CN101506679B - 细胞死亡的13c-mr成像或波谱分析 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质的细胞死亡的13C-MR成像和/或13C-MR波谱分析方法。
Description
本发明涉及用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质的细胞死亡的13C-MR成像或波谱分析方法。
细胞死亡可起因于多种机制。这些机制中有几种已被完全确定，包括细胞凋亡和坏死。
细胞凋亡即程序性细胞死亡在控制多细胞生物发育和维持多细胞生物的组织稳态中起重要作用。通过一系列需要能量并由附近的吞噬细胞吞噬将死的细胞来终止的严密调控步骤来进行细胞凋亡，在该过程中避免由细胞坏死引起的炎性反应。在哺乳动物细胞中，由两种主要信号途径介导细胞凋亡：第一种通过经由细胞表面死亡受体启动的外途径，第二种通过内部启动子，例如DNA损伤。这两种途径都集中于线粒体表面。
细胞凋亡在哺乳动物体内的众多过程中是关键事件。例如，胚胎发育高度依赖细胞凋亡，迅速更新的组织需要严密调控以避免严重的病理结果。细胞凋亡调控失败，即细胞死亡不够多或太多，导致象癌症和自身免疫性疾病(不够多)或神经退行性疾病例如阿尔海默病(细胞死亡太多)等病理状况。因此，对于非侵入性地体内鉴别人类或非人类动物身体内的细胞凋亡有兴趣。
坏死是一种偶发性细胞死亡形式，其起因于长期暴露于创伤、感染、癌症、梗塞、毒素和炎症。对细胞的一个基本系统的严重损伤导致对其它系统的二级损伤，所谓级联效应。坏死特征为大小随机的DNA片段、自由基形成、细胞增大和导致释放细胞内容物的细胞膜完整性丧失。
坏死可起因于对创伤位点、感染或梗塞缺乏适当护理。梗塞发生例如心肌中，但也发生于其它组织中，尤其是脑中。尽管梗塞可治愈到某种程度，但在坏死情况下，对于生物体其余部分的有害结果只能被预防或至少减轻。关于梗塞形成，知道坏死的程度和种类对于进一步医学治疗很重要。因此，对非侵入地体内鉴别人类或非人类动物身体内的坏死有兴趣。
本领域已知在人类或非人类动物体中的细胞死亡成像的几种成像形式。Lahorte等，Eur.J.Nucl.Med.31(2004)，887业已综述用于细胞死亡成像的放射性药物。单独用18F-FDG的PET成像或与CT联合也已用于检测细胞死亡，参见例如Romer等，Blood 91(1998)，4464或von Schulthess等，Radiology 238(2006)，405。
磁共振(MR)检测例如MR成像(MRI)和MR波谱分析(MRS)可能是用于检测细胞死亡的有价值的工具，这些工具对医生变得特别有吸引力，原因是它们允许以非侵入方式获得患者身体或其部分的图像并不需让患者及医务人员暴露于潜在有害的辐射例如X射线。因为其高质量的图像和良好的空间分辨率及瞬时清晰度，MRI为软组织和器官的有利的成像技术。
检测细胞死亡的基于MR的方法已成为几个新近综述的主题，例如Kettunen等，Prog.Nucl.Mag.Res.Sp.47(2005)，175或等，Eur.J.Radiol.56(2005)，143。
现在业已发现超极化13C-丙酮酸盐可作为用13C-MR成像或13C-MR波谱分析在人类或非人类动物体内检测细胞死亡的试剂使用。
丙酮酸盐是内生化合物，其即使在高浓度也为人类身体高度耐受。作为柠檬酸循环的前体，丙酮酸盐在人体中起着重要的代谢作用。丙酮酸盐转化为不同化合物：其转氨作用产生丙氨酸；经由氧化脱羧作用，丙酮酸盐转化为乙酰-CoA和二氧化碳(其进一步转化为碳酸氢盐)；丙酮酸盐还原产生乳酸盐；和其羧化作用产生草酰乙酸盐。
另外，超极化13C-丙酮酸盐代谢转化为其代谢物超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐(仅在13C1-丙酮酸盐、13C1，2-丙酮酸盐或13C1，2，3-丙酮酸盐情况下)和超极化13C-丙氨酸可用于用MR研究人体内代谢过程。13C1-丙酮酸盐在人全血中于37℃具有约42秒的T1驰豫时间，然而，业已发现超极化13C-丙酮酸盐转化为超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸快到可检测来自13C-丙酮酸盐母体化合物和其代谢物的信号。丙氨酸、碳酸氢盐和乳酸盐的量视被研究的组织的代谢状态而定。超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸的MR信号强度与这些化合物的量及检测时剩下的极化程度相关联，因此通过监测超极化13C-丙酮酸盐转化为超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸，可能通过非侵入性MR成像或MR波谱分析来研究人类或非人类动物身体的体内代谢过程。
业已发现MR信号幅度由不同丙酮酸盐代谢物产生，视组织类型而变化。由丙氨酸、乳酸盐、碳酸氢盐和丙酮酸盐形成的独特的代谢峰图可用作被检查组织的代谢状态的指纹图谱，因此，使得可辨别健康组织和肿瘤组织。业已在WO-A-2006/011810中详细阐述超极化13C-丙酮酸盐用于肿瘤(且肿瘤组织显示高代谢活性)成像的用途。
另外，业已在WO-A-2006/054903中阐述超极化13C-丙酮酸盐用于心脏成像的用途。
因此，本发明第一方面提供用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质检测细胞死亡的13C-MR成像和/或13C-MR波谱分析方法。
术语“细胞死亡”表示起因于多种机制的所有形式的细胞死亡。该术语包括细胞凋亡和坏死。
术语“13C-丙酮酸盐”表示13C-丙酮酸的盐。
术语“超极化”和“极化”在下文中可互换使用，表示核极化水平超过0.1％、更优选超过1％和最优选超过10％。
