CN109477872A - 超极化微核磁共振系统和方法 - Google Patents

超极化微核磁共振系统和方法 Download PDF

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Abstract

本文描述了微线圈超极化NMR系统和用于测量活体和非活体样本中的代谢通量的方法。这样的系统可以执行代谢通量的高通量测量(利用多个线圈)而不破坏材料，使得其可用于分析肿瘤活组织检查，癌症干细胞等。在某些实施方案中，本文所述的超极化微磁共振光谱仪(HMRS)用于实现活体细胞或非活体样本的实时、显著更灵敏(例如，103倍更灵敏)的代谢分析。在该平台中，将与超极化代谢物混合的悬浮液加载到小型化的检测线圈(例如，约2μL)中，其中通量分析可在一分钟内完成而对样本存活性没有显著变化。所提供系统的灵敏和快速分析能力使得能够快速评估给定药物造成的代谢变化，这可以指导患者的治疗选择。

Description

超极化微核磁共振系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月10日提交的美国申请序列号62/306,538的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明一般涉及用于分析生物和非生物样本的系统和方法。在某些实施方案中，本发明涉及通过微线圈超极化核磁共振(NMR)系统检测代谢数据。
政府资助
本发明是在国立卫生研究院授予的资助号EB014328和CA008748的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
代谢重编程被广泛认为是癌症的标志，了解代谢物转化率或“通量”所描述的代谢动力学可以阐明肿瘤发生的生物学过程和对治疗的反应。
为了对完整细胞或生物体中的代谢通量进行实时分析，已经开发了磁共振(MR)光谱和成像方法以及核自旋的超极化。这些方法能够非侵入性地监测肿瘤进展和治疗功效，并且正在多个临床试验中进行测试。然而，由于它们的灵敏度有限，这些方法需要大量细胞，大约107个，这在涉及很少靶细胞或质量受限样本的临床情况下可能是不切实际的。
癌症的新陈代谢在20世纪20年代首次被发现为线粒体缺陷，现在被认为是癌症的标志之一。癌细胞可以重新编程其代谢，促进细胞生长和增殖，适应营养或氧气耗尽的环境，并逃避免疫监视。常见的表型是葡萄糖摄取增加，无论氧气可用性如何，都可通过糖酵解代谢。被称为有氧糖酵解或'Warburg效应'，该途径提供对许多生物合成过程至关重要的代谢中间体，赋予增殖优势，并酸化肿瘤微环境，促进转移至其他器官。因此，有氧糖酵解与预后不良密切相关。考虑到糖酵解速率或“通量”代表在葡萄糖衍生的任何给定时刻的能量反应的代谢活动。其分析可以描述癌细胞如何实时响应环境变化，如营养可用性或药物治疗。
核磁共振(NMR)光谱和成像技术已经与核自旋的超极化一起开发，用于完整细胞或器官中的代谢的实时分析。尤其是动态核极化(DNP),这是一种新兴技术，它通过将极化从稳定的有机自由基中的未配对电子转移到相邻的核来实现超极化，展示了NMR灵敏度提高10,000倍以上。使用富含13C的代谢物(例如[1-13C]丙酮酸或[U-13C]葡萄糖，它们是核磁共振活性核)作为超极化分子，DNP-NMR技术可以测量多种代谢途径，毒性最小，并且其应用于癌症诊断正在进行多项临床试验。然而，由于其有限的灵敏度，该方法需要许多目的细胞(107个数量级)，并且DNP-NMR的分析应用对于数量有限的样本(包括原发性癌细胞，干细胞或类器官)具有挑战性。
因此，仍然需要能够快速且准确地分析少量细胞同时保持细胞存活性的系统和方法。
发明内容
本文描述了微线圈超极化NMR系统和用于测量癌细胞中例如从丙酮酸到乳酸的代谢通量的方法。这样的系统可以执行代谢通量的高通量测量(具有多个线圈)而不破坏材料，使得其可用于分析肿瘤活组织检查，癌症干细胞等。
在某些实施方案中，本文所述的超极化微磁共振光谱仪(HMRS)用于实现活细胞或非活体样本的实时并且显著更敏感(例如，103倍更敏感)的代谢分析。在该平台中，将与超极化代谢物混合的细胞悬浮液加载到小型化的检测线圈(例如，约2μL)中，其中通量分析可在一分钟内完成而存活性不会发生显著变化。HMRS的灵敏和快速分析能力允许表征细胞中的代谢通量，例如白血病干细胞。它还能够快速评估给定药物的代谢变化，这可能指导患者的治疗选择。
本文描述的平台已经被设计用于通过整合微流体系统(例如，3D打印的微流体系统)来对超极化分子进行高通量分析。HMRS平台作为研究质量受限样本(例如活检标本和干细胞)中的代谢动力学的敏感方法，从而鉴定新的治疗靶标并提供对细胞代谢的增强理解。
所提供的系统和方法与各种样本类型(例如，生物样本、合成样本、环境样本和其他样本)兼容。此外，所提供的系统和方法与多种细胞类型相容，其可以通过高通量平台用各种抑制剂治疗，以确定由于各种代谢途径的扰动引起的代谢变化。细胞类型包括癌细胞(例如，白血病癌细胞；例如，实体癌细胞；例如癌症干细胞)、基质细胞(例如成纤维细胞)、造血干细胞、神经干细胞、免疫细胞(例如T细胞；例如B细胞；例如巨噬细胞)。而且，可以同时使用各种频率和探针来提供具有单个源的集成检测系统。
在一个方面，本发明涉及一种样本分析方法，该方法包括：在微线圈内提供包含超极化物质的样本，并将所述样本和微线圈暴露于磁场；并检测样本的NMR信号。
在某些实施方案中，该方法包括代谢成像。
在某些实施方案中，样本包含选自活体样本和非活体样本的成员。在某些实施方案中，活体样本包含生物样本。在某些实施方案中，生物样本选自下组：细胞悬浮液、实体组织样本、包封细胞的多孔结构、肿瘤类器官、生物细胞、蛋白质和/或代谢物、细菌、酵母、酶系统和蓝/绿藻。
在某些实施方案中，非活体样本选自合成细胞系统、合成酶系统和化学分子。
在某些实施方案中，该方法还包括使样本超极化。在某些实施方案中，通过对仲氢诱导的极化(Para-Hydrogen Induced Polarization，PHIP)、动态核极化(DynamicNuclear Polarization，DNP)、自旋交换光泵浦(Spin-Exchange Optical Pumping)、仲氢诱导的极化(Parahydrogen Induced Polarization)或其他气体诱导的极化来进行超极化。在某些实施方案中，使样本超极化包括引入自由基源。在某些实施方案中，自由基源包含选自有机持久自由基、光诱导的非持久自由基、纳米金刚石或可形成暂时自由基的代谢物和硅颗粒的成员。
在某些实施方案中，超极化物质包含活性核(例如，任何NMR活性核)。在某些实施方案中，活性核包括选自1H、13C、31P、15N和19F的成份。在某些实施方案中，超极化物质包含选自下组的成份：超极化的13C-丙酮酸、13C-DHA和13C-VitC(维生素C)、13C-果糖、13C-葡萄糖、13C-谷氨酰胺、13C-丝氨酸、13C-甘氨酸和13C-乙酸酯。
在某些实施方案中，生物细胞包含选自下组的量：不超过200k个细胞、不超过150k个细胞、不超过100k个细胞、不超过50k个细胞、不超过25k个细胞、和不超过10k个细胞。
在某些实施方案中，样本包含选自不大于100μL、不大于50μL、不大于25μL、不大于10μL、不大于5μL的体积，并且来自约1至3μL。
在某些实施例中，微线圈包括小型化射频(RF)线圈。
在某些实施方案中，将样本置于含有微线圈的腔室内，所述微线圈围绕该样本。
在某些实施方案中，磁场为约0.5T至7T。在某些实施例中，磁场约为1T。
在某些实施方案中，该方法包括(例如，通过计算装置的处理器)
从NMR信号确定样本的代谢数据。在某些实施方案中，该方法包括确定代谢通量。
在某些实施方案中，该方法包括监测酶促反应速率。在某些实施方案中，以小于500pmol/sec、小于100pmol/sec、小于50pmol/sec或约30pmol/sec的速率监测酶促反应速率。
在某些实施方案中，该方法包括，对于多个样本中的每一个，将所述样本置于单独的微线圈室或隔室中，从而实现高通量信号和/或代谢数据检测。在某些实施方案中，该方法包括使用多个(例如，2、4、8、16、48、96、192、384、1536等，例如高通量平台)微线圈或微线圈部分的配置将多个样本中的每一个置于其单独的微线圈室或隔室中。在某些实施方案中，每个微线圈或微线圈部分围绕单独的样本。
在某些实施例中，微线圈的直径不大于5mm，例如不大于3mm、例如不大于2mm、例如不大于1.5mm、例如不大于1.0mm、例如不大于0.5毫米。在某些实施方案中，微线圈的直径为约0.5mm至约2mm。在某些实施方案中，微线圈的直径为约0.5mm至约1.5mm。
在某些实施方案中，样本包含来自肿瘤活组织检查和/或癌症干细胞的细胞。
在某些实施方案中，该方法包括从NMR信号确定代谢数据，其中样本包括在手术期间从患者获得的细胞，并且代谢数据的确定在获得细胞的10分钟内发生。在某些实施方案中，手术是脑外科手术。
在某些实施方案中，代谢数据的确定在获得细胞的5分钟内发生，例如在3分钟内、例如在1分钟内发生。在某些实施方案中，该方法包括在手术期间获得的组织样本的术中分析。
在某些实施方案中，样本包含在施用药物后从受试者获得的细胞。在某些实施方案中，该方法包括监测治疗功效。
