CN101854953A - 阶段ⅱ解毒和抗氧化剂活性 - Google Patents

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Abstract

提供了增强阶段II解毒或抗氧化剂酶转录的Nrf2(SKN-1)激活的方法和组合物(包含植物提取物(例如柳提取物)或其活性级分)，以及用于鉴定提高那些酶的Nrf2调节的别的化合物的方法。

Description

阶段Ⅱ解毒和抗氧化剂活性
优先权要求
本申请要求2007年9月11日提交的美国临时专利申请流水号60/993,325的权益，在此通过提及而收录其全部内容。
发明领域
本发明涉及柳、茶、及其提取物的抗氧化剂和解毒功能增强作用。
发明背景
活体不断被暴露于能引起不良效果的各种物质。此类物质包括例如重金属、某些食品添加剂、紫外线、和烟草。在这些物质对活体起作用时，产生称为自由基的反应性氧类别(reactive oxygen species)。活体进一步暴露于它作为某些生理学过程的副产物生成自身的氧化应激。认为氧化应激为许多状况诸如癌症、常见的疾病、和衰老症状的风险因素之一。活体使用清除自由基和使毒性物质解毒的机制(在本文中称为宿主防御机制)来处理此类氧化应激。在这种介导(mediation)/解毒机制受到损害时(例如由于正常的衰老过程)，防御机制不能完全介导这些化学物，并使这些化学物解毒，即一种有时能导致疾病发作的过程。
为了解决此问题，已经尝试了用于阻止疾病的形成或行进的方法，包括采取或应用具有抗氧化剂效果的物质(例如包含维生素C和/或E的组合物)。这些方法是有效的；不过，通常需要消化大量的抗氧化物质，以便产生临床上显著的效果。
另一方面，一旦得到增强，上文所提及的宿主防御机制能有效地除去氧化应激，并且因此预期比采用抗氧化物质更有用。“Nrf2”(即一种细胞核内转录因子)作为调节宿主防御机制的一种至关重要的蛋白质吸引了众多兴趣。在细胞暴露于氧化应激或毒性物质时，细胞胞质中存在的Nrf2分子被输入细胞核中，在那里它们结合称为抗氧化剂应答元件的基因调节区(参见例如Nguyen等，Ann.Rev.Pharm.Toxicol.，2003，43：233-60)，而且诱导称为阶段II解毒酶(phase II detoxification enzyme)的氧化应激响应酶(其存在于称为抗氧化剂应答元件的序列下游)的表达。已知缺乏Nrf2基因的动物具有受损的宿主防御机制。如此Nrf2在针对氧化应激和毒性物质的宿主防御机制中发挥至关重要的作用。
发明概述
本发明人已经发现了，某些植物提取物中的物质活化SKN-1/Nrf2，而且强烈诱导阶段II解毒酶(P2D)基因的表达，降低8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)的水平，并提高叉头框(forkhead box)O1(FOXO1)基因表达的水平。
如此，一方面，本发明的特征为用于增强P2D和抗氧化剂酶活性的方法和组合物，例如包含植物提取物(例如柳、绿茶、胡萝卜、或花椰菜(broccoli)的提取物)和/或其活性级分的组合物。另一方面，本发明的特征为鉴定活化SKN-1/Nrf2，因此增强P2D基因表达的物质的方法。如本文中所使用的，“活性级分”指与非分级提取物相比每份重量具有升高的活性的提取物级分。
一方面，本发明提供了包含植物提取物(例如柳、绿茶、胡萝卜、或花椰菜的提取物)或其活性级分的组合物，其中所述组合物提高阶段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化剂酶基因之一或两者在细胞中的表达。例如，组合物能提高选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰物亚基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的P2D基因；和/或抗氧化剂基因(例如超氧化物歧化酶1(SOD1))的表达。在一些实施方案中，组合物还提高FOXO1的表达和/或降低8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)的水平。
在一些实施方案中，将所述组合物配制用于口服，而且还可以包含一种或多种口服可接受载体和添加剂。在一些实施方案中，将组合物配制用于表面(topical)施用，而且还可以包含一种或多种表面可接受载体和添加剂。
在又一方面，本发明提供了用于提高柳提取物的阶段II解毒酶(P2D)和/或抗氧化剂酶增强活性的方法。该方法包括提供具有第一水平的P2D增强活性的柳提取物；对所述提取物分级，以便获得两种或更多种级分；选择具有0.5或更大的Rf值的级分；测定所述级分的P2D增强活性；并且若级分具有比P2D增强活性的第一水平高的P2D增强活性水平，则选择该级分。
在一些实施方案中，对所述提取物分级包括使用一种或多种选自下组的方法：柱层析、液液分级、和固液分级。
在又一方面，本发明提供了鉴定提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂基因在细胞中表达的化合物的方法。该方法包括提供表达(i)P2D或抗氧化剂基因或(ii)包含P2D或抗氧化剂基因启动子(例如P2D基因启动子的Nrf2结合序列)的报告物构建体的细胞；提供植物提取物的级分；使所述细胞与所述级分接触；并检测所述级分对所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的影响。提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)和/或抗氧化剂基因在细胞中的表达的化合物。
在一些实施方案中，该方法还包括选择提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；提供表达P2D或抗氧化剂基因或包含P2D或抗氧化剂基因启动子(例如P2D基因启动子的Nrf2结合序列)的报告物构建体的细胞；使所述细胞与所述亚级分接触；并检测所述亚级分对所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的影响，其中提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的亚级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂基因在细胞中表达的化合物。提高P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的亚级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)和/或抗氧化剂基因在细胞中表达的化合物。任选地，可以重复这些步骤，直至获得纯化的化合物，或者使用标准的分开-合并(split-pool)方法来鉴定和获得纯化的化合物。
在一些实施方案中，该方法还包括将所述纯化的化合物配制用于口服或表面施用。
在一些实施方案中，这些方法中所使用的细胞是培养细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的细胞(例如ASI细胞)。
在一些实施方案中，所述植物提取物是柳提取物。
在一些实施方案中，所述P2D基因选自下组：谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰物亚基(GCLM)，谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)。还可以使用抗氧化剂基因(例如超氧化物歧化酶1(SOD1))来实施这些方法。
在一些实施方案中，所述方法还包括选择提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；提供表达FOXO1基因或包含FOXO1基因启动子的报告物构建体的细胞；使所述细胞与所述亚级分接触；检测所述亚级分对所述FOXO1基因或报告物构建体表达的影响；并选择提高所述FOXO1基因或报告物构建体的表达的亚级分。
在一些实施方案中，所述方法还包括选择提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；使细胞与所述亚级分接触；检测所述亚级分对所述细胞中的8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平的影响；并选择降低所述细胞中的8-OHdG水平的亚级分。
在又一方面，本发明提供了鉴定提高叉头框O1(FOXO1)基因在细胞中表达的化合物的方法。该方法包括提供表达(i)FOXO1基因或(ii)包含FOXO1基因启动子的报告物构建体的细胞；提供植物提取物的级分；使所述细胞与所述级分接触；并检测所述级分对所述FOXO1基因或报告物构建体表达的影响。提高所述FOXO1基因或报告物构建体表达的级分包含提高FOXO1在细胞中表达的化合物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括选择提高所述FOXO1基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；提供表达FOXO1基因或包含FOXO1基因启动子的报告物构建体的细胞；使所述细胞与所述亚级分接触；并检测所述亚级分对所述FOXO1基因或报告物构建体表达的影响。提高所述FOXO1基因或报告物构建体表达的亚级分包含提高FOXO1在细胞中表达的化合物。可以重复这些步骤，直至获得纯化的化合物，或者可以使用其它方法来鉴定纯化的活性化合物，例如分开-合并方法。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述级分或纯化的化合物配制用于口服或表面施用。