极化水平可例如通过固态13C-NMR测量用固态超极化13C-丙酮酸盐(例如通过使13C-丙酮酸盐动态核极化(DNP)获得的固态超极化13C-丙酮酸盐)来测定。固态13C-NMR测量优选由用低脉冲角的获得简单脉冲的NMR程序(simple pulse-acquire NMR sequence)组成。将NMR波谱中超极化13C-丙酮酸盐信号强度与在极化处理前获得的NMR波谱中的13C-丙酮酸盐信号强度比较。然后从极化前后信号强度比率计算极化水平。
以类似的方式，可通过液态NMR测量测定溶解的超极化13C-丙酮酸盐的极化水平。再次比较溶解的超极化13C-丙酮酸盐的信号强度和极化前溶解的13C-丙酮酸盐的信号强度。随后从极化前后3C-丙酮酸盐的信号强度比率计算极化水平。
术语“成像介质”表示包含作为MR活化剂的超极化13C-丙酮酸盐液态组合物。本发明成像介质可在MR成像中用作成像介质或在MR波谱分析中用作MR波谱分析试剂。
本发明方法的成像介质可作为用于体内MR成像和/或波谱分析(即在活人或活的非人类动物中实施的MR成像和/或波谱分析)的成像介质使用。另外，本发明方法的成像介质可作为用于体外MR成像和/或波谱分析(例如用于检测细胞培养物或离体组织中的细胞死亡)的成像介质使用。细胞培养物可源自从样品获得的细胞，所述样品可源自人类或非人类动物体，例如血液、尿液或唾液，而离体组织可从活组织检查或手术过程获得。
用于本发明方法的超极化13C-丙酮酸盐的同位素富集优选至少75％、更优选至少80％和尤其优选至少90％，超过90％同位素富集最优选。理想的是，所述富集为100％。用于本发明方法的13C-丙酮酸盐可在以下位置富集同位素：在C1-位(下文中表示为13C1-丙酮酸盐)、在C2-位(下文中表示为13C2-丙酮酸盐)、在C3-位(下文中表示为13C3-丙酮酸盐)、在C1-和C2-位(下文中表示为13C1，2-丙酮酸盐)、在C1-和C3-位(下文中表示为13C1，3-丙酮酸盐)、在C2-和C3-位(下文中表示为13C2，3-丙酮酸盐)或在C1-、C2-和C3-位(下文中表示为13C1，2，3-丙酮酸盐)。因为在人全血中于37℃下13C1-丙酮酸盐比在其它C-位富集同位素的13C-丙酮酸盐具有更高的T1弛豫时间(约42秒)，所以优选在C1-位富集同位素。
NMR活性13C-核的超极化可通过不同方法来完成，例如阐述于WO-A-98/30918、WO-A-99/24080和WO-A-99/35508(它们通过引用结合到本文中)中的方法，超极化方法有从惰性气体极化转移、“强力法”(“brute force”)、旋转制冷(spin refrigeration)、仲氢法和动态核极化(DNP)。
为了得到超极化13C-丙酮酸盐，优选直接使13C-丙酮酸盐极化，或使13C-丙酮酸极化并例如通过用碱中和将极化的13C-丙酮酸转化为极化的13C-丙酮酸盐。
用于获得超极化13C-丙酮酸盐的一个适当的方法是从超极化惰性气体极化转移，该方法阐述于WO-A-98/30918中。可通过循环极化光使具有非零核自旋的惰性气体超极化。超极化惰性气体(优选He或Xe或这样的气体的混合物)可用于实现13C-核的超极化。超极化气体可呈气相，其可溶解于液体/溶剂中，或超极化气体本身可作为溶剂。或者，可将该气体冷凝到冷却的固态表面上并以该形式使用，或使其升华。优选让超极化气体与13C-丙酮酸盐或13C-丙酮酸均匀混合。因此，若使在室温为液态的13C-丙酮酸极化，则优选让超极化气体溶解于液体/溶剂中或作为溶剂。若使13C-丙酮酸盐极化，则优选让超极化气体溶解于也溶解丙酮酸盐的液体/溶剂中。
用于获得超极化13C-丙酮酸盐的另一适当方法为通过在极低温度和强磁场时的热力学平衡使13C-核极化。通过用与NMR波谱仪的操作磁场和温度相比极强磁场和极低温度(强力法)来实现超极化。所用磁场强度应该尽可能高，适宜地高于1T，优选地高于5T，更优选15T或更高，尤其优选20T或更高。温度应该极低，例如4.2K或更低，优选1.5K或更低，更优选1.0K或更低，尤其优选100mK或更低。
获得超极化13C-丙酮酸盐的另一适当方法为旋转制冷方法。该方法包括通过旋转制冷极化使固态化合物或系统自旋极化。该系统掺有合适的晶体顺磁性材料或与其均匀混合，这些材料为例如Ni2+、具有三阶或更多阶对称轴的镧系元素或锕系元素离子。使用仪器比DNP所需要的简单，且不需均匀磁场，因为不施用共振激发场。通过用物理方法使样品围绕垂直于磁场方向的轴旋转来进行该过程。该方法的必要条件是顺磁性物类具有高各向异性g-因子。作为样品旋转的结果，将使电子顺磁共振与核自旋联系，导致核自旋温度降低。样品旋转一直进行到核自旋极化达到新的平衡。
在一个优选实施方案中，将DNP(动态核极化)用于获得超极化13C-丙酮酸盐。在DNP中，待极化化合物中的MR活性核的极化通过极化剂或所谓的DNP剂(包含不成对电子的化合物)来实现。在DNP过程中，提供通常为微波辐射形式的能量，该能量将在最初激发DNP剂。一旦退到基态，DNP剂不成对的电子就极化转移到待极化化合物的NMR活性核，例如极化转移到13C-丙酮酸盐的13C核。在DNP过程中通常使用中度或强磁场和极低温度，例如在液态氦和约1T或更高磁场中实施DNP过程。或者，可采用足以增进极化的中度磁场和任何温度。DNP技术例如进一步阐述于WO-A-98/58272和WO-A-01/96895中，二者都通过引用结合到本文中。
为了通过DNP方法使化合物极化，制备待极化的化合物和DNP剂的混合物(“样品”)，然后使其冻结，插入到用于极化的DNP极化器中。极化后，通过使其融解或通过使其溶解于合适的溶解介质中将冻结的固态超极化样品迅速转化为液态。优选溶解，冻结的超极化样品的溶解过程和因此适当的装置详细阐述于WO-A-02/37132中。融解过程和用于融解的适当装置例如阐述于WO-A-02/36005中。
为了使待极化化合物获得高极化水平，在DNP过程中所述化合物和DNP剂需要紧密接触。若样品冻结或冷却后结晶，则不符合这种情况。为了避免结晶，样品中必须有玻璃体成形剂(glass former)，或者必须选择在冻结后不结晶而是形成玻璃体的化合物用于极化。