另一方面，本发明涉及一种超极化微核磁共振系统，包括：用于产生磁场的磁体；微型线圈室，其尺寸和形状设计成包含悬浮样本和超极化物质；第一调谐电路；用于检测样本的NMR信号的检测器；计算装置的处理器，用于执行指令以从NMR信号确定样本的代谢数据。
在某些实施例中，第一调谐电路是用于1H的调谐电路。
在某些实施方案中，微核NMR系统包括第二调谐电路。在某些实施例中，第二调谐电路是用于13C的调谐电路。
在某些实施方案中，微核NMR系统包括机械开关。在某些实施例中，机械开关选择第一调谐电路。在某些实施例中，机械开关选择第二调谐电路。
在某些实施方案中，磁场为约0.5T至7T。在某些实施例中，磁场约为1T。
在某些实施例中，计算机设备的处理器确定代谢通量。在某些实施方案中，该系统监测酶促反应速率。在某些实施方案中，酶促反应速率小于500pmol/sec、小于100pmol/sec、小于50pmol/sec或约30pmol/sec。
在某些实施方案中，微核磁共振系统配置为执行本文提供的任何方法。
在某些实施例中，微线圈的直径不大于5mm，例如不大于3mm、例如不大于2mm、例如不大于1.5mm、例如不大于1.0mm、例如不大于0.5毫米。在某些实施方案中，微线圈的直径为约0.5mm至约2mm。在某些实施方案中，微线圈的直径为约0.5mm至约1.5mm。
在某些实施例中，该系统包括极化模块。在某些实施方案中，极化模块包含选自由以下组成的组的成员：仲氢诱导极化(PHIP)模块、动态核极化(DNP)模块、自旋交换光泵浦模块、仲氢诱导极化模块和其他气体诱导极化模块。
涉及本发明的一个方面的实施例的元素(例如，方法)可以应用于涉及本发明的其他方面的实施例(例如，系统)，反之亦然。
定义
为了更容易理解本公开内容，首先在下面定义某些术语。在整个说明书中阐述了对以下术语和其他术语的附加定义。
在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。如在本申请中所使用的，术语“包括”和术语的变体，例如“包含”和“包含”，并不旨在排除其他添加剂、组分、整数或步骤。如在本申请中所使用的，术语“约”和“大约”用作等同物。本申请中使用的有或没有约/近似的任何数字旨在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，术语“大约”或“大约”是指在所述参考值的两个方向上(大于或小于)在25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围。除非另有说明或从上下文中显而易见(除非此类数字超过可能值的100％)。
“生物相容的”：如本文所用，术语“生物相容的”旨在描述在体内不引起实质上有害反应的材料。在某些实施方案中，如果材料对细胞无毒，则它们是“生物相容的”。在某些实施方案中，如果材料在体外添加到细胞中导致小于或等于20％的细胞死亡，和/或它们在体内的施用不诱导炎症或其他此类副作用，则材料是“生物相容的”。在某些实施方案中，材料是可生物降解的。
“生物样本”：如本文所用，术语“生物样本”通常是指从感兴趣的生物来源(例如，组织或生物体或细胞培养物)获得或衍生的样本，如本文所述。在某些实施方案中，感兴趣的来源包括生物，例如动物或人。在某些实施方案中，生物样本是或包含生物组织或流体。在某些实施方案中，生物样本可以是或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活组织检查样本；含细胞的体液；自由浮动的核酸；痰；唾液；尿；脑脊液，腹膜液；胸水；屎；淋巴；妇科液体；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗液或灌洗液，如导管灌洗液或支气管肺泡灌洗液；抽吸；刮出；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；粪便，其他体液，分泌物和/或排泄物；和/或其中的细胞等。在某些实施方案中，生物样本是或包含从个体获得的细胞。在某些实施方案中，获得的细胞是或包括来自获得样本的个体的细胞。在某些实施方案中，样本是通过任何适当的方式直接从目的来源获得的“初级样本”。例如，在某些实施方案中，通过选自活组织检查(例如，细针抽吸或组织活检)，手术，体液收集(例如，血液，淋巴，粪便等)的方法获得初级生物样本。在某些实施方案中，如从上下文中显而易见的，术语“样本”是指通过加工(例如，通过除去一种或多种组分和/或通过添加一种或多种试剂)获得的初级样本。例如，使用半透膜过滤。这样的“加工样本”可以包括例如从样本中提取的核酸或蛋白质，或者通过使初级样本经受诸如mRNA的扩增或逆转录，某些组分的分离和/或纯化等技术而获得的核酸或蛋白质。
“癌症”：如本文所用，术语“癌症”是指其中细胞表现出相对异常，不受控制和/或自主生长的疾病，病症或病症，使得它们显示异常升高的增殖率和/或异常生长表型，其特征在于显著丧失对细胞增殖的控制。在某些实施方案中，癌症可以由一种或多种肿瘤表征。本领域技术人员知道多种类型的癌症，包括例如肾上腺皮质癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、类癌、心脏、胆管癌、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、颅咽管瘤、原位导管癌、室管膜瘤、眼内黑色素瘤、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、组织细胞增多症、白血病(如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、毛细胞白血病、髓性白血病、骨髓性白血病)、淋巴瘤(如Burkitt淋巴瘤[非霍奇金淋巴瘤]、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、蕈样真菌病、Sezary综合征、艾滋病相关淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)、黑色素瘤、merkel细胞癌、间皮瘤、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、骨髓增生异常综合征、乳头状瘤、副神经节细胞瘤、pheochromacytoma、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肉瘤(如Ewing肉瘤、Kaposi肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、子宫肉瘤、血管肉瘤)、肾母细胞瘤、和/或肾上腺皮质、肛门、阑尾、胆汁导管、膀胱、骨、脑、乳腺、支气管、中枢神经系统、子宫颈、结肠、子宫内膜、食道、眼、输卵管、胆囊、胃肠道、生殖细胞、头颈部、心脏、肠、肾(例如、肾母细胞瘤、喉、肝、肺(如非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、口腔、鼻腔、口腔、卵巢、胰腺、直肠、皮肤、胃、睾丸、喉咙、甲状腺、阴茎、咽、腹膜、垂体、前列腺、直肠、唾液腺、输尿管、尿道、子宫、阴道或外阴等器官的癌。
“检测器”：如本文所用，术语“检测器”包括任何电磁辐射检测器，包括但不限于射频检测器(例如，射频天线(例如，螺线管天线)(例如，亥姆霍兹对，例如，微槽平面探测器)EMCCD摄像机、CMOS摄像机、光电倍增管、光电二极管和雪崩光电二极管。
“超极化的”或“超极化的物质”：如本文所用，术语“超极化的”或“超极化的物质”是指具有核磁共振(NMR)活性核的物质，其在给定的磁场强度具有显著高于其玻尔兹曼分布的极化。例如，13C在3特斯拉(30,000高斯)下极化为2.8ppm(或2.8×10-6极化)。在本文所述的超极化实验中，溶解DNP用于使13C超极化至0.28ppm，这在3特斯拉时将增强约100,000倍。
“治疗方案”：如本文所用的术语“治疗方案”是指给药方案，其在相关群体中的施用可与期望的或有益的治疗结果相关。
“样本”：如本文所用，术语“样本”通常是指从感兴趣的源获得或衍生的等分试样材料，如本文所述。在某些实施方案中，感兴趣的来源是生物或环境来源。在某些实施方案中，感兴趣的来源可以是或包含细胞或生物，例如微生物、植物或动物(例如人)。在某些实施方案中，感兴趣的来源是或包含生物组织或流体(例如，体内样本或离体样本)。在某些实施方案中，生物组织或流体可以是或包含羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、母乳、脑脊髓液、耳垢、乳糜、乳汁、精液、内淋巴、渗出液、粪便、胃酸、胃液、淋巴液、粘液、心包液、外淋巴、腹膜液、胸水、脓液、大黄、唾液、皮脂、精液、血清、包皮垢、痰液、滑液、汗液、眼泪、尿液、阴道分泌物、玻璃体液、呕吐物和/或其组合或组分。在某些实施方案中，生物流体可以是或包含细胞内液、细胞外液、血管内液(血浆)、组织液、淋巴液和/或跨细胞液。在某些实施方案中，生物流体可以是或包含植物分泌物。在某些实施方案中，可以例如通过抽吸，活组织检查(例如，细针或组织活检)，拭子(例如，口腔，鼻腔，皮肤或阴道拭子)，刮擦，手术，洗涤或灌洗(例如，brocheoalvealar，导管，鼻，眼，口，子宫，阴道或其他洗涤或灌洗)来获得生物组织或样本。在某些实施方案中，生物样本是或包含从个体获得的细胞。在某些实施方案中，样本是通过任何适当的方式直接从目的来源获得的“初级样本”。在某些实施方案中，如从上下文中显而易见的，术语“样本”是指通过处理(例如，通过除去一种或多种组分和/或通过添加一种或多种试剂而获得)初级样本而获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这样的“加工样本”可以包括例如从样本中提取的核酸或蛋白质，或者通过使初级样本经受一种或多种技术(例如核酸的扩增或逆转录，分离和/或纯化某些组分)而获得的核酸或蛋白质，在某些实施方案中，样本是非活体样本(例如，合成细胞系统，例如合成酶系统，例如化学组合物，例如石油样本)。
