(MRI)已经成为对内科医生特别有吸引力的技术，因为它以非侵入的方式获得患者身体或其部分的图像，并且不会使患者和医务人员暴露于可能有害的辐射例如X-射线中。由于其高质量的图像以及良好的空间和时间分辨率，MRI是用于软组织和器官成像的有利成像技术。
可以用或不用MR造影剂进行MRI。然而，对比度增强的MRI通常能够检测更小的组织改变，这使其成为检测早期组织改变例如小的肿瘤或转移的强大工具。
几种类型的造影剂已经用于MRI。水溶性的顺磁性金属螯合剂，例如，钆螯合物，如OmniscanTM(GE Healthcare)是广泛使用的MR造影剂。当施用于脉管系统中时，由于它们的低分子量，它们迅速分布于细胞外间隙(即血液和间质)。它们还可以相对快速地从体内清除。
另一方面，血池MR造影剂，例如超顺磁性氧化铁颗粒，在脉管系统中保持延长的时间。已经证明它们对提高肝脏中的对比度以及检测毛细血管渗透性异常是非常有用的，例如，肿瘤血管生成引起的肿瘤中“渗漏的”毛细血管壁。
WO-A-99/35508公开了采用高T1剂的超极化溶液作为MRI造影剂的MR研究患者的方法。术语“超极化”是指增强高T1剂中存在的NMR活性核的核极化，即具有非零核自旋的核，优选13C-或15N-核。增强NMR活性核的核极化时，这些核的激发核自旋状态和基态核自旋状态之间的粒子数差显著提高，从而使MR信号强度放大上百倍。当使用超极化13C-和/或15N-富集的高T1剂时，基本上没有背景信号的干扰，因为13C和/或15N的天然丰度是可以忽略的，因此图像对比度将有利地高。常规MRI造影剂和这些超极化高T1剂的主要差别是，前者的对比度变化是由影响体内水质子的驰豫时间引起的，而后类试剂可以被视为非放射性示踪剂，因为获得的信号由试剂单独引起。
WO-A-99/35508中公开了许多种可能的用作MR成像剂的高T1剂，包括非内源性和内源性化合物。作为例子，提到了正常代谢周期中后者的中间体，据说它们对成像代谢活性是优选的。通过代谢活性的体内成像，可以获得组织代谢状态的信息，所述信息可以用于例如辨别健康和疾病组织。
例如，丙酮酸盐是在柠檬酸循环中起作用的化合物，超极化13C-丙酮酸盐向其代谢物超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸的转化可以用于人体代谢过程的体内MR研究。如WO-A-2006/011810中详细描述，超极化13C-丙酮酸盐可以例如用作体内肿瘤成像的MR成像剂，如WO-A-2006/054903中详细描述，通过MR成像用于评价心肌组织的活力。
超极化13C-丙酮酸盐向其代谢物超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸的代谢转化可以用于人体代谢过程的体内MR研究，因为已经发现所述转化速度快到足以允许来自母体化合物即超极化13C1-丙酮酸盐及其代谢物的信号得以检测。丙氨酸、碳酸氢盐和乳酸盐的量取决于所研究组织的代谢状态。超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸的MR信号强度与这些化合物的量和检测时剩余的极化程度有关，因此通过监测超极化13C-丙酮酸盐向超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢和超极化13C-丙氨酸的转化，有可能通过使用非侵入性MR成像或MR光谱法研究人类或非人类动物体的体内代谢过程。
产生于不同丙酮酸盐代谢物的MR信号振幅根据组织类型而不同。丙氨酸、乳酸盐、碳酸氢盐和丙酮酸盐形成的独特代谢峰模式可以用作所检测组织的代谢状态的指纹图谱。
然而，适合作为体内成像剂的超极化13C-丙酮酸盐的生产并非没有挑战。如WO-A1-2006/011809中详细描述，超极化13C-丙酮酸盐优选通过动态核极化(DNP)13C-丙酮酸或13C-丙酮酸盐获得，其通过参考引入本文。
13C-丙酮酸的使用简化了极化方法，因为它在冷冻/冷却下不结晶(结晶导致低的动态核极化或完全不极化)。因此不需要溶剂和/或玻璃形成剂来制备用于DNP法的组合物并且因此可以使用高浓度的13C-丙酮酸样品。然而，由于其低pH，需要使用在强酸中稳定的DNP剂。此外，需要强碱来溶解固体超极化13C-丙酮酸并在极化后将其转化为超极化13C-丙酮酸盐。强的丙酮酸和强碱都需要仔细地选择化合物所接触的材料(例如溶解介质池、管道等)。
或者，13C-丙酮酸盐可以用于DNP法。遗憾的是，钠13C-丙酮酸盐在冷冻/冷却下会结晶，这使其需要添加玻璃形成剂。如果将超极化13C-丙酮酸盐用作体内成像剂，包含丙酮酸盐和玻璃形成剂的组合物中丙酮酸盐浓度不利地低的。而且，用于体内应用时玻璃形成剂也要被除去。
因此如WO-A-2007/111515中详细描述，可以用于DNP的优选的盐为包含无机阳离子的13C-丙酮酸盐，所述无机阳离子选自NH4 +、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+，优选NH4 +、K+、Rb+或Cs+，更优选K+、Rb+、Cs+并且最优选Cs+。这些盐的大多数不是商业可获得的，需要分别合成。此外，如果将超极化13C-丙酮酸盐用于体内MR成像，优选通过生理上很好耐受的阳离子例如Na+或葡甲胺交换选自NH4 +、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+的无机阳离子。因此，在固体超极化13C-丙酮酸盐溶解后，需要额外的步骤，在此期间极化会衰减。
其他优选的盐是有机胺或氨基化合物的13C-丙酮酸盐，优选TRIS-13C1-丙酮酸盐或葡甲胺-13C1-丙酮酸盐，如WO-A-2007/069909中详细描述。这些盐还需要分别合成。
因此需要可供选择的超极化成像剂，其可以用于获得有关代谢活性的信息。
我们现已发现超极化13C-醋酸盐可以用作这种成像剂。
13C-醋酸钠是商业可获得的化合物，其可以直接用于DNP，因为它在冷却/冷冻时不会结晶。由于这消除了对玻璃形成剂和/或样品中大量溶剂的需要，可以制备高浓度的样品并将其用于DNP法。还有，13C-醋酸钠样品只是弱碱性的，因此可以使用许多种DNP试剂。醋酸盐是可以很好耐受的内源性化合物，从安全性角度看使用超极化13C-醋酸盐作为成像剂是有利的。
与丙酮酸盐相比，醋酸盐可以用于了解不同于前者的代谢途径。因此，醋酸盐可以用于获得关于脂肪酸能量代谢的信息和用于研究糖酵解。该信息可以用于鉴定除使用丙酮酸盐可以鉴定的疾病之外的疾病状态。或者，可以将该信息与使用丙酮酸盐获得的信息组合，从而帮助早期和/或更准确地鉴定疾病。
因此，在第一方面，本发明提供使用包含超极化13C-醋酸盐的成像介质的13C-MR检测方法，其中检测13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的信号。