如前所述的13C-丙酮酸或13C-丙酮酸盐为合适的获得超极化13C-丙酮酸盐的原材料。
同位素富集的13C-丙酮酸盐例如作为13C-丙酮酸钠可市购。或者，其可如S.Anker，J.Biol.Chem 176，1948，133-1335所述合成。
本领域已知几种用于合成13C1-丙酮酸的方法。简言之，Seebach等，Journal of Organic Chemistry 40(2)，1975，231-237阐述依赖保护和活化含羰基原材料如S，S-缩醛(例如1，3-二噻烷或2-甲基-1，3-二噻烷)的合成路线。使二噻烷金属化，并与含甲基化合物和/或13CO2反应。通过用在该参考文献中概述的合适的同位素富集的13C-组分，可能获得13C1-丙酮酸盐、13C2-丙酮酸盐或13C1，2-丙酮酸盐。通过用阐述于该文献中的常规方法可随后释放羰基官能团。一个不同的合成路线从乙酸开始，其首先转化为乙酰溴，然后与Cu13CN反应。经由酰胺将获得的腈转化为丙酮酸(参见例如S.H.Anker等，J.Biol.Chem.176(1948)，1333或J.E.Thirkettle，Chem Commun.(1997)，1025)。另外，可通过使市购13C-丙酮酸钠质子化来获得13C-丙酮酸，例如通过阐述于US 6,232,497中的方法或通过阐述于WO-A-2006/038811中的方法。
通过DNP使13C-丙酮酸超极化详细阐述于WO-A1-2006/011809(通过引用结合到本文中)中。简言之，可将13C-丙酮酸直接用于DNP，因为冻结时其形成玻璃体。在DNP后，冻结的超极化13C-丙酮酸需要溶解和中和，即转化为13C-丙酮酸盐。转化需要强碱。另外，因为13C-丙酮酸为强酸，需要选择在该强酸中稳定的DNP剂。优选的碱为氢氧化钠，用氢氧化钠将超极化13C-丙酮酸转化为超极化13C-丙酮酸钠，其为用于体内MR成像和/或波谱分析(即在活人或活的非人类动物中进行的MR成像和/或波谱分析)的成像介质的优选13C-丙酮酸盐。
或者，13C-丙酮酸盐(即13C-丙酮酸的盐)可用于DNP。优选的盐为包含选自以下的无机阳离子的13C-丙酮酸盐：NH4 +、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+，优选NH4 +、K+、Rb+或Cs+，更优选K+、Rb+、Cs+，最优选Cs+，其详细阐述于PCT/NO07/00109(通过引用结合到本文中)中。这些优选的13C-丙酮酸盐的合成也公开于PCT/NO07/00109中。若将超极化13C-丙酮酸盐用于体内MR成像和/或波谱分析的成像介质中，则优选用生理上极为耐受的阳离子如Na+或甲葡胺交换选自以下的无机阳离子：NH4 +、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+。这可通过本领域已知方法例如用阳离子交换柱来进行。
进一步优选的盐为有机胺或氨基化合物的13C-丙酮酸盐，优选TRIS-13C1-丙酮酸盐或甲葡胺-13C1-丙酮酸盐，其详细阐述于WO-A2-2007/069909(通过引用结合到本文中)中。这些优选13C-丙酮酸盐的合成也公开于WO-A2-2007/069909中。
若通过DNP获得用于本发明方法的超极化13C-丙酮酸盐，则包含13C-丙酮酸或13C-丙酮酸盐和DNP剂的待极化的样品可进一步包含顺磁性金属离子。业已发现待通过DNP极化的组合物中顺磁性金属离子的存在，将导致提高13C-丙酮酸/13C-丙酮酸盐的极化水平，其详细阐述于WO-A2-2007/064226(通过引用结合到本文中)中。
如前所述，本发明方法成像介质可用作体内MR成像和/或波谱分析(即在活人或活的非人类动物中实施的MR成像和/或波谱分析)的成像介质。这样的成像介质优选除了MR活性剂13C-丙酮酸盐外还包含水性载体，优选为生理上可耐受和药用水性载体，例如水、缓冲溶液或盐水。这样的成像介质可进一步包含常规药用或兽用载体或赋形剂，例如配方助剂如常规用于人类或兽医中的诊断组合物。
另外，本发明方法的成像介质可用作体外MR成像和/或波谱分析(例如用于检测细胞培养物或离体组织中的细胞死亡)的成像介质。这样的成像介质优选除了MR活性剂13C-丙酮酸盐外还包含与体外细胞或组织检测相容并可用于体外细胞或组织检测的溶剂，例如DMSO或甲醇或包含水性载体和非水性溶剂的溶剂混合物，例如DMSO和水或缓冲溶液或甲醇和水或缓冲溶液的混合物。对于技术人员来说很明显，药用载体、赋形剂和配方助剂可存在于这样的成像介质中但对于这样的目的并不是必需的。
在另一实施方案中，本发明方法成像介质包含非超极化乳酸盐，下文中用乳酸盐表示。
适宜地，以乳酸或乳酸的盐的形式加入乳酸盐，优选乳酸锂或乳酸钠，最优选乳酸钠。
用于本发明方法的显像剂中超极化13C-丙酮酸盐和乳酸盐的浓度大约相等或相等，或乳酸盐以低于或高于13C-丙酮酸盐的浓度存在。若例如显像剂含有xM 13C-丙酮酸盐，则其含有xM乳酸盐或约xM乳酸盐或更低乳酸盐，但优选不低于xM的十分之一的乳酸盐或更多乳酸盐，但优选不高于xM的3倍的乳酸盐。在一个优选实施方案中，用于本发明方法的显像剂中乳酸盐的浓度约等于或等于超极化13C-丙酮酸盐的浓度。术语“约等于......浓度”表示乳酸盐浓度为13C-丙酮酸盐浓度的+/-30％，优选+/-20％，更优选+/-10％。