“基本上”：如本文所用，术语“基本上”和语法等同物是指表现出感兴趣的特征或性质的总或接近总程度或程度的定性条件。本领域普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或趋向于完成或实现或避免绝对结果。
“受试者”：如本文所用，术语“受试者”包括人和哺乳动物(例如，小鼠，大鼠，猪，猫，狗和马)。在许多实施方案中，受试者是哺乳动物，特别是灵长类动物，尤其是人。在某些实施方案中，受试者是牲畜，例如牛，绵羊，山羊，牛，猪等；家禽，如鸡，鸭，鹅，火鸡等；和家养动物，特别是宠物，如狗和猫。在某些实施方案中(例如，特别是在研究背景下)，受试哺乳动物将是例如啮齿动物(例如小鼠，大鼠，仓鼠)，兔，灵长类动物或猪，例如近交系猪等。
“治疗剂”：如本文所用，短语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗效果和/或引发所需生物学和/或药理学作用的任何试剂。
“治疗”：如本文所用，术语“治疗”是指对于特定疾病，病症和/或病症的一种或多种症状，特征和/或原因的任何部分或完全缓解，改善，缓解，抑制，延迟发作，降低其严重性和/或发生率的物质的给药。这种治疗可以是针对于没有表现出相关疾病、病症和/或病症迹象的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病症的早期迹象的受试者。或者此类治疗可以是针对于表现出相关疾病、病症和/或病症的一种或多种确定体征的受试者。
在某些实施方案中，治疗可以是针对于已被诊断患有相关疾病，病症和/或病症的受试者。在某些实施方案中，治疗可以是针对于已知具有一种或多种易感因子的受试者，所述易感因子与相关疾病，病症和/或病症的发展风险增加在统计学上相关。在某些实施方案中，治疗包括递送治疗剂，包括但不限于小分子递送，放射疗法，免疫疗法，内在治疗性质(例如，铁下垂)和颗粒驱动的肿瘤微环境调节。在某些实施方案中，治疗剂附着于例如本文所述的那些颗粒上。
本文提供的附图用于说明目的，而非用于限制。
附图说明
通过参考以下结合附图的描述，本公开的前述和其他目的，方面，
特征和优点将变得更加明显和更好理解，其中：
图1A-1C示出了根据本发明的说明性实施例的超极化微磁共振光谱仪(HMRS)平台。
图1A显示了根据本发明的说明性实施方案的癌症和正常细胞中的糖酵解代谢的示意图。
图1B显示了根据本发明的说明性实施方案的HMRS测定的示意图。富含13C的丙酮酸超极化并与细胞悬浮液混合。一旦将悬浮液加载到微线圈中，就在1.05特斯拉磁场中开始13C NMR采集。
图1C示出了根据本发明的说明性实施例的HMRS中的微线圈探针的光学图片。机械开关用于改变微线圈的共振模式。图中显示嵌入PDMS块中的微线圈。线圈内的净容量为2μL。
图2A-2C显示了使用HMRS分析代谢通量。
图2A显示来自50,000个UOK262细胞的超极化代谢物的NMR光谱。使用30°射频脉冲每四秒采集一次光谱。Lac,乳酸；Pyr-H,丙酮酸水合物；Pyr,丙酮酸。
图2B显示了图2A中所示的丙酮酸和乳酸峰的NMR信号的点线图。每个信号都是从每个区域的积分量化的。
图2C显示乳酸信号与总信号(丙酮酸，丙酮酸水合物和乳酸信号的总和)的比率随时间的曲线图。所有测量均一式两份进行。误差条显示标准偏差。
图3A-3D显示了用HMRS对糖酵解通量的敏感度和非破坏性分析。
图3A显示UOK262细胞的通量度量ξ的滴定数据。
图3B示出了五种不同细胞系中的通量度量的分布图。UOK262(肾癌)，U87(胶质母细胞瘤)，Jurkat(急性T细胞白血病)，K562(慢性髓性白血病)和HK-2(肾)。
图3C显示从恶性癌细胞(UOK262)和非恶性癌细胞(HK-2)获得的超极化代谢物的NMR光谱。每个HMRS测定使用105个细胞。
图3D显示HMRS测定之前和之后的存活性的比较。测试了两种癌细胞系(K562和UOK262)。在HMRS测定之前15分钟进行“之前”测量，并且在HMRS测定之后15分钟进行“之后”测量。所有测量均一式两份进行。误差条显示标准偏差。
图4A-4C显示白血病干细胞中代谢通量的定量。
图4A显示来自具有MLL-AF9AML的小鼠的白血病细胞的流式细胞术的代表性图。使用图中指示的门对从小鼠骨髓收集的白血病细胞进行分选。
图4B显示在培养基中20小时后白血病干细胞(c-KitHi)和白血病非干细胞(c-KitLo)中c-Kit的中值荧光强度。
图4C显示白血病细胞中通量度量ξ的分布图。
图5A-5G显示用HMRS快速评估药物处理反应。
图5A显示伊马替尼(GLEEVEC)处理后K562细胞计数的测量。
图5B显示处理24小时后K562细胞的存活性。
图5C显示在处理24小时后由HMRS获得的超极化代谢物的NMR光谱。
图5D示出了处理后归一化度量ξ/ξ0的图。度量ξ0由未处理的K562细胞(对照)计算。
图5E显示了具有不同处理持续时间的代谢分析的示意图。伊马替尼的剂量设定为1μM。
图5F示出了具有不同持续时间的归一化度量ξ/ξ0的曲线图。度量ξ0由未处理的K562细胞计算(持续时间为0小时)。
图5G显示来自具有不同持续时间的细胞培养基的标准化乳酸浓度的图。通过常规的高场NMR光谱仪获得每种乳酸信号。所有测量一式三份进行。误差条显示标准偏差。
图6A-6E示出了根据本发明的说明性实施例的用于多重分析的与微流体系统集成的HMRS。
图6A示出了根据本发明的说明性实施例的集成HMRS平台的示意图。图6A示出了用于1H的调谐/匹配电路，机械开关和用于13C的调谐/匹配电路。机械开关设计用于选择1H和13C之间的调谐/匹配电路。
图6B显示了根据本发明的说明性实施方案的测定示意图。
图6C显示了从多次分析中收集的超极化丙酮酸的连续光谱。
图6D显示来自12次分析的NMR信号的定量和比较。通过相同分析的第一信号(I0)将每次分析(I)中的NMR信号归一化。所有数据集都适合于超极化自旋态衰变的单一模型。12次分析得到R2为99.5±0.4％，均方根误差(RMSE)为3.07±1.05％。
图6E显示了来自超极化丙酮酸单次溶解的糖酵解通量的多重分析。每次分析包括五次NMR采集(总共15秒)，然后是15秒间隔以在移动后稳定样本。每105个细胞的总糖酵解通量度量ξ为34.69(pmol/sec)，这与图3B中呈现的K562的ξ(33.24±2.51)很好地匹配。测量一式三份进行。误差条显示标准偏差。
图7显示细胞中[1-13C]丙酮酸代谢的示意图。圆圈表示丙酮酸和乳酸中的13C。当[1-13C]丙酮酸转化为乳酸时，13C保持在相同的羧基(COOH)中。丙酮酸和乳酸通过MCT转入/转出。LDH，乳酸脱氢酶；PDH，丙酮酸脱氢酶；MCT，单羧酸转运蛋白。
图8A-8C显示使用HMRS的代谢通量测量。
图8A显示50,000个UOK262细胞中超极化代谢物的NMR光谱图。这是图2A的扩展图。
图8B表示出了图8A中绘制的丙酮酸信号与模拟数据的比较。在假设测量期间没有代谢反应的情况下进行模拟。模拟数据模拟具有丙酮酸的弛豫常数T1(70秒)的自旋晶格弛豫衰变。
图8C显示了图8A中绘制的乳酸信号与模拟数据的比较。在假设测量期间没有代谢反应的情况下进行模拟。模拟数据模拟具有乳酸的弛豫常数T1(40秒)的自旋晶格弛豫衰变。
图9显示了乳酸相对于总碳(乳酸+丙酮酸+丙酮酸水合物)随时间的增加速率的数学分析。超极化信号电平(dPyr/dt或dLac/dt)的变化可以通过简化的数学模型来描述。在该模型中，变化取决于转换速率常数(kPL或kLP)和自旋晶格弛豫时间(TPyr或TLac)。因为在相同的pH条件下丙酮酸水合物水平与丙酮酸水平的比率是恒定的，所以可以假设(Lac+Pyr+Pyr-H)≈(Lac+Pyr)。因为丙酮酸信号水平显著大于乳酸水平，所以可以假设(Lac/Pyr)<<1。在该模型中，乳酸相对于总碳的增加率可以作为常数kPL导出。Lac，乳酸；Pyr，丙酮酸；Pyr-H，丙酮酸水合物。
图10显示了来自三个不同线圈的NMR信号的比较。所有的微线圈都具有相同的长度，1.3毫米。在每个微线圈中，加载28μmol的[1-13C]丙酮酸用于实验。用以下参数进行NMR实验：90°脉冲数，20；脉冲之间的重复时间，4秒。所有测量均一式两份进行。
图11显示HMRS测定之前和之后的存活性的比较。这是图3D右图的扩展图。测试了两种癌细胞系(K562和UOK262)。在HMRS测定之前15分钟进行“之前”测量，并且在HMRS测定之后15分钟进行“之后”测量。所有测量均一式两份进行。误差条显示标准偏差。
