CN101951963B - Mr成像剂、成像介质和其中使用该成像介质的成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及超极化¹³C-α-酮异己酸盐，其作为成像剂的用途、包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质和其中使用这样的成像介质的¹³C-MR检测的方法。进一步，本发明涉及生产超极化¹³C-α-酮异己酸盐的方法。

Description

MR成像剂、成像介质和其中使用该成像介质的成像方法

本发明涉及超极化¹³C-α-酮异己酸盐，其作为成像剂的用途，包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质和其中使用该成像介质的¹³C-MR检测的方法。进一步，本发明涉及制备超极化¹³C-α-酮异己酸盐的方法。

核磁共振(MR)成像(MRI)已经成为对内科医生特别有吸引力的技术，因为它以非侵入的方式获得患者身体或其部分的图像，并且不会使患者和医务人员暴露于可能有害的辐射例如X-射线中。由于其高质量的图像以及良好的空间和时间分辨率，MRI是用于软组织和器官成像的有利成像技术。

可以用或不用MR造影剂进行MRI。然而，对比度增强的MRI通常能够检测更小的组织改变，这使其成为检测早期组织改变例如小的肿瘤或转移的强大工具。

几种类型的造影剂已经用于MRI。水溶性的顺磁金属螯合剂，例如，钆螯合物，如Omniscan^TM(GE Healthcare)是广泛使用的MR造影剂。当施用于脉管系统中时，由于它们的低分子量，它们迅速分布于细胞外间隙(即血液和间质)。它们还可以相对快速地从体内清除。

另一方面，血池MR造影剂，例如超顺磁氧化铁颗粒，在脉管系统中保持延长的时间。已经证明它们对提高肝脏中的对比度以及检测毛细血管渗透性异常是非常有用的，例如，肿瘤血管生成引起的肿瘤中“渗漏的”毛细血管壁。

尽管上述造影剂的无可置辩的极好的性能，其的使用不是没有任何风险的。虽然顺磁性金属螯合物通常具有高稳定性常数，但是有可能在给予后在身体内释放有毒金属离子。进一步，这些类型的造影剂显示了差的专一性。

WO-A-99/35508公开了采用高T₁剂的超极化溶液作为MRI造影剂的MR研究患者的方法。术语“超极化”是指增强高T₁剂中存在的NMR活性核的核极化，即具有非零核自旋的核，优选¹³C-或¹⁵N-核。增强NMR活性核的核极化时，这些核的激发核自旋状态和基态核自旋状态之间的粒子数差显著提高，从而使MR信号强度放大上百倍。当使用超极化¹³C-和/或¹⁵N-富集的高T₁剂时，基本上没有背景信号的干扰，因为¹³C和/或¹⁵N的天然丰度是可以忽略的，因此图像对比度将有利地高。常规MRI造影剂和这些超极化高T₁剂的主要差别是，前者的对比度变化是由影响体内水质子的驰豫时间引起的，而后类试剂可以被视为非放射性示踪剂，因为获得的信号由试剂单独引起。

WO-A-99/35508中公开了许多种可能的用作MR成像剂的高T₁剂，包括非内源性和内源性化合物。作为例子，提到了正常代谢周期中后者的中间体，据说它们对成像代谢活性是优选的。通过代谢活性的体内成像，可以获得组织代谢状态的信息，所述信息可以用于例如辨别健康和疾病组织。

例如，丙酮酸盐是在柠檬酸循环中起作用的化合物，超极化¹³C-丙酮酸盐向其代谢物超极化¹³C-乳酸盐、超极化¹³C-碳酸氢盐和超极化¹³C-丙氨酸的转化可以用于人体代谢过程的体内MR研究。

超极化¹³C-丙酮酸盐向其代谢物超极化¹³C-乳酸盐、超极化¹³C-碳酸氢盐和超极化¹³C-丙氨酸的代谢转化可以用于人体代谢过程的体内MR研究，因为已经发现所述转化速度快到足以允许来自母体化合物即超极化¹³C₁-丙酮酸盐及其代谢物的信号得以检测。丙氨酸、碳酸氢盐和乳酸盐的量取决于所研究组织的代谢状态。超极化¹³C-乳酸盐、超极化¹³C-碳酸氢盐和超极化¹³C-丙氨酸的MR信号强度与这些化合物的量和检测时剩余的极化程度有关，因此通过监测超极化¹³C-丙酮酸盐向超极化¹³C-乳酸盐、超极化¹³C-碳酸氢盐和超极化¹³C-丙氨酸的转化，有可能通过使用非侵入性MR成像或MR光谱法研究人类和/或非人类动物体的体内代谢过程。

产生于不同丙酮酸盐代谢物的MR信号振幅根据组织类型而不同。丙氨酸、乳酸盐、碳酸氢盐和丙酮酸盐形成的独特代谢峰模式可以用作所检测组织的代谢状态的指纹图谱。

超极化¹³C-丙酮酸盐可以例如用作MR成像剂用于通过MR成像评定心肌组织的生存性(如WO-A-2006/054903中详细描述的)以及用于体内肿瘤成像(如WO-A-2006/011810中详细描述的)。

肿瘤组织常常表征为提高的灌注(perfusion)和更高的代谢活性。增加血管床的过程，血管生成，是通过细胞诱发的，由于它们的更高的代谢需要和/或它们距离毛细管的较大距离，所述细胞不能得到充足的底物，所述底物能够提供用于维持能量动态平衡所需要的能量。在该领域中，其中细胞具有产生足够能量的问题，期望代谢模式的显著变化。具有维持能量动态平衡的问题的组织将改变其能量代谢，其特别地导致增加的乳酸盐生成。在使用超极化¹³C-丙酮酸盐作为MR成像剂的情况下，这种更高的代谢活性可以通过¹³C-乳酸盐的产量增加而看出，其可以通过¹³C-MR检测进行检测。

然而，因为生产适合作为体内成像剂的超极化¹³C-丙酮酸盐不是没有挑战的，因此需要备选的超极化成像剂，其可用于获得有关代谢活性的信息，特别地在肿瘤领域。

我们现已发现超极化¹³C-α-酮异己酸盐可以用作这种成像剂。

α-酮异己酸可逆地代谢为亮氨酸；酶支链转氨酶催化所述反应并且需要谷氨酸盐/α-酮戊二酸盐作为共底物。进一步，通过支链α-酮酸脱氢酶的α-酮异己酸的脱羧导致形成CO₂和随后碳酸氢盐。α-酮异己酸的这两种代谢转化在线粒体中发生。因此通过使用超极化¹³C-α-酮异己酸盐作为成像剂，可以评定代谢活性。

因此在第一方面中本发明提供了一种包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质

术语“成像介质”表示包含超极化¹³C-α-酮异己酸盐作为MR活性剂(即成像剂)的液体组合物。

本发明方法中所用的成像介质可以用作体内¹³C-MR检测的成像介质，即，在有生命的人类或非人类动物中。此外，本发明方法中所用的成像介质可以用作体外¹³C-MR检测的成像介质，例如，细胞培养物，例如尿液、唾液或血液的样品，离体组织，例如由活检或离体器官获得离体组织，所有这些来源于有生命的人类或非人类动物体。在优选实施方案中，用于本发明方法的成像介质可以用作体内¹³C-MR检测的成像介质。

术语“¹³C-MR检测”表示¹³C-MR成像或¹³C-MR光谱法或联合¹³C-MR成像和¹³C-MR光谱法，即¹³C-MR光谱成像。该术语还表示不同时间点的¹³C-MR光谱成像。

术语”¹³C-α-酮异己酸盐”表示4-甲基-2-氧代戊酸的盐，即包括作为阴离子的4-甲基-2-氧代戊酸根的盐，并且所述盐同位素富集以¹³C。

超极化¹³C-α-酮异己酸盐的同位素富集优选为至少75％，更优选地至少80％和特别优选地至少90％，高于90％的同位素富集是最优选的。理想地，该富集是100％。通常，本发明的超极化¹³C-α-酮异己酸盐可以在该分子中在任何碳原子处同位素富集。然而，为获得长T₁，优选地是¹³C-α-酮异己酸盐在以下位置同位素富集以¹³C：C₁-位置(在下文中表示¹³C₁-α-酮异己酸盐)、C₂-位置(在下文中表示¹³C₂-α-酮异己酸盐)或C₄-位置(在下文中表示¹³C₄-α-酮异己酸盐)。多富集也是可能的，例如在以下位置的同位素富集：C₁-和C₂-位置(在下文中表示¹³C_1，2-α-酮异己酸盐)、C₁-和C₄-位置(在下文中表示¹³C₁，4-α-酮异己酸盐)或C₁-、C₂-和C₄-位置(在下文中表示¹³C_1，2，4-α-酮异己酸盐)。在C₁-位置的同位素富集是优选的。