适宜地，在极化处理后将乳酸盐加入到超极化13C-丙酮酸盐。可能存在几种加入乳酸盐的方式。当极化处理导致包含超极化13C-丙酮酸盐的液态组合物时，可将乳酸盐溶解于所述液态组合物中，或可将乳酸盐在合适溶剂(优选水性载体)中的溶液加入到该液态组合物中。若极化处理导致包含超极化13C-丙酮酸盐的固态组合物，则可将乳酸盐溶解于用于溶解该固态组合物的溶解介质中。例如，可将通过DNP方法极化的13C-丙酮酸盐溶解于水性载体例如含有乳酸盐的水或缓冲溶液中。若通过DNP已经获得超极化13C-丙酮酸盐，则优选将乳酸盐加入到最终液态组合物中，即加到冻结的极化13C-丙酮酸盐/13C-丙酮酸溶解/融化后的液态组合物中，或加到除掉DNP剂和/或任选的顺磁性金属离子的液态组合物中。此外，乳酸盐可作为固体加入到液态组合物或溶解于合适溶剂例如水性载体中。为了促进乳酸盐的分散，可使用本领域已知的几种手段，例如搅拌、旋涡振荡或超声。然而，优选快速和不需混合设备或有助于与液态组合物接触的方法。因此，优选例如旋涡振荡或超声等方法。
在另一实施方案中，本发明成像介质与乳酸盐一起给予。在该实施方案中，乳酸盐可溶解于合适溶剂例如水性载体中，并在给予/加入超极化13C-丙酮酸盐(“预处理(pre-conditioning)”)之前或伴随给予/加入超极化13C-丙酮酸盐，将其给予人类或非人类动物体或加入到细胞培养物或离体组织中。
对于预处理，优选在给予超极化13C-丙酮酸盐之前0.5-5分钟、更优选在给予超极化13C-丙酮酸盐之前1-2分钟将乳酸盐给予人类或非人类动物体。最优选地，伴随给予超极化13C-丙酮酸盐将乳酸盐给予人类或非人类动物体。
在细胞培养物或离体组织情况下，乳酸盐分布到细胞中比在人类或非人类动物体发生得更快，因为在后者中不得不将乳酸盐给予脉管系统并从给予点分布到被检查的组织。因此，在细胞培养物或离体组织情况下，可在临加入超极化13C-丙酮酸盐之前将乳酸盐加入到所述细胞培养物或离体组织，优选在加入超极化13C-丙酮酸盐之前2-1分钟、更优选1-0.5分钟、最优选伴随加入超极化13C-丙酮酸盐。
为了在本发明方法中作为体内MR成像或波谱分析的成像介质使用，包含超极化13C-丙酮酸盐和任选的乳酸盐的成像介质必须适于给予活人或活的非人类动物体。该成像介质优选包含如上所述水性载体，例如水、缓冲液或缓冲液混合物。成像介质可进一步包含常规药用载体、赋形剂和配方助剂。因此，成像介质可例如包括稳定剂、渗透压调节剂、助溶剂等等。
为了在本发明方法中作为体外MR成像或波谱分析的成像介质使用，包含超极化13C-丙酮酸盐和任选的乳酸盐的成像介质必须适于加入到例如细胞培养物或离体组织，该成像介质优选包含如上所述水性载体，例如水、缓冲液或缓冲液混合物。
若超极化13C-丙酮酸盐用作在体外MR成像或波谱分析方法中例如用细胞培养物或离体组织检测细胞死亡的显像剂，则加入到细胞培养物或离体组织的包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质的13C-丙酮酸盐为10mM-100mM、更优选20mM-90mM和最优选40-80mM13。
通过随着时间过去跟踪13C-丙酮酸盐信号和其代谢物13C-乳酸盐信号，可由本发明方法检测细胞死亡。在存活的例如非凋亡/非坏死细胞中，13C-丙酮酸盐信号随时间衰减。由于13C-丙酮酸盐代谢转化为13C-乳酸盐，开始13C-乳酸盐信号增强，然后主要由于弛豫时间而慢慢减弱。在将死例如凋亡或坏死的细胞中，13C-丙酮酸盐到13C-乳酸盐的代谢转化大大减少，尽管13C-丙酮酸盐信号随时间衰减，但13C-乳酸盐信号仅稍微增强，或者可能根本无法检测到，这要视细胞死亡程度/死亡细胞的量而定。不应该受该理论的束缚，我们认为这是由于催化伴随NADH和NAD+互变的丙酮酸盐和乳酸盐互变的乳酸脱氢酶活性损失，和/或由于NADH和NAD+协同因子的损失，和/或由于细胞乳酸盐浓度降低。
对通过用依托泊苷(etoposide)处理诱导经历细胞死亡的EL-4鼠淋巴瘤细胞的酸提取物进行31P-NMR测定，证明与未处理的对照细胞比较，来自NAD(H)的共振强度降低了。通过DNA损伤诱导的多聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)活化可解释NAD(H)损失，PARP使各种蛋白质聚腺苷化，并用NAD+作为底物。也增强了来自糖酵解中间体1，6-二磷酸果糖(FBP)的共振，这可通过经由其辅酶NAD(H)损失抑制糖酵解酶甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)来解释。用竞争性抑制剂(20mM烟酰胺或10mM 3-氨基苯甲酰胺)抑制PARP活性抑制了NAD(H)的损失，并在将死的细胞中观察到FBP浓度增大。
这种由于PARP活化的NAD(H)损失应该也抑制乳酸脱氢酶(LDH)活性，并因此抑制的丙酮酸盐和乳酸盐之间的13C-标记的测定通量。与该假设一致的是，观察到用烟酰胺和依托泊苷或烟酰胺和3-氨基苯甲酰胺二者处理的细胞，仍保持其在丙酮酸盐和乳酸盐库(pool)之间转移超极化13C-标记的能力，同时用荧光显微镜检测仍表现将死细胞的常见形态特征。
业已进一步发现，加入乳酸盐-存在于本发明成像介质中或单独加入/给予-导致可观察的13C-乳酸盐量增加，因此，增强来自13C-乳酸盐的MR信号。
如上面所解释，来自13C-乳酸盐的信号是在检测细胞死亡的MR成像或波谱分析测量中监测到的信号，与人们从活组织观测到的13C-乳酸盐信号比较，将死或死组织显示低或没有13C-乳酸盐信号。增强的来自13C-乳酸盐的信号使得区别“低乳酸盐信号”和“无乳酸盐信号”情形更容易，即区别某种程度的细胞死亡更容易。
施用以联合频率(combined frequency)和空间选择方式来编码(encode)感兴趣体积的MR成像序列，随后通过MR成像或波谱分析，在加入显像剂(t＝0)到约10分钟、优选6分钟和更优选5分钟的时间段对13C-丙酮酸盐的13C-MR信号进行跟踪。在同一时期内，监测13C-乳酸盐信号的出现、增强和随后的衰减。为了获得定量评估，可进行健康细胞或组织的MR成像或波谱分析，可比较结果一即经给定时间形成13C-乳酸盐的量或速率。