术语“检测13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的信号”是指在本发明的方法中，仅检测13C-乙酰肉毒碱的信号，或者检测13C-乙酰肉毒碱和13C-乙酰基-CoA的信号，或者检测13C-乙酰肉毒碱和13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的信号。
术语“13C-MR检测”表示13C-MR成像或13C-MR光谱法或联合13C-MR成像和13C-MR光谱法，即13C-MR光谱成像。该术语还表示不同时间点的13C-MR光谱成像。
术语“成像介质”表示包含超极化13C-醋酸盐作为MR活性剂(即成像剂)的液体组合物。
本发明方法中所用的成像介质可以用作体内13C-MR检测的成像介质，即，在有生命的人类或非人类动物中。此外，本发明方法中所用的成像介质可以用作体外13C-MR检测的成像介质，例如，细胞培养物，例如尿液、唾液或血液的样品，离体组织，例如由活检或离体器官获得离体组织，所有这些来源于有生命的人类或非人类动物体。
术语“13C-醋酸盐”表示同位素富集13C-的13C-醋酸的盐，即，其中13C同位素的量大于其天然丰度。除非另外指明，术语“13C-醋酸盐”和“13C-醋酸”表示在分子中任意两个碳原子上，即，在C1-位和/或C2-位13C-富集的化合物。
本发明方法中所用的超极化13C-醋酸盐的同位素富集优选至少75％，更优选至少80％，特别优选至少90％，最优选超过90％的同位素富集。理想地，富集是100％。本发明方法中所用的13C-醋酸盐可以是在C1-位(下文称为13C1-醋酸盐)、在C2-位(下文称为13C2-醋酸盐)或在C1-和C2-位(下文称为13C1，2-醋酸盐)同位素富集的。在C1-位或在C1-和C2-位同位素富集是优选的，在C1-位同位素富集是最优选的。
此外，氘代13C-醋酸盐可以用于本发明的方法，即13C-醋酸盐中的一个或多个氢原子可以被氘原子交换。在优选的实施方案中，13C1-醋酸盐-d3用于本发明的方法，即13C1-醋酸盐中甲基的所有三个氢原子被氘原子交换。
在优选的实施方案中，本发明的成像介质包含超极化13C1-醋酸盐或13C1-醋酸盐-d3。
术语“13C-乙酰肉毒碱”表示同位素富集13C的3-乙酰氧基-4-三甲基胺基丁酸盐，即其中13C的量大于其天然丰度。除非另外指明，术语“13C-乙酰肉毒碱”表示在乙酰氧基的任意两个碳原子上，即在甲基上或如果本发明方法中使用氘代13C1-醋酸盐在氘代甲基上，和/或所述乙酰氧基的羰基上13C-富集的化合物。
术语“13C-乙酰基-CoA”表示同位素富集13C的辅酶A和醋酸的硫酯，即其中13C的量大于其天然丰度。除非另外指明，术语“13C-乙酰基-CoA”表示在乙酰基的任意两个碳原子上，即在甲基上，或如果本发明方法中使用氘代13C1-醋酸盐在氘代甲基上，和/或所述乙酰基的羰基上13C-富集的化合物。
在下文中术语“超极化”和“极化的”可以互换使用，表示核极化水平超过0.1％，更优选超过1％，最优选超过10％。
可以在固体超极化13C-醋酸盐中通过例如固态13C-NMR测量法测定极化水平，所述固体超极化13C-醋酸盐例如通过动态核极化(DNP)13C-醋酸盐获得的固体超极化13C-醋酸盐。固态13C-NMR测量法优选包括使用低反转角的单一脉冲捕获NMR序列。将NMR光谱中超极化13C-醋酸盐的信号强度与极化处理前获得的NMR光谱中的13C-醋酸盐的信号强度进行比较。然后由极化前后信号强度的比值计算极化水平。
以类似的方式，可以通过液态MR测量法测定溶解的超极化13C-醋酸盐的极化水平。再将溶解的超极化13C-醋酸盐的信号强度与极化前溶解的13C-醋酸盐的信号强度进行比较。然后由极化前后13C-醋酸盐信号强度的比值计算极化水平。
NMR活性13C-核的超极化可以通过不同方法实现，例如WO-A-98/30918、WO-A-99/24080和WO-A-99/35508中描述的方法，其都通过参考引入本文，本领域已知的超极化方法是从惰性气体的极化转移、“暴力式(brute force)”、自旋冷冻、仲氢法和动态核极化(DNP)。
为了获得超极化13C-醋酸盐，优选直接极化13C-醋酸盐。还可以极化13C-醋酸，但是极化13C-醋酸必须随后转化为极化13C-醋酸盐，例如，通过使用碱中和的额外步骤，因此该实施方案是不太优选的。13C-醋酸盐，例如，13C-醋酸钠是商业可获得的。13C-醋酸也是商业可获得的；它也可以通过质子化商业可获得的13C-醋酸盐，例如13C-醋酸钠而获得。
获得超极化13C-醋酸盐的一种方法是WO-A-98/30918中描述的由超极化惰性气体的极化转移。可以通过使用循环极化光超极化具有非零核自旋的惰性气体。超极化惰性气体，优选He或Xe，或者这种气体的混合物，可以用于影响超极化13C-核。超极化气体可以是气相，它可以溶解于液体/溶剂中，或者超极化气体自身可以用作溶剂。或者，该气体可以冷凝于冷却的固体表面并以该形式使用，或者使其升华。优选将超极化气体与13C-醋酸盐或13C-醋酸充分混合。
获得超极化13C-醋酸盐的另一方法是在非常低的温度下并且在高场中，通过热力学平衡使13C-核极化。与操作场和NMR光谱仪的温度相比，通过使用非常高的场和非常低的温度(暴力式)实现超极化。所用的磁场强度应尽可能地高，适当地高于1T，优选高于5T，更优选15T或更高，特别优选20T或更高。温度应当非常低，例如4.2K或更低，优选1.5K或更低，更优选1.0K或更低，特别优选100mK或更低。
获得超极化13C-醋酸盐的另一方法是自旋冷冻法。该方法包括通过自旋冷冻极化使固体化合物或系统的自旋极化。该系统掺有或充分混合有合适的晶体顺磁材料，例如Ni2+、镧系元素或锕系元素离子，具有大约三个或更多的对称轴。仪器比DNP所需的仪器简单，不需要均匀的磁场，因为不使用共振激发场。通过将样品围绕垂直于磁场方向的轴物理旋转实现该方法。该方法的先决条件是顺磁物质具有高的各向异性g-因子。作为样品旋转的结果，电子顺磁共振将与核自旋接触，导致核自旋温度降低。进行样品旋转，直到核自旋达到新的平衡。
在优选的实施方案中，DNP(动态核极化)用于获得超极化13C-醋酸盐。在DNP中，极化化合物中MR活性核的极化受到极化剂或所谓的DNP剂、包含未成对电子的化合物的影响。在DNP法中，能量，通常以微波辐射的形式提供，其在初期引发DNP剂。在衰减到基态后，极化从DNP剂未成对的电子转移至极化化合物的NMR活性核上，例如13C-醋酸盐中的13C-核。通常，在DNP法中使用中等或高磁场和非常低的温度，例如，通过在液态氦和大约1T或更高的磁场中实施DNP法。或者，可以使用中磁场和任何可以获得足够的极化增强的温度。DNP技术例如还描述于WO-A-98/58272和WO-A-01/96895，两篇都通过参考引入本文。