在下文中术语“超极化”和“极化的”可以互换使用，表示核极化水平超过0.1％，更优选超过1％，最优选超过10％。

可以在固体超极化¹³C-α-酮异己酸盐中通过例如固态¹³C-NMR测量法测定极化水平，所述固体超极化¹³C-α-酮异己酸盐例如通过动态核极化(DNP)¹³C-α-酮异己酸盐获得的固体超极化¹³C-α-酮异己酸盐。固态¹³C-NMR测量法优选包括使用低反转角的单一脉冲捕获NMR序列。将NMR光谱中超极化¹³C-α-酮异己酸盐的信号强度与极化处理前获得的NMR光谱中的¹³C-α-酮异己酸盐的信号强度进行比较。然后由极化前后信号强度的比值计算极化水平。

以类似的方式，可以通过液态NMR测量法测定溶解的超极化¹³C-α-酮异己酸盐的极化水平。再将溶解的超极化¹³C-α-酮异己酸盐的信号强度与极化前溶解的¹³C-α-酮异己酸盐的信号强度进行比较。然后由极化前后¹³C-α-酮异己酸盐信号强度的比值计算极化水平。

NMR活性¹³C-核的超极化可以通过不同方法实现，例如WO-A-98/30918、WO-A-99/24080和WO-A-99/35508中描述的方法，其都通过参考引入本文，本领域已知的超极化方法是从惰性气体的极化转移、“暴力式(brute force)”、自旋冷冻、仲氢法和动态核极化(DNP)。

超极化¹³C-α-酮异己酸盐可以通过下述方式获得：直接极化¹³C-α-酮异己酸盐，或者极化¹³C-α-酮异己酸并且随后用碱将酸转化(中和)为¹³C-α-酮异己酸盐。因为用碱中和是另外的步骤，优选地直接极化¹³C-α-酮异己酸盐。合适的¹³C-α-酮异己酸盐是市售可得的或者可以由市售可得的¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐来制备并且在以下段落中将详细地讨论。

获得超极化¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐的一种方法是WO-A-98/30918中描述的由超极化惰性气体的极化转移。可以通过使用循环极化光超极化具有非零核自旋的惰性气体。超极化惰性气体，优选He或Xe，或者这种气体的混合物，可以用于影响超极化¹³C-核。超极化气体可以是气相，它可以溶解于液体/溶剂中，或者超极化气体自身可以用作溶剂。或者，该气体可以冷凝于冷却的固体表面并以该形式使用，或者使其升华。优选将超极化气体与¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐充分混合。

获得超极化¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐的另一方法是在非常低的温度下并且在高场中，通过热力学平衡使¹³C-核极化。与操作场和NMR光谱仪的温度相比，通过使用非常高的场和非常低的温度(暴力式)实现超极化。所用的磁场强度应尽可能地高，适当地高于1T，优选高于5T，更优选15T或更高，特别优选20T或更高。温度应当非常低，例如4.2K或更低，优选1.5K或更低，更优选1.0K或更低，特别优选100mK或更低。

获得超极化¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐的另一方法是自旋冷冻法。该方法包括通过自旋冷冻极化使固体化合物或系统的自旋极化。该系统掺有或充分混合有合适的晶体顺磁材料，例如Ni²⁺、镧系元素或锕系元素离子，具有大约三个或更多的对称轴。仪器比DNP所需的仪器简单，不需要均匀的磁场，因为不使用共振激发场。通过将样品围绕垂直于磁场方向的轴物理旋转实现该方法。该方法的先决条件是顺磁物质具有高的各向异性g-因子。作为样品旋转的结果，电子顺磁共振将与核自旋接触，导致核自旋温度降低。进行样品旋转，直到核自旋极化达到新的平衡。

在优选的实施方案中，DNP(动态核极化)用于获得超极化¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐。在DNP中，极化化合物中MR活性核的极化受到极化剂或所谓的DNP剂、包含未成对电子的化合物的影响。在DNP法中，能量，通常以微波辐射的形式提供，其在初期激发DNP剂。在衰减到基态后，极化从DNP剂未成对的电子转移至待极化化合物的NMR活性核上，例如¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐中的¹³C-核。通常，在DNP法中使用中等或高磁场和非常低的温度，例如，通过在液态氦和大约1T或更高的磁场中实施DNP法。或者，可以使用中磁场和任何可以获得足够的极化增强的温度。DNP技术例如还描述于WO-A-98/58272和WO-A-01/96895，两篇都通过参考引入本文。

为了通过DNP法极化化学体即化合物，制备极化化合物与DNP剂的组合物，然后组合物任选被冷冻并插入DNP极化剂中(如果它没有被冷冻，它将会冻结)用于极化。在极化后，通过熔化或在合适的溶解介质中溶解使冷冻的固体超极化组合物快速转变为液态。溶解是优选的，冷冻的超极化组合物的溶解方法及其合适的装置详细描述于WO-A-02/37132中。熔化方法和合适的融化装置例如描述于WO-A-02/36005中。

为了获得极化化合物中的高极化水平，所述化合物和DNP剂在DNP处理中需要充分接触。如果组合物在冷冻或冷却时结晶，情况就并非如此。为了避免结晶，玻璃形成体需要存在于组合物中或者需要选择用于极化的化合物，其在冷冻时不会结晶而是形成玻璃。

在一个实施方案中，¹³C-α-酮异己酸，优选地¹³C₁-α-酮异己酸，用作原材料来通过DNP方法获得超极化¹³C-α-酮异己酸，其然后在碱的帮助下被中和与转化为超极化¹³C-α-酮异己酸盐。在另一实施方案中，¹³C-α-酮异己酸盐，优选地¹³C₁-α-酮异己酸盐用作原材料来通过DNP方法获得超极化¹³C-α-酮异己酸盐。

在第一实施方案中，¹³C-α-酮异己酸，优选地¹³C₁-α-酮异己酸，用作原材料来通过DNP方法获得超极化¹³C-α-酮异己酸，其然后在碱的帮助下被中和与转化为超极化¹³C-α-酮异己酸盐。¹³C-α-酮异己酸是市售可得的化合物；或者¹³C-α-酮异己酸可以由市售可得的¹³C-α-酮异己酸钠通过用酸转化来制备，一种在本领域中是众所周知的并且在本申请的实施例部分中举例说明的方法。

在第二实施方案中，¹³C-α-酮异己酸盐，优选地¹³C₁-α-酮异己酸盐用作原材料，来通过DNP方法获得超极化¹³C-α-酮异己酸盐。合适的¹³C-α-酮异己酸盐例如是¹³C-α-酮异己酸钠或者¹³C-α-酮异己酸钠，其包括选自以下的无机阳离子：NH₄ ⁺，K⁺，Rb⁺，Cs⁺，Ca²⁺，Sr²⁺和Ba²⁺，优选地NH₄ ⁺，K⁺，Rb⁺或者Cs⁺，更优选地K⁺，Rb⁺，Cs⁺和最优选地Cs⁺，如WO-A-2007/111515中详细描述的，其引入本文作为参考。

在另一实施方案中，有机胺或氨基化合物的¹³C-α-酮异己酸盐用作原材料，更优选地TRIS-¹³C-α-酮异己酸盐或者葡甲胺-¹³C-α-酮异己酸盐酸(meglumine-¹³C-α-ketoisocaproate acid)。这些盐详细地描述于WO-A-2007/069909中，其引入本文作为参考。

术语“TRIS”表示2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，术语“TRIS-¹³C-α-酮异己酸盐”表示包含¹³C-α-酮异己酸根阴离子和TRIS阳离子的盐，所述TRIS阳离子即TRIS铵(2-羟甲基-1，3-丙二酰铵)。

为了通过DNP法超极化¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐，制备包含¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐和DNP剂的组合物。

DNP剂在DNP处理中起决定性作用，因为其选择对¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐中可获得的极化水平具有重要影响。许多种DNP剂-在WO-A-99/35508中称为“OMRI造影剂”-是已知的。如WO-A-99/35508、WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711或WO-A-96/39367中描述的氧基、硫基或碳基稳定的三苯甲基自由基的使用在许多种不同样品中引起高水平的极化。