若超极化13C-丙酮酸盐在体内MR成像或波谱分析方法(例如在活人或活的非人类动物体)中用作检测细胞死亡的显像剂，则优选胃肠外(优选静脉内)给予所述身体含有超极化13C-丙酮酸盐的成像介质。通常将被检查的身体安置在MR磁体内。放置专门的13C-MR RF-线圈覆盖目的区域。成像介质的剂量和浓度将视一系列因素例如毒性和给予途径而定。通常以达至每kg体重1mmol 13C-丙酮酸盐、优选0.01-0.5mmol/kg、更优选0.1-0.3mmol/kg的浓度给予成像介质。给予速率优选低于10ml/秒、更优选低于6ml/分钟和最优选从5ml/秒到0.1ml/秒。给予后不到400秒、优选不到120秒、更优选给予后不到60秒、尤其优选20-50秒，施用以联合频率和空间选择方式编码感兴趣体积的MR成像序列。这将产生13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的代谢图像。施用MR序列的准确时间高度依赖检测细胞死亡的感兴趣体积。
可通过用如阐述于例如T.R.Brown等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，3523-3526(1982)；A.A.Maudsley，等，J.Magn.Res 51，147-152(1983)中的所谓的波谱成像序列完成感兴趣体积的编码。波谱图像数据含有很多体积元素，其中每一元素含有全13C-MR波谱。13C-丙酮酸盐和其代谢物13C-乳酸盐在13C-MR波谱中具有其独特的位置，其共振频率可用于鉴别它们。其共振频率的峰积分直接分别与13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的量相关联。当用例如L.Vanhamme等，J MagnReson 129，35-43(1997)所述时域拟合程序估测13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的量时，可产生13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐图像，其中彩色编码或灰色编码代表了所测13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的量。
尽管波谱成像方法已经证明了其在用各种MR核(例如1H、31P、23Na)产生代谢图像中的价值，但完全编码波谱成像所需的重复量使得该方法较不适于超极化13C。在获得MR数据的整个期间，为了确保得到超极化13C-信号不得不小心谨慎。在付出降低信噪比代价的情况下，可通过降低在每一相位编码步骤施用的RF-脉冲角达到这一点。较高矩阵尺度需要更多相位编码步骤和更长的扫描时间。
基于P.C.Lauterbur(Nature，242，190-191，(1973)和P.Mansfield(J.Phys.C.6，L422-L426(1973))的开拓性工作的成像方法(其在数据采集期间施用读出梯度)，将允许较高信噪比图像，或较高空间分辨率图像等同物。然而，这些呈其基本形式的成像方法将不能产生单独的13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐图像，即不可能区别具体的代谢物。
在一个优选实施方案中，使用将利用多回声编码频率信息的成像序列。可产生分开的水和脂肪1H-图像的序列例如阐述于G.Glover，JMagn Reson Imaging 1991；1：521-530和S.B.Reeder等，MRM 5135-45(2004)中。既然已知待检测的代谢物并因此已知其MR频率，那么可应用在上述参考文献中讨论的方法以获得13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的直接图像。和波谱成像比较，该程序使得超极化13C-MR信号的使用更有效，得到更好的信号质量、更高的空间分辨率和更快的采集时间。
在一个优选实施方案中，本发明方法包括采集直接13C-MR图像或13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的波谱，波谱来自预先给予包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质的人类或非人类动物体，或来自业已加入成像介质的细胞培养物或离体组织。在所述方法中，通过来自13C-乳酸盐的低13C-信号强度或来自13C-乳酸盐的无13C-信号或降低13C-乳酸盐形成率，鉴别并检测了细胞死亡。
为了校正丙酮酸盐信号，乳酸盐和丙酮酸盐二者的图像可在每一单独图像中标准化为最大值。第二步，标准化的乳酸盐图像乘以转化的丙酮酸盐图像(例如图像中的最大丙酮酸盐信号减去每一像素的丙酮酸盐水平)。最后一步，让在上述操作中获得的中间结果乘以最初乳酸盐图像。或者，在其各自图像的每一像素中丙酮酸盐和乳酸盐峰强度可拟合成在丙酮酸盐和乳酸盐之间13C-标记通量的动力学模型，以获得标记通量速率常数和自旋点阵弛豫时间。对于多RF脉冲，对极化损失的作用需要进行校正。
若该方法用于体外检测细胞死亡，则解剖和/或灌注信息可包括在检测细胞死亡的本发明方法中。例如，可通过采用或不采用合适的造影剂获得质子或13C-MR图像，来获得解剖信息。可通过用MR造影剂例如OmniscanTM确定相关灌注。同样地，本领域已知不给予造影剂的用于灌注测量的MR成像技术。在一个优选实施方案中，未代谢的超极化13C-造影剂用于测定定量灌注。合适的技术和造影剂例如阐述于WO-A-02/23209中。在一个更优选实施方案中，超极化13C-丙酮酸盐用于测定定量灌注。
在另一优选实施方案中，重复给予包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质，由此进行动力学研究。由于丙酮酸盐的低毒性和其有利的安全特性，患者很好地耐受重复给予该化合物。
本发明方法中获得的结果例如使得医生可为检查中的患者选择适当的治疗。在另一优选实施方案中，本发明方法用于测定治疗是否成功。