图12显示伊马替尼处理K562细胞后的存活性。在处理24小时和96小时后比较K562细胞的存活性。所有测量一式三份进行。误差条显示标准偏差。
图13显示了处理后蛋白质表达和磷酸化水平的变化。在对K562细胞进行伊马替尼处理24小时后，通过蛋白质印迹分析致癌酪氨酸激酶BCR-ABL和代谢酶LDHA。
图14显示了超极化丙酮酸的高通量分析。通过与微贮器结合的HMRS系统获得超极化丙酮酸的NMR信号。从超极化丙酮酸的单次溶解进行12次分析；每个分析包括五个NMR信号。在完成一次分析(例如，获得五个NMR信号)后，将完整的超极化丙酮酸加载到微线圈中用于进一步分析。
图15显示白血病干细胞(c-KitHi)和白血病非干细胞(c-KitLo)中c-Myc的免疫印迹分析。
图16A显示了用超极化的13C-丙酮酸对癌症代谢的实时分析。左图显示了GIST(胃肠道间质瘤)小鼠异种移植物的T2加权MRI图像。虚线表示肿瘤区域。中心图像显示来自肾(顶部)，肿瘤(中部)和肌肉(底部)的超极化NMR光谱。来自肿瘤的光谱与来自肾和肌肉的光谱显著不同。右图显示假彩色图像，显示肿瘤区域中较高水平的乳酸。
图16B显示了根据本发明的说明性实施方案，用超极化的13C-DHA和13C-VitC(维生素C)对脑代谢进行的实时分析。
图17显示了根据本发明的说明性实施方案，用超极化的13-C-羟乙基丙酸酯进行肺灌注的实时分析。
图18示出了具有磁矩的原子核的示意图，其可以在没有任何标记的情况下进行分析。在某些实施方案中，NMR信号来自极化(例如，状态占有率的差异)。因此，磁场越高，极化越高，NMR信号越高。注意，磁信号不被生物材料(例如，组织)吸收。NMR的局限性在于磁场中的原子核极化很差。例如，即使在高磁场(例如，10特斯拉)中，极化仅为0.0044％。由于极化不良，NMR仅限于高浓度样本的分析。
图19显示了描述超极化NMR如何用于克服NMR限制的示意图。例如，通过使用具有射频(RF)辐射的自由基，可以显著增强原子核的极化(例如，大于10,000倍)。因此，超极化NMR可以应用于活细胞中的生物反应。
图20显示了使用超极化NMR来克服NMR所面临的限制的数据。图20的左图显示70mM的13C丙酮酸需要超过1小时的采集时间以便观察NMR峰。然而，在超极化之后，同样的丙酮酸仅需要大约1秒的采集时间。
图21示出了在超极化微核磁共振系统中使用的较小线圈提供了更高的灵敏度(例如，更高的信噪比)。本公开还描述了灵敏度增加的替代实施例。图21还描绘了描述线圈尺寸如何影响信噪比的数学公式。
图22显示酶促反应的监测和灵敏度分析(30pmol/sec)。
图23A-23B显示了根据本发明的说明性实施方案的3D打印的多孔微型池，其提供用于NMR分析的不同样本。
图24是根据说明性实施例的用于分析光谱测定数据的方法和系统中的示例网络环境的框图。
图25是用于本发明的说明性实施例中的示例计算设备和示例移动计算设备的框图。
图26-28示出了根据本发明的说明性实施例的样本分析方法。
详细描述
在整个说明书中，当组合物被描述为具有，包括或包含特定组分，或者其中方法被描述为具有，包括或包含特定步骤时，预期另外存在本发明的组合物，其基本上由所述组件组成，或由所述组件组成，以及另外存在本发明的方法，其基本上由所述处理步骤组成或由所述处理步骤组成。
应当理解，只要本发明仍然可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序是不重要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
例如，在背景技术部分中提及任何出版物并不是承认该出版物用作关于本文提出的任何权利要求的现有技术。背景技术部分是出于清楚的目的而给出的，并不意味着对任何权利要求的现有技术的描述。
本文描述了一种快速且灵敏的NMR平台，其设计用于在少量细胞上进行代谢通量分析。该系统称为“超极化微磁共振光谱仪(HMRS)”，在某些实施方案中，该系统(i)配备有双调谐微线圈电路，用于13C分子的灵敏检测，(ii)优化以处理少量生物样本，和(iii)与微流体系统集成以进行高通量分析。HMRS系统可以量化糖酵解通量，其灵敏度比传统的DNP-NMR方法高1000倍。该系统用于体外测定白血病干细胞中的代谢通量，并在细胞存活性或增殖发生任何变化之前评估药物治疗反应。此外，该平台在一个实验中分析超过10个超极化分子样本，与用于研究代谢通量的其他系统相比，展示了改进的特征。
有氧糖酵解或'Warburg效应'是癌细胞的独特代谢特征，与多种致癌信号传导途径密切相关。由于糖酵解通量代表在任何给定时刻主要代谢途径的活性，它已成为癌症诊断和治疗反应监测的有效生物标志物。非常需要能够在质量受限的样本(包括癌症干细胞)中进行快速通量分析的方法，本文提出的HMRS系统提供了可以在质量受限的样本中进行快速通量分析的方法的解决方案。
与用于代谢通量分析的常规技术相比，所开发的HMRS系统具有若干优点。首先，所提供系统的检测模式基于磁共振，这使得通量分析完全非破坏性，从而允许重复测量以及下游的使用其他技术的分子分析。其次，所提供系统的小型化检测线圈增加了目标分子的填充因子并提高了灵敏度。第三，通过利用诸如DNP超极化技术的超极化技术，所提供的系统实时监测代谢反应而无需任何信号平均。第四，所提供的系统可以使用集成的微流体系统进行多次分析，使得高通量系统能够分析超极化分子以及将该平台集成到其他高通量方法中的潜力。
基于这些技术优势，HMRS平台定量分析白血病干细胞中的代谢通量，并且比存活性的任何变化更早地评估癌细胞中的治疗反应，使用常规方法难以实现。本公开为干细胞研究提供了令人惊讶的机会，其中快速和敏感的分析能力是关键的。此外，所提供的公开内容可用于研究干细胞如何代谢地响应外部刺激，例如药物治疗。
针对白血病干细胞和造血干细胞代谢差异的药物进一步研究可以为治疗癌症提供更有效的治疗策略。HMRS平台还可以连续方式用于临床相关样本(例如活检标本或患者衍生的类器官)中的快速代谢通量分析，以评估治疗反应。
其他功能可以推进HMRS系统。为了分析不同的代谢途径，除丙酮酸之外的代谢物的超极化可以容易地应用于HMRS。对于较少数量的细胞的分析，存在多种策略。
首先，可以采用用于NMR信号采集的较小线圈。直径小于1.4毫米的线圈可以提供更高的灵敏度；然而，在有限的时间范围内将样本精确加载到亚微升空间并非易事。克服这一挑战的一个策略是将微气动执行器集成到HMRS中，其将液体样本快速精确地移动到微型线圈中；
其次，可以设计高阶匀场线圈以使磁场更均匀。在某些实施例中，所提供的系统配备有一阶匀场线圈，其在微线圈电路区域中提供有限的磁场均匀性(0.14ppm FWHM)。由于NMR信号与经历相同磁场的目标原子核的数量成比例，因此更均匀的磁场导致更窄的NMR峰和更高的SNR。将二阶和三阶匀场线圈添加到永磁体中可以改善磁场的均匀性，从而导致增强HMRS的灵敏度。
第三，可以将选择性RF脉冲应用于信号采集。在某些实施方案中，所提供的系统使用单个RF脉冲获得NMR光谱，其同时激发所有代谢底物和产物。设计成仅激发产物(例如乳酸)的选择性脉冲可使底物(例如丙酮酸)的超极化旋转状态相对完整。缓慢衰减的超极化底物的益处允许通量分析延长的时间段，提供监测多种代谢途径的机会。
HMRS平台为生物相关系统中的代谢动力学提供了快速和灵敏探索的机会。
超极化核磁共振的应用
在某些实施方案中，超极化NMR用于术中组织分析。例如，在脑外科手术期间，通过冷冻切片分析肿瘤活组织检查样本，其需要约20至约30分钟。超极化NMR允许在冷冻切片之前一分钟内分析活检样本的代谢信息。分析悬浮液中约50,000个细胞的代谢动力学。在某些实施方案中，修改所提供的系统和方法，使得可以分析实体组织样本。
在某些实施方案中，超极化NMR用于药物治疗后的治疗功效监测。例如，白血病细胞的表征可能需要几个小时或几天。超极化NMR允许在FACS，蛋白质印迹或PCT之前的一分钟内分析治疗后的代谢信息。如本文所述，研究酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的分析以确定其对代谢的影响。在某些实施方案中，所提供的系统和方法可用于其他TKI治疗(例如，用于CLL的依鲁替尼(ibrutinib))。
传统的超极化NMR系统需要超过数千万个细胞。相反，本公开提供了可以分析少量细胞的超极化微核磁共振系统。
鉴定目标和治疗
本公开内容描述了超极化的微核磁共振系统和用于鉴定代谢途径中的多种药物靶标的方法(例如，用于早期发现)。在某些实施方案中，所公开的系统和方法促进对代谢途径中涉及的各种化合物的高通量筛选。
此外，所公开的系统和方法可以基于功效监测指导治疗方案，并且可以通过识别对应于代谢差异的干预点(例如，目标)来支持治疗开发。例如，超极化微核磁共振可以描述少数细胞的代谢特征(例如，不超过200k个细胞，不超过150k个细胞，不超过100k个细胞，不超过50k个细胞，不超过25k个细胞，或不超过10k个细胞)。因此，所公开的系统和方法提供了研究来自患者的肿瘤的异质性的能力，从而揭示了有效的治疗功效。这不能通过仅在大量细胞上分析代谢特征的系统来实现，例如，具有需要在大量细胞上进行信号平均的解决方案的系统。
药物可以靶向多种代谢途径，例如癌症中的代谢途径和非癌性疾病和其他病症中的代谢途径，例如糖尿病和脂肪肝疾病中的代谢途径。