在优选的实施方案中，通过DNP获得本发明方法中所用的超极化¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐，所用的DNP剂为三苯甲基自由基。如上文简述，通过接近电子拉莫频率的微波辐射，DNP剂即三苯甲基自由基的大电子自旋极化转化为¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐中¹³C核的核极化自旋。微波通过e-e和e-n跃迁刺激电子和核自旋系统间的联系。为了有效的DNP，即为了实现¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐中高水平的极化，三苯甲基自由基在这些化合物或其溶液中必须是稳定和可溶的，以便实现所述的¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐与三苯甲基自由基间的充分接触，这对上述电子和核自旋系统间的联系是必要的。

在优选的实施方案中，三苯甲基自由基是式(1)自由基：

其中

M表示氢或一价阳离子；和

R1相同或不同，表示任选被一个或多个羟基取代的直链或支链的C₁-C₆-烷基或-(CH₂)_n-X-R2基团，

其中n为1、2或3；

X为O或S；以及

R2为任选被一个或多个羟基取代的直链或支链的C₁-C₄-烷基。

在优选的实施方案中，M表示氢或一价生理上耐受的阳离子。术语“生理上耐受的阳离子”表示人类或非人类动物活体耐受的阳离子。优选地，M表示氢或碱金属阳离子，铵离子或有机胺离子，例如葡甲胺。最优选地，M表示氢或钠。

如果¹³C-α-酮异己酸盐用作起始物质通过DNP法来获得超极化¹³C-α-酮异己酸盐，R1优选相同，更优选直链或支链的C₁-C₄-烷基，最优选甲基、乙基或异丙基；或者R1优选相同，更优选被一个羟基取代的直链或支链的C₁-C₄-烷基，最优选-CH₂-CH₂-OH；或者R1优选相同，表示-CH₂-OC₂H₄OH。

如果¹³C-α-酮异己酸用作起始物质通过DNP法来获得超极化¹³C-α-酮异己酸盐，R1相同或不同，优选相同，并且优选表示-CH₂-OCH₃、-CH₂-OC₂H₅、-CH₂-CH₂-OCH₃、-CH₂-SCH₃、-CH₂-SC₂H₅或-CH₂-CH₂-SCH₃，最优选-CH₂-CH₂-OCH₃。

可以如WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711、WO-A-96/39367、WO-A-97/09633、WO-A-98/39277和WO-A-2006/011811中详细描述的合成上述式(1)的三苯甲基自由基。

通常，对于DNP方法，制备起始物质即¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐(下文称为“样品”)和DNP剂的溶液，DNP剂优选三苯甲基自由基，更优选式(1)的三苯甲基自由基。溶剂或溶剂混合物需要用于促进DNP剂和样品的溶解。如果将超极化¹³C-α-酮异己酸盐用作体内¹³C-MR检测的成像剂，优选保持溶剂的量为最小。为了用作体内成像剂，通常以相对高的浓度施用超极化¹³C-α-酮异己酸盐，即在DNP方法中优选使用高浓缩的样品，因此优选保持溶剂的量为最小。在这种情况下，同样重要的是指出使包含样品，即DNP剂，样品和必要的溶剂的组合物的质量尽可能的小。如果使用溶解将DNP处理后的包含超极化¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐的固体组合物转化为液态，例如将其用作¹³C-MR检测的成像剂，高质量对溶解过程的效率具有不利的影响。这是由于对于溶解过程中给定体积的溶解介质，当组合物的质量增加时，组合物与溶解介质的质量比降低。此外，在将在本发明的成像介质中使用的超极化¹³C-α-酮异己酸盐施用于人类或非人类动物前，使用某些溶剂可能需要除去它们，因为它们可能不是生理上耐受的。

如果使用¹³C-α-酮异己酸通过DNP获得超极化¹³C-α-酮异己酸盐的话，制备了DNP试剂的溶液，优选地三苯甲基自由基并且更优选地式(1)的三苯甲基自由基/¹³C-α-酮异己酸，其在室温下是液体。可以任选地添加玻璃形成体例如甘油或二醇。化合物的均匀混合可以通过本领域已知的多种方法来促进，例如搅拌、涡流(旋转-混合)或声处理和/或温和加热。

如果¹³C-α-酮异己酸盐如TRIS-¹³C-α-酮异己酸盐用作原材料的话，其可以溶于合适的溶剂，优选地水，或者溶剂混合物和DNP试剂可以被添加到该溶液中。在另一实施方案中，将DNP试剂溶解在合适的溶剂或溶剂混合物中并且将¹³C-α-酮异己酸盐添加到该溶液中。可以任选地添加玻璃形成体例如甘油或二醇，例如如果¹³C-α-酮异己酸钠。还可以通过几种本领域已知的方式促进化合物的充分混合，例如搅拌、涡旋或超声和/或轻微加热。

如果¹³C-α-酮异己酸盐用作原材料，其在冷冻时结晶，例如¹³C-α-酮异己酸钠，将玻璃形成体添加到溶剂或溶剂混合物是优选的。¹³C-α-酮异己酸盐的合适的溶剂是水，合适的玻璃形成体是例如二醇或甘油。因此在一个实施方案中，将¹³C-α-酮异己酸盐溶解在溶剂或溶剂混合物中并且将DNP试剂和玻璃形成体添加到该溶液中。在另一实施方案中，将DNP试剂溶解在溶剂或溶剂混合物中并且将¹³C-α-酮异己酸盐和玻璃形成体添加到该溶液。在又一个实施方案中，将DNP试剂溶解在玻璃形成体和¹³C-α-酮异己酸盐中并且将溶剂或溶剂混合物添加到该溶剂中。

包含¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐和DNP剂的待DNP-极化的组合物还可以包含顺磁金属离子。现已发现顺磁金属离子的存在可以导致要通过DNP所极化的化合物中增加的极化水平，如WO-A2-2007/064226中详细描述，其通过参考引入本文。

术语“顺磁金属离子”表示盐形式或螯合形式的顺磁金属离子，即顺磁螯合物。后者是包含螯合剂和顺磁金属离子的化学体，其中所述顺磁金属离子和所述螯合剂形成复合物，即顺磁螯合物。

在优选的实施方案中，顺磁金属离子为包含Gd³⁺的盐或顺磁螯合物，优选包含Gd³⁺的顺磁螯合物。在更优选的实施方案中，所述顺磁金属离子在所极化的组合物中是可溶和稳定的。

如果使用前面描述的DNP剂，所极化的¹³C-α-酮异己酸/¹³C-α-酮异己酸盐也必须与顺磁金属离子充分接触。用于DNP的包含¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐、DNP剂和顺磁金属离子的组合物可以以多种方式获得。

如果¹³C-α-酮异己酸用作原材料，优选地将DNP试剂添加到¹³C-α-酮异己酸，或者以固体的形式或者在溶液中。如果式(1)的三苯甲基自由基用作DNP试剂，其优选地以固体的形式添加。在随后的步骤中，添加顺磁金属离子。顺磁金属离子可以以固体的形式或在溶液中添加。或者，可以制备DNP试剂和顺磁金属离子的溶液并且将¹³C-α-酮异己酸添加到该溶液或者将该溶液添加到¹³C-α-酮异己酸。化合物的均匀混合可以通过本领域已知的多种方法来促进，例如搅拌、涡流或声处理和/或温和加热。

如果¹³C-α-酮异己酸盐如TRIS-¹³C-α-酮异己酸盐用作原材料，其可以溶于合适的溶剂或溶剂混合物并且可以将DNP试剂添加到该溶液。DNP试剂，优选地三苯甲基自由基，可以以固体形式或者在溶液中添加。在随后的步骤中，添加顺磁金属离子。还有，顺磁金属离子可以以固体的形式或在溶液中添加。在另一实施方案中，将DNP试剂和顺磁金属离子溶解在合适的溶剂(复数)或合适的溶剂(单数)中并且向该溶液中添加¹³C-α-酮异己酸盐。在又一实施方案中，将DNP试剂(或顺磁金属离子)溶解在合适的溶剂中并且添加到固体或溶解的¹³C-α-酮异己酸盐。在随后的步骤中，将顺磁金属离子(或DNP试剂)添加到该溶液，或者以固体的形式或者在溶液中。优选地，用于溶解全部化合物的溶剂的量被保持达最小。如前所述，如果¹³C-α-酮异己酸盐用作原材料，其冷冻时结晶，例如¹³C-α-酮异己酸钠，添加玻璃形成体至溶剂或溶剂混合物是优选的。还可以通过几种本领域已知的方式促进化合物的充分混合，例如搅拌、涡旋或超声和/或轻微加热。