在一些实施方案中，所述细胞是培养细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、成纤维细胞、或秀丽隐杆线虫中的细胞，例如ASI细胞。
本文还提供了提高细胞中的阶段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化剂酶基因增强活性的方法，其通过对所述细胞施用有效量的植物提取物(例如柳提取物)或其活性级分来进行。
此外，本发明提供了提高细胞中的阶段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化剂酶基因增强活性的方法，其通过对所述细胞施用有效量的包含植物提取物(例如柳提取物)或其活性级分的组合物来进行。
在一些实施方案中，提取物或活性级分降低或阻止对细胞的氧化损害。
在一些实施方案中，所述细胞在活的哺乳动物中，并且所述提取物降低所述哺乳动物组织中的氧化损害。在一些实施方案中，所述细胞是皮肤细胞，并且所述提取物降低对所述哺乳动物皮肤的氧化损害。
在一些实施方案中，所述细胞是皮肤细胞，并且所述提取物降低源自于暴露于紫外放射的所述哺乳动物皮肤中的色素沉着。
在一些实施方案中，在暴露于紫外放射前将所述植物提取物应用至所述哺乳动物的皮肤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将通过本文所描述的方法鉴定的提取物或纯化的化合物配制用于口服或表面施用。还包括化合物和配制的化合物。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。本文中描述了在本发明中使用的方法和材料；也可以使用本领域中已知的其它合适的方法和材料。材料、方法、和实施例仅是例示性的，而且并不意图是限制性的。通过提及而完整收录本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它参考文献。在矛盾的情况中，应以本说明书(包括定义)为准。
从以下详细的描述和附图及权利要求书出发，本发明的其它特征和优点会是显而易见的。
附图简述
图1的图形显示了由绿茶提取物诱导的GFP表达。
图2的图形显示了由柳提取物诱导的GFP表达。
图3的图形显示了由莱菔硫烷(sulforaphane)诱导的GFP表达。
图4是薄层层析谱的再现，其显示了如实施例4中所描述的那样生成的9种级分之每种的分开，其中表格描述了各级分的物理特征和活性。
图5是一组9幅照片，其显示了如实施例4中所描述的分级实验的结果。
图6和图7是柱形图，其显示了不同浓度(10、50、或100μg/ml)的分级柳级分对Nrf2下游基因表达的影响。使用用SYBRTM Green进行的RT-PCR来检测谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰物亚基(GCLM，图6)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC，图7)的表达。
图8是一幅线图，其显示了柳提取物补充对SOD1表达的影响。
图9是一幅线图，其显示了柳提取物补充对Nrf2表达的影响。
图10是一幅线图，其显示了柳提取物补充对GCLM表达的影响。
图11是一幅线图，其显示了柳提取物补充对过氧化氢酶表达的影响。
图12是一幅线图，其显示了柳提取物补充对血清8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)转化的影响。
图13是一幅线图，其显示了柳提取物补充对血清GSH转化的影响。
图14是一幅线图，其显示了柳提取物补充对血清SOD转化的影响。
图15是一幅线图，其显示了柳提取补充对叉头框O1(FOXO1)表达的影响。
图16是薄层层析谱的复现，其显示了如实施例4中所描述的那样生成和如实施例6中所描述的那样合并的5种级分之每种的分开，其中表格描述了各级分的物理特征和活性。
图17是一幅柱形图，其显示了分级的柳提取物诱导阶段II响应(GCS-1::GFP表达)。将指定数目的动物暴露于柳制备物的不同级分。使用10mg/ml每种材料(除级分A(5μg/ml)外)来实施温育。使用M9作为所有样品(除那些含有级分A的样品外，对此DMSO为对照)的对照。误差工形线对应于多个个体实验间的标准偏差。
图18是一幅线图，其显示了柳提取物(10mg/ml)、绿茶提取物(2μg/ml)或柳级分A(5μg/mL)保护N2虫免于氧化应激。显示了代表性实验，其中误差工形线指明标准偏差。在平板上进行48小时(参见文本)。
图19是一幅柱形图，其显示了胡萝卜和花椰菜粉末诱导阶段II响应(GCS-1::GFP表达)。将指定数目的动物暴露于胡萝卜或花椰菜制备物，除在右侧标示的对照样品外。显示了代表性的实验。
图20A-B是柱形图，其显示了柳提取物对两种正是其表达由Nrf1调节的基因，即HO-1(20A)和NQO1(20B)的影响。
图21是一幅柱形图，其显示了10ug/ml和100ug/ml柳提取物对人PBMC中的NRF2基因表达的影响。
图22是一幅柱形图，其显示了10ug/ml和100ug/ml柳提取物对人PBMC中的NRF2蛋白水平的影响。
图23是一幅柱形图，其显示了1柳提取物对表达抗氧化剂应激水平的影响。
图24是一幅线图，其显示了口服柳提取物对人受试者中的TBARS的影响。
图25是一幅柱形图，其显示了口服的柳提取物对安慰剂对人皮肤中的抗氧化剂响应的效果，其通过暴露于UV的皮肤的灰度值均值测量。
图26是一幅柱形图，其显示了表面施用的柳提取物对安慰剂对人皮肤中的抗氧化剂响应的影响，其通过暴露于UV的皮肤的灰度值均值测量。
发明详述
本文描述了可以用于增强Nrf2活性，并且如此激活阶段II解毒系统，降低8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG，氧化受损的DNA的标准标志物)水平，和/或降低叉头框O1(FOXO1)基因表达水平的方法和组合物，以及用于鉴定柳和茶中存在的也增强Nrf2，降低8-OHdG水平，和提高FOXO1基因表达水平的别的化合物的方法。
Nrf2
Nrf2(即一种转录因子)是哺乳动物中氧化应激响应的一种关键因子。Nrf2受到Keap1、GSK-3、和其它机制阻抑；此阻抑在存在氧化应激的情况中被消除，在该点Nrf2从细胞质输入细胞核中，在那里它结合阶段II解毒酶(P2D)基因的抗氧化剂应答区。Nrf2的结合激活P2D基因的转录，由此诱导P2D酶的表达。如此，在细胞核输入和NRF2对Nrf2基因的结合受到促进时，P2D酶的生成受到增强，而且体内抗氧化剂能力受到加强。Nrf2基因敲除小鼠趋于受到药物毒素和癌症的极端影响，而且不响应化学防御方法中所使用的抗氧化剂(Chan and Kan，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.，96，12731-12736；Chan等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.，98，4611-4616；Fahey等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.，99，7610-7615；Ramos-Gomez等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.，98，3410-3415)。
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(即一类线虫)与哺乳动物具有类似的氧化应激响应系统。此系统称为MAPK级联。SKN-1(即MAPK级联的一种靶物)是一种转录因子。与Nrf2一样，SKN-1的GSK-3阻抑在存在氧化应激的情况中被解除。然后SKN-1从细胞质转运入细胞核中(例如在消化系统(肠)中)，结合P2D基因的抗氧化剂应答区，并且激活P2D基因的转录，由此诱导P2D酶的表达。如此，线虫的SKN-1通过与哺乳动物中的Nrf2机制非常类似的机制来调节P2D酶的生成。假设于此，预期促进SKN-1的细胞核输入和阶段II解毒酶基因对抗氧化剂应答区的结合，由此增强阶段II解毒酶在秀丽隐杆线虫中生成的物质能增强哺乳动物中由Nrf2引起的阶段II解毒酶生成。此外，还可以预期对癌症和各种变性疾病的阻抑。
为了证实由SKN-1引起的P2D基因表达，已知的方法使用如下基因，其中可以将编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的gcs-1基因(秀丽隐杆线虫中的一种已知P2D基因)和SKN-1的结合靶物与编码报告物(例如绿色荧光蛋白(GFP))的基因融合(GCS-1::GFP)(An和Blackwell，2003，Genes&Dev.，17，1882-1893；An等，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，102，16275-16280；Inoue等，2005，Genes Dev.，19，2278-2283)。在此方法中，首先将融合的GCS-1::GFP基因转移至线虫进行转化。在具有低氧化应激的正常条件下，可以通过自GFP的荧光发射来确认融合基因在秀丽隐杆线虫的咽和ASI中的表达。在氧化应激条件下，此融合基因在秀丽隐杆线虫的肠中表达。如本文中所描述的，SKN-1活化物质(例如柳提取物和荼提取物)强烈地引起GCS-1::GFP融合基因的表达。
FOXO1