药物也可以改变细胞的内源性代谢。在某些实施方案中，药物可以是超极化的，并且检测和定量其在细胞中的代谢产物。
例如，药物可包括受体酪氨酸激酶抑制剂和代谢酶抑制剂(例如，IDHi，例如LDHi，例如PDHK的DCA)，伊马替尼(例如，用于慢性髓性白血病(CML)，例如用于急性淋巴细胞白血病(ALL)，例如，用于胃肠道间质瘤(GIST))，雷帕霉素(例如，用于肾癌)，enasidenib，表皮生长因子受体(EGFR)-靶向酪氨酸激酶抑制剂(例如，厄洛替尼(例如，用于肺癌))，BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂(例如，厄洛替尼(例如，用于肺癌))，PI3K抑制剂(例如，Idelalisib(例如，用于CLL))，FLT3-ITD酪氨酸激酶抑制剂(例如，Quizartinib(例如，对于AML))，PDK的抑制剂(例如，二氯乙酸酯(DCA))，mTORC1的间接抑制剂(例如，二甲双胍(例如，用于胰腺癌))和P450。
具体实施方式
超极化微磁共振谱仪
图1A说明了癌细胞和正常细胞之间糖酵解代谢的基本差异。丙酮酸是糖酵解的3碳中间产物，主要通过细胞质中的乳酸脱氢酶(LDH，EC 1.1.2.4)转化为乳酸，或通过线粒体中的丙酮酸脱氢酶(PDH，EC 1.2.4.1)转化为乙酰辅酶A。LDH通常在癌细胞中过表达，驱使丙酮酸转化为乳酸。在正常细胞中，丙酮酸被氧化到更大程度并用于线粒体中的ATP生成。当[1-13C]丙酮酸直接通过单羧酸转运蛋白(MCTs)进入细胞时，它进入细胞内丙酮酸池并被代谢，与正常细胞相比，在癌细胞中产生更高的[1-13C]乳酸(图1A和7)。然后[1-13C]丙酮酸的超极化提供了一种通过显著的MR信号增强来非侵入性地探测糖酵解的最后一步的方法。
图1B显示HMRS测定方案。将样本(细胞悬浮液)与超极化的[1-13C]丙酮酸混合，然后加载到HMRS系统中的微线圈(1.4mm直径，2-μL体积)中(图1C)。HMRS系统在1.05特斯拉(B0)永磁体(nanoScan，Mediso)中获得丙酮酸和乳酸的NMR信号。因为丙酮酸和乳酸具有相对长的自旋晶格弛豫时间T1，在1.05Telsa(分别为71和43秒)，这些分子的超极化状态在代谢反应和信号采集期间不会显著衰减。值得注意的是，分析代谢通量的整个过程在两分钟内完成(图1B)。采用微线圈探针电路以在我们的永磁体(分别为44.69和11.24MHz)的1H和13C的拉莫尔频率下共振。通常，永磁体为MR研究提供了成本有效的解决方案，但它受到磁场的时间和空间不均匀性的影响。这些问题通过微线圈中的1H共振模式得到解决；在1H共振模式下，通过一阶匀场诊断和校准漂移和不均匀性。然后在13C NMR实验之前立即将共振模式从1H模式切换到13C模式(图1C)。
HMRS系统使用30°RF脉冲每四秒获得NMR光谱，并基于峰面积对它们进行定量。利用50,000个UOK262细胞(肾细胞癌)，观察到从第一个NMR谱中检测到乳酸峰，并且其信号水平相对于丙酮酸随时间增加(图2A和2B)。考虑到乳酸具有比丙酮酸更短的T1，乳酸的相对增加表明微线圈内的细胞在测量期间消耗丙酮酸并产生乳酸(图8A-8C)。
因为丙酮酸的13C NMR信号显著大于乳酸和丙酮酸水合物的13C NMR信号，13C乳酸信号相对于13C总信号(丙酮酸+丙酮酸水合物+乳酸)的增加速率可以等于丙酮酸至乳酸的转化率常数，kPL(图9)。因此，HMRS测定中从丙酮酸到乳酸的总转化率可以假设为kPL和丙酮酸的初始量[Pyr]t＝0，加载到系统中的产物(＝28×10-9mol))。总转化率(kPL×[Pyr]t＝0)定义为代谢通量度量ξ。
分析活细胞的代谢通量，灵敏度提高1000倍
为了评估所述方法的灵敏度，用UOK262细胞进行滴定实验，证明检测灵敏度低至104个癌细胞，对细胞数具有线性响应(R2>99％，图3A)。常规的超极化NMR技术通常需要更多数量的细胞(>107)用于代谢通量分析，而HMRS平台需要大约104个目标细胞。这种1000倍的灵敏度是HMRS系统的关键优势之一，例如，通过线圈设计的小型化实现。NMR信号的信噪比(SNR)取决于流过线圈的单位电流引起的磁场，因此较小的线圈比具有相同数量的目标分子的较大线圈产生更高的SNR(图10)。SNR较高的另一个因素是目标分子的填充因子。嵌入聚合物块中的所述微线圈允许样本填充整个线圈，最大化NMR检测的填充因子(≈1)。
分析了五种不同的细胞系，UOK262，U87，Jurkat，K562和HK-2(图3B)。与良性肾小管细胞HK-2相比，UOK262显示出大约高2倍的通量(分别为40.6和21.0pmol/sec)(图3C)。在HMRS测定之前和之后，使用两种癌细胞系UOK262(作为实体癌的代表)和K562(一种慢性髓性白血病(CML)细胞系)作为液体癌的代表进一步评估细胞存活性。在实验期间细胞损失可忽略不计，并且细胞存活性没有显著差异(p值＝NS，图3D和图11)，从而证明了HMRS平台的另一个优点(例如，代谢通量的非破坏性分析)。
量化白血病干细胞的代谢通量
白血病干细胞(LSCs或白血病起始细胞)，由其在移植后启动和重建恶性肿瘤的能力所定义，与大量白血病群相比，对常规治疗方案更具抗性。考虑到不同的代谢特征赋予癌细胞生存益处，理解LSC对特定代谢途径的依赖有可能阐明更有效的靶向癌症干细胞的治疗策略。考虑到这一点，HMRS平台的灵敏度增加被用来量化原代LSC中的代谢通量，这在以前使用传统方法是不可能的。由MLL-AF9致癌基因驱动的急性髓性白血病(AML)中的LSCs特别令人感兴趣，因为MLL-AF9与Myc33,34的失调表达有关，其可能介导癌症中的代谢重编程。基于表面蛋白质c-Kit(CD117)对从MLL-AF9AML小鼠的骨髓中收集的LSC进行分选，并在24小时内非侵入性地快速测定(图4A和4B)。有趣的是，LSCs(c-KitHi)表现出比白血病非干细胞(c-KitLo)高近2倍的通量(图4C)。鉴于所提供的方法是非破坏性的，可以通过免疫印迹进一步测定这些原代细胞中c-Myc的状态(图16)，这证实c-KitHi细胞也表现出高表达水平的Myc。虽然可以进行进一步的实验来表征c-Myc在原代c-KitHi LSCs中对代谢的控制，但是使用超极化底物的实验提供了LSC区室中差异代谢的定量证据。
快速定量评估药物治疗反应
由于在发生主要临床病理变化之前可以通过抗癌药物治疗诱导代谢变化，因此与该途径相关的任何代谢变化可以是治疗功效的早期指标。因此，基于代谢通量分析的高灵敏度和非破坏性的优点，HMRS平台被应用于药物治疗功效的快速评估。
伊马替尼(GLEEVEC)，一种用于慢性粒细胞白血病(CML)治疗的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，已被证明可以影响癌细胞中的糖酵解活性。有理由认为，用伊马替尼治疗K562细胞的糖酵解通量分析将是评估药物作用的时间依赖性变化的模型。药物处理24小时后，细胞增殖速率略微降低，并且在高达1μM伊马替尼的浓度下细胞存活性没有显著改变(图5A，5B和图12)。然而，使用HMRS，发现在1μM伊马替尼处理24小时后乳酸峰降低约75％(图5C和5D)。这种糖酵解通量的减少可以通过治疗靶向的信号传导途径来解释：即使在0.25μM伊马替尼处理时，靶蛋白BCR-ABL的磷酸化水平也降低，这导致PI3K/AKT/mTOR途径的下调和关键代谢酶LDH-A的磷酸化降低(图13)。通过评估不同的时间点，发现早在处理后3小时就可以检测到药物作用(图5E和5F)。与通量分析相反，使用常规高场NMR光谱仪对代谢物浓度的分析显示对治疗的响应慢得多(图5G)。不希望受任何理论束缚，通量和池大小分析之间的这种显著差异可以解释如下：通量表示给定时刻的代谢活动，但池大小表示在某时段的代谢活动。早在处理后3小时，伊马替尼就开始影响K562细胞的代谢活动，并且降低的糖酵解活性开始改变乳酸池的大小，这是大的(大约为mM水平)。在所提供的测定中，需要约12小时来使池大小发生显著变化。这些结果证明了HMRS通量分析的另一个优点：快速评估治疗效果。
单次溶出的多重分析
虽然目前的方法提供了快速测量代谢通量的手段，但仍然需要开发高通量方法。为了满足这一需求，推进了HMRS平台，以实现超极化分子的高通量分析。DNP方法为13C核提供大于20％的极化，但它在通量方面存在一些限制。例如，(i)DNP方法用相对昂贵的化学化合物进行超极化需要一个多小时，以及ii)用RF激发脉冲超极化状态快速衰减到热平衡，这仅允许一个NMR实验。非常需要能够使用DNP-NMR方法进行高通量分析的方法。假设如果在与超极化分子的T1弛豫时间成比例的时间范围内可以将完整的超极化分子持续供应到微线圈中，则可以进行多次NMR分析。
设计3D打印的微型池以容纳用于多个实验(例如，高达100μL)的样本并连接到微线圈通道的入口(图6A)。通道出口连接到注射泵(PH2000，Harvard Apparatus)，拉伸速率为5μL/sec。图6B描述了来自单次溶解的高通量分析的测定方案；i)注射泵将样本(Z1)拉至微线圈区域，然后采集13C NMR信号，ii)采集后，注射泵将完整样本(Z2)拉入微线圈区域，和iii)另一个13C核磁共振信号采集开始。HMRS平台与微型池集成，成功地对单次溶解的超极化自旋状态进行了12次分析(图6C，6D和图14)。所有12个分析均符合于单个衰减模型，其中T1为67秒，RF脉冲为60°翻转角，其产生99.5±0.4％R2和分析之间的均方根误差3.07±1.05％(图6D)。此外，该方法扩展到来自单次溶解的癌细胞中糖酵解通量的多重分析(图6E)。提供的集成HMRS平台将样本池与微线圈(施加RF脉冲)分开，实现了超极化分子单次溶解的多重分析。该分析能力显示了HMRS在细胞中进行高通量分析的潜力。