从另一方面来看，本发明提供超极化13C-丙酮酸盐和任选的乳酸盐在制备用于检测细胞死亡的13C-MR成像和/或13C-MR波谱分析方法中的成像介质中的用途。优选地，用于制备成像介质的超极化13C-丙酮酸盐通过13C-丙酮酸或13C-丙酮酸盐的动态核极化获得。
从13C-丙酮酸或13C-丙酮酸盐制备超极化13C-丙酮酸盐以及制备包含超极化13C和任选的乳酸盐的成像介质的制备和优选实施方案，详细阐述于本申请的第6-9页。
在一个优选实施方案中，本发明提供超极化13C-丙酮酸盐和任选的乳酸盐在制备用于检测细胞死亡的13C-MR成像和/或13C-MR波谱分析方法中的成像介质中的用途，所述方法从业已预先给予成像介质的人或非人类动物体，或从已经加入成像介质的细胞培养物或离体组织，获得13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的直接13C-图像和/或13C-波谱。
前述用途和该用途的优选实施方案详细阐述于本申请的第10-13页。
附图简述
图1描绘用依托泊苷处理的EL4细胞悬浮液和未处理的EL4细胞悬浮液中13C1-丙酮酸盐和13C1-乳酸盐峰强度对时间的曲线。图1中的曲线编号表示以下：
1：在未处理对照细胞和用依托泊苷处理细胞悬浮液中的13C1-丙酮酸盐强度(除以100)
2：对照细胞悬浮液中13C1-乳酸盐强度
3：依托泊苷处理细胞悬浮液中13C1-乳酸盐强度
图2显示依托泊苷和依托泊苷/烟酰胺处理EL4细胞的效果到药物依托泊苷诱导细胞死亡。图2中的条线图代表3次实验+/-标准偏差。
图2中条线图编号表示以下：
1：未处理的EL4细胞悬浮液
2：依托泊苷处理的EL4细胞悬浮液
3：依托泊苷/烟酰胺处理的EL4细胞悬浮液
图3A显示在静脉注射0.2ml的75mM超极化13C1-丙酮酸盐后、依托泊苷处理之前的肿瘤的5mm厚断层的一系列代表性13C MR波谱。171ppm处的共振来自13C1-丙酮酸盐，183ppm处的共振来自13C1-乳酸盐。
图3B显示在静脉注射0.2ml的75mM超极化13C1-丙酮酸盐后肿瘤13C1-丙酮酸盐(实心)和13C1-乳酸盐(空心)峰强度。实线显示拟合成双位点交换模型(two-site exchange model)。
图3C显示在小鼠中静脉注射0.2ml的75mM超极化13C1-丙酮酸盐后不处理(空心符号)和依托泊苷处理的(实心符号)肿瘤的13C1-乳酸盐/13C1-丙酮酸盐峰强度比。阴影区域代表来自平均值的一个SD(n＝8，两组动物都是)。20和25秒之间的黑条表示实施13C-波谱MR成像时的时间区间。
实施例
以下术语丙酮酸盐、13C-丙酮酸盐和13C1-丙酮酸盐可互换使用，都表示13C1-丙酮酸盐。同样地，术语丙酮酸、13C-丙酮酸和13C1-丙酮酸可互换使用，都表示13C1-丙酮酸。另外，除非另外指出，否则术语乳酸盐、13C-乳酸盐和13C1-乳酸盐可互换使用，都表示13C1-乳酸盐。
实施例1：三(8-羧基-2，2，6，6-(四(甲氧基乙基)苯并-[1，2-4，5’]双-(1，3)二硫杂环戊烯(dithiole)-4-基)甲基钠盐(DNP剂)的合成
将按照WO-A1-98/39277中的实施例7合成的10g(70mmol)三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟乙基)苯并-[1，2-4，5’]-双-(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲基钠盐在氩气氛中悬浮于280ml二甲基乙酰胺中。加入氢化钠(2.75g)接着是甲基碘(5.2ml)，让该稍微放热的反应在34℃水浴60分钟进行1小时。氢化钠和甲基碘每一种化合物都以相同量重复2次加入，最后一次加入后，在室温将该混合物搅拌68小时，然后倒入到500ml水中。用40ml 1M NaOH(水溶液)将pH调整到pH＞13，在环境温度下将该混合物搅拌15小时以水解形成的甲酯。然后用50ml 2MHCl(水溶液)将该混合物酸化到pH约2，用乙酸乙酯(500ml和2×200ml)萃取3次。经Na2SO4干燥合并的有机相，然后蒸发至干。通过制备性HPLC用乙腈/水作为洗脱液纯化粗产物(24g)。蒸发收集的馏分以去除乙腈。用乙酸乙酯萃取剩下的水相，经Na2SO4干燥有机相，然后蒸发至干。向该残留物中加入水(200ml)，用0.1M NaOH(水溶液)将pH小心调整到7，在该过程中残留物缓慢溶解。中和后冻干水溶液。
实施例2：包含用13C1-丙酮酸和实施例1的DNP剂(三苯甲基自由基(radical))通过DNP方法获得的超极化13C1-丙酮酸盐的组合物的制备
通过将5.0mg实施例1的自由基溶解于13C1-丙酮酸(164μl)中制备20mM溶液。让样品混合均匀，将等份样溶液(41mg)置于样品杯并插入DNP极化器。
在DNP条件下于1.2K在3.35T磁场中用微波辐射(93.950GHz)使样品极化。2小时后停止极化，用WO-A-02/37132的溶解装置将样品溶解于氢氧化钠和三(羟基甲基)-氨基甲烷(TRIS)水溶液中，以提供超极化13C1-丙酮酸钠中性溶液。用13C-NMR迅速分析溶解的样品以评价极化，获得19.0％13C-极化。
实施例3：包含用13C1-丙酮酸和实施例1的DNP剂(三苯甲基自由基)通过DNP方法获得的超极化13C1-丙酮酸盐的组合物的制备
通过将实施例1的自由基(209.1mg)溶解于13C1-丙酮酸(553mg)和未标记的丙酮酸(10.505g)混合物中制备15mM溶液。让样品混合均匀，并将该溶液的等份样(2.015g)置于样品杯中并插入DNP极化器。