为了通过DNP法极化化学体即化合物，制备极化化合物与DNP剂的组合物，然后组合物任选被冷冻并插入DNP极化剂中(如果它没有被冷冻，它将会冻结)用于极化。在极化后，通过熔化或在合适的溶解介质中溶解使冷冻的固体超极化组合物快速转变为液态。溶解是优选的，冷冻的超极化组合物的溶解方法及其合适的装置详细描述于WO-A-02/37132中。熔化方法和合适的融化装置例如描述于WO-A-02/36005中。
为了获得极化化合物中的高极化水平，所述化合物和DNP剂在DNP处理中需要充分接触。如果组合物在冷冻或冷却时结晶，情况就并非如此。为了避免结晶，玻璃形成剂需要存在于组合物中或者需要选择用于极化的化合物，其在冷冻时不会结晶而是形成玻璃。
在一个实施方案中，13C-醋酸，优选13C1-醋酸或13C1-醋酸-d3(醋酸-1-13C，2，2，2-d3)用作起始物质通过DNP法来获得超极化13C-醋酸盐。
在优选的实施方案中，13C-醋酸盐，优选13C1-醋酸盐或13C1-醋酸盐-d3用作起始物质通过DNP法来获得超极化13C-醋酸盐。合适的13C-醋酸盐是13C-醋酸钠和13C-醋酸盐，其包含选自的NH4 +、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+的无机阳离子。后种盐详细描述于WO-A-2007/111515中，其通过参考引入本文。或者，可以使用无机胺或氨基化合物的13C-醋酸盐，优选TRIS-13C-醋酸盐或葡甲胺-13C-醋酸盐。这些盐详细描述于WO-A-2007/069909中，其通过参考引入本文。在最优选的实施方案中，任选氘代TRIS-13C-醋酸盐或任选氘代13C-醋酸钠以及更优选TRIS-13C1-醋酸盐、TRIS-13C1-醋酸盐-d3、13C1-醋酸钠或13C1-醋酸钠-d3用作起始物质通过DNP法来获得超极化13C-醋酸盐。
术语“TRIS”表示2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，术语“TRIS-13C-醋酸盐”表示包含13C-醋酸盐作为阴离子和TRIS作为阳离子的盐，所述TRIS阳离子即TRIS铵(2-羟甲基-1，3-丙二酰铵)。
为了通过DNP法超极化13C-醋酸盐，制备包含13C-醋酸盐或13C-醋酸和DNP剂的组合物。
DNP剂在DNP处理中起决定性作用，因为其选择对13C-醋酸盐中可获得的极化水平具有重要影响。许多种DNP剂-在WO-A-99/35508中称为“OMRI造影剂”-是已知的。如WO-A-99/35508、WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711或WO-A-96/39367中描述的氧基、硫基或碳基稳定的三苯甲基自由基的使用在许多种不同样品中引起高水平的极化。
在优选的实施方案中，通过DNP获得本发明方法中所用的超极化13C-醋酸盐，所用的DNP剂为三苯甲基自由基。如上文简述，通过接近电子拉莫频率的微波辐射，DNP剂即三苯甲基自由基的大电子自旋极化转化为13C-醋酸盐或13C-醋酸中13C核的核极化自旋。微波通过e-e和e-n跃迁刺激电子和核自旋系统间的联系。为了有效的DNP，即为了实现13C-醋酸盐或13C-醋酸中高水平的极化，三苯甲基自由基在这些化合物中必须是稳定和可溶的，以便实现所述的13C-醋酸盐或13C-醋酸与三苯甲基自由基间的充分接触，这对上述电子和核自旋系统间的联系是必要的。
在优选的实施方案中，三苯甲基自由基是式(1)自由基：
Figure GPA00001037859300081
其中
M表示氢或一价阳离子；和
R1相同或不同，表示任选被一个或多个羟基取代的直链或支链的C1-C6-烷基或-(CH2)n-X-R2基团，
其中n为1、2或3；
X为O或S；以及
R2为任选被一个或多个羟基取代的直链或支链的C1-C4-烷基。
在优选的实施方案中，M表示氢或一价生理上耐受的阳离子。术语“生理上耐受的阳离子”表示人类或非人类动物活体可以耐受的阳离子。优选地，M表示氢或碱金属阳离子，铵离子或有机胺离子，例如葡甲胺。最优选地，M表示氢或钠。
如果13C-醋酸盐用作起始物质通过DNP法来获得超极化13C-醋酸盐，R1优选相同，更优选直链或支链的C1-C4-烷基，最优选甲基、乙基或异丙基；或者R1优选相同，更优选被一个羟基取代的直链或支链的C1-C4-烷基，最优选-CH2-CH2-OH；或者R1优选相同，表示-CH2-OC2H4OH。
如果13C-醋酸用作起始物质通过DNP法来获得超极化13C-醋酸盐，R1相同或不同，优选相同，并且优选表示-CH2-OCH3、-CH2-OC2H5、-CH2-CH2-OCH3、-CH2-SCH3、-CH2-SC2H5或-CH2-CH2-SCH3，最优选-CH2-CH2-OCH3。
可以如WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711、WO-A-96/39367、WO-A-97/09633、WO-A-98/39277和WO-A-2006/011811中详细描述的合成上述式(1)的三苯甲基自由基。
对于DNP方法，制备起始物质即13C-醋酸或13C-醋酸盐(下文称为“样品”)和DNP剂的溶液，DNP剂优选三苯甲基自由基，更优选式(1)的三苯甲基自由基。溶剂或溶剂混合物可以用于促进DNP剂在样品中的溶解。然而，如果将超极化13C-醋酸盐用作体内13C-MR检测的成像剂，优选保持溶剂的量为最小，或者如果可能避免使用溶剂。为了用作体内成像剂，通常以相对高的浓度施用极化13C-醋酸盐，即在DNP方法中优选使用高浓缩的样品，因此优选保持溶剂的量为最小。在这种情况下，同样重要的是指出使包含样品，即DNP剂，样品和必要的溶剂的组合物的质量尽可能的小。如果使用溶解将DNP处理后的包含超极化13C-醋酸和13C-醋酸盐的固体组合物转化为液态，例如将其用作13C-MR检测的成像剂，高质量对溶解过程的效率具有不利的影响。这是由于对于溶解过程中给定体积的溶解介质，当组合物的质量增加时，组合物与溶解介质的质量比降低。此外，在将用作MR成像剂的超极化13C-醋酸盐施用于人类或非人类动物前，使用某些溶剂可能需要除去它们，因为它们可能不是生理上耐受的。
如果13C-醋酸用作起始物质通过DNP来获得超极化13C-醋酸盐，制备DNP剂的13C-醋酸溶液，所述DNP剂优选三苯甲基自由基，更优选式(1)的三苯甲基自由基。13C-醋酸在室温下是液体，优选将DNP剂溶解于所述液体中。由于13C-醋酸在冷冻时会结晶，加入少量的玻璃形成剂，优选甘油。可以通过几种本领域已知的方式促进化合物的充分混合，例如搅拌、涡旋(旋转混合)或超声和/或轻微加热。