方法和材料
微线圈的制造
将细磁线(Belden 8042,32AWG)围绕金属棒(直径1.4mm)缠绕五次，并将其嵌入聚二甲基硅氧烷(PDMS)(Down Corning)中。在PDMS在80℃下固化过夜后，拉出导线，形成具有微流体通道的小型化螺线管线圈(微线圈)。
3D打印的微型池
使用CAD软件(3Ds MAX，Autodesk)和3D打印机(Micro Plus Hi-Res，EnvisionTec)来设计和打印微型池。微型池的出口(直径1.4毫米)设计成适合微流体通道，微型池(10毫米直径)的入口设计用于容易装载样本。微型池的最大容量为约100μL。
药物(伊马替尼)对K562细胞的处理
将K562细胞以100,000细胞/mL的浓度置于10mL完全RPMI培养基中。10μL完全RPMI培养基，二甲基亚砜(DMSO)、DMSO中的0.25mM伊马替尼和DMSO中的1mM伊马替尼，分别用于对照样本，0.1％DMSO处理的样本，0.25μM和1.0μM伊马替尼处理的样本。伊马替尼购自Cayman Chemical。制备两组四个烧瓶(每个样本两个烧瓶)并在培养箱中储存24小时。24小时后检查细胞数和存活性，用完全RPMI培养基洗涤细胞一次，并准备进行超极化实验。
使用动态核极化(DNP)的超极化
使用SPINLab极化器(GE)使[1-13C]丙酮酸极化。极化的制备步骤如下：i)用自由基制备富含13C的丙酮酸样本：将15mM AH-111501(GE)在[1-13C]丙酮酸(Sigma Aldrich：677175)中充分混合。ii)制备用于溶解的缓冲溶液：将0.4mM乙二胺四乙酸(EDTA)加入40mMTrizma盐酸盐溶液(Sigma Aldrich：T2663)中。iii)将100μL来自步骤i)的丙酮酸样本和20mL来自步骤ii)的缓冲溶液加载到SPINLab极化器(3特斯拉，0.98K)中。极化90分钟后，将丙酮酸样本迅速溶解于含有120μL10N氢氧化钠溶液(Fisher Scientific：SS255)的冰冷烧瓶中，使溶解的样本保持中性(pH～7.4)并更快地达到37℃。将溶解的丙酮酸样本以1:10的比例加入细胞悬浮液中。
细胞培养
K562和Jurkat细胞在Gibco RPMI-160培养基(Thermo Fisher Scientific：11875-093)中生长。UOK262和HK-2细胞在Advanced DMEM/F-12(Thermo FisherScientific：12634-010)中生长。U87细胞在EMEM(ATCC：30-2003)中生长。所有培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素。
细胞数量和存活性
使用CELLOMETER Mini细胞计数器(Nexcelom Bioscience)测量细胞数和存活性；在测量之前，将细胞悬浮液与台盼蓝溶液以1：1的比例混合。对于每次测量，将细胞悬浮液稀释至其浓度在0.8-2×106/mL的范围内。
FACS分选白血病细胞
处理移植了MLL-AF9白血病细胞的白血病小鼠的骨髓，并用Mac1-PacBlue和c-Kit-PeCy7染色(34)。使用BD FACS Aria III仪器分别将顶部15％和最低20％的c-Kit细胞分类为c-KitHi和c-KitLo细胞。在超极化实验之前，将细胞在含有SCF(10ng/ml)，IL-3(10ng/ml)和IL-6(10ng/ml)的RPMI培养基中培养20小时。
蛋白质印迹分析
用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液(Thermo Scientific：89901)裂解K562细胞，用不含Ca+Mg的冷PBS洗涤并通过离心(3000rpm，10分钟)浓缩(ThermoScientific：78480，78420)。使用BCA测定法定量蛋白质裂解物的浓度。使用NuPAGE预制凝胶分离蛋白质裂解物，并转移至NOVEX聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Thermo FisherScientific：LC2002)，如制造商的方案中所述。用一抗免疫印迹膜中的靶蛋白；BCR-ABL(Cell Signaling：3902)，磷酸BCR-ABL(Cell Signaling：3901)，LDHA(Cell Signaling：2012)，磷酸化LDHA(Cell Signaling：8176)和β-肌动蛋白(Cell Signaling：8457)。然后将辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(Santa Cruz Biotechnology：SC-2004)与膜一起温育。使用化学发光(ECL)HRP底物(Thermo Fisher Scientific：34080)在X射线胶片(ThermoFisher Scientific：34090)上检测蛋白质条带。
较小的线圈对质量受限的样本更敏感
图10示出较小的线圈对质量受限的样本更敏感。发现NMR信号取决于微线圈的直径。图10描绘了测试结果图，其中测试直径为1.4mm的微线圈测量样本中17.5μmole浓度，直径为2.8mm的微线圈测量样本中17.5μmole浓度和直径为2.8mm的微线圈测量样本中浓度70μmol的，其产生的NMR信号(a.u.)分别为约40、20和80。因此，图10表明，与较大的线圈(例如，直径为2.8mm)相比，当使用较小的线圈(例如，具有1.4mm的直径)时，可以以更高的灵敏度检测相同量的靶材料。但是，使用直径太小的线圈会导致样本加载出现问题。因此，本文提供的系统非常适合于测量样本中有限的细胞(例如，癌症干细胞，例如干细胞，例如患者活检样本)中的代谢通量。
高通量微核磁共振设备
为了开发将进行多个超极化NMR实验的微核磁共振系统，提供的系统和方法被设计成连续地将超极化分子供应到NMR线圈中。
设计3D打印的微型池以供应用于高通量实验的样本(图6A-6E)。图6A-6E描绘了来自超极化分子的单次溶解的高通量分析的示例性测定方案。
图6B显示微流体系统将样本“Z1”拉入微线圈区域，然后采集13C NMR信号。在采集之后，微流体系统将另一个完整样本(“Z2”)拉入微线圈区域，并开始另一个13C NMR信号采集。这个过程不断重复。
图6D和6E显示在分析之间可用99.5％的R2实现超过12个超极化分子的分析(图6D)。此外，可以通过单次溶解进行活细胞中代谢活动的多种分析(图6E)。
图6F显示了根据本发明的说明性实施方案的3D打印的多孔微型池，其提供用于NMR分析的不同样本。将每个孔中的不同样本加载到微线圈区域中，其中获得13C NMR信号。每次采集在1秒内完成，样本切换时间小于5秒。因此，可以在1分钟内完成8个样本的分析。
示例性的网络环境
图24示出了用于分析对应于样本颗粒的光谱测定数据的方法和系统中的示例性的网络环境2400，如本文所述。简要概述，现在参考图24，示出并描述了示例性云计算环境2400的框图。云计算环境2400可以包括一个或多个资源提供者2402a，2402b，2402c(统称为2402)。每个资源提供者2402可以包括计算资源。在一些实现中，计算资源可以包括用于处理数据的任何硬件和/或软件。例如，计算资源可以包括能够执行算法，计算机程序和/或计算机应用程序的硬件和/或软件。在一些实现中，示例性计算资源可以包括具有存储和检索能力的应用服务器和/或数据库。每个资源提供者2402可以连接到云计算环境2400中的任何其他资源提供者2402。在一些实施中，资源提供者2402可以通过计算机网络2408连接。每个资源提供者2402可以通过计算机网络2408连接到一个或多个计算设备2404a，2404b，2404c(统称为2404)。
云计算环境2400可以包括资源管理器2406。资源管理器2406可以通过计算机网络2408连接到资源提供者2402和计算设备2404。在一些实施中，资源管理器2406可以实现一个或多个资源提供者2402提供计算资源到一个或多个计算设备2404。资源管理器2406可以从特定计算设备2404接收对计算资源的请求。资源管理器2406可以识别一个或多个资源提供者2402提供计算设备2404所请求的计算资源。资源管理器2406可以选择资源提供器2402来提供计算资源。资源管理器2406可以实现资源提供者2402与特定计算设备2404之间的连接。在一些实施中，资源管理器2406可以在特定资源提供者2402和特定计算设备2404之间建立连接。在一些实施中，资源管理器2406可以利用所请求的计算资源将特定计算设备2404重定向到特定资源提供者2402。