FOXO蛋白是受到胰岛素相关信号传导抑制，并且牵涉许多生物学过程(包括干细胞维持、脂肪分化、胰岛素敏感性、通过提高抗氧化剂酶基因增强活性实现的针对反应性氧类别(ROS)的防御、凋亡、肿瘤抑制、和寿命)的转录因子家族。它们公知的靶基因中有许多是应激应答基因，包括SOD。参见例如Antebi，PLOS genetics 3，1565-1571(2007)；Tothova和Gilliland，CellStem Cell 1，140-152(2007)；及Accili和Arden，Cell 117，421-476(2004)。
柳提取物
在本文所描述的方法中使用的柳是杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)或杨属(Populus)中的植物。杨属中的植物的例子包括“Urajirohako yanagi”(同义词“Hakuyo”，“Gindoro”；银白杨(P.alba))、加拿大白杨(加杨(P.x Canadensis))、三叶杨(cottonwood)(美洲黑杨(P.deltoides))(同义词“Hiroha hakoyanagi”)、“Kotokake yanagi”(胡杨(P.euphratica))、“Oobayamanarashi”(毛白杨(P.tomentosa))、“Chirimendoro”(香杨(P.koreana))、“Doronoki”(辽杨(P.maximowiczii))、“Yoroppa kuroyamanarashi”(黑杨(P.nigra))、“Seiyohakoyanagi”(同义词“Italia yamanarashi”；钻天杨(P.nigra var.italica))、“Yamanarashi”(同义词“Hakoyanagi”，“Popura”；西氏杨(P.sieboldii))、香脂白杨(Balsam Poplar)(香脂白杨(P.tacamahaca))、“Shina yamanarashi”、“Chosenyamanarashi”、(山杨(P.davidiana))、美洲杨(American Poplar)(美洲山杨(P.tremuloides))、和欧美杨(P.euramericana)。柳属中的植物的例子包括白柳(S.alba)、“Saikoku kitsune yanagi”(S.alopochroa)、“Yusuraba yanagi”(耳柳(S.aurita))、“Shidare yanagi”(同义词“Ito yanagi”，垂柳(S.babylonica))、“Yamaneko yanagi”(同义词“Bakko yanagi”，S.bakko)、“Akame yanagi”(同义词“Maruba yanagi”，腺柳(S.chaenomeloides))、“Koganeshidare”(S.chrysochoma)、瑞香柳(S.daphnoides)、“Salikkusu elaeagunosu”(S.elaeagnos‘Scopoli’)、“Pokkiri yanagi”(爆竹柳(S.fragilis))、“Ookitsune yanagi”(同义词“Kinme yanagi”，S.futura)、“Kawayanagi”(同义词“Nagaba kawa yanagi”，吉尔吉柳(S.gilgiana))、“Neko yanagi”(细柱柳(S.gracilistyla))、“Kuro yanagi”(黑穗细柱柳(S.gracilistyla var.melanostachys))、“Sause”(S.humboldtiana)、“Inukori yanagi”(杞柳(S.integra))、“Shiba yanagi”(S.japonica)、“Shiro yanagi”(S.jessoensis)、“Kinu yanagi”(S.kinuyanagi)、“Kori yanagi”(尖叶紫柳(S.koriyanagi))、“Ezo yanagi”(粉枝柳(S. rorida))、“Furisode yanagi”(银芽柳((S.leucopithecia))、“Unryu yanagi”(龙爪柳(S. matsudana f.tortuosa))、“Takaneiwa yanagi”(同义词“Rengeiwa yanagi”)、“Ooshidare yanagi”(青皮垂柳(S.ohsidare))、“Ezomame yanagi”(S.nummularia ssp.Pauciflora)、“Ezonokinu yanagi”(S. pet-susu)、红皮柳(S.purpurea)、“Kouhiryu”、“Miyamayanagi”(同义词“Mineyanagi”，S.reinii)、“Komaiwa yanagi”(S.rupifraga)、“Onoe yanagi”(同义词“Karafuto yanagi”，龙江柳(S.sachalinensis))、“Kogomeyanagi”(S.serissaefolia)、“Shirai yanagi”(S.shiraii)、柳(Salix sp)、“Tachiyanagi”(S.subfragilis)、“Noyanagi”(同义词“Himeyanagi”)、“Seiyotachiyanagi”、“Kitsune yanagi”(同义词“Iwayanagi”，S.vulpine)、和“Ezonotakaneyanagi”(S.yezoalpina)。柳的芽、叶、果实、枝、树干、树皮、和/或根可以单独或以其任意组合使用，并在必要时加工成适合于摄取的形式。优选的柳是白柳，特别优选瑞香柳、柳、红皮柳、爆竹柳、和白柳。在一些实施方案中，柳是白柳、瑞香柳、红皮柳或爆竹柳。
优选地，在上述柳在必要时进行适合于提取的处理(例如切碎、干燥、和/或粉碎)后提取本发明的柳提取物。通常使用提取剂在必要时通过例如静置(standing)、摇动、照射超声(irradiating ultrasound)、加热、和/或应用压力(独立地或以其任意组合)来提取如上文所提及的经处理的柳。在一些实施方案中，优选的规程是在提取剂中浸没柳，接着摇动或搅拌。在一些实施方案中，对柳提取物进行分级，如本文中所描述的，并在本文中所描述的组合物中使用具有最高活性的级分。
水性和有机溶剂通常作为提取剂使用，并且可以单独地或以其组合使用。有机溶剂的例子包括乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇、聚乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、二丙二醇等多元醇；乙酸乙酯、乙酸丁酯和类似的酯；丙酮、甲基乙基甲酮等酮；和CO2及类似的超临界流体。在一些实施方案中，优选的提取剂包括水、乙醇和其混合物。在一些实施方案中，水作为提取剂使用。
还可以改变实施这些操作所处的温度。提取温度通常自3℃至所使用提取剂的沸点。提取时间随着例如提取剂的种类、提取温度、和/或柳的形式而变化，但是通常自1小时至7天，且优选自2小时至3天。可以应用压力，若需要的话。在一些实施方案中，使用沸水来制备柳提取物。
可以在本文所描述的组合物和方法中使用没有修饰的提取物。提取物也可以以溶解于例如水或有机溶剂中的形式使用，例如在浓缩、脱水(desiccate)、干燥(exsiccate)、和/或冷冻干燥后；在以不损害提取物效果的程度进行纯化处理诸如脱色、除臭、和/或脱盐后；和/或在进行级分处理(例如液液分配层析和柱层析)后。或者，柳提取物可以包含在合适的载体(例如脂质体或微胶囊)中。
在一些实施方案中，测定级分的保留因素(retention factor，Rf)，并选择具有高于0.5，例如高于0.6、0.7、0.75、或0.78的Rf值的级分。在一些实施方案中，本方法中有用的级分不含显著量的水杨苷。
茶提取物
本文中所描述的方法和组合物中使用的茶可以包括例如绿茶、乌龙茶(Oolong tea)、红茶、或普洱茶(Pu-erh tea)(它们均衍生自茶(Camelliasinensis))。可以使用植物的任何部分，例如花、叶、和/或枝(单独地或以其任意组合)，并在必要时加工成适合于摄取的形式。在一些实施方案中，单独使用叶。在一些实施方案中，优选的茶是绿茶。
一般在茶在必要时进行适合于提取的处理(例如切碎、干燥、和/或粉碎)后制备本文中所描述的茶提取物。然后通常使经处理的茶与提取剂接触，并通过例如静置、摇动、照射超声、加热、和/或应用压力(独立地或以其任意组合)来提取。在一些实施方案中，将茶浸没于提取剂中，接着摇动或搅拌。
水性和有机溶剂通常作为提取剂使用(单独地或以其任意组合)。有机溶剂的例子包括但不限于乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇、聚乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、二丙二醇等多元醇；和CO2及其它超临界流体。它们可以单独地或者以其组合使用。优选的提取剂是水和乙醇。在一些实施方案中，提取剂是约65至85％的含水乙醇，例如水中约70-80％的乙醇。
提取温度通常自3℃至所使用提取剂的沸点。提取时间随着例如提取剂的种类、提取温度、和/或柳的形式而变化，但是通常自1小时至7天，例如自2小时至3天。可以进一步应用压力，若需要的话。此外，可以在必要时预先将抗氧化物质诸如抗坏血酸添加至提取物，用于活性成分的稳定提取。
在一些实施方案中，对茶提取物进行分级，如本文中所描述的，并在本文中所描述的组合物中使用具有最高活性的级分。
可以在本文所描述的组合物和方法中使用没有修饰的提取物。提取物也可以以溶解于水、有机溶剂等中的形式使用，例如在浓缩、脱水、干燥、或冷冻干燥后；在以不损害提取物效果的程度进行纯化处理，例如脱色、除臭、或脱盐后；和/或在进行级分处理诸如液液分配层析和柱层析后。或者，茶提取物可以以包含在合适的载体(例如微胶囊或脂质体)中的形式使用。
花椰菜粉末