如果使用三苯甲基自由基作为DNP剂，这类三苯甲基自由基在用于DNP的组合物中合适的浓度为1-25mM，优选2-20mM，更优选10-15mM。如果向组合物中添加顺磁金属离子，这类顺磁金属离子在组合物中合适的浓度为0.1-6mM(金属离子)，并且浓度为0.3-4mM是优选的。

在制备包含¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐、DNP剂和任选的顺磁金属离子的组合物后，通过本领域已知的方法冷冻所述组合物，例如在冷冻器中、在液氮中冷冻它，或者简单地将其置于DNP极化器中，其中液氦将使其冷冻。在优选的实施方案中，在将组合物插入极化器前将其冷冻为“珠子”。这类珠子可以通过向液氮中逐滴加入组合物获得。已经观察到这类珠子更有效的溶解，如果极化较大量的¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐，例如在体内¹³C-MR检测法中意图使用该化合物时，这是特别相关的。

如果顺磁金属离子存在于组合物中，可以在冷冻前将所述组合物除气，例如通过将氦气鼓泡通入该溶液中(例如2-15分钟的时间)，但可以通过其他已知的常规方法实现除气。

DNP技术例如描述于WO-A-98/58272和WO-A-01/96895中，其都通过参考并入本文。通常，在DNP法中使用中等或高磁场和非常低的温度，例如，在液氦和大约1T或更大的磁场中实施DNP法。或者，可以使用中等磁场和任何获得足够的极化增强的温度。在优选的实施方案中，在液氦和大约1T或更大的磁场中实施DNP法。合适的极化装置例如描述于WO-A-02/37132中。在优选的实施方案中，极化装置包括低温恒温器和极化设备，例如，通过波导管连接微波源的微波室，所述微波源位于被磁场产生装置例如超导磁体环绕的中心孔中。孔垂直向下延伸到至少接近超导磁体的P区水平，其中磁场强度足够高，例如1-25T，足以使样品核发生极化。探针的孔(即，所极化的冷冻溶液)优选是可密封的并且可以抽空至低压，例如1毫巴或更小数量级的压力。探针引入工具例如可移动的传送管可以包含于孔内，可以将该管从孔的顶部向下插入至微波室内P区的位置。通过液氦将P区冷却至低到足以发生极化的温度，优选0.1-100K，更优选0.5-10K，最优选1-5K数量级的温度。探针引入工具优选可在其上端以任何合适的方式密封以保持孔内部分真空。探针保留容器，例如探针保留杯，可以可拆卸地安装于探针引入工具的下端内。探针保留容器优选由轻质材料制备，所述材料具有低的比热容和良好的低温特性，例如，KelF(聚氯三氟乙烯)或PEEK(聚醚醚酮)，并且可以以能够容纳一个以上探针的方式设计探针保留容器。

将探针插入探针保留容器中，浸入液氦中并使用微波辐射，优选地频率为大约94GHz，在200mW。可以在微波辐射期间通过例如获得探针的固态¹³C-NMR信号来监测极化水平。通常，在显示NMR信号对时间的图中获得饱和曲线。因此有可能测定何时达到最佳和/或足够的极化水平。固态¹³C-NMR测定法适当地包括使用低反转角的单一脉冲捕获NMR序列。将动态核极化的核即¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐中的¹³C核的信号强度与DNP前的¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐中的¹³C核的信号强度进行比较。然后由DNP前后信号强度的比值计算极化水平。

在DNP处理后，包含超极化¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐的固体组合物由固态转化为液态，即液化。这可以通过溶解于合适的溶剂或溶剂混合物(溶解介质)中或通过熔化固体组合物而实现。溶解是优选的，溶解方法及其合适的装置详细描述于WO-A-02/37132中。熔化方法和用于熔化的合适装置例如描述于WO-A-02/36005中。简言之，使用溶解装置/熔化装置，所述溶解装置/熔化装置是与极化器物理分离的或是作为包含极化器和溶解装置/熔化装置的仪器的一部分。在优选的实施方案中，在升高的磁场中实施溶解/熔化，例如在极化器中，以改善驰豫并保持超最大的极化。尽管以上的测量，应当避免场节点，低场可能导致升高的驰豫。

如果¹³C-α-酮异己酸盐用作动态核极化的起始物质并且如果通过溶解液化包含超极化¹³C-α-酮异己酸盐的固体组合物，水性载体，优选生理上耐受的和药学上可接受的水性载体例如水，缓冲液或盐水合适地用作溶剂，特别优选如果将超极化¹³C-α-酮异己酸盐用于体内¹³C-MR检测的成像介质中。水性载体可以包含碱以便调整最终溶液的pH值，使得其适于体内给药。合适的的pH为6.8至7.8。对于体外应用，还可以使用非水性溶剂或溶剂混合物，例如DMSO或甲醇或包含水性载体和非水性溶剂的混合物，例如DMSO和水或甲醇和水的混合物。在另一优选的实施方案中，水性载体或非水性溶剂或溶剂混合物可以进一步包括一种或多种化合物，其能够结合或络合游离的顺磁离子，例如螯合剂如DTPA或EDTA。

如果¹³C-α-酮异己酸用作动态核极化的起始物质，获得的超极化¹³C-α-酮异己酸需要转化为¹³C-α-酮异己酸盐。如果通过溶解液化包含超极化¹³C-α-酮异己酸的固体组合物并且超极化¹³C-α-酮异己酸盐意图体内使用时，溶解介质优选为水性载体，例如，水或缓冲液，优选生理上耐受的缓冲液或其包含水性载体，例如水或缓冲液，优选生理上耐受的缓冲液。下文所用的术语“缓冲液”或“缓冲剂”可以互换使用。在本申请的上下文中，“缓冲剂”表示一种或多种缓冲剂，即，缓冲剂的混合物。

优选的缓冲剂是生理上耐受的缓冲剂，更优选在pH 7至8范围内缓冲的缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂(KH₂PO₄/Na₂HPO₄)、ACES、PIPES、咪唑/HCl、BES、MOPS、HEPES、TES、TRIS、HEPPS或TRICIN。

为了将超极化¹³C-α-酮异己酸转化为超极化¹³C-α-酮异己酸盐，通常将¹³C-α-酮异己酸与及碱反应。在一个实施方案中，将¹³C-α-酮异己酸与碱反应以使其转化为¹³C-α-酮异己酸盐。对于意图体内使用来说，随后加入水性载体。在另一优选的实施方案中，水性载体和碱混合于一种溶液中，将该溶液加入¹³C-α-酮异己酸，使其溶解并同时将其转化为¹³C-α-酮异己酸盐。在优选的实施方案中，碱是NaOH、Na₂CO₃或NaHCO₃的水溶液，最优选的碱是NaOH。

在另一个优选的实施方案中，水性载体缓冲剂或-如果适用-混合的水性载体/碱溶液还包含一种或多种化合物，所述化合物能够结合或络合游离的顺磁离子，例如螯合剂，例如DTPA或EDTA。

对于体外施用超极化¹³C-α-酮异己酸盐来说，还可以使用非水性溶剂或溶剂混合物，例如DMSO或甲醇或包括水性载体和非水性溶剂的混合物，例如DMSO和水或甲醇和水的混合物。

如果通过DNP法实施超极化，DNP剂，优选三苯甲基自由基和任选的顺磁金属离子可以从包含超极化¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐的液体中除去。如果将超极化¹³C-α-酮异己酸或¹³C-α-酮异己酸盐用于体内应用的成像介质中，除去这些化合物是优选的。如果超极化¹³C-α-酮异己酸用作DNP的起始物质，优选首先将超极化¹³C-α-酮异己酸转化为¹³C-α-酮异己酸盐，在所述转化发生后除去DNP剂和任选的顺磁金属离子。

用于除去三苯甲基自由基和顺磁金属离子的方法是本领域已知的，并且详细描述于WO-A2-2007/064226和WO-A1-2006/011809中。

在优选实施方案中，通过动态核极化一种组合物获得了根据本发明的成像介质的超极化¹³C-α-酮异己酸盐，所述组合物包括¹³C-α-酮异己酸或TRIS-¹³C-α-酮异己酸盐或¹³C-α-酮异己酸钠，式(1)的三苯甲基自由基和任选地包括Gd³⁺的顺磁螯合物。