图25示出了可以在本公开中描述的方法和系统中使用的计算设备2500和移动计算设备2550的示例。计算设备2500旨在表示各种形式的数字计算机，例如笔记本电脑，台式机，工作站，个人数字助理，服务器，刀片服务器，大型机和其他适当的计算机。移动计算设备2550旨在表示各种形式的移动设备，诸如个人数字助理，蜂窝电话，智能电话和其他类似的计算设备。这里示出的组件，它们的连接和关系以及它们的功能仅仅是示例，并没有限制于此。
计算设备2500包括处理器2502，存储器2504，存储设备2506，连接到存储器2504的高速接口2508和多个高速扩展端口2510，以及连接到低速扩展端口2514和存储设备2506的低速接口2512。处理器2502，存储器2504，存储设备2506，高速接口2508，高速扩展端口2510和低速接口2512中的每一个使用各种总线互连，并且可以适当地安装在公共主板上或以其他方式安装。处理器2502可以处理用于在计算设备2500内执行的指令，包括存储在存储器2504中或存储设备2506上的指令，以在外部输入/输出设备上显示GUI的图形信息，例如耦合到外部输入/输出设备的显示器2516。在其他实施中，可以适当地使用多个处理器和/或多个总线以及多个存储器和类型的存储器。而且，可以连接多个计算设备，每个设备提供必要操作的部分(例如，作为服务器库，一组刀片服务器或多处理器系统)。
存储器2504存储计算设备2500内的信息。在一些实施中，存储器2504是易失性存储器单元。在一些实施方案中，存储器2504是非易失性存储器单元。存储器2504还可以是另一种形式的计算机可读介质，例如磁盘或光盘。
存储设备2506能够为计算设备2500提供大容量存储。在一些实施中，存储设备2506可以是或包含计算机可读介质，诸如软盘设备，硬盘设备，光盘设备，或磁带设备，闪存或其他类似的固态存储设备，或设备阵列，包括存储区域网络中的设备或其他配置。指令可以存储在信息载体中。当由一个或多个处理设备(例如，处理器2502)执行时，指令执行一个或多个方法，例如上面描述的那些方法。指令还可以由一个或多个存储设备存储，例如计算机或机器可读介质(例如，存储器2504，存储设备2506或处理器2502上的存储器)。
高速接口2508管理计算设备2500的带宽密集型操作，而低速接口2512管理低带宽密集型操作。这种功能分配仅是一个例子。在一些实施方式中，高速接口2508耦合到存储器2504，显示器2516(例如，通过图形处理器或加速器)，并且耦合到高速扩展端口2510，高速扩展端口2510可以接受各种扩展卡(未示出)。在该实现中，低速接口2512耦合到存储设备2506和低速扩展端口2514。低速扩展端口2514，其可以包括各种通信端口(例如，USB，蓝牙，以太网，无线以太网)可以耦合到一个或多个输入/输出设备，例如键盘，指示设备，扫描仪，或网络设备，例如交换机或路由器，例如，通过网络适配器。
计算设备2500可以以多种不同的形式实现，如图中所示。例如，它可以实现为标准服务器2520，或者在一组这样的服务器中实现多次。另外，它可以在诸如笔记本电脑2522的个人计算机中实现。它还可以实现为机架服务器系统2524的一部分。或者，来自计算设备2500的组件可以与移动设备中的其他组件组合。这些设备中的每一个可以包含计算设备2500和移动计算设备2550中的一个或多个，并且整个系统可以由彼此通信的多个计算设备组成(未示出)，诸如移动计算设备2550。
移动计算设备2550包括处理器2552，存储器2564，诸如显示器2554的输入/输出设备，通信接口2566和收发器2568，以及其他组件。移动计算设备2550还可以被提供存储设备，例如微驱动器或其他设备，以提供额外的存储。处理器2552，存储器2564，显示器2554，通信接口2566和收发器2568中的每一个使用各种总线互连，并且若干组件可以适当地安装在公共主板上或以其他方式安装。
处理器2552可以执行移动计算设备2550内的指令，包括存储在存储器2564中的指令。处理器2552可以实现为芯片的芯片组，其包括单独的和多个模拟和数字处理器。处理器2552可以提供例如移动计算设备2550的其他组件的协调，诸如用户界面的控制，由移动计算设备2550运行的应用，以及移动计算设备2550的无线通信。
处理器2552可以通过控制接口2558和耦合到显示器2554的显示器接口2556与用户通信。显示器2554可以是例如TFT(薄膜晶体管液晶显示器)显示器或OLED(有机发光二极管)显示器或其他适当的显示技术。显示器接口2556可以包括用于驱动显示器2554以向用户呈现图形和其他信息的适当电路。控制接口2558可以从用户接收命令并将它们转换以提交给处理器2552.此外，外部接口2562可以提供与处理器2552的通信，以便实现移动计算设备2550与其他区域的近区域通信。外部接口2562可以在例如一些实现中提供有线通信，或者在其他实现中提供无线通信，并且还可以使用多个接口。
存储器2564存储移动计算设备2550内的信息。存储器2564可以作为计算机可读介质或媒介，易失性存储器单元或非易失性存储器单元中的一个或多个。还可以提供扩展存储器2574，并通过扩展接口2572将2574连接到移动计算设备2550，扩展接口2572可能包括例如SIMM(单列直插存储器模块)卡接口。扩展存储器2574可以为移动计算设备2550提供额外的存储空间，或者还可以存储用于移动计算设备2550的应用程序或其他信息。具体来说，扩展存储器2574可以包括执行或补充上述过程的指令，并且还可以包括安全信息。因此，举例来说，扩展存储器2574可以被作为安全模块用于移动计算设备2550，并且可以被编程为指令，允许安全使用移动计算设备2550。此外，可以通过SIMM(单列直插存储器模块)提供安全应用程序以及其他信息，例如以非黑客的方式在SIMM卡上放置识别信息。
存储器可以包括例如闪存和/或NVRAM存储器(非易失性随机存取存储器)，如下所述。在一些实施中，指令存储在信息载体中，并且当由一个或多个处理设备(例如，处理器2552)执行时，执行一个或多个方法，例如上面描述的那些方法。指令还可以由一个或多个存储设备存储，例如一个或多个计算机或机器可读介质(例如，存储器2564，扩展存储器2574或处理器2552上的存储器)。在一些实施中，可以在传播信号中接收指令，例如，通过收发器2568或外部接口2562。
移动计算设备2550可以通过通信接口2566无线通信，通信接口2566在必要时可能会进行数字信号处理。通信接口2566可以提供各种模式或协议下的通信，例如GSM语音呼叫(全球移动通信系统)，SMS(短消息服务)，EMS(增强消息服务)或MMS消息(多媒体消息服务)，CDMA(码分多址)，TDMA(时分多址)，PDC(个人数字蜂窝)，WCDMA(宽带码分多址)，CDMA2000或GPRS(通用分组无线业务)等。这种通信可以通过使用例如射频的收发器2568发生。另外，可能发生短距离通信，例如使用蓝牙，Wi-Fi TM或其他这样的收发器(未示出)。另外，GPS(全球定位系统)接收器模块2570可以向移动计算设备2550提供附加的导航和位置相关的无线数据，其可以由在移动计算设备2550上运行的应用适当地使用。
移动计算设备2550还可以使用音频编解码器2560进行可听地通信，音频编解码器2560可以从用户接收语音信息并将其转换为可用的数字信息。音频编解码器2560同样可以为用户产生可听声音，例如通过扬声器，例如在移动计算设备2550的手机中。这种声音可以包括来自语音电话呼叫的声音，可以包括记录的声音(例如，语音消息)。音乐文件等，并且还可以包括由在移动计算设备2550上操作的应用程序生成的声音。
移动计算设备2550可以以多种不同的形式实现，如图中所示。例如，它可以被用作为蜂窝电话2580.它还可以用作为智能电话2582，个人数字助理或其他类似移动设备的一部分。
这里描述的系统和技术的各种实现可以在数字电子电路，集成电路，专门设计的ASIC(专用集成电路)，计算机硬件，固件，软件和/或其组合中实现。这些各种实现可以包括在可编程系统上可执行和/或可解释的一个或多个计算机程序中的实现，该可编程系统包括至少一个可编程处理器，其可以是特殊的或通用的，耦合以从数据接收数据和指令，以及传输数据。存储系统，至少一个输入设备和至少一个输出设备的指令和指令。
这些计算机程序(也称为程序，软件，软件应用程序或代码)包括用于可编程处理器的机器指令，并且可以用高级过程和/或面向对象的编程语言和/或汇编/机器语言来实现。如本文所用，术语机器可读介质和计算机可读介质是指任何计算机程序产品、装置和/或设备(例如，磁盘，光盘，存储器，可编程逻辑设备(PLD))，用于向包括机器可读介质的可编程处理器提供机器指令和/或数据，其接收机器指令作为机器可读信号。术语机器可读信号是指用于向可编程处理器提供机器指令和/或数据的任何信号。
为了提供与用户的交互，这里描述的系统和技术可以在具有用于向用户显示信息的显示设备(例如，CRT(阴极射线管)或LCD(液晶显示器)监视器)的计算机上实现，以及用户可以通过其向计算机提供输入的键盘和指示设备(例如，鼠标或轨迹球)。其他类型的设备也可用于提供与用户的交互；例如，提供给用户的反馈可以是任何形式的感官反馈(例如，视觉反馈，听觉反馈或触觉反馈)；并且可以以任何形式接收来自用户的输入，包括声学，语音或触觉输入。