本文中所描述的方法中使用的花椰菜是甘蓝（Brassica oleracea)属中的甘蓝(Cabbage)科，即十字花科(Brassicaceae)(以前为Cruciferae)植物。花椰菜的花、芽、茎、和叶可以单独地或者以其任意组合使用，并且在必要时加工成适合于内部或外部使用的形式。优选地，使用花芽和茎两者。优选地，在上述花椰菜在必要时进行适合于准备好提取的处理(例如切碎、干燥、和/或粉碎)后提取花椰菜粉末。然后通常使用提取剂(例如水、乙醇、或其混合物)在必要时通过静置、摇动、照射超声、加热、和/或应用压力(独立地或以其任意组合)来榨取和/或提取如上文所提及的经处理的花椰菜。在一些实施方案中，优选的规程是榨取大量花椰菜头状花序的菜浆。在一些实施方案中，对花椰菜提取物进行分级，如本文中所描述的，并在本文中所描述的组合物中使用具有最高活性的级分。
在一些实施方案中，可以在本文所描述的组合物和方法中使用没有修饰的提取物。提取物也可以以溶解于例如水或有机溶剂中的形式使用，例如在浓缩、脱水、干燥、和/或冷冻干燥后；在以不损害提取物效果的程度进行纯化处理诸如脱色、除臭、和/或脱盐后；和/或在进行级分处理(例如液液分配层析和柱层析)后。
胡萝卜粉末
本文中所描述的方法中使用的胡萝卜是野胡萝卜(Daucus carota)属中的植物。胡萝卜的根、叶、和茎可以单独地或者以其任意组合使用，并且在必要时加工成适合于内部或外部使用的形式。优选地，使用根。优选地，在上述胡萝卜在必要时进行适合于准备好提取的处理(例如切碎、干燥、和/或粉碎)后提取胡萝卜粉末。然后通常使用提取剂(例如水、乙醇、或其混合物)在必要时通过例如静置、摇动、照射超声、加热、和/或应用压力(独立地或以其任意组合)来榨取和/或提取如上文所提及的经处理的胡萝卜。在一些实施方案中，优选的规程是榨取胡萝卜的根泥。在一些实施方案中，对胡萝卜提取物进行分级，如本文中所描述的，并在本文中所描述的组合物中使用具有最高活性的级分。
可以在本文所描述的组合物和方法中使用没有修饰的提取物。提取物也可以以溶解于例如水或有机溶剂中的形式使用，例如在浓缩、脱水、干燥、和/或冷冻干燥后；在以不损害提取物效果的程度进行纯化处理诸如脱色、除臭、和/或脱盐后；和/或在进行级分处理(例如液液分配层析和柱层析)后。
组合物
本文中所描述的组合物可以包含一种或多种植物提取物(例如胡萝卜、花椰菜、柳、和/或茶提取物)和/或自其衍生的活性级分或药剂，其通常占约0.0001至95％(按重量计)，优选0.001至70％(按重量计)，且最优选0.01至30％(按重量计)。在一些实施方案中，有用的组合物包含如下文实施例4中所描述的那样制备的柳提取物的一些或所有更具活性的级分，例如级分1+2或级分1+2+3。此外，本文中所描述的组合物可以含有在例如化妆品、医学、或食品领域中可用的添加剂，只要化合物的活性没有受到显著不利的影响。
供口服用的药物组合物
一方面，本发明包括包含如本文中所描述的提取物和活性级分的药物组合物。在一种或多种植物提取物和/或自其衍生的活性级分或药剂外，本文中所描述的组合物可以进一步含有口服可接受载体、添加剂等。组合物可以以多种形式使用，例如适合于口服摄取的形式，例如液体制剂；片剂、粒剂、细微粒剂、粉末等固体制剂；含有所述液体或固体制剂的胶囊；口服喷雾剂；和锭剂。可以通过标准方法来生成这些形式的制剂。优选地，制剂处于丸剂(特别是片剂)、胶囊、小粒(parvule)、粉剂、或粒剂，更优选丸剂或胶囊的形式。药学制剂领域中使用的口服可接受添加剂和载体也可以包含在组合物中。下文给出了例子，但不限于此。赋形剂包括例如糖醇(例如麦芽糖醇、木糖醇、山梨糖醇、或赤藻糖醇)、乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸盐(例如碳酸钙)、高岭土、结晶纤维素、硅酸、甲基纤维素、甘油、精氨酸钠、阿拉伯胶、滑石、磷酸盐(例如二代磷酸钙(calcium secondaryphosphate)、磷酸二氢钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钙、或磷酸二氢钠)、硫酸钙、乳酸钙、或可可脂。粘度控制剂包括例如单糖浆(simple syrup)、葡萄糖液体、淀粉液体、和明胶溶液。粘合剂包括例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮(crosspolyvinylpyrrolidone)、羟丙基纤维素、低取代羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧基乙烯基聚合物(carboxyvinyl polymer)、结晶纤维素、粉状纤维素、结晶纤维素-羧甲基纤维素钠(carmellose sodium)、羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素、乙基纤维素、磷酸钾、粉状阿拉伯胶、支链淀粉(pullulan)、果胶、糊精、玉米淀粉、α-淀粉、羟丙基淀粉、明胶、黄原胶、角叉藻聚糖、黄蓍胶、粉状黄蓍胶、和Macrogoal。崩解剂包括例如干淀粉、精氨酸钠、琼脂粉末、海带多糖(laminaran)粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸甘油一酯、淀粉、和乳糖。崩解抑制剂包括例如白糖、硬脂酸、可可脂、氢化油等；吸收促进剂诸如季铵盐和十二烷基硫酸钠。吸附剂包括例如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、和胶体硅酸。滑润剂包括例如精制滑石、硬脂酸盐、硼酸粉末、和聚乙二醇。乳化剂包括例如蔗糖脂肪酯、山梨聚糖脂肪酯、经酶处理的卵磷脂、酶解卵磷脂、和皂苷。抗氧化剂包括例如抗坏血酸和生育酚。抗氧化剂包括例如乳酸、柠檬酸、葡糖酸、和谷氨酸。增强剂包括例如维生素、氨基酸、乳酸盐、柠檬酸盐、和葡糖酸盐。增塑剂包括例如二氧化硅。增甜剂包括例如半乳蔗糖、乙酰磺胺酸钾(acesulphame potassium)、阿司帕坦(aspartame)、和甘草皂苷(glycyrrhizin)。芳香剂包括例如薄荷油、桉叶油、肉桂油、小茴香油、丁香油、橙油、柠檬油、玫瑰油、果实香料(fruit flavor)、薄荷香料(mintflavor)、薄荷粉、dl-薄荷醇、和l-薄荷醇。寡糖包括例如乳果糖、棉子糖、和乳果糖(lactosucrose)。制剂溶剂包括例如乙酸钠。
此外，可以用如制备例如糖包被的片剂、明胶薄膜包被的片剂、肠溶性包被片剂、薄膜包被片剂、双层片剂、或多层片剂所必需的典型涂层来包被固体制剂诸如片剂。液体制剂可以处于基于水或基于油的悬浮液、溶液、糖浆、或酏剂形式，而且可以通过标准方法使用例如如本领域中所知道的和/或本文中所描述的典型载体和/或添加剂来制备。
供口服用的保健用组合物
本发明中还包括包含与例如可食用载体、食品成分、或食品添加剂组合的一种或多种植物提取物和/或自其衍生的活性级分或药剂的保健用组合物。通过本领域中已知的方法来制备此类组合物。此类保健食品的例子包括液体食品诸如饮料，和固体食品诸如条形物(bar)、蛋糕、片剂、粒剂、可咀嚼片剂。或者，它们可以是半固体，例如酸乳酪或酸乳酪样稠度。此类食品形式的具体例子包括但不限于液体饮料诸如汁(juice)、软饮料、和茶；粉状饮料诸如粉状汁或粉状汤；零食诸如巧克力、糖果、口香糖、冰淇淋、果子冻(jelly)、饼干(cookies)、软饼(biscuit)、玉米片(corn flake)、可咀嚼片剂、薄膜片(filmsheet)、薄饼(wafer)、软糖(gummies)、脆米饼(rice cracker)、和具有豆酱填充物的小圆面包；调味品(seasoning)诸如敷料剂(dressing)、酱油(sauce)等；面包、面团(pasta)、konjakmannans、鱼酱(fish paste)(例如鱼糜(kamaboko))、晒干的喷撒物(seasoned sprinkle)、口服喷雾剂、和锭剂。
保健食品还可以包括本领域中已知的各种添加剂和载体。例如，活的微生物诸如乳酸细菌、灭活的微生物、其它益生菌(probiotics)、维生素、植物学药物、其它植物诸如全草及其提取物可以作为添加剂使用。载体的例子包括糖醇、赋形剂、粘合剂、乳化剂、抗氧化剂、酸化剂、增强剂、抗结团剂、润滑剂、增甜剂和调味品(flavoring)。
可以使用保健用组合物作为例如健康食品、功能食品、指定的健康食品、营养功能食品、或用于治疗受试者中的状况(例如疾病或衰老症状)的食品。
口腔护理产品
可以在供口腔护理诸如牙膏、牙粉、液体洁齿剂(dentifrice)、凝胶洁齿剂、预防膏、口腔喷雾剂、和漱口剂用的组合物中使用本文中所描述的植物提取物和其活性级分。用于制备此类组合物和合适的载体和添加剂的方法是本领域中已知的。
供表面施用用的组合物