如果室温下为固体的13C-醋酸盐用作起始物质通过DNP来获得超极化13C-醋酸盐，需要加入溶剂来制备DNP剂和13C-醋酸盐的溶液。优选水性溶剂并且最优选水用作溶剂。在一个实施方案中，溶解DNP剂，随后将13C-醋酸盐溶解于溶解的DNP剂中。如果使用包含无机阳离子的13C-醋酸盐和有机胺或氨基化合物的13C-醋酸盐，该实施方案是优选的，所述无机阳离子选自NH4 +、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+。在另一个实施方案中，将13C-醋酸盐溶解于溶剂中，随后加入DNP剂(干化合物或溶液中)并将其溶解于溶解的13C-醋酸盐中。当使用13C-醋酸钠时，该实施方案是优选的。在更优选的实施方案中，将13C-醋酸钠溶解于水中，轻微加热该溶液。得到相对高粘度的超饱和溶液，该溶液在冷却/冷冻时不结晶。如果使用上述13C-醋酸盐，即13C-醋酸钠，包含无机阳离子的13C-醋酸盐以及有机胺或氨基化合物的13C-醋酸盐，所述无机阳离子选自NH4 +、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+，不需要加入玻璃形成剂，因为包含这些13C-醋酸盐的组合物在冷却/冷冻时不结晶。还可以通过几种本领域已知的方式促进化合物的充分混合，例如搅拌、涡旋或超声和/或轻微加热。
如果通过DNP获得本发明方法中所用的超极化13C-醋酸盐，包含13C-醋酸或13C-醋酸盐和DNP剂的极化组合物还可以包含顺磁金属离子。现已发现顺磁金属离子的存在可以导致要通过DNP所极化的化合物中增加的极化水平，如WO-A2-2007/064226中详细描述，其通过参考引入本文。
术语“顺磁金属离子”表示盐形式或螯合形式的顺磁金属离子，即顺磁螯合物。后者是包含螯合剂和顺磁金属离子的化学体，其中所述顺磁金属离子和所述螯合剂形成复合物，即顺磁螯合物。
在优选的实施方案中，顺磁金属离子为包含Gd3+的盐或顺磁螯合物，优选包含Gd3+的顺磁螯合物。在更优选的实施方案中，所述顺磁金属离子在所极化的组合物中是可溶和稳定的。
如果使用前面描述的DNP剂，所极化的13C-醋酸或13C-醋酸盐也必须与顺磁金属离子充分接触。用于DNP的包含13C-醋酸或13C-醋酸盐、DNP剂和顺磁金属离子的组合物可以以多种方式获得。在第一个实施方案中，将13C-醋酸盐溶解于合适的溶剂中得到溶液；或者，使用前文所述的液态13C-醋酸。向13C-醋酸盐的该溶液或液态13C-醋酸中加入DNP剂并使其溶解。DNP剂，优选优选三苯甲基自由基，可以作为固体或以溶液形式添加，优选作为固体。在随后的步骤中，加入顺磁金属离子。顺磁金属离子可以作为固体或以溶液形式添加，优选作为固体。在另一个实施方案中，将DNP剂和顺磁金属离子溶解于合适的溶剂或溶剂(solvents)中，向该溶液中加入13C-醋酸或13C-醋酸盐。在另一个实施方案中，将DNP剂(或顺磁金属离子)溶解于合适的溶剂中并加入到13C-醋酸或13C-醋酸盐中。在随后的步骤中向该溶液中加入固体或溶液形式的顺磁金属离子(或DNP剂)，优选作为固体。优选地，使用于溶解顺磁金属离子(或DNP剂)的溶剂的量保持最小。还可以通过几种本领域已知的方式促进化合物的充分混合，例如搅拌、涡旋或超声和/或轻微加热。
如果使用三苯甲基自由基作为DNP剂，这类三苯甲基自由基在用于DNP的组合物中合适的浓度为1-25mM，优选2-20mM，更优选10-15mM。如果向组合物中添加顺磁金属离子，这类顺磁金属离子在组合物中合适的浓度为0.1-6mM(金属离子)，并且浓度为0.5-4mM是优选的。
在制备包含13C-醋酸或13C-醋酸盐、DNP剂和任选的顺磁金属离子的组合物后，通过本领域已知的方法冷冻所述组合物，例如在冷冻器中、在液氮中冷冻它，或者简单地将其置于DNP极化器中，其中液氦将使其冷冻。在另一个实施方案中，在将组合物插入极化器前将其冷冻为“珠子”。这类珠子可以通过向液氮中逐滴加入组合物获得。已经观察到这类珠子更有效的溶解，如果极化较大量的13C-醋酸或13C-醋酸盐，例如在体内13C-MR检测法中使用极化13C-醋酸盐时，这是特别相关的。
如果顺磁金属离子存在于组合物中，可以在冷冻前将所述组合物除气，例如通过将氦气鼓泡通入该溶液中(例如2-15分钟的时间)，但可以通过其他已知的常规方法实现除气。
DNP技术例如描述于WO-A-98/58272和WO-A-01/96895中，其都通过参考并入本文。通常，在DNP法中使用中等或高磁场和非常低的温度，例如，在液氦和大约1T或更大的磁场中实施DNP法。或者，可以使用中等磁场和任何获得足够的极化增强的温度。在优选的实施方案中，在液氦和大约1T或更大的磁场中实施DNP法。合适的极化装置例如描述于WO-A-02/37132中。在优选的实施方案中，极化装置包括低温恒温器和极化设备，例如，通过波导管连接微波源的微波室，所述微波源位于被磁场产生装置例如超导磁体环绕的中心孔中。孔垂直向下延伸到至少接近超导磁体的P区水平，其中磁场强度足够高，例如1-25T，足以使样品核发生极化。探针的孔(即，所极化的冷冻溶液)优选是可密封的并且可以抽空至低压，例如1毫巴或更小数量级的压力。探针引入工具例如可移动的传送管可以包含于孔内，可以将该管从孔的顶部向下插入至微波室内P区的位置。通过液氦将P区冷却至低到足以发生极化的温度，优选0.1-100K，更优选0.5-10K，最优选1-5K数量级的温度。探针引入工具优选可在其上端以任何合适的方式密封以保持孔内部分真空。探针保留容器，例如探针保留杯，可以可拆卸地安装于探针引入工具的下端内。探针保留容器优选由轻质材料制备，所述材料具有低的比热容和良好的低温特性，例如，KelF(聚氯三氟乙烯)或PEEK(聚醚醚酮)，并且可以以能够容纳一个以上探针的方式设计探针保留容器。
将探针插入探针保留容器中，浸入液氦中并使用微波辐射。可以由DNP剂的EPR系测定微波频率，其取决于28.0GHz/T磁体的磁场。可以通过调整最大NMR信号的频率测定最佳微波频率。优选地，最佳微波频率为3.35T磁体大约94GHz，4T磁体大约110GHz，5T磁体大约140GHz以及7T磁体大约200GHz。功率可以在50-200mW之间选择，取决于探针体积。可以如前文所述在微波辐射期间通过例如获得探针的固态13C-NMR信号来监测极化水平。通常，在显示NMR信号对时间的图中获得饱和曲线。因此有可能测定何时达到最佳极化水平。固态13C-NMR测定法适当地包括使用低反转角的单一脉冲捕获NMR序列。将动态核极化的核即13C-醋酸或13C-醋酸盐中的13C核的信号强度与DNP前的13C-醋酸或13C-醋酸盐中的13C核的信号强度进行比较。然后由DNP前后信号强度的比值计算极化水平。