本发明的成像介质可以用作体外¹³C-MR检测的成像介质，例如细胞培养物、样品、离体组织或来源于人类或非人类动物体的离体器官的¹³C-MR检测。为此目的，成像介质作为组合物提供，所述组合物适合于添加到，例如，细胞培养物，例如尿、血或唾液的样品，例如活检组织的离体组织或离体器官中。除了成像剂即超极化¹³C-α-酮异己酸盐之外，这类成像介质优选包括与体外细胞或组织测定相容并且用于体外细胞或组织测定的溶剂，例如DMSO或甲醇，或包含水性载体和非水性溶剂的溶剂混合物，例如DMSO和水或缓冲液或甲醇和水或缓冲液的溶液。对本领域技术人员显而易见的是，药学可接受的载体、辅料和制剂助剂可以存在于这类成像介质中，但并不为此目的而需要它们。

此外，本发明的成像介质可以用作体内¹³C-MR检测的成像介质，即在有生命的人类或非人类动物中实施的¹³C-MR检测。为此目的，成像介质需要适合施用于有生命的人体或非人类动物体。因此，除了成像剂即超极化¹³C-α-酮异己酸盐之外，这类成像介质优选包括水性载体，优选生理可耐受并且药学可接受的水性载体例如水，缓冲液或盐水。这类成像介质还可以包括常规的药学或兽药载体或辅料，例如制剂助剂，例如稳定剂、渗透压调节剂、增溶剂等，这些对人或兽医药物中的诊断组合物是常规的。

如果本发明的成像介质用于体内¹³C-MR检测，即在有生命的人类或非人类动物体中，所述成像介质优选经肠道外施用于所述主体，优选静脉内。通常，将检测的主体置于MR磁铁中。放置专用¹³C-MRRF线圈来覆盖目标部位。成像介质的精确剂量和浓度取决于一系列因素，例如毒性和给药途径。通常，成像介质的给药浓度高达1mmol¹³C-α-酮异己酸盐每kg体重，优选0.01-0.5mmol/kg，更优选0.1-0.3mmol/kg。在给药后低于400s，优选低于120s，更优选给药后低于60s，特别优选20-50s，应用以组合频率和空间选择方式编码目标体积的MR成像序列。应用MR序列的精确时间高度取决于目标体积和物种体积。

根据本发明的成像介质优选地用于¹³C-MR检测方法并且这样的方法是本发明的另一个方面。

因此，在第二方面中本发明提供了¹³C-MR检测的方法，其使用包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质。

在优选的第一实施方案中，本发明提供了¹³C-MR检测的方法，其使用包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质，其中检测¹³C-亮氨酸和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号。

在优选的第二实施方案中，本发明提供了¹³C-MR检测的方法，其使用包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质，其中检测¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号。

在优选的第三实施方案中，本发明提供了¹³C-MR检测的方法，其使用包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质，其中检测¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号。

术语“检测¹³C-亮氨酸和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号”是指在本发明的方法中，仅仅检测¹³C-亮氨酸的信号或者检测¹³C-亮氨酸和¹³C-α-酮异己酸盐的信号。

术语“检测¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号”是指在本发明的方法中检测仅仅¹³CO₂的信号或仅仅¹³C-碳酸氢盐的信号或者检测¹³CO₂和¹³C-碳酸氢盐的信号或者检测¹³CO₂和¹³C-α-酮异己酸盐的信号或¹³C-碳酸氢盐和¹³C-α-酮异己酸盐的信号或者检测¹³CO₂和¹³C-碳酸氢盐和¹³C-α-酮异己酸盐的信号。

术语“检测¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号”是指在本发明的方法中检测¹³C-亮氨酸和¹³CO₂的信号或¹³C-亮氨酸和¹³C-碳酸氢盐的信号或¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和¹³C-碳酸氢盐的信号。其进一步是指检测¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和¹³C-α-酮异己酸盐的信号或者¹³C-亮氨酸和¹³C-碳酸氢盐和¹³C-α-酮异己酸盐的信号或者¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和¹³C-碳酸氢盐和¹³C-α-酮异己酸盐的信号。

术语“¹³C-亮氨酸”表示同位素富含¹³C的2-氨基-4-甲基-戊酸，即，其中¹³C同位素的量大于其天然丰度。除非另有规定，术语“¹³C-亮氨酸”表示在C₁-和/或C₂-和/或C₄-位置¹³C-富集的化合物。在¹³C-亮氨酸中同位素富集的位置当然取决于在其母体化合物¹³C-α-酮异己酸盐中同位素富集的位置。因此，如果例如在用于本发明方法中的成像介质中使用超极化的¹³C₁-α-酮异己酸盐，那么检测¹³C₁-亮氨酸的信号。

术语“¹³C-碳酸氢盐”表示同位素富含¹³C的HCO₃ ^-，即，其中¹³C同位素的量大于其天然丰度。同样，术语“¹³CO₂”表示同位素富含¹³C的二氧化碳，即，其中¹³C同位素的量大于其天然丰度。是否有可能检测¹³C-碳酸氢盐和/或¹³CO₂当然取决于在其母体化合物¹³C-α-酮异己酸盐中同位素富集的位置。只有当在C₁-位置¹³C-富集的¹³C-α-酮异己酸盐用于本发明方法中使用的成像介质时，¹³C-碳酸氢盐和¹³CO₂才形成并且因此可以由¹³C-MR检测进行检测。

α-酮异己酸盐酸至亮氨酸和二氧化碳的代谢转化示于¹³C₁-α-酮异己酸盐的方案1中：*表示¹³C-标记：¹³C-α-酮异己酸盐通过支链转氨酶(BCAT，EC 2.6.1.42)转化为¹³C₁-亮氨酸并且通过支链α-酮酸脱氢酶(BCKD，EC 1.2.4.4.)转化为¹³CO₂(和随后¹³C-碳酸氢盐)。

方案1.

本发明上下文中的术语“信号”是指MR信号振幅或积分或¹³C-MR光谱中的峰面积或(to)峰噪音，其表示¹³C-亮氨酸、¹³CO₂、¹³C-碳酸氢盐和/或¹³C-α-酮异己酸盐。在优选实施方案中，信号是峰面积。

在本发明方法的优选实施方案中，¹³C-亮氨酸、¹³CO₂、¹³C-碳酸氢盐和/或¹³C-α-酮异己酸盐的上述信号用于生成有生命的人类或非人类动物的代谢分布图。所述代谢分布图可以来源于整个身体，例如通过整个身体的体内¹³C-MR检测获得。或者，所述代谢分布图由目标区域或体积生成，即某些组织、器官或所述人类或非人类动物体的一部分。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，¹³C-亮氨酸、¹³CO₂、¹³C-碳酸氢盐和/或¹³C-α-酮异己酸盐的上述信号用于生成细胞培养物中的细胞、例如尿、血或唾液的样品、例如活检组织的离体组织或来自人类或非人类动物的离体器官的代谢分布图。随后通过体外¹³C-MR检测生成所述代谢分布图。

因此，在优选的第一实施方案中，本发明提供使用包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质的¹³C-MR检测的方法，其中检测¹³C-亮氨酸和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号，并且其中所述信号用于生成代谢分布图。

在优选的第二实施方案中，本发明提供使用包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质的¹³C-MR检测的方法，其中检测¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号，并且其中所述信号用于生成代谢分布图。

在优选的第三实施方案中，本发明提供使用包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质的¹³C-MR检测的方法，其中检测¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号，并且其中所述信号用于生成代谢分布图。

在更优选的第一实施方案中，¹³C-亮氨酸和¹³C-α-酮异己酸盐的信号用于生成所述代谢分布图。

在一个实施方案中，¹³C-亮氨酸和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的光谱信号强度用于生成代谢分布图。在另一个实施方案中，¹³C-亮氨酸和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的光谱信号积分用于生成代谢分布图。在另一个实施方案中，¹³C-亮氨酸和¹³C-α-酮异己酸盐的分离图像的信号强度用于生成代谢分布图。在又一实施方案中，在两个或多个时间点获得¹³C-亮氨酸和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号强度来计算¹³C-亮氨酸的改变率和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的改变率。

在另一实施方案中，代谢分布图包括¹³C-亮氨酸和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的处理的信号数据或使用该处理的信号数据生成，例如，信号的比值、校正的信号、或由多重MR检测的信号模式推导得到的动态或代谢率常数信息，即光谱或图像。