在一种或多种植物提取物和/或自其衍生的活性级分或药剂外，本文中所描述的组合物可以进一步含有外部可接受载体、添加剂等。组合物可以以多种适合于向皮肤应用的形式使用，例如水溶液、溶解性表面组合物、粉末分散体、水油2层组合物、水油粉末3层组合物、油/水乳剂、水/油乳剂、水/油/水乳剂、凝胶、气溶胶、喷雾(mist)、胶囊、片剂、粒剂和粉末。可以通过标准方法来生成这些形式的制剂。优选地，制剂处于水溶液、油/水乳剂、水/油乳剂、水/油/水乳剂、凝胶、气溶胶、或喷雾形式。药学或化妆品制剂领域中使用的外部可接受添加剂和载体也可以包含在组合物中。下文给出了例子，但不限于此。赋形剂包括例如阴离子表面活性剂(例如烷基硫酸盐、聚氧乙烯烷基醚、烷基丙氨酸盐、烷基谷氨酸盐、烷基羟乙基磺酸盐、烷基肌氨酸盐或脂肪酸盐(soap))、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂(例如烷基甜菜碱、氨基丙基甜菜碱、或咪唑啉甜菜碱)、非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯氢化蓖麻油、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基酯、嵌段共聚物、脂肪酸酯、烷基甘油醚、卵磷脂、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、皂苷、糖酯、或烷醇酰胺)、油性物质(例如矿物油、角鲨烷、羊毛脂、软石腊(petrolatum)、植物油、动物油、地蜡(ceresin)、脂肪酸酯、或高级醇)、多元醇(例如丙二醇、1，3-丁二醇、甘油、1，2-己二醇、戊二醇、或聚氧乙烯二醇)、聚合物(例如聚硅氧烷、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇、支链淀粉、果胶、糊精、或黄原胶)、粉末(例如高岭土、结晶纤维素、滑石、或膨润土(bentonite))、有机酸、和无机酸。可以掺入适合于掺入化妆品、准药物(quasi-drug)、药物等中的其它各种成分(例如环硅氧烷、聚乙烯醇、蛋白质、水解蛋白质、肽、氨基酸、紫外线吸收剂、防腐剂、pH调节剂、润湿剂、维生素、医学有效成分、防腐剂、着色剂、或芳香剂)，只要由此没有对本发明的目的强加显著的有害影响，例如活性成分的活性没有显著的降低。准药物对身体具有适度影响，但是既不意图诊断、预防或治疗疾病，也不影响身体的结构或功能。
产品还可以是常规用于向皮肤外部应用的任何类型的，包括例如面部化妆品诸如护肤液(lotion)、乳状乳剂(milky emulsion)、面霜(cream)和美容涂敷剂(pack)；化妆品诸如粉底、胭脂、唇膏、眼睑膏、眼线笔和遮光剂(sunscreen)；体用化妆品，例如护肤液和面霜；皮肤清洁化妆品诸如卸妆液(make-upremover)、面部洗洁剂和体用洗发剂；浴用配制品；和头发护理配制品诸如洗发剂和润发乳(conditioner)。
有效剂量
可以使用本领域中已知的方法(例如基于体外研究和动物实验)来确定本文中所描述的组合物的有效剂量。在一些实施方案中，要在内部施用的植物提取物(例如作为口服组合物)的剂量会是每天每名成人约50至2000mg，例如约100至1000mg。此外，可以在一天的一个至数个部分中，即在各餐前(例如在5分钟内)、在各餐间、在各餐后(例如在5分钟内)、或与各餐一起服用口服组合物。在一些实施方案中，与各餐一起或者在各餐后服用口服剂量。在一些实施方案中，要外部施用的植物提取物(例如在表面配制品诸如面霜或护肤液中)的剂量会占所述配制品的约0.0001至95％(按重量计)，优选0.001至70％(按重量计)，且更优选0.001至30％(按重量计)。在一些实施方案中，表面配制品可以每天应用一次或多次。
用途
本文中所描述的或由本文中所描述的方法所公开的组合物在需要阶段II解毒活性增强的受试者的治疗中是有用的。例如，认为氧化应激可以在变性疾病的病因学中发挥重要的作用，所述变性疾病一般的特征在于：组织细胞的进行性形态学变化和进行性正常代谢活性丧失。在一些实施方案中，变性疾病可以以例如患病细胞或组织中存在的谷胱甘肽、或任何阶段II酶的异常水平表征。这些异常水平可以是变性疾病的原因或症状。如本文中所使用的，短语“变性疾病”指以受累组织中不是由于肿瘤生长或急性毒性损伤引起的正常细胞死亡表征的生理学状况。变性病症的例子包括但不限于糖尿病、慢性肝衰竭、慢性肾衰竭、威尔逊氏病(Wilson’s disease)、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、和神经变性疾病，例如帕金森氏病(Parkinson’s Disease)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s Disease)、亨延顿氏病(Huntington’s Disease)、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、癫痫、重症肌无力、神经病、共济失调、痴呆、慢性轴突性神经病(chronic axonal neuropathy)和中风。可以使用本文中所描述的处理来治疗患有先存在的变性状况的受试者，或者预防或延迟有变性病症素因的受试者中的疾病发作或形成。
另外，化合物可用于处理受试者中的衰老对例如受试者的皮肤的影响。如此，可以使用本文中所描述的组合物来治疗例如皱纹、不想要的色素沉着、粗糙且干燥的皮肤、或暗淡的皮肤。
筛选方法
茶和柳提取物中存在的化合物是P2D基因的Nrf2/Skn-1激活的增强物的发现提供了用于鉴定那些提取物中的活性化合物的方法的基础。可以在这些方法中使用许多测定法，例如秀丽隐杆线虫中的天然或工程化改造的Skn-1活性，和任何合适的细胞(例如表达Nrf2的哺乳动物细胞)中的报告基因构建体。对抗氧化剂应答元件激活物的基因组筛选记载于Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，104(12)：5205-5210(2007)。报告物构建体包含与典型的最小启动子序列以及任何可检测报告元件(例如荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP)或其变体，例如红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或增强型GFP(eGFP)；萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、或β-半乳糖苷酶)连接的抗氧化剂应答元件。用于设计、选择、和制备此类构建体的方法是本领域中公知的，参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，New York，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
抗氧化剂应答元件(ARE)
ARE是许多阶段II解毒酶的5’侧翼区中找到的顺式作用调节增强子元件(核心共有序列：5’-GTGACnnnGC-3’)。ARE受到反应性氧类别以及其它亲电子剂及受到Nrf2结合激活。受ARE调节的基因包括P2D血红素加氧酶-1、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽S-转移酶、和NAD(P)H：醌氧化还原酶1(NQO1)、谷氨酰半胱氨酸合成酶(例如谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰物亚基(GCLM)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC))、和过氧化氢酶、和抗氧化剂酶超氧化物歧化酶(例如SOD1)。
阶段II解毒酶
有6类阶段II偶联反应，包括葡糖醛酸化(glucuronidation)、硫酸化、甲基化、乙酰化、氨基酸偶联和谷胱甘肽偶联。由酶硫氰酸生成酶催化的反应(将硫离子转移至氰化物以形成硫氰酸盐)在本文中也会被认为阶段II反应。参见美国专利No.6,812,248，通过提及而将其完整收入。在一些实施方案中，本文中所描述的筛选方法包括在细胞中检测这些中的一种或多种偶联反应，并量化此类活性以确定级分是否包含提高偶联反应的化合物。
分级的样品
一般而言，本文中所描述的方法包括使用提取物的级分，例如提取物中存在的所有成分的子集。可以使用本领域中已知的任何方法来生成此类级分，并且可以基于提取物成分的一项或多项物理性质(例如大小、pH、pI、溶解度、或电荷)来制备。用于对本文中所描述的提取物分级的许多方法是本领域中已知的，例如蛋白质和肽分级技术，包括但不限于免疫消减(亲和力消除)、凝胶电泳、反相层析、凝胶或其它过滤、离子交换、柱层析(例如使用硅胶)、等电点聚焦(例如固定化的pH梯度等电点聚焦(IPG IEF))，和通过pI对蛋白质或肽分级的溶液相、基于pI的分级系统。也可以使用液液分级或固液分级方法。
参见例如Jin等，Biotechnol J.2006年2月；1(2)：209-13；Si等，Bioassay-guided purification and identification of antimicrobial components inChinese green tea extract.J Chromatogr A.2006；1125(2)：204-10；Paveto等，Anti-Trypanosoma cruzi activity of green tea(Camellia sinensis)catechins.Antimicrob Agents Chemother.2004；48(1)：69-74；Kinjo等，Activity-guidedfractionation of green tea extract with antiproliferative activity against humanstomach cancer cells.Biol Pharm Bull.2002；25(9)：1238-40；Satoh等，Black teaextract，thearubigin fraction，counteracts the effect of tetanus toxin in mice.ExpBiol Med(Maywood).2001；226(6)：577-80；Sagesake-Mitane等，Plateletaggregation inhibitors in hot water extract of green tea.Chem Pharm Bull(Tokyo).1990；38(3)：790-3；Jassbi，Z Naturforsch[C].2003；58(7-8)：573-9.Secondary metabolites as stimulants and antifeedants of Salix integra for the leafbeetle Plagiodera versicolora；及Wildermuth和Fall，Biochemicalcharacterization of stromal and thylakoid-bound isoforms of isoprene synthase inwillow leaves.Plant Physiol.1998；116(3)：1111-23等。