在DNP条件下于1.2K在3.35T磁场中用微波辐射(93.950GHz)使样品极化。4小时后停止极化，用WO-A-02/37132的溶解装置将样品溶解于氢氧化钠和三(羟基甲基)-氨基甲烷(TRIS)水溶液中，以提供超极化13C1-丙酮酸钠中性溶液，在100mM tris缓冲液中丙酮酸盐总浓度为0.5M。串联连接溶解装置和色谱柱。该柱由含有由Varian供应的疏水填充材料(Bondesil-C18，40UM Part#：12213012)的cartridge柱(D＝38mm；h＝10mm)组成。强迫已溶解的样品通过选择性吸收自由基的柱。用13C-NMR迅速分析滤出溶液以评价极化，获得16.5％13C极化。随后用UV分光光度计在469nm处分析残留的自由基浓度，确定其低于0.1μM的检测限。
实施例4：用13C1-丙酮酸和作为DNP剂的三(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基-乙氧基)甲基-苯并[1，2-d：4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯-4-基)甲基钠盐通过DNP方法制备超极化13C1-丙酮酸盐
如WO-A-97/09633中的实施例29所述合成三(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基乙氧基)甲基-苯并[1，2-d：4，5-d’]-双-(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲基钠盐。
通过将三(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基乙氧基)甲基-苯并[1，2-d：4，5-d’]-双-(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲基钠盐溶解于13C1-丙酮酸(83.1mg)制备20mM溶液。让样品混合均匀，置于样品杯中并插入DNP极化器。在DNP条件下于1.2K在3.35T磁场中用微波辐射(93.950GHz)使样品极化。用Varian Inova-200NMR分光计收集来自样品的13C-NMR信号。从测量的热平衡13C-NMR信号和增强的NMR信号计算DNP增加。获得16％13C-极化。
实施例5：包含超极化13C1-丙酮酸盐和非超极化未标记的乳酸盐的成像介质的制备
通过将实施例1的DNP剂(三苯甲基自由基)溶解于13C1-丙酮酸(44mg，91％)中制备15mM溶液。让样品混合均匀，并将该溶液置于样品杯中插入DNP极化器。
在DNP条件下于1.2K在3.35T磁场中用微波辐射(分别为94GHz和100mW)使样品极化。通过固态NMR跟踪极化。在超极化90分钟后，让样品溶解于6ml 94mM NaOH、30mM NaCl、40mM HEPES和50mg/升EDTA的水溶液。溶解的样品的pH为7.4，且最终13C1-丙酮酸盐浓度为75mM。
2ml该溶液与含有18mg乳酸锂的500μl水溶液合并，产生包含60mM超极化13C1-丙酮酸盐和75mM乳酸盐的成像介质。
实施例6：细胞培养物中细胞死亡的检测
6.1EL4细胞的制备
用15μM依托泊苷(PCH Pharmachemie BV，Harleem)处理EL4鼠淋巴瘤细胞(108个细胞)，已知依托泊苷这种化合物在接触16小时后诱导细胞死亡。用15μM依托泊苷加20mM烟酰胺(已知的PARP抑制剂)对分开的一组细胞处理16小时。通过吖啶橙和碘化丙锭染色确证细胞死亡(细胞凋亡和坏死)。在37℃用含有10％FCS的RPMI 1640生长培养基将细胞洗涤3次，向2ml依托泊苷-和依托泊苷/烟酰胺处理的EL4细胞悬浮液中加入2ml实施例5的成像介质。因此，最终细胞悬浮液含有30mM超极化13C1-丙酮酸盐和37.5mM乳酸盐。
6.2EL4细胞的13C-MR波谱分析
在加入成像介质的时间起240秒的时间内跟踪来自阐述于6.1的依托泊苷-处理的EL4细胞悬浮液中13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的13C-信号强度。在9.4T用低脉冲角脉冲每秒收集一个13C波谱，共收集240个波谱。也如上所述检查非依托泊苷处理(未处理)对照EL4淋巴瘤细胞，将未处理的和依托泊苷处理的13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐峰强度绘成图表(图1)。
6.3EL4细胞的13C-MR波谱分析
在加入成像介质的时间起240秒的时间内跟踪来自阐述于6.1中的依托泊苷处理的和依托泊苷/烟酰胺处理的EL4细胞悬浮液中的13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的13C-信号强度。在9.4T用低脉冲角脉冲每秒收集一个13C波谱，共收集240个波谱。也如上所述检查非依托泊苷处理(未处理)对照EL4淋巴瘤细胞，比较未处理的、依托泊苷处理的和依托泊苷/烟酰胺处理的EL4细胞的13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐信号强度。数据拟合成基于改良的Bloch方程的双位点交换模型，测定正向和反向交换13C-通量的速度常数。图2中的条线图代表3次实验+/-标准偏差。
实施例7：包含超极化13C1-丙酮酸盐的成像介质的制备
通过将实施例1的DNP剂(三苯甲基自由基)溶解于13C1-丙酮酸(44mg，91％)制备15mM溶液。让样品混合均匀，并将该溶液置于样品杯中插入DNP极化器。
在DNP条件下于1.2K在3.35T磁场中在微波辐射下(分别为94GHz和100mW)使样品极化。通过固态NMR跟踪极化。在超极化90分钟后，将样品溶解于6ml的94mM NaOH、30mM NaCl、40mMHEPES和50mg/升EDTA水溶液中。溶解的样品pH为7.4，且最终13C1-丙酮酸盐浓度为75mM。
实施例8：细胞死亡的体内检测
通过皮下植入EL4细胞在小鼠中产生淋巴瘤肿瘤。用i.p.注射67mg依托泊苷/kg处理该小鼠。组织学评估依托泊苷处理后的肿瘤细胞死亡。非依托泊苷处理小鼠用作对照。