因此，在优选的实施方案中，校正的¹³C-亮氨酸，即¹³C-亮氨酸对¹³C-α-酮异己酸盐信号包含于或用于生成代谢分布图。在进一步优选的实施方案中，校正的¹³C-亮氨酸对总¹³C-碳信号包含于或用于生成代谢分布图，其中总¹³C-碳信号为¹³C-亮氨酸和¹³C-α-酮异己酸盐的信号的总和。在更优选的实施方案中，¹³C-亮氨酸与¹³C-α-酮异己酸盐的比值包含于或用于生成代谢分布图。

在更优选的第二种实施方案中，¹³CO₂的信号和/或¹³C-碳酸氢盐和¹³C-α-酮异己酸盐用于生成所述代谢分布图。

在一个实施方案中，¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的光谱信号强度用于生成代谢分布图。在另一实施方案中，¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的光谱信号积分用于生成代谢分布图。在另一实施方案中，来自¹³CO₂和¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的独立图像或¹³CO₂和¹³C-α-酮异己酸盐的独立图像或¹³C-碳酸氢盐和¹³C-α-酮异己酸盐的独立图像的信号强度用于生成代谢分布图。在又一实施方案中，在两个或多个时间点获得¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号强度来计算¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐的改变率和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的改变率。

在另一实施方案中，代谢分布图包括¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的处理的信号数据或使用该处理的信号数据生成，例如，信号的比值、校正的信号、或由多重MR检测的信号模式推导得到的动态或代谢率常数信息，即光谱或图像。

因此，在优选的实施方案中，校正的¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐信号，即¹³CO₂对¹³C-α-酮异己酸盐信号或者¹³C-碳酸氢盐对¹³C-α-酮异己酸盐包含于或用于生成代谢分布图。在进一步优选的实施方案中，校正的¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐对总¹³C-碳信号包含于或用于生成代谢分布图，其中总¹³C-碳信号为¹³CO₂的信号和/或¹³C-碳酸氢盐信号和¹³C-α-酮异己酸盐的总和。在更优选的实施方案中，¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐信号与¹³C-α-酮异己酸盐信号的比值包含于或用于生成代谢分布图。

在更优选的第三实施方案中，¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号用于生成代谢分布图。

在一个实施方案中，¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的光谱信号强度用于生成代谢分布图。在另一实施方案中，¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的光谱信号积分用于生成代谢分布图。在另一实施方案中，来自¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的独立图像或者¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的独立图像或者¹³C-亮氨酸和¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的独立图像的信号强度用于生成代谢分布图。在又一实施方案中，在两个或多个时间点获得¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号强度来计算¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐的改变率和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的改变率。

在另一实施方案中，代谢分布图包括¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的处理的信号数据或使用该处理的信号数据生成，例如，信号的比值、校正的信号、或由多重MR检测的信号模式推导得到的动态或代谢率常数信息，即光谱或图像。

因此，在优选的实施方案中，校正的¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐信号，即¹³C-亮氨酸对¹³CO₂信号或者¹³C-亮氨酸对¹³C-碳酸氢盐信号和任选地¹³C-亮氨酸对¹³C-α-酮异己酸盐信号，包含于或用于生成代谢分布图。在进一步优选的实施方案中，校正的¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐对总¹³C-碳信号包含于或用于生成代谢分布图，其中总¹³C-碳信号为¹³C-亮氨酸和¹³CO₂的信号和/或¹³C-碳酸氢盐信号和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的总和。在更优选的实施方案中，¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐信号与¹³C-α-酮异己酸盐信号的比值包含于或用于生成代谢分布图。

根据本发明方法的优选实施方案中生成的代谢分布图提供有关所检测的身体、身体的部分、细胞、组织、身体样品等代谢活性的信息，所述信息可以用于随后的步骤中，例如用于鉴定疾病。

这类疾病优选地是肿瘤，因为肿瘤组织通常特征为比健康组织更高的代谢活性。通过将肿瘤或肿瘤的离体样品的代谢分布图与健康组织(例如外周组织或健康离体组织)的代谢分布图进行比较可以明显看出这种更高的代谢活性，并且本身在代谢分布图中通过¹³C-亮氨酸和/或¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐的高信号或者通过高校正的¹³C-亮氨酸和/或¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐信号或者¹³C-亮氨酸对¹³C-α-酮异己酸盐信号和/或¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐对¹³C-α-酮异己酸盐信号的高比值或者¹³C-亮氨酸信号对总碳信号的高比值和/或¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐信号对总碳信号的高比值或者¹³C-亮氨酸和/或¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐叠加的高代谢率可以表现出来。

在肿瘤组织中，谷氨酸的浓度常常高于健康组织中的。这种共底物(co-substrate)将能够在其中BCAT活性高的肿瘤组织中使¹³C-α-酮异己酸盐高翻转为¹³C-亮氨酸。

术语“高”是一种相对术语并且其必须被理解为“高信号、比值、代谢率”等，其是在如上所述的疾病组织的代谢分布图中见到的，相比于在健康组织的代谢分布图中见到的信号、比值、代谢率等，是提高的。

在肝性脂肪变性中，在肝脏中存在着较低活性的酶BCKD并且基于¹³C-α-酮异己酸盐的脱羧的¹³C-呼吸试验被用于诊断所述疾病状态。在该试验中，动态地收集所呼出的¹³CO₂并且通过本领域中的方法来量化。因此指出在根据本发明方法的优选的实施方案中生成的代谢分布图所提供的信息可用于识别肝脏相关疾病如脂肪肝、肝脏纤维化或者肝硬化。对于这样的肝脏相关疾病来说，可以认为它们本身将在患病肝脏的代谢分布图中，相比于健康肝脏的代谢分布图，通过¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐信号和/或这些代谢产物对¹³C-α-酮异己酸盐的比值的变化而显现出来。

又一个疾病可以是肾相关疾病，因为众所周知催化¹³C-α-酮异己酸盐转化为¹³C-亮氨酸的BCAT的活性在肾中是高效的。在通过BCAT活性变化表现自己的肾病中，可以认为，所述变化，其可以是¹³C-亮氨酸信号的变化和/或¹³C-亮氨酸对¹³C-α-酮异己酸盐的比值的变化，能够在病肾/病肾组织的代谢分布图中检测到，当相比于健康肾/健康周围肾组织的代谢分布图。

解剖和/或-如果适用-灌注信息可以包含于本发明的方法中用于鉴定疾病。解剖信息可以例如在本发明方法前后使用或不使用合适的造影剂通过获取质子或¹³C-MR图像而获得。

在另一优选的实施方案，反复给予包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质，因此允许动态研究。与其他使用常规的-在较高剂量下-可能显示毒性作用的MR造影剂的MR检测方法相比，这是本发明的方法的其他优势。α-酮异己酸盐存在于人体中并且超极化¹³C-α-酮异己酸盐在我们使用的且描述于本申请实施例部分中的动物模型中是良好耐受的。因此预期的是超极化¹³C-α-酮异己酸盐将同样在患者中是良好耐受的并且因此该化合物的重复剂量给药应当是可行的。

如上所述，代谢分布图提供有关检测的身体、身体的部分、细胞、组织、身体样品等代谢活性的信息，所述信息可以用于随后的步骤中，例如用于鉴定疾病。然而，内科医生也可以将该信息用于其他步骤中来选择对所检查的患者合适的治疗。

因此，所述信息可以用于监测上述疾病的治疗反应，例如治疗成功，其灵敏度使得该方法特别适合于监测早期治疗反应，即在治疗开始后不久对治疗的反应。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以用于评价药物的功效。在所述实施方案中，在药物筛选的非常早期可以测试用于治疗某种疾病的可能的药物如抗癌药物，例如在所述某种疾病相关模型的体外细胞培养物中，或在患病离体组织中，或在患病的离体器官中。或者，在体内药物筛选的早期可以测试用于治疗某种疾病的可能的药物，例如在所述某种疾病相关动物模型中。通过比较所述细胞培养物、离体组织或离体或测试动物在使用可能的药物治疗前后的代谢分布图，可以测定所述药物的功效和治疗反应和成功，这显然在筛选可能的药物中提供有价值的信息。