实施例
本发明在以下实施例中进一步进行描述，所述实施例并不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
实施例1-提取物的制备
制备多种提取物来在本实验中使用，包括绿茶、白柳、松树皮、和花椰菜(莱菔硫烷)提取物。
绿茶提取物
如下制备绿茶提取物(Thaea Sinensis，Emil Flachsmann AG/Frutarom，Haifa，Israel，Prod.No.85.942)，即将绿茶叶浸没在如下溶液中，其中将0.0025％抗坏血酸溶解于乙醇(80％)中，并于室温缓慢搅拌4小时，接着过滤提取物以除去茶叶。然后使用减压浓缩器来除去提取剂，由此制备绿色/褐色提取物，向该提取物添加糊精作为赋形剂，并使混合物成粉末以在实验中使用。
制备含有绿茶提取物的2mg/mL DMSO溶液。因为DMSO在较高浓度能引起氧化应激，将绿茶提取物添加至M9盐水培养基(42mM Na2HPO4；22mMKH2PO4；86mM NaCl；1mM MgSO4*7H2O)以便具有作为测试材料使用的2μg/mL的最终浓度。DMSO的终浓度是0.1％。此类低浓度的DMSO在秀丽隐杆线虫中不引起氧化应激。
白柳提取物
如下制备白柳提取物(Salicis Cortex，Emil Flachsmann AG/Frutarom，Haifa，Israel，Prod.No.0085816)，即将干燥的商品化白柳树皮和芽浸没于净化水中，并于室温缓慢搅拌4小时，接着过滤提取物以除去固体物质。然后使用减压浓缩器来除去提取剂，由此制备褐色提取物，向该提取物添加阿拉伯胶作为赋形剂，并使混合物成粉末以在实验中使用。
使用处于10mg/mL浓度的溶解于M9盐水培养基中的柳提取物作为测试材料。
松树皮提取物
如下制备松树皮提取物来在实验中使用，即在热水中达3至4小时自干燥的松树皮提取。
将松树皮提取物溶解于DMSO中以便具有2mg/mL的浓度，并添加至M9盐水培养基以具有作为测试材料使用的2μg/mL的终浓度。
莱菔硫烷
此外，使用莱菔硫烷(花椰菜芽的活性衍生物)作为阳性对照。将莱菔硫烷溶解于乙腈中，然后用M9盐水培养基稀释至1mg/mL以作为测试材料使用。
实施例2-gcs-1::GFP融合构建体的制备和表达
公知的是，由gcs-1基因编码的酶(CGS-1)，即阶段II解毒酶(P2D)是用于体内谷胱甘肽合成的限速酶，而且gcs-1基因是调节第二代的解毒和抗氧化的SKN-1的靶基因。
使用标准的分子生物学技术将编码GCS-1启动子的核酸(如记载于An和Blackwell，2003，Genes&Dev.，17，1882-1893的)与编码绿色荧光蛋白(GFP)的序列融合以制备报告物构建体(gcs-1::GFP)。将此融合构建体基因转移入秀丽隐杆线虫中(An和Blackwell，2003，Genes&Dev.，17，1882-1893；Mello等，EMBO J..1991.10(12)：3959-70)，并在实验中使用所获得的经转化秀丽隐杆线虫。在正常的、低氧化应激条件下，gcs-1::GFP构建体在秀丽隐杆线虫的咽区和ASI中表达，在那里可以测量GFP的荧光发射。
作为比较，将gcs-1基因启动子中的SKN-1结合位点的变体(gcs 1Δ2Mut3)(参见An和Blackwell，2003，Genes&Dev.，17，1882-1893)与编码GFP的序列融合以制备基因(gcs-1Δ2Mut3::GFP基因)，其以与用gcs-1::GFP基因相同的方式测试。因为此突变型基因不能与SKN-1结合，它不能表达由SKN-1调节的GCS-1。因此在GFP在上述融合基因中表达，但不在突变型基因中表达时确认GCS-1表达的SKN-1调节。
实施例3-柳和茶提取物增强GCS-1::GFP表达
遵循依照An和Blackwell，2003，Genes&Dev.，17，1882-1893的方法进行实验来研究实施例1中所制备的各种提取物对GCS-1::GFP报告物构建体(实施例2中所描述的)在秀丽隐杆线虫中表达的影响。
每次实验前，将携带GCS-1::GFP报告物构建体转基因的约20粒L4期虫挑选至含有OP50细菌(大肠杆菌菌株；秀丽隐杆线虫的食物)的NGM平板(一类琼脂培养基，参见Brenner，Genetics，1974May；77(1)：71-94)，并容许生长2至3天。为了用测试材料进行处理通过用盐水培养基(M9)淹没NGM平板表面来将虫与盐水培养基(M9)一起转移至微离心管。然后离心微离心管，并除去上清液。再次重复相同的规程以清洗虫。此清洗除去已经作为食物给予的细菌。
一旦虫得到清洗，便添加它们以在规定浓度的规定测试材料中温育达如下的时间量。首先，温育时间是30分钟，并且随后意图包括60、90、和120分钟。进行处理达所述给定的时间后，在M9中清洗虫至少两次，转移回含有细菌的NGM平板，并容许恢复约30分钟。然后将虫嵌入(mount)载玻片上，并在显微镜下对GFP表达水平评分。基于三次得分来评估每粒虫的肠中的GFP表达水平；高的、中等的、和低的表达。对整条肠具有GFP表达的虫给予高得分。肠上半段的GFP表达评分为中等的。将低得分给予在其肠中具有非常少或没有GFP表达的虫。
图1和图2中所显示的结果表明用绿茶提取物或柳提取物进行的处理与对照条件相比显著地提高由gcs-1启动子驱动的GFP表达。
柳提取物显著地增加在表达方面给予中等或高得分的虫数目。在这些实验中，阴性对照M9盐水溶液没有在肠中诱导GFP表达，其中所有虫都被评分为低的。在60分钟处理的情况中看到最大应答。然而，用莱菔硫烷在温育30、60或90分钟后没有看到效果。对于此原因，给予用莱菔硫烷进行的处理更长的温育时间，并且在6小时后首次看到效果。图3中所显示的数据揭示，茶提取物和柳提取物与莱菔硫烷相比在明显更短的时间中显著诱导GCS-1::GFP表达。
使用转移有gcs-1Δ2::GFP基因的虫(GCS-1Δ2::GFP虫)来测试测试材料的效果是否依赖于SKN-1。此启动子突变型转基因缺乏咽gcs-1基因表达；然而，它在ASI神经元和肠中维持SKN-1依赖性表达。用绿茶提取物和柳提取物两者，GCS-1Δ2::GFP虫在60分钟温育的条件下展示出与GCS-1::GFP虫相同的表达水平。还使用突变型转基因GCS-1Δ2mut3::GFP虫来确定应答是否是SKN-1依赖性的。此基因，即gcs-1Δ2::GFP基因的变体(gcs-1Δ2mut3::GFP基因)在其启动子区域中缺乏SKN-1结合位点，因此在正常和应激条件下GFP不在咽、ASI神经元、或肠中表达。在用绿茶或柳提取物处理这些变体(GCS-1Δ2mut3::GFP虫)时，没有观察到GFP表达。用测试材料在CGS-1::GFP虫、GCS-1Δ2::GFP虫、和GCS-1Δ2mut3::GFP虫中的结果的比较揭示，用绿茶提取物和柳提取物，在ASI神经元和肠中看到GCS-1::GFP表达，在咽中基本上没有看到GCS-1::GFP表达，如此GCS-1::GFP表达受到SKN-1结合调节。然而，在莱菔硫烷的情况中，比较显示在咽中看到约一半的GCS-1::GFP表达，并且GCS-1::GFP表达并不是部分受到SKN-1调节。
实施例4-柳提取物的分级
为了自初始柳提取物鉴定对阶段II激活具有最大影响的级分，使用柱层析方法。例如，可以使用硅胶填充柱来对柳提取物分级。图4和图5显示了使用柱层析实施的分级实验的代表性结果。
为了制备分离柱，将400g硅胶60(70-230筛目ASTM，购自Merck)在甲醇中悬浮，并倒入柱中。之后，用氯仿∶甲醇(10∶1)溶液替换甲醇。将5克初始柳提取物在水中重悬，并在硅胶表面上侧上加样。作为第一洗脱溶剂，使用约1.5L氯仿∶甲醇(10∶1)来洗脱材料。将洗脱的溶液收集入分级管中，达每管20mL。液相是氯仿∶甲醇(10∶1)溶液，接着是上层的氯仿∶甲醇∶水(7∶3∶1)，然后是氯仿∶甲醇∶水(6∶4∶1)，氯仿∶甲醇∶水(5∶5∶1)，并且最后使用甲醇清洗。然后，通过薄层层析(TLC)方法来测定材料。使用氯仿∶甲醇∶水(6∶4∶1)溶液来在TLC板(由Merck提供的TLC板硅胶60F254)上显现洗脱的溶液。为了检测级分，将50％硫酸喷洒在TLC板上，然后将其于250度加热。
通过TLC显现的保留因素(Rf)值来进一步限定最有效的材料。Rf定义为化合物经过的距离除以溶剂经过的距离。表1中显示了级分1-4的Rf值。有效级分的Rf值位于0.5至0.9。最有效级分的Rf值为0.6至0.9。
表1：级分1-4的Rf值
  级分   Rf值
  1   0.78-0.88
  2   0.76-0.85
  3   0.64-0.76
  3   0.52-0.72
也可以通过其它方法分离具有0.6至0.9的Rf值的级分。例如，也可以使用反相颗粒(C2，C8，C18：C指碳carbon)替代硅胶。在此情况中，可以使用水∶甲醇或水∶乙醇溶液来洗脱更有效的级分，并通过其Rf值确定级分的身份。
也可以使用凝胶层析方法(其通过分子量分开各种类)和离子吸附凝胶层析方法(其通过分子的极性分开)来分级。也可以使用液液分级或固液分级方法来替代柱层析。