这里描述的系统和技术可以在包括后端组件(例如，作为数据服务器)的计算系统中实现，或者包括中间件组件(例如，应用服务器)，或者包括前端组件(例如，具有图形用户界面或Web浏览器的客户端计算机，用户可以通过该浏览器与这里描述的系统和技术的实现进行交互)，或者这种后端、中间件或前端组件的任何组合。系统的组件可以通过任何形式或介质的数字数据通信(例如，通信网络)互连。通信网络的示例包括局域网(LAN)，广域网(WAN)和因特网。
计算系统可以包括客户端和服务器。客户端和服务器通常彼此远离，并且通常通过通信网络进行交互。客户端和服务器的关系由于在各自的计算机上运行并且彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序而产生。

Claims (54)

1.一种样本分析方法，该方法包括：
微线圈内提供包含超极化物质的样本，并将所述样本和微线圈暴露于磁场之下；以及
检测样本的核磁共振(NMR)信号。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括代谢成像。
3.权利要求1或2的方法，其中所述样本选自于活体样本和非活体样本。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述活体样本包含生物样本。
5.权利要求4的方法，其中所述生物样本选自下组：细胞悬浮液，实体组织样本、包封细胞的多孔结构、肿瘤类器官、生物细胞、蛋白质和/或代谢物、细菌、酵母、酶系统和蓝藻/绿藻。
6.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述非活体样本选自合成细胞系统、合成酶系统和化学分子。
7.前述权利要求中任一项的方法，还包括使样本超极化。
8.权利要求7的方法，其中超极化通过对氢诱导的极化(PHIP)、动态核极化(DNP)、自旋交换光泵浦、副氢诱导的极化或其他气体诱导的极化来进行。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述使样本超极化包括引入自由基源。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述自由基源选自：有机持久自由基、光诱导的非持久自由基、纳米金刚石或可形成临时自由基的代谢物和硅颗粒。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述超极化物质包含活性核(例如，任何NMR活性核)。
12.权利要求11的方法，其中活性核选自于：1H、13C、31P、15N和19F。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述超极化物质选自超极化的13C-丙酮酸、13C-DHA和13C-VitC(维生素C)、13C-果糖、13C-葡萄糖、13C-谷氨酰胺、13C-丝氨酸、13C-甘氨酸和13C-乙酸酯。
14.权利要求5-13中任一项的方法，其中所述生物细胞的数量选自如下数量：不超过200k个细胞、不超过150k个细胞、不超过100k个细胞、不超过50k个细胞的量、不超过25k个细胞、和不超过10k个细胞。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样本的体积选自如下体积：不大于100μL、不大于50μL、不大于25μL、不大于10μL、不大于超过5μL、和约为1至3μL。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微线圈包括小型化射频(RF)线圈。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述样本放置在包含所述微线圈的腔室内，所述微线圈围绕所述样本。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述磁场为约0.5T至7T。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述磁场为约1T。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括(例如，通过计算装置的处理器)从NMR信号确定样本的代谢数据。
21.如权利要求20所述的方法，包括确定代谢通量。
22.权利要求20或21的方法，包括监测酶促反应速率。
23.权利要求22的方法，其中以小于500pmol/sec、小于100pmol/sec、小于50pmol/sec或约30pmol/sec的速率监测酶促反应速率。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括：对于多个样本中的每一个，将所述样本放置在单独的微线圈室或隔室中，从而实现高通量信号和/或代谢数据检测。
25.根据权利要求24所述的方法，包括使用多个微线圈或微线圈部分的配置(例如，2、4、8、16、48、96、192、384、1536，例如，高通量平台)将所述多个样本中的每一个分别放置在其单独的微线圈室或隔室中。
26.如权利要求25所述的方法，其中每个微线圈或微线圈部分围绕单独的样本。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微线圈的直径不大于5mm，例如不大于3mm、例如不大于2mm、例如不大于1.5mm、例如不大于1.0mm、例如不大于0.5mm。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微线圈的直径在约0.5mm至约2mm的范围内。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微线圈的直径在约0.5mm至约1.5mm的范围内。
30.根据权利要求5至29中任一项所述的方法，其中所述样本包含来自肿瘤活组织检查和/或癌症干细胞的细胞。
31.根据权利要求5至30中任一项所述的方法，还包括从所述NMR信号确定代谢数据，其中所述样本包括在手术期间从患者获取的细胞，并且要在获取所述细胞之后10分钟内进行所述代谢数据的确定。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述手术是脑外科手术。
33.权利要求31或32的方法，其中在获得细胞之后的5分钟内，例如在3分钟内，例如1分钟内，确定所述代谢数据。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述方法包括在手术期间获得的组织样本的术中分析。
35.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样本包含在施用药物后从受试者获得的细胞。
36.如权利要求35所述的方法，还包括监测治疗功效。
37.一种超极化微核磁共振系统，包括：
用于产生磁场的磁铁；
微型线圈室，其尺寸和形状设计成包含悬浮样本和超极化物质；
第一调谐电路；
用于检测样本的NMR信号的检测器；和
计算设备的处理器，用于执行指令以从NMR信号确定样本的代谢数据。
38.如权利要求37所述的微核磁共振系统，其中第一调谐电路是1H的调谐电路。
39.如权利要求37或38所述的微核磁共振系统，还包括第二调谐电路。
40.如权利要求39所述的微核磁共振系统，其中所述第二调谐电路是13C的调谐电路。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的微核磁共振系统，还包括机械开关。
42.根据权利要求41所述的微核NMR系统，其中所述机械开关选择所述第一调谐电路。
43.如权利要求41或42所述的微核磁共振系统，其中所述机械开关选择所述第二调谐电路。
44.根据权利要求37至43中任一项所述的微核磁共振系统，其中所述磁场为约0.5T至7T。
45.根据权利要求37至43中任一项所述的微核磁共振系统，其中，所述磁场为约1T。
46.根据权利要求37至45中任一项所述的微核磁共振系统，其中所述计算机设备的处理器确定代谢通量。
47.根据权利要求37至46中任一项所述的微核磁共振系统，其中所述系统监测酶促反应速率。
48.权利要求47的微核磁共振系统，其中酶促反应速率小于500pmol/sec、小于100pmol/sec、小于50pmol/sec、或约30pmol/sec。
49.根据权利要求37至48中任一项所述的微核磁共振系统，被配置为执行权利要求1至36中任一项所述的方法。
50.根据权利要求37至49中任一项所述的微核磁共振系统，其中所述微线圈的直径不大于5mm，例如不大于3mm、例如不大于2mm、例如不大于1.5mm、例如不大于1.0mm、例如不大于0.5mm。
51.根据权利要求37至49中任一项所述的微核磁共振系统，其中所述微线圈的直径在约0.5mm至约2mm的范围内。
52.根据权利要求37至49中任一项所述的微核磁共振系统，其中所述微线圈的直径在约0.5mm至约1.5mm的范围内。
53.根据权利要求37至52中任一项所述的微核磁共振系统，其中，所述系统包括极化模块。
54.如权利要求53所述的微核磁共振系统，其中所述极化模块选自如下模块：仲氢诱导极化(PHIP)模块、动态核极化(DNP)模块、自旋交换光泵浦模块、仲氢诱导极化(PHIP)模块和其他气体诱导极化模块。
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