本发明的又一个方面是一种组合物，其包括¹³C-α-酮异己酸或者¹³C-α-酮异己酸盐、DNP试剂和任选地顺磁金属离子。可以使用所述组合物以便通过动态核极化(DNP)获得超极化¹³C-α-酮异己酸盐，其可被用作本发明的成像介质中的成像剂(MR活性剂)。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包括¹³C-α-酮异己酸、DNP试剂和任选地顺磁金属离子。在优选的实施方案中，所述DNP试剂是三苯甲基自由基，更优选地式(1)的三苯甲基自由基和最优选地式(1)的三苯甲基自由基，其中M表示氢或钠，R1相同或不同，优选相同并且优选是-CH₂-OCH₃、-CH₂-OC₂H₅、-CH₂-CH₂-OCH₃、-CH₂-SCH₃、-CH₂-SC₂H₅或者-CH₂-CH₂-SCH₃，最优选-CH₂-CH₂-OCH₃。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含顺磁金属离子，优选包含Gd³⁺的盐或顺磁螯合物，更(优选)包含Gd³⁺的顺磁螯合物。任选地，所述组合物进一步包括一种或多种溶剂和/或玻璃形成体。在优选实施方案中，该组合物包括玻璃形成体例如甘油。可以使用上述组合物以便通过动态核极化(DNP)以高极化水平获得超极化¹³C-α-酮异己酸。所述超极化¹³C-α-酮异己酸可以通过用碱如NaOH溶解(如本申请前文中所述的)而转变为超极化¹³C-α-酮异己酸盐。

在另一实施方案中，所述组合物包括¹³C-α-酮异己酸盐，优选地TRIS-¹³C-α-酮异己酸盐或者¹³C-α-酮异己酸钠、DNP试剂和任选地顺磁金属离子。在优选实施方案中，所述DNP试剂是三苯甲基自由基，更优选地式(1)的三苯甲基自由基和最优选地式(1)的三苯甲基自由基，其中M表示氢或钠并且R1优选相同，更优选直链或支链的C₁-C₄-烷基，最优选甲基、乙基或异丙基；或者R1优选相同，更优选被一个羟基取代的直链或支链的C₁-C₄-烷基，最优选-CH₂-CH₂-OH；或者R1优选相同并且表示-CH₂-OC₂H₄OH。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含顺磁金属离子，优选包含Gd³⁺的盐或顺磁螯合物，更(优选)包含Gd³⁺的顺磁螯合物。合适地，所述组合物还包含一种或多种溶剂；优选水性载体。任选地，所述组合物包括玻璃形成体例如甘油。可以使用上述组合物以便通过动态核极化(DNP)以高极化水平获得超极化¹³C-α-酮异己酸盐。

本发明的又一个方面是一种组合物，其包括超极化¹³C-α-酮异己酸或者超极化¹³C-α-酮异己酸盐、DNP试剂和任选地顺磁金属离子，其中所述组合物是通过动态核极化如前面段落中所述的组合物而获得的。

本发明的又一方面是超极化¹³C-α-酮异己酸或者超极化¹³C-α-酮异己酸盐，优选地TRIS-¹³C-α-酮异己酸盐或者¹³C-α-酮异己酸钠。优选的实施方案是超极化¹³C₁-α-酮异己酸或者超极化¹³C₁-α-酮异己酸盐，优选地TRIS-¹³C₁-α-酮异己酸盐或者¹³C₁-α-酮异己酸钠。上述的化合物可被用作在本发明的成像介质中的成像剂(MR活性剂)并且所述成像介质可被用于本发明的¹³C-MR检测的方法。

本发明的又一个方面是制备超极化¹³C-α-酮异己酸或者超极化¹³C-α-酮异己酸盐的方法，该方法包括制备一种组合物，所述组合物包括¹³C-α-酮异己酸或者¹³C-α-酮异己酸盐、DNP试剂和任选地顺磁金属离子，并且对所述组合物进行动态核极化。在本申请中早先历述了所述组合物的制备以及如何对所述组合物进行动态核(极化)。

附图说明：

图1显示了在给予包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质后在小鼠肝脏中¹³C₁-α-酮异己酸盐至¹³C₁-亮氨酸的转化。获得了时间分辨的¹³C-NMR谱并且检测¹³C₁-α-酮异己酸盐和¹³C₁-亮氨酸(176.8ppm)的信号。

图2描述了在给予包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质后的健康大鼠中的肾最初的¹³C-α-酮异己酸盐和¹³C-亮氨酸在¹³C-化学位移图像中的信号强度。切削选择示于图2a中。¹³C-亮氨酸信号分布示于图2b中并且¹³C-α-酮异己酸盐信号分布示于图2c中。

图3描述了在小鼠肋上皮下生长的淋巴瘤小鼠瘤(EL-4)的¹³C-α-酮异己酸盐和¹³C-亮氨酸在¹³C-化学位移图像中的信号强度。¹³C-亮氨酸信号分布示于图³a中并且¹³C-α-酮异己酸盐信号分布示于图³b中。比值图像(¹³C-亮氨酸对¹³C-α-酮异己酸盐)限定瘤并且示于图3中。¹H参考物借助于Omniscan^TM-强化成像获得的，其示于图3d中。

本发明通过以下非限制性实施例举例说明。

实施例

实施例1：包括超极化TRIS-¹³C₁-α-酮异己酸盐的成像介质的制备

实施例1a：制备TRIS-¹³C₁-α-酮异己酸盐

向微试管中添加¹³C₁-α-酮异己酸钠(Cambridge Isotopes，151.2mg，0.987mmol)，TRIS(156.7mg，0.994mmol)和2mL甲醇。对试管进行声处理并且白色粉末(NaCl)沉淀。上层清液被吸取在注射器中并且滤过针筒式滤器(0.45μm)到含35mL二乙醚的另一试管中。沉淀物离心分离并且通过真空除去醚。

实施例1b：TRIS-¹³C₁-α-酮异己酸盐的动态核极化

将实施例1a中获得的TRIS-¹³C₁-α-酮异己酸盐(73.2mg，0.29mmol)溶解在三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟乙基)-苯并[1，2-4，5′]-双-(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)-甲基钠盐(三苯甲基自由基；44.0mg，30.8μmol)(其已根据WO-A1-98/39277的实施例7合成)(44.0mg，30.8μmol)和1，3，5-三(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三-嗪烷-2，4，6-三酮(顺磁金属离子；2.30mg，1.1μmol)(其已经根据WO-A-2007/064226的实施例4合成)的Gd-螯合物的50.0mg的混合物/甘油(1543μL，1948mg)中。对所得的组合物进行声处理并且逐渐地加热来溶解全部化合物。将组合物(80μl，10mM的三苯甲基自由基和1mM的Gd³⁺)用移液管转移到样品杯(夹持探针的容器)中，将样品杯迅速地沉入到液氮中并且然后插入DNP极化器中。组合物在DNP条件下于3.35T磁场中在微波辐照(93.89GHz)下在1.2K下极化。极化后进行固态¹³C-NMR，测定的固态极化为36％。

实施例1c：溶解和制备成像介质

动态核极化120分钟后，将所获得的冷冻极化组合物溶解在6mL磷酸盐缓冲液(pH7.3，40mM)中。含溶解的组合物的最终溶液的pH值是7.3。所述最终溶液中的TRIS-¹³C₁-α-酮异己酸盐浓度是50mM。

在400MHz通过液态¹³C-NMR确定液态极化为34％。

实施例2：包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质的制备

实施例2a：¹³C₁-α-酮异己酸钠的动态核极化

将¹³C₁-α-酮异己酸钠(19.5mg，0.126mmol)溶解在三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟乙基)-苯并[1，2-4，5′]-双-(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)-甲基钠盐(三苯甲基自由基；44.0mg，30.8μmol)(其已根据WO-A1-98/39277的实施例7合成)(44.0mg，30.8μmol)和1，3，5-三(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三-嗪烷-2，4，6-三酮(顺磁金属离子；2.30mg，1.1μmol)(其已经根据WO-A-2007/064226的实施例4合成)的Gd-螯合物的50.0mg的混合物/甘油(1543μL，1948mg)中。向该溶液中添加5μL的水。对所得的组合物进行声处理并且逐渐地加热来溶解全部化合物。将组合物(110μl，12.5mM的三苯甲基自由基和1.3mM的Gd³⁺)用移液管转移到样品杯中，将样品杯迅速地沉入到液氮中并且然后插入DNP极化器中。组合物在DNP条件下于3.35T磁场中在微波辐照(93.89GHz)下在1.2K下极化。极化之后是固态¹³C-NMR，确定固态极化为大约30％。