实施柱层析前，可以使用活化的木炭(例如活化的木炭柱)作为预处理，以除去颜色(例如从黑暗的奇特颜色的提取物除去叶绿素)。
图4和图5显示了使用柱层析的一次分级实验的结果。柱是固相硅胶60(70-230筛目ASTM，购自Merck)。液相是氯仿∶甲醇(10∶1)溶液，接着是氯仿∶甲醇∶水(7∶3∶1)，然后是氯仿∶甲醇∶水(6∶4∶1)，氯仿∶甲醇∶水平(5∶5∶1)，和最后的甲醇清洗。如下制备图5中所显示的提取物：使用氯仿∶甲醇(10∶1)溶液提取提取物1至3，使用氯仿∶甲醇∶水(7∶3∶1)提取提取物4，使用氯仿∶甲醇∶水(6∶4∶1)提取提取物5至7，使用氯仿∶甲醇∶水(5∶5∶1)提取提取物8，然后使用甲醇提取提取物9。然后使用标准的蒸发器除去溶剂。“外表(aspect)”指目视检查的级分外观。将0.05g材料放入5ml水中，并旋涡振荡。若它在室温中明显可溶，则测量水溶解度；在图4中，空心圆圈指明材料是明显可溶的，而“X”指明不是明显可溶的(例如存在颗粒物质)。使用UV检测器观察UV斑点，并通过目视检查测量UV吸收。还是在图4中，空心圆圈指明，观察到UV斑点，而“X”指明没有观察到斑点。图4中显示的百分比按重量计。若GCLM和GCLC两者的基因表达与对照相比显著更高，且相对值大于4(在100μg/ml)，则归于“高”基因表达；若GCLM和GCLC两者的基因表达与对照相比显著更高，且相对值小于4(在100μg/ml)，则归于“中等的”；而“低的”意味着GCLM和GCLC两者的基因并不显著高于对照，且相对值小于4(在100μg/ml)。
图6和图7显示了评估分级的柳提取物对Nrf2下游基因表达的影响的结果。使人成纤维细胞与10μg/ml、50μg/ml、或100μg/ml浓度的图4和图5中所显示的9种分级柳提取物接触，并温育24小时。使用用SYBRTM Green进行的RT-PCR来检测谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰物亚基(GCLM，图6)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC，图7)的表达。还评估PPIA作为内部对照基因。结果表明级分1、2、和3含有最高量的NRF2激活活性。
实施例5-对人受试者施用柳提取物
本实施例描述了为了在年龄为约26-45岁，且平均年龄为34.2岁的健康人志愿者中检查柳提取物的抗氧化能力而进行的小试验。登记16名受试者(7名男性和9名女性)，试验过程中放弃3名。
对受试者施用来自Ask Intercity Co.，Ltd.的柳提取物。如下制备此柳提取物，即在加热的情况中将干燥的商品化柳树皮和芽浸没于净化水中，其中柳树皮和幼嫩的枝是基于欧洲药典和德国药典(Commission E Monograph)的
“白柳树皮”。剂量方案是6粒胶囊/天(每天总共800mg柳提取物)达两周的一段时间(接着是两周的冲洗(washout)期间)。然后每名受试者经历临床检查，包括：
(i)在使用Ficcoll-Conray梯度自肝素化血液分离的外周血单个核细胞(PBMC)中测量抗氧化剂相关基因表达-Nrf2、GCLM、叉头框O1(FOXO1)、SOD1、和过氧化氢酶。使用GAPDH作为内部对照(使用RT-PCR在0、1、2、和4周时测量)；
(ii)血清抗氧化系数-8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)、GSH、SOD、8-异前列腺素(isoprostane)、和TRAP的水平(在0、1、2、和4周时测量)；
(iii)血液生物化学-总蛋白质、GOT、GPT、总胆固醇、HDL-C、LDL-C、甘油三酯、ALP、清蛋白、A/G比率、γ-GTP、淀粉酶、尿素氮、尿酸、肌酸酐、和动脉硬化症系数(在0、2、和4周时测量)；
(iv)血液血细胞计数-血液葡萄糖、HbA1c、WBC、RBC、Hb、Ht、血小板、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞(acidphol)、嗜中性粒细胞、白细胞、单核细胞、MCV、MCH、和MCHC(在0、2、和4周时测量)；和
(v)其它-胰岛素、脂连蛋白、IGF-1和水杨酸(在0、2、和4周时测量)。
表2中显示了受试者的概况。
表2：受试者概况
  受试者号   性别   年龄   摄取率   数据缺陷   备注
  1   F   27   100.0   -
  2   F   45   91.7   -
  3   F   35   95.2   -
  4   F   26   107.1   2w
5 F 40 84.5 1w   补充过程中有抗生素
  受试者号   性别   年龄   摄取率   数据缺陷   备注
  6   F   26   100   -
  7   F   35   101.2   -
8 F 38 100 -   补充过程中有避孕药
  9   F   28   100   -
  10   M   36   98.8   -
  11   M   28   100   -
  12   M   43   102.4   -
  13   M   31   103.6   -
  14   M   39   81.0   -
  15   M   26   92.9   -
  16   M   44   100.0   -
图8-15中显示了结果。首先，如图8和表2中所显示的，2周的柳提取物补充在PBMC中诱导SOD1基因表达。如图9-11中所显示的，PBMC中的Nrf2基因表达在摄取后一周显著下降，而下游基因GCLM或过氧化氢酶在补充期期间都不显著改变(过氧化氢酶基因表达在第一周摄取期期间略微升高，但在第二周摄取期期间返回至基线，而过氧化氢酶基因表达在剩余期期间降低)。如图12中所显示的，用柳提取物进行的补充在两周中显著降低血清8-OHdG水平，并且效果在结束处理后持续。然而，如图13和图14中所显示的，血清中的GSH和SOD转化水平贯穿整个测试期均没有改变。
比较而言，如图15中所显示的，FOXO1 mRNA在用柳提取物补充2周后在PBMC中显著升高。FOXO1是已知用于调节解毒和抗氧化剂基因表达(包括SOD1)的转录因子。
实施例6-疏水性柳提取物提高体内GCS-1表达
本实施例描述了为了调查柳提取物的某些级分是否在活的秀丽隐杆线虫中诱导SKN-1/阶段II解毒途径而实施的实验。如上文所描述的那样制备柳提取物的分级产物，并如表3中所显示的那样合并以形成级分A-E(Fr.A-Fr.E)。
表3：组合的级分
  新级分名称   先前的级分
  A   1，2
  B   3
  C   4
  D   5，6
  E   7，8，9
如上文的，在秀丽隐杆线虫中使用已经与绿色荧光蛋白(GFP)融合的gcs-1转基因(GCS-1::GFP)实施这些实验。gcs-1编码如下酶，其对于谷胱甘肽合成是限速的，而且是阶段II主要调节物SKN-1的尤其充分表征的和诊断性的靶基因(An和Blackwell，Genes Dev.(17)：1882-93(2003)；An等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(102)：16275-80(2005)；Inoue等，Genes Dev.(19)：2278-83(2005)；Tullet等，Cell.132：1025-38(2008))。在氧化应激条件下，SKN-1依赖性gcs-1表达在肠细胞中受到诱导。
用各种级分对GCS-1::GFP虫进行处理，并观察动物肠中的GFP表达水平。在每次个体实验试验中，将约20粒L4期虫挑选至含有0P50细菌的新鲜平板。2-3天后，用材料处理动物。如下将虫转移至微离心管，即用M9(盐水培养基)淹没含有虫的平板，并使用移液管将它们转移至管。快速旋转后，除去M9，并用M9再清洗动物一次。此清洗除去任何剩余的细菌。一旦清洗过虫，将它们与所提供的制备物一起温育30或60分钟。温育后，在M9中再清洗虫2次，并转移至含有细菌的新鲜NGM平板，并容许恢复约30分钟。然后将虫嵌入载玻片上，并在显微镜下对GFP表达评分。基于肠中的GFP表达水平给出三种得分(高的、中等的或低的表达)之一，如记载于(An和Blackwell，Genes Dev.(17)：1882-93(2003)；Tullet等，Cell.132：1025-38(2008))的。对整条肠具有GFP的动物给予高得分。整条肠半段的GFP表达是中等得分的例子。将低得分给予在其肠中具有非常少或没有GFP表达的虫。
首先，检查用柳提取物级分处理后的gcs-1转基因报告物的诱导(图17)。用级分A进行的处理在处理30分钟后在与对照相比时导致肠GFP表达升高最高(图17)。以低浓度(5μg/mL)施用来自级分A的材料，因为它被溶解于DMSO中，所述DMSO在较高浓度能引起氧化应激响应。级分A样品中的DMSO的低的终浓度(006％DMSO)没有在gcs-1虫(对照，图17)中引发应激响应。级分B-E(其在M9培养基中以10mg/ml施用)也诱导肠GCS-1::GFP表达，其中每种连续级分导致比先前级分略低水平的诱导(图17)。有趣的是，级分B在以5μg/mL施用时引发相当强烈的应答(未显示)，提示其潜力与级分A的潜力相当。
总之，以gcs-1诱导活性表征所有柳级分，其中级分A和B是最有力的，而其它的连续显示较小的活性。
实施例7-绿茶和柳提取物的保护性效果
本实施例描述了为了调查用先前分析的绿茶和柳提取物材料进行的处理是否在氧化应激和正常条件下增强秀丽隐杆线虫存活而实施的实验。
对下列材料测试它们是否保护动物免于对氧化应激的暴露：
柳提取物
绿茶提取物
柳提取物的分级产物(Fr.A)