静脉内注射实施例7的超极化13C1-丙酮酸盐(0.2ml)迅速产生来自肿瘤的13C-丙酮酸盐和乳酸盐的可测量信号(图3A)。在注射开始后的12秒开始的2分钟时间每2秒收集波谱。在依托泊苷处理和未处理动物中来自肌肉下的成像断层和来自肿瘤上的断层(通过肝)的测量结果显示丙酮酸盐信号，但仅有很少乳酸盐信号。乳酸盐和丙酮酸盐的肿瘤信号的时间依赖变化拟合成交换模型以获得表观速率常数，和自旋晶格弛豫时间(图3B)。错失开始10-15秒的数据采集，因为这是完成注射并插入13C表面线圈探头组合件所花的时间(包含让动物进入成像磁体的时间)。
与对照组(n＝3，P＜0.01)的4.8±0.7％相比，用依托泊苷处理携带EL-4肿瘤的动物，导致药物处理后24小时37.0±3.8％的细胞死亡，肿瘤体积从不处理的肿瘤的1.6±0.4cm3(n＝8)小量缩小到处理肿瘤的1.3±0.2cm3(n＝8)(从多断层1H自旋回波图像测量)。依托泊苷处理导致速率常数kP app减小大约25％，其在注射超极化13C-丙酮酸盐后测量。在对照肿瘤中速率常数为0.075±0.011s-1，在依托泊苷处理肿瘤(n＝8，p＜0.01)中为0.056±0.005s-1。速率常数差别不能通过递送到肿瘤的丙酮酸盐的差异来解释，因为通过1H NMR测量对冷冻固定(freeze-clamped)肿瘤的高氯酸提取物测定的丙酮酸盐浓度，在对照肿瘤中为0.55±0.19μmol/g湿重(n＝8)，在依托泊苷处理肿瘤中为0.75±0.48μmol/g湿重(n＝8)。在丙酮酸盐和乳酸盐间降低的13C-标记通量(flux)易于从标记的乳酸盐/丙酮酸盐比率图(图3C)中观察到，这表明几乎可完全区分这两组动物。用依托泊苷处理动物后20小时采集数据。40秒后增加的SD反映由极化损失产生的乳酸盐和丙酮酸盐共振信噪比降低。计算的平衡乳酸盐/丙酮酸盐比率(即L∞/P∞，等于浓度比率)显示从对照肿瘤的4.0±0.8(n＝8)降低到依托泊苷处理肿瘤的2.7±0.4(n＝8)(p＜0.005)。在通过1H NMR测量对冷冻固定肿瘤的高氯酸提取物测定的乳酸盐/丙酮酸盐比率中观察到相似的降低，该比率从9.5±3.5(n＝8)降低到5.1±2.0(n＝8)(p＜0.01)。在完成MR实验后立即进行这些提取物测量。在没有注射丙酮酸盐的动物的依托泊苷处理的和不处理的肿瘤中的乳酸盐浓度分别为3.6±0.2μmol/g湿重和3.0±0.6μmol/g湿重(n＝3)。这些值和注射丙酮酸盐的动物的相应值没有统计学显著不同，其分别为3.2±1.3μmol/g湿重和5.0±1.9μmol/g湿重(n＝8)。从冷冻固定肿瘤制备的蛋白提取物的酶活性测量显示LDH浓度从不处理的肿瘤的350±200单位/g湿重(n＝5)降低到药物处理的肿瘤的100±20单位/g湿重(p＜0.05)(n＝3)。
在另一系列实验中，成像后24小时用依托泊苷处理动物，然后在依托泊苷处理后24小时采集第二套图像，因此，每一只动物可作为其自己的对照。然而，与其他实验一样，在组内几乎没有变化，提呈了该组结果。处理前的速率常数为0.065±0.017s-1，处理后为0.040+0.012s-1(n＝4，p＜0.01)，表示通量降低了39％。
Claims (13)
1.用于检测细胞死亡的13C-MR成像和/或13C-MR波谱分析方法，所述方法包括：
(1)给予/加入包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质，和
(2)在伴随给予所述成像介质或在给予所述成像介质之前给予/加入非超极化乳酸盐。
2.权利要求1的方法，其中将所述成像介质和乳酸盐给予人或非人类动物体，所述13C-MR成像和/或13C-MR波谱分析用于在所述人类或非人类动物体进行细胞死亡检测。
3.权利要求1的方法，其中将所述成像介质和乳酸盐加入到细胞培养物或离体组织中，所述13C-MR成像和/或13C-MR波谱分析用于在所述细胞培养物或离体组织中进行细胞死亡检测。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中跟踪来自13C-丙酮酸盐和其代谢物13C-乳酸盐的13C-信号强度随时间的变化。
5.权利要求4的方法，其中从给予/加入所述成像介质的时间点到10分钟跟踪来自13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的13C-信号强度。
6.权利要求4的方法，其中从给予/加入所述成像介质的时间点到6分钟跟踪来自13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的13C-信号强度。
7.权利要求4的方法，其中从给予/加入所述成像介质的时间点到5分钟跟踪来自13C-丙酮酸盐和13C-乳酸盐的13C-信号强度。
8.权利要求1的方法，其中通过与从活组织观测到的13C-乳酸盐信号比较来自13C-乳酸盐的低13C-信号强度或来自13C-乳酸盐的无13C-信号或降低的13C-乳酸盐形成速率来检测细胞死亡。
9.权利要求1的方法，其中所述成像介质进一步包括乳酸盐。
10.权利要求2的方法，其中在给予/加入所述成像剂之前给予所述人类或非人类身体乳酸盐。
11.权利要求3的方法，其中在加入所述成像剂之前向所述细胞培养物或离体组织加入乳酸盐。
12.权利要求1的方法，其中通过13C-丙酮酸或13C-丙酮酸盐的动态核极化获得所述超极化13C-丙酮酸盐。
13.超极化13C-丙酮酸盐和乳酸盐在制备用于检测细胞死亡的13C-MR成像和/或13C-MR波谱分析方法中的成像介质中的用途。
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Granted publication date: 20130306 Termination date: 20190817 |