在DNP处理后，包含超极化13C-醋酸或13C-醋酸盐的固体组合物由固态转化为液态，即液化。这可以通过溶解于合适的溶剂或溶剂混合物(溶解介质)中或通过熔化固体组合物而实现。溶解是优选的，溶解方法及其合适的装置详细描述于WO-A-02/37132中。熔化方法和用于熔化的合适装置例如描述于WO-A-02/36005中。简言之，使用溶解装置/熔化装置，所述溶解装置/熔化装置是与极化器物理分离的或是作为包含极化器和溶解装置/熔化装置的仪器的一部分。在优选的实施方案中，在升高的磁场中实施溶解/熔化，例如在极化器中，以改善驰豫并保持超最大的极化。尽管以上的测量，应当避免场节点，低场可能导致升高的驰豫。
如果13C-醋酸盐用作动态核极化的起始物质并且如果通过溶解液化包含超极化13C-醋酸盐的固体组合物，水性载体，优选生理上耐受的和药学上可接受的水性载体例如水，缓冲液或盐水合适地用作溶剂，特别优选如果将超极化13C-醋酸盐用于体内13C-MR检测的成像介质中。对于体外应用，还可以使用非水性溶剂或溶剂混合物，例如DMSO或甲醇或包含水性载体和非水性溶剂的混合物，例如DMSO和水或甲醇和水的混合物。
如果13C-醋酸用作动态核极化的起始物质，获得的超极化13C-醋酸必须转化为13C-醋酸盐。如果通过溶解液化包含超极化13C-醋酸的固体组合物，溶解介质优选为水性载体，例如，水或缓冲液，优选生理上耐受的缓冲液或其包含水性载体，例如水或缓冲液，优选生理上耐受的缓冲液。下文所用的术语“缓冲液”或“缓冲剂”可以互换使用。在本申请的上下文中，“缓冲剂”表示一种或多种缓冲剂，即，缓冲剂的混合物。
优选的缓冲剂是生理上耐受的缓冲剂，更优选在pH 7至8范围内缓冲的缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂(KH2PO4/Na2HPO4)、ACES、PIPES、咪唑/HCl、BES、MOPS、HEPES、TES、TRIS、HEPPS或TRICIN。
为了将超极化13C-醋酸转化为超极化13C-醋酸盐，通常将13C-醋酸与及碱反应。在一个实施方案中，将13C-醋酸与碱反应以使其转化为13C-醋酸盐并且随后加入水性载体。在另一优选的实施方案中，水性载体和碱混合于一种溶液中，将该溶液加入13C-醋酸，使其溶解并同时将其转化为13C-醋酸盐。在优选的实施方案中，碱是NaOH、Na2CO3或NaHCO3的水溶液，最优选的碱是NaOH。
在另一个优选的实施方案中，水性载体缓冲剂或-如果适用-混合的水性载体/碱溶液还包含一种或多种化合物，所述化合物能够结合或络合游离的顺磁离子，例如螯合剂，例如DTPA或EDTA。
如果通过DNP法实施超极化，DNP剂，优选三苯甲基自由基和任选的顺磁金属离子可以从包含超极化13C-醋酸盐的液体中除去。如果将超极化13C-醋酸盐用于体内应用的成像介质中，除去这些化合物是优选的。如果13C-醋酸为DNP的起始物质，优选首先将超极化13C-醋酸转化为13C-醋酸盐，在所述转化发生后除去DNP剂和任选的顺磁金属离子。
用于除去三苯甲基自由基和顺磁金属离子的方法是本领域已知的，并且详细描述于WO-A2-2007/064226和WO-A1-2006/011809中。
在优选的实施方案中，本发明方法中所用的超极化13C-醋酸盐通过动态核极化组合物获得，所述组合物包含TRIS-13C-醋酸盐或13C-醋酸钠，更优选TRIS-13C1-醋酸盐、TRIS-13C1-醋酸盐-d3、13C1-醋酸钠或13C1-醋酸钠-d3，式(1)的三苯甲基自由基和任选的包含Gd3+的顺磁螯合物。在该优选的实施方案中，制备三苯甲基自由基和包含Gd3+的顺磁螯合物(如果使用)的溶液。将溶解的三苯甲基自由基和任选的溶解的顺磁螯合物添加到13C-醋酸钠或TRIS-13C-醋酸盐中，超声或旋转混合和轻微加热该组合物以促进所有组分的充分混合。
本发明方法的成像介质可以用作体外13C-MR检测的成像介质，例如细胞培养物、样品、离体组织或来源于人类或非人类动物体的离体器官的13C-MR检测。为此目的，成像介质作为组合物提供，所述组合物适合于添加到，例如，细胞培养物，例如尿、血或唾液的样品，例如活检组织的离体组织或离体器官中。除了成像剂即超极化13C-醋酸盐之外，这类成像介质优选包括与体外细胞或组织测定相容并且用于体外细胞或组织测定的溶剂，例如DMSO或甲醇，或包含水性载体和非水性溶剂的溶剂混合物，例如DMSO和水或缓冲液或甲醇和水或缓冲液的溶液。对本领域技术人员显而易见的是，药学可接受的载体、辅料和制剂助剂可以存在于这类成像介质中，但并不为此目的而需要它们。
此外，本发明方法的成像介质可以用作体内13C-MR检测的成像介质，即在有生命的人类或非人类动物中实施的13C-MR检测。为此目的，成像介质需要适合施用于有生命的人体或非人类动物体。因此，除了成像剂即超极化13C-醋酸盐之外，这类成像介质优选包括水性载体，优选生理可耐受并且药学可接受的水性载体例如水，缓冲液或盐水。这类成像介质还可以包括常规的药学或兽药载体或辅料，例如制剂助剂，例如稳定剂、渗透压调节剂、增溶剂等，这些对人或兽医药物中的诊断组合物是常规的。
如果本发明方法中所用的成像介质用于体内13C-MR检测，即在有生命的人类或非人类动物体中，所述成像介质优选经肠道外施用于所述主体，优选静脉内。通常，将检测的主体置于MR磁铁中。放置专用13C-MR RF线圈来覆盖目标部位。成像介质的精确剂量和浓度取决于一系列因素，例如毒性和给药途径。通常，成像介质的给药浓度高达1mmol醋酸盐每kg体重，优选0.01-0.5mmol/kg，更优选0.1-0.3mmol/kg。在给药后低于400s，优选低于120s，更优选给药后低于60s，特别优选20-50s，应用以组合频率和空间选择方式编码目标体积的MR成像序列。应用MR序列的精确时间高度取决于目标体积和物种体积。
在本发明的方法中，检测13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的信号。在优选的实施方案中，检测13C-乙酰肉毒碱和13C-乙酰基-CoA的信号。
对于13C1-醋酸盐，醋酸盐向乙酰基-CoA和乙酰肉毒碱的代谢转化显示于方案1中；*表示13C-标记物：在乙酰基CoA生成酶(ACS，EC6.2.1.1)催化的反应中13C-醋酸盐与辅酶A反应形成13C-乙酰基-CoA。
在肉毒碱乙酰转移酶(CAT，EC 2.3.1.7)催化的反应中，13C-乙酰基-CoA随后与肉毒碱反应形成13C-乙酰肉毒碱和辅酶A。
Figure GPA00001037859300151
方案1.