实施例2b：溶解和制备成像介质

动态核极化120分钟后，将所获得的冷冻极化组合物溶解在6ml的磷酸盐缓冲液(pH7.3，40mM)中。含溶解的组合物的最终溶液的pH值是7.3。所述最终溶液中的¹³C₁-α-酮异己酸钠浓度是50mM。

在400MHz通过液态¹³C-NMR确定液态极化为29％。

实施例3：包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质的制备

实施例3a：制备¹³C₁-α-酮异己酸

将¹³C₁-α-酮异己酸钠(210.0mg，1.37mmol)溶解在500μL浓H2SO4/2mL水的冷却溶液中。混合物用6mL二乙醚萃取4次。合并有机相并且用MgSO4干燥。过滤干燥溶液(0.45μm针筒式滤器)而除去MgSO4颗粒并且在真空条件下除去二乙醚。获得175mg的¹³C₁-α-酮异己酸(98％)。

实施例3a：¹³C₁-α-酮异己酸的动态核极化

将三苯甲基自由基三(8-羧基-2，2，6，6-(四(甲氧基乙基)-苯并[1，2-4，5’]-双-(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)-甲基钠盐(1.18mg，0.74mmol)(其已根据WO-A2-2006/011811的实施例1合成)和1.52mg的1，3，5-三(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三-嗪烷-2，4，6-三酮的Gd-螯合物的水溶液(顺磁金属离子，14.5μL/g溶液)(其已根据WO-A-2007/064226的实施例4合成)溶解在49μL¹³C₁-α-酮异己酸(50.5mg，0.19mmol)中。对所得的组合物进行声处理并且逐渐地加热来溶解全部化合物。将组合物(42μl，14mM的三苯甲基自由基和1.5mM的Gd³⁺)用移液管转移到样品杯中，将样品杯迅速地沉入到液氮中并且然后插入DNP极化器中。组合物在DNP条件下于3.35T磁场中在微波辐照(93.89GHz)下在1.2K下极化。极化之后是固态¹³C-NMR，确定固态极化为27％。

实施例3c：溶解和制备成像介质

动态核极化90分钟后，将所获得的冷冻极化组合物溶解在6mL由5.97mL磷酸盐缓冲液(pH7.3，40mM)和30μLNaOH水溶液(12M)制备的溶液中。含溶解的组合物的最终溶液的pH值是7.3。所述最终溶液中的¹³C₁-α-酮异己酸钠浓度是50mM。

在400MHz通过液态¹³C-NMR确定液态极化为25％。

实施例4：使用包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质，用为检测小鼠肝脏而放置的表面线圈进行的体内¹³C-MR检测

在6s的时间内将175μl如实施例1所述制备的包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质注射到C57Bl/6小鼠中。所述成像介质中¹³C₁-α-酮异己酸钠的浓度为约50mM。将12mm表面线圈(调谐碳)置于小鼠上来覆盖肝脏区域并且通过¹³C-MR光谱法检测¹³C-α-酮异己酸盐和¹³C-亮氨酸的信号，所述¹³C-MR光谱法在2.4TBruker光谱仪中进行来形成代谢分布图。以5s的循环时间和30度RF脉冲，获得了总共10个¹³C-光谱。结果示于图1中。在本实施例中，¹³C-亮氨酸信号是¹³C-α-酮异己酸盐信号的大约1％。

实施例5：使用包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质，健康大鼠肾的体内¹³C-化学位移成像

在6s的时间内将2mL的如实施例2所述制备的包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质注射到Wistar大鼠中。所述成像介质中¹³C₁-α-酮异己酸钠的浓度为约50mM。将大鼠线圈(调谐碳和质子)置于大鼠上来覆盖肾区域并且通过¹³C-MR光谱法检测¹³C₁-α-酮异己酸盐和¹³C-亮氨酸的信号，所述¹³C-MR光谱法是使用2.4T Bruker光谱仪进行的，从而形成肾区域的代谢分布图。使用以下参数获得¹³C-化学位移图像：FOV12.6x12.6mm2X12mm，矩阵大小18x18，7度RF脉冲，TR＝66ms。总采集时间是15秒并且在开始注射成像介质后18秒，化学位移成像开始。获得了高分辨率质子图像备考。结果示于图2中。

实施例6：使用包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质，用放置在皮下小鼠淋巴瘤(EL-4)上的表面线圈进行体内¹³C-化学位移成像

将EL-4细胞注入C57Bl/6小鼠来形成皮下小鼠淋巴瘤。在6s的时间内将175μL的如实施例2所述制备的包括超极化¹³C₁-α-酮异己酸钠的成像介质注射到小鼠中。所述成像介质中¹³C₁-α-酮异己酸钠的浓度为约50mM。将20mm表面线圈(调谐碳)置于皮下瘤上并且通过¹³C-MR光谱法检测¹³C-α-酮异己酸盐和¹³C-亮氨酸的信号，所述¹³C-MR光谱法是使用2.4T Bruker光谱仪进行的，从而形成肿瘤和周围健康组织的代谢分布图。使用以下参数获得¹³C-化学位移图像：FOV 35x35mm2x10mm，矩阵大小16x16，10度RF脉冲，TR＝35ms。总采集时间是11秒(呼吸时触发死亡(die to triggering on breathing))并且在开始注射成像介质后15秒，化学位移成像开始。进行Omniscan^TM(GE Healthcare)-强化质子成像来证实肿瘤位置和灌注。结果示于图3中。在大血管中，¹³C-α-酮异己酸盐信号是最高的；然而在表面线圈的全部视野上看到了¹³C-α-酮异己酸盐的分布。¹³C-亮氨酸分布局限于肿瘤区域并且比值图象(¹³C-亮氨酸对¹³C-α-酮异己酸盐)限定了肿瘤区域，其被证实并且示于造影提高的质子图像中。

Claims (20)

1.包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐的成像介质。

2.根据权利要求1的成像介质，其中所述超极化¹³C-α-酮异己酸盐是超极化¹³C₁-α-酮异己酸盐。

3.根据权利要求1的成像介质，其中所述超极化¹³C-α-酮异己酸盐是超极化TRIS-¹³C-α-酮异己酸盐或超极化¹³C-α-酮异己酸钠。

4.根据权利要求1至3中任一项的成像介质，其用于体内或体外¹³C-MR检测。

5.根据权利要求1-3中任一项的成像介质在制备¹³C-MR检测的成像介质中的用途。

6.根据权利要求5的用途，其中检测¹³C-亮氨酸和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号。

7.根据权利要求5的用途，其中检测¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号。

8.根据权利要求5的用途，其中检测¹³C-亮氨酸和¹³CO₂和/或¹³C-碳酸氢盐和任选地¹³C-α-酮异己酸盐的信号。

9.根据权利要求5至8中任一项的用途，用于通过体内¹³C-MR检测产生有生命的人类或非人类动物的代谢分布图。

10.根据权利要求5至8中任一项的用途，用于通过体外¹³C-MR检测产生细胞培养物中的细胞、样品、离体组织或来自人类或非人类动物的离体器官的代谢分布图。

11.根据权利要求9的用途，其中代谢分布图用于确定疾病。

12.根据权利要求11的用途，其中所述疾病为癌症。

13.根据权利要求10的用途，其中代谢分布图用于确定疾病。

14.根据权利要求13的用途，其中所述疾病为癌症。

15.一种组合物，其包括¹³C-α-酮异己酸盐或¹³C-α-酮异己酸、DNP试剂和任选地顺磁金属离子。

16.根据权利要求15的组合物，其中所述顺磁金属离子存在并且是包括Gd³⁺的顺磁螯合物。

17.根据权利要求15和16中任一项的组合物，其中所述DNP试剂是式(1)的三苯甲基自由基

其中

M表示氢或一价阳离子；和

R1相同或不同，表示任选被一个或多个羟基取代的直链或支链的C₁-C₆-烷基，或-(CH₂)_n-X-R2基团，

其中n为1、2或3；

X为O或S；以及

R2为任选被一个或多个羟基取代的直链或支链的C₁-C₄-烷基。

18.根据权利要求15至16中任一项的组合物，其用于动态核极化。

19.一种组合物，其包括超极化¹³C-α-酮异己酸盐或¹³C-α-酮异己酸、DNP试剂和任选地顺磁金属离子，其中所述组合物是通过动态核极化权利要求15至17中任一项的组合物而获得的。

20.超极化¹³C-α-酮异己酸盐或超极化¹³C-α-酮异己酸。

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