本发明上下文中的术语“信号”是指MR信号振幅或积分或13C-MR光谱中的峰面积或峰噪音，其表示13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐。在优选的实施方案中，信号是峰面积。
在本发明方法的优选实施方案中，13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的上述信号用于生成有生命的人类或非人类动物的代谢分布图。所述代谢分布图可以来源于整个身体，例如通过整个身体的体内13C-MR检测获得。或者，所述代谢分布图由目标区域或体积生成，即某些组织、器官或所述人类或非人类动物体的一部分。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的上述信号用于生成细胞培养物中的细胞、例如尿、血或唾液的样品、例如活检组织的离体组织或来自人类或非人类动物的离体器官的代谢分布图。随后通过体外13C-MR检测生成所述代谢分布图。
因此，在优选的实施方案中，提供使用包含超极化13C-醋酸盐的成像介质和检测13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐信号的13C-MR检测方法，其中所述信号用于生成代谢分布图。
在优选的实施方案中，13C-乙酰肉毒碱和13C-乙酰基-CoA的信号用于生成所述代谢分布图。
在一个实施方案中，13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的光谱信号强度用于生成代谢分布图。在另一个实施方案中，13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的光谱信号积分用于生成代谢分布图。在另一个实施方案中，13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的分离图像的信号强度用于生成代谢分布图。在另一个实施方案中，在两个或多个时间点获得13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的信号强度来计算13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的改变率。
在另一个实施方案中，代谢分布图包括处理的13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的信号数据或使用该信号数据生成，例如，信号的比值、校正的信号、或由多重MR检测的信号模式推导得到的动态或代谢率常数信息，即光谱或图像。因此，在优选的实施方案中，校正的13C-乙酰肉毒碱信号，即13C-乙酰肉毒碱对13C-醋酸盐信号或13C-乙酰肉毒碱信号对13C-乙酰基-CoA信号包含于或用于生成代谢分布图。在优选的实施方案中，校正的13C-乙酰肉毒碱对总13C-碳信号包含于或用于生成代谢分布图，总13C-碳信号为13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的信号的总和。在更优选的实施方案中，13C-乙酰肉毒碱与13C-乙酰基-CoA的比值包含于或用于生成代谢分布图。
根据本发明方法的优选实施方案中生成的代谢分布图提供有关所检测的身体、身体的部分、细胞、组织、身体样品等代谢活性的信息，所述信息可以用于随后的步骤中，例如用于鉴定疾病。
这类疾病可以是肿瘤，因为肿瘤组织通常特征为比健康组织更高的代谢活性。通过将肿瘤或肿瘤的离体样品的代谢分布图与健康组织(例如外周组织或健康离体组织)的代谢分布图进行比较可以明显看出这种更高的代谢活性，在代谢分布图中通过13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA的高信号或高校正的13C-乙酰肉毒碱信号或13C-乙酰肉毒碱与13C-乙酰基-CoA或13C-醋酸盐的高比值或总碳或13C-乙酰肉毒碱叠加的高代谢率可以表现出来。
其他疾病可以是心脏局部缺血，因为局部缺血的心肌组织通常特征为比健康心肌组织更低的代谢活性。以如上段所述的相似方式通过将局部缺血的心肌组织的代谢分布图与健康心肌组织的代谢分布图进行比较可以明显看出这种更低的代谢活性。
其他疾病可以是阿尔茨海默氏病或其他大脑和/或与大脑功能、认知和/或记忆相关的疾病和障碍，因为13C-乙酰肉毒碱在这些疾病或障碍中起到增强的中枢代谢作用的。可以预期通过本发明方法获得的受到这些疾病影响的大脑或其部分的代谢分布图不同于健康大脑或其部分的代谢分布图，这些疾病或障碍在代谢分布图中通过13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA的高信号或高校正的13C-乙酰肉毒碱信号或13C-乙酰肉毒碱与13C-乙酰基-CoA或13C-醋酸盐的高比值或总碳或13C-乙酰肉毒碱叠加的高代谢率表现出来。
其他疾病可以是糖尿病，因为在醋酸盐代谢中一种重要的酶，肉毒碱乙酰转移酶，在脂肪酸氧化中起到决定性作用，并且是开发抗糖尿病和抗肥胖药物的有前景的靶点。合适地，肝脏是选择生成根据本发明方法的代谢分布图以鉴定糖尿病的器官。该疾病在所述代谢分布图中通过13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA的高信号或高校正的13C-乙酰肉毒碱信号或13C-乙酰肉毒碱与13C-乙酰基-CoA或13C-醋酸盐的高比值或总碳或13C-乙酰肉毒碱叠加的高代谢率表现出来。
其他疾病可以是肝脏相关疾病，例如肝纤维化或肝硬化。在这些疾病中特征为升高量的酯化肉毒碱，并且因此患病肝脏的代谢分布图会显示出13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA的高信号或高校正的13C-乙酰肉毒碱信号或13C-乙酰肉毒碱与13C-乙酰基-CoA或13C-醋酸盐的高比值或总碳或13C-乙酰肉毒碱叠加的高代谢率。
解剖和/或-如果适用-灌注信息可以包含于本发明的方法中用于鉴定疾病。解剖信息可以例如在本发明方法前后使用或不使用合适的造影剂通过获取质子或13C-MR图像而获得。
如果疾病是心脏局部缺血，通过使用MR造影剂例如OmniscanTM可以测定心肌中的相对灌注。同样，用于灌注测定的不施用造影剂的MR成像技术是本领域已知的。在优选的实施方案中，非代谢超极化13C-造影剂用于测定定量灌注。合适的技术和造影剂例如描述于WO-A-02/23209中。
在另一个优选的实施方案中，重复施用包含超极化13C-醋酸盐的成像介质，从而允许动态研究。与其他使用常规的-在较高剂量下-可能显示毒性作用的MR造影剂的MR检测方法相比，这是本发明的方法的其他优势。由于醋酸盐的低毒性和其有利的安全性质，该化合物的重复剂量可以被患者很好地耐受。
如上所述，代谢分布图提供有关检测的身体、身体的部分、细胞、组织、身体样品等代谢活性的信息，所述信息可以用于随后的步骤中，例如用于鉴定疾病。然而，内科医生也可以将该信息用于其他步骤中来选择对所检查的患者合适的治疗。
此外，所述信息可以用于监测上述疾病的治疗反应，例如治疗成功，其灵敏度使得该方法特别适合于监测早期治疗反应，即在治疗开始后不久对治疗的反应。
在另一个实施方案中，本发明的方法可以用于评价药物的功效。在所述实施方案中，在药物筛选的非常早期可以测试用于治疗某种疾病的可能的药物，例如在所述某种疾病相关模型的体外细胞培养物中，或在患病离体组织中，或在患病的离体器官中。或者，在体内药物筛选的早期可以测试用于治疗某种疾病的可能的药物，例如在所述某种疾病相关动物模型中。通过比较所述细胞培养物、离体组织或离体或测试动物在使用可能的药物治疗前后的代谢分布图，可以测定所述药物的功效和治疗反应和成功，这显然在筛选可能的药物中提供有价值的信息。
本发明的另一方面是包含13C1-醋酸钠、13C1-醋酸钠-d3、TRIS-13C1-醋酸盐-d3、13C1-醋酸或13C1-醋酸-d3、三苯甲基自由基和任选的顺磁金属离子的组合物。
在第一个实施方案中，所述组合物包含13C1-醋酸钠或13C1-醋酸钠-d3或TRIS-13C1-醋酸盐-d3，三苯甲基自由基和任选的顺磁金属离子。在优选的实施方案中，所述三苯甲基自由基是式(1)的三苯甲基自由基，其中M表示氢或钠，R1优选相同，更优选直链或支链的C1-C4-烷基，最优选甲基、乙基或异丙基；或者R1优选相同，更优选被一个羟基取代的直链或支链的C1-C4-烷基，最优选-CH2-CH2-OH；或者R1优选相同并且表示-CH2-OC2H4OH。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含顺磁金属离子，优选包含Gd3+的盐或顺磁螯合物，更优选包含Gd3+的顺磁螯合物。合适地，所述组合物还包含溶剂或溶剂(solvents)；优选水性载体以及最优选水用作溶剂。上述组合物可以用于通过具有高极化水平的动态核极化(DNP)获得超极化13C1-醋酸钠或13C1-醋酸钠-d3或TRIS-13C1-醋酸盐-d3。
在第二个实施方案中，所述组合物包含13C1-醋酸或13C1-醋酸-d3、三苯甲基自由基和任选的顺磁金属离子。在优选的实施方案中，所述三苯甲基自由基为式(1)的三苯甲基自由基，其中M表示氢或钠，R1相同或不同，优选相同并且优选表示-CH2-OCH3、-CH2-OC2H5、-CH2-CH2-OCH3、-CH2-SCH3、-CH2-SC2H5或-CH2-CH2-SCH3，最优选-CH2-CH2-OCH3。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含顺磁金属离子，优选包含Gd3+的盐或顺磁螯合物，更优选包含Gd3+的顺磁螯合物。所述组合物可以或不可以包含溶剂或溶剂(solvents)；在优选的实施方案中，水性载体以及最优选水用作溶剂。上述组合物可以用于通过具有高极化水平的动态核极化(DNP)获得超极化13C1-醋酸或超极化13C1-醋酸-d3。所述超极化13C1-醋酸或超极化13C1-醋酸-d3可以通过与碱例如NaOH溶解转化为超极化13C1-醋酸盐或超极化13C1-醋酸盐-d3。
本发明的另一方面是包含超极化13C1-醋酸钠、超极化13C1-醋酸钠-d3、超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3、超极化13C1-醋酸或超极化13C1-醋酸-d3，三苯甲基自由基和任选的顺磁金属离子的组合物，其中所述组合物通过动态核极化获得。
本发明的另一方面是超极化13C1-醋酸钠-d3、超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3、超极化13C1-醋酸或超极化13C1-醋酸-d3。本发明这个方面优选的实施方案是超极化13C1-醋酸钠-d3或超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3，其可以用作用于13C-MR检测方法的组合物(成像介质)中的成像剂。
本发明的另一方面是包含超极化13C1-醋酸钠-d3或超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3的成像介质。
本发明的成像介质可以用作13C-MR检测方法中的成像介质。
根据本发明方法的成像介质可以用作体外13C-MR检测的成像介质，例如细胞培养物、样品、离体组织或来源于人类或非人类动物体的离体器官的13C-MR检测。为此目的，成像介质作为组合物提供，所述组合物适合于添加到，例如，细胞培养物，例如尿、血或唾液的样品，例如活检组织的离体组织或离体器官中。除了成像剂即超极化13C1-醋酸钠-d3或超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3之外，这类成像介质优选包括与体外细胞或组织测定相容并且用于体外细胞或组织测定的溶剂，例如DMSO或甲醇，或包含水性载体和非水性溶剂的溶剂混合物，例如DMSO和水或缓冲液或甲醇和水或缓冲液的混合物。对本领域技术人员显而易见的是，药学可接受的载体、辅料和制剂助剂可以存在于这类成像介质中，但并不为此目的而需要它们。
此外，根据本发明方法的成像介质可以用作体内13C-MR检测的成像介质，即在有生命的人类或非人类动物上实施的13C-MR检测。为此目的，成像介质需要适合施用于有生命的人类体或非人类动物体。因此，除了成像剂即13C1-醋酸钠-d3或超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3之外，这类成像介质优选包括水性载体，优选生理可耐受并且药学可接受的水性载体例如水，缓冲液或盐水。这类成像介质还可以包括常规的药学或兽药载体或辅料，例如制剂助剂，例如稳定剂、渗透压调节剂、增溶剂等，这些对人类或兽医药物中的诊断组合物是常规的。
附图简述：
图1描绘了13C1-醋酸盐和13C1-乙酰肉毒碱的信号随时间的叠加(build-up)和衰减。使用置于小鼠心脏的表面线圈收集数据。
图2描绘了在静脉注射超极化13C1-醋酸盐后10s取得的13C1-醋酸盐、13C1-乙酰基-CoA和13C1-乙酰肉毒碱的信号强度。使用置于小鼠心脏的表面线圈收集数据。
图3描绘了使用置于这些器官的表面线圈在小鼠心脏和肝脏测定的13C1-乙酰肉毒碱和13C1-乙酰基-CoA的比值。
图4描绘了在30分钟的局部缺血期前、局部缺血期后5分钟或局部缺血期后1小时在小鼠的后腿测定的13C1-乙酰肉毒碱和13C1-醋酸盐的比值。
通过下列非限制性实施例阐述本发明。
实施例
实施例1a在作为顺磁金属离子的Gd-螯合物和作为DNP剂的三苯甲基自由基存在下通过DNP法的超极化13C1-醋酸钠的生产
向微量试管中加入13C1-醋酸钠(Aldrich，24.9mg，0.30mmol)和16μl水。轻微加热试管并超声溶解13C1-醋酸钠。制备根据WO-A1-98/39277的实施例7合成的三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟乙基)-苯并-[1，2-4，5’]-双-(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)-甲基钠盐(三苯甲基自由基)的水溶液(139μmol/g溶液)，将3.4mg的该溶液加入到试管中溶解的13C1-醋酸钠中。此外，制备根据WO-A-2007/064226的实施例4合成的1，3，5-三-(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基苯基)-[1，3，5]三-嗪烷-2，4，6-三酮(顺磁金属离子)的Gd-螯合物的水溶液(14.6μmol/g溶液)，将1.2mg的该溶液加入到含有13C1-醋酸钠和三苯甲基自由基的试管中。超声并轻微加热得到的组合物以溶解所有化合物。将组合物(37μl，12.5mM的三苯甲基自由基和1.41mM的Gd3+)从试管转移到样品杯中，将样品杯插入DNP极化器中。组合物在DNP条件下于3.35T磁场中在微波搅拌(93.89GHz)下在1.2K下极化。极化后进行固态13C-NMR，测定的固态极化超过20％。
实施例1b 包含超极化13C1-醋酸钠的成像介质的生产
在动态核极化75分钟后，将得到的冷冻极化组合物溶解于6ml磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7，100mg/l EDTA，0.9％NaCl)。包含溶解的组合物的最终溶液的pH为7.3±0.1。所述最终溶液中13C1-醋酸钠浓度为50mM。
通过液态13C-NMR在400MHz测定的液态极化为19％。
实施例2a TRIS-13C1-醋酸盐的制备
将13C1-醋酸(ldrich，474mg，7.7mmol)溶解于50ml水中。向溶液中加入TRIS(946mg，7.80mmol)。在固体溶解后将溶液稀释于200ml水中并且冷冻干燥。通过NMR表征冷冻干燥的产物TRIS-13C1-醋酸盐：纯度93％，1.12eq.TRIS。
实施例2b  在作为顺磁金属离子的Gd-螯合物和作为DNP剂的三苯甲基自由基存在下通过DNP法的超极化TRIS-13C1-醋酸盐的生产
向微量试管中加入根据实施例2a制备的TRIS-13C1-醋酸盐(54.6mg，0.30mmol)和10μl水。轻微加热试管并超声溶解TRIS-13C1-醋酸盐。制备根据WO-A1-98/39277的实施例7合成的三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟乙基)-苯并-[1，2-4，5’]-双-(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)-甲基钠盐(三苯甲基自由基)的水溶液(139μmol/g溶液)，将6.0mg的该溶液加入到试管中溶解的TRIS-13C1-醋酸盐中。此外，制备根据WO-A-2007/064226的实施例4合成的1，3，5-三-(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基苯基)-[1，3，5]三-嗪烷-2，4，6-三酮(顺磁金属离子)的Gd-螯合物的水溶液(14.6μmol/g溶液)，将1.3mg的该溶液加入到含有TRIS-13C1-醋酸盐和三苯甲基自由基的试管中。超声并轻微加热得到的组合物以溶解所有化合物。将组合物(65μl，12.8mM的三苯甲基自由基和0.9mM的Gd3+)从试管转移到样品杯中，将样品杯插入DNP极化器中。组合物在DNP条件下于3.35T磁场中在微波搅拌(93.89GHz)下在1.2K下极化。极化后进行固态13C-NMR，测定的固态极化超过25％。
实施例2c  包含超极化TRIS-13C1-醋酸盐的成像介质的生产
在动态核极化75分钟后，将得到的冷冻极化组合物溶解于6ml磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7，100mg/l EDTA，0.9％NaCl)。包含溶解的组合物的最终溶液的pH为7.3±0.1。所述最终溶液中TRIS-13C1-醋酸盐浓度为50mM。
实施例3a在作为顺磁金属离子的Gd-螯合物和作为DNP剂的三苯甲基自由基存在下通过DNP法的超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3的生产
向微量试管中加入根据实施例2a制备的TRIS-13C1-醋酸盐-d3(55.5mg，0.30mmol)和10μl水。轻微加热试管并超声溶解TRIS-13C1-醋酸盐-d3。制备根据WO-A1-98/39277的实施例7合成的三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟乙基)-苯并-[1，2-4，5’]-双-(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)-甲基钠盐(三苯甲基自由基)的水溶液(139μmol/g溶液)，将6.0mg的该溶液加入到试管中溶解的TRIS-13C1-醋酸盐-d3中。此外，制备根据WO-A-2007/064226的实施例4合成的1，3，5-三-(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基苯基)-[1，3，5]三-嗪烷-2，4，6-三酮(顺磁金属离子)的Gd-螯合物的水溶液(14.6μmol/g溶液)，将1.3mg的该溶液加入到含有TRIS-13C1-醋酸盐-d3和三苯甲基自由基的试管中。超声并轻微加热得到的组合物以溶解所有化合物。将组合物(65μl，12.8mM的三苯甲基自由基和0.9mM的Gd3+)从试管转移到样品杯中，将样品杯插入DNP极化器中。组合物在DNP条件下于3.35T磁场中在微波搅拌(93.89GHz)下在1.2K下极化。极化后进行固态13C-NMR，测定的固态极化超过25％。
实施例3b  包含超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3的成像介质的生产
在动态核极化75分钟后，将得到的冷冻极化组合物溶解于6ml磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7，100mg/l EDTA，0.9％NaCl)。包含溶解的组合物的最终溶液的pH为7.3±0.1。所述最终溶液中TRIS-13C1-醋酸盐-d3浓度为50mM。
通过液态13C-NMR在400MHz测定的液态极化为32％。
实施例4 包含超极化TRIS-13C1-醋酸盐的成像介质的小鼠(心脏)体内13C-MR光谱法
在6s的时间内将200μl如实施例3a所述制备的成像介质注射到C57Bl/6小鼠中。所述成像介质中TRIS-13C1-醋酸盐的浓度为75mM，在注射时极化为20％。将13C-表面线圈(直径12mm)放置于小鼠心肌上。大鼠1H-体线圈用于解剖对照成像和局部匀场。使用2.4T Bruker光谱仪进行13C-MR光谱法。使用30度RF脉冲每3s获得13C-MR图谱的动态集合(总共30)。通过该试验，可以清楚地看到13C1-乙酰肉毒碱随试验时间的信号叠加(图1)。
实施例5  使用包含超极化TRIS-13C1-醋酸盐的成像介质的小鼠(心脏)体内13C-MR光谱法
在6s的时间内将200μl如实施例3a所述制备的成像介质注射到C57Bl/6小鼠中。所述成像介质中TRIS-13C1-醋酸盐的浓度大约为50mM。在所有两个试验(n＝2)中，将13C-表面线圈(直径12mm)放置于小鼠心肌上，使用2.4T Bruker光谱仪进行13C-MR光谱法。使用90度RF脉冲在成像介质注射10s后获得光谱。通过这两个试验，可以鉴定(图2)并定量(图3)13C1-乙酰基-CoA和13C1-乙酰肉毒碱。心脏中13C1-乙酰肉毒碱和13C1-乙酰基-CoA的比值比肝脏中大约高3倍，参见实施例6。
实施例6  使用包含超极化TRIS-13C1-醋酸盐的成像介质的小鼠(肝脏)体内13C-MR光谱法
在6s的时间内将200μl如实施例3a所述制备的成像介质注射到C57Bl/6小鼠中。所述成像介质中TRIS-13C1-醋酸盐的浓度大约为50mM。在所有两个试验(n＝2)中，将13C-表面线圈(直径12mm)放置于小鼠肝脏上，使用2.4T Bruker光谱仪进行13C-MR光谱法。使用90度RF脉冲在成像介质注射后10s获得光谱。通过这两个试验，可以鉴定(图2)并定量(图3)13C1-乙酰基-CoA和13C1-乙酰肉毒碱。心脏中13C1-乙酰肉毒碱和13C1-乙酰基-CoA的比值比肝脏中大约低3倍，参见实施例5。
实施例7使用包含超极化TRIS-13C1-醋酸盐的成像介质的小鼠(骨骼肌)体内13C-MR光谱法
在6s的时间内将200μl如实施例3a所述制备的成像介质注射到C57Bl/6小鼠中。所述成像介质中TRIS-13C1-醋酸盐的浓度大约为50mM。将13C-表面线圈(直径9mm)放置于小鼠后腿上并且使用2.4TBruker光谱仪进行13C-MR光谱法。每4s获取25°反转角的20脉冲。进行三个试验：1)在30分钟的局部缺血期前，2)局部缺血期后5分钟和3)局部缺血期后1小时。通过这些试验，可以定量13C1-乙酰肉毒碱和13C1-醋酸盐的比值，参见图4。在局部缺血期后立刻观察到13C1-乙酰肉毒碱信号大约10倍的降低，在灌注1小时后与对照肌肉相比信号还是非常低。

Claims (13)

1.使用包含超极化13C-醋酸盐的成像介质的13C-MR检测方法，其中检测13C-乙酰肉毒碱和任选的13C-乙酰基-CoA或13C-乙酰基-CoA以及13C-醋酸盐的信号。
2.根据权利要求1的方法，其中检测13C-乙酰肉毒碱和13C-乙酰基-CoA的信号。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述信号用于生成代谢分布图。
4.根据权利要求3的方法，其中所述方法为体内13C-MR检测方法，所述代谢分布图为有生命的人类或非人类动物的代谢分布图。
5.根据权利要求3的方法，其中所述方法为体外13C-MR检测方法，所述代谢分布图为细胞培养物中的细胞、样品、离体组织或来自人类或非人类动物的离体器官的代谢分布图。
6.包含13C1-醋酸钠、13C1-醋酸钠-d3、TRIS-13C1-醋酸盐-d3、13C1-醋酸或13C1-醋酸-d3、三苯甲基自由基和任选的顺磁金属离子的组合物。
7.根据权利要求6的组合物，其中所述顺磁金属离子存在于组合物中，并且是包含Gd3+的顺磁鳌合物。
8.根据权利要求6和7的组合物，其中所述三苯甲基自由基是式(1)的三苯甲基自由基
M  表示氢或一价阳离子；和
R1相同或不同，表示任选被一个或多个羟基取代的直链或支链C1-C6-烷基或-(CH2)n-X-R2基团，
其中n为1、2或3；
X为O或S；以及
R2为任选被一个或多个羟基取代的直链或支链C1-C4-烷基。
9.根据权利要求6-8的组合物，所述组合物用于动态核极化。
10.包含超极化13C1-醋酸钠、超极化13C1-醋酸钠-d3、超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3、超极化13C1-醋酸或超极化13C1-醋酸-d3、三苯甲基自由基和任选的顺磁金属离子的组合物，其中所述组合物通过动态核极化权利要求6-9的组合物获得。
11.包含超极化13C1-醋酸钠-d3或超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3的成像介质。
12.根据权利要求11的成像介质，所述成像介质用于权利要求1-5的方法。
13.超极化13C1-醋酸钠-d3或超极化TRIS-13C1-醋酸盐-d3。
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