在每次实验中，通过用叔丁基过氧化氢溶液(t-BOOH)(即过氧化物游离基的脂溶性来源)进行的处理来将虫暴露于氧化应激(图18)。将L4期虫挑选至含有要测试的材料或对照的平板。已经用细菌培养物接种那些平板，所述细菌培养物已经被向下旋转，并在5ml各种材料中重悬。于20℃温育24或48小时后，将虫与少量细菌一起移动至含有15.4mM t-BOOH的平板。然后每小时对虫检查移动和咽泵，直至所有虫均死亡。每块平板使用约20粒虫一式三份实施每次分析。使用如下对照：柳：LB中重悬的OP50细菌食物；绿茶：含有.1％DMSO的LB中重悬的OP50；柳级分A：含有.006％DMSO的LB中重悬的OP50。
48小时后，所有三种材料均提供针对氧化应激的保护，如随着与合适对照相比存活增加所指明的。柳提取物在LB中在10mg/mL的浓度是可溶的。此组的阴性对照(单独的OP50细菌)没有提供针对t-BOOH的保护，其中所有虫到第9小时均死亡。比较而言，用柳提取物处理的一些虫活过12小时(图18)。茶叶提取物也提供保护，即使其终浓度为2ug/mL，因为它仅在DMSO(.01％)中是可溶的。最后，用柳提取物级分A进行的处理也提供显著的保护。
比较而言，暴露于这些相同的提取物材料仅24小时没有提供针对t-BOOH应激的任何保护。
总之，用每种所测试的制备物进行的处理保护秀丽隐杆线虫免于随后的氧化应激考验(用t-BOOH进行的处理)。建立条件用于分析对寿命的影响。
实施例8-胡萝卜和花椰菜提取物的效果
使用下列材料替换柳或茶提取物来实施如上文在实施例6中所描述的实验：
胡萝卜粉末
发酵的胡萝卜粉末
花椰菜粉末
发酵的花椰菜粉末
用各10mg/mL每种制备物处理虫达30分钟。用胡萝卜粉末进行的处理在30分钟处理后与其它材料相比导致GFP报告物的肠表达升高最高(图19)。这些中的每种在M9盐水中在10mg/mL浓度是可溶的。阴性M9对照再次显示对肠中的GFP没有影响，其中所有虫均被评分为低的。
总之，所有所测试的材料与M9对照相比都适度地诱导gcs-1表达。
实施例9-柳提取物对由Nrf2调节的基因(HO-1和NQO1)的表达的影 响
为了检查柳提取物对由Nrf2调节的基因的表达的影响，HUVEC购自Sanko Junyaku(日本)，并于37℃和5％CO2在补充有10％FBS、10ng/mL FGF和100U/mL青霉素、和100μg/mL链霉素的MCDB131中在经I型胶原包被的平板中培养。在12孔经I型胶原包被的平板上接种第4代HUVEC。在细胞达到汇合时，在含有2％FBS而没有FGF的培养基中使它们饥饿达随后的24小时。饥饿期后，将培养基交换成含有以想要的终浓度溶解的柳提取物(Ask IntercityCo.，Ltd.)的新鲜培养基(参见图20A-B)。在导入柳提取物后6小时时使用总RNA迷你试剂盒(BIO-RAD，USA)自细胞提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara，Japan)自0.5μg总RNA合成单链cDNA。通过使用ABI 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems，Japan)进行的实施PCR来实施对血红素加氧酶1(HO-1)和NADPH脱氢酶醌1(NQO1)mRNA的定量分析。使用Premix Ex Taq(Takara，Japan)和Assay-on-Demand，基因表达产品(GeneExpression Products)来进行定量实时PCR分析。通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达水平来标准化所有定量数据。
图20A-B中显示的结果指明柳提取物以剂量依赖性方式提高HO-1和NQO1，即由Nrf-2调节的基因的表达。
实施例10-柳提取物对分离的PBMC中的Nrf2表达的影响
将来自健康志愿者的血液收集入肝素化的管中，并通过添加等量的PBS(-)来稀释。使用Ficcoll-Conray梯度方法自稀释的血液分离外周血单个核细胞(PBMC)。在存在或没有来自Ask Intercity Co.，Ltd的柳提取物的情况中于37℃和5％CO2在补充有10％FBS、100U/mL青霉素、和100μg/mL链霉素的RPMI1640中培养1.0×106个PBMC。在温育后4小时使用总RNA迷你试剂盒(BIO-RAD，USA)自细胞提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara，Japan)自总RNA合成单链cDNA。通过使用ABI 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems，Japan)进行的实施PCR来实施对谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰物亚基(GCLM)和NF-E2相关因子2(NRF2)mRNA的定量分析。使用Premix Ex Taq(Takara，Japan)和Assay-on-Demand，基因表达产品来进行定量实时PCR分析。通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达水平来标准化所有定量数据。
图21中显示的结果指明柳提取物在人PBMC中以剂量依赖性方式提高Nrf-2的表达。
实施例11-对Nrf2自细胞质向细胞核的移位的评估：皮肤成纤维细胞中 的Nrf2激活效果
用于本实施例的皮肤成纤维细胞是自50岁白人女性衍生的的腹部成纤维细胞(下文缩写为HDF50)(Cell Applications，Inc.)。所使用的培养基是如下制备的MEM(+)培养基，即将50mL标准胎牛血清(SIGMA)和5.0mL抗生素杀真菌剂溶液(100x)(SIGMA)添加至500mL MEM-Eagle培养基(SIGMA)，并混合。
将HDF50在5％CO2培养箱中于37℃在MEM(+)培养基中培养。在HDF50达到汇合状态时，分离细胞以通过血球计(Bürker-Türk血球计)来计算细胞数目。将所获得的细胞在MEM(+)培养基中稀释以制备1.9x105个细胞/15mL。将要评估的材料添加至经稀释的培养基后，将混合物在5％CO2培养箱中于37℃再温育24小时。其后，再次分离细胞以使用细胞核/胞质溶胶分级试剂盒来获得细胞核提取物。使用蛋白质测定快速试剂盒来测定细胞核提取物中的蛋白质，并调节蛋白质浓度以使所有样品间的蛋白质量相等。将如此制备的样品与等体积的含有5％2-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液混合，并煮沸。将自煮沸的混合物获得的上清液进行凝胶电泳。完成电泳后立即使用iBlot凝胶转移装置将凝胶转移至与试剂盒附着的硝酸纤维素膜，并使用Amersham ECLPlus Western印迹检测系统在100Kda左右检测Nrf2条带。此外，使用Re-BlotWestern印迹再循环试剂盒除去抗体后，以类似的方式检测核纤层蛋白A/C作为对照。关于Nrf2条带，扫描凝胶图像，并使用Scion图像软件(NIH的Windows版本)来定量Nrf2条带的密度以计算相对Nrf2蛋白水平作为对照。
图22中显示的结果指明柳提取物在人成纤维细胞中以剂量依赖性方式提高Nrf-2蛋白水平。
实施例12-对预防氧化应激的能力的评估
在具有经稀释的材料的培养基中培养24小时后，将HDF50在含有5mMH2O2的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(SIGMA)(下文缩写为D-PBS)中温育30分钟。其后，用MEM(+)培养基替换培养液，并在5％CO2培养箱中于37℃再继续培养3小时。
完成培养后，使用血球计(Bürker-Türk血球计)来测定活细胞数目(A)，并依照如下等式比较无H2O2添加条件的活细胞数目(B)来计算细胞成活率：
细胞成活率＝[(A)/(B)]×100(％)
图23中显示的结果指明柳提取物对预防氧化应激有阳性效果。
实施例13-人皮肤中的抗氧化(口服摄取)
为了评估柳提取物对人皮肤中的抗氧化的刺激作用，以每天800mg的剂量对7名年龄为32至43岁的健康男性口服给予柳提取物(Ask Intercity Co.，Ltd.)。摄取期为4周，而冲洗期为8周。通过皮脂中的脂质过氧化物量来测量抗氧化剂活性。总共4次获得皮质，即摄取开始前立即，完成摄取期后，冲洗期间(在第4周时)和完成冲洗期后。
如下获得皮脂，即将丙酮/醚(1∶1)溶液注射入紧密放置在收集位置上的具有4cm内径的圆筒中。组合自每名受试者背部三处位置获得的皮脂样品，并使用TBARS测定试剂盒(OXITEK)来测定脂质过氧化物。使用RF540荧光分光光度计(Shimadzu，Japan)来实施脂质过氧化物测定中的荧光测量，并获得脂质过氧化物量作为MDA值(TBARS含量(nmol/mL/g))。
图24中显示的结果指明柳提取物在口服4周后显著地且可逆地提高抗氧化剂活性。
为了进一步评估口服的柳提取物对人皮肤中的抗氧化的刺激作用，将16名年龄为24至47岁的健康男性分成测试组(11名男性)和安慰剂组(5名男性)。对测试组口服给予每天6粒胶囊(每天总共800mg柳提取物(Ask IntercityCo.，Ltd.)和结晶纤维素)。对安慰剂组口服给予每天6粒胶囊(仅含有结晶纤维素)。摄取期为6周。实施UV照射两次，即在开始摄取前2周和开始摄取后4周。使用太阳模拟器以30mJ/cm2对每名受试者背部照射UV。每次UV照射后2周拍摄UV照射位置处的照片。在与测试组中的时间相同的时间在安慰剂组中实施UV照射和拍照。使用Photoshop Element(Adobe)中的色图实施照片图像数据的自动颜色水平修正后使用Java第1.39版(NIH)中的图像加工和分析来获得色素量(灰度值均值)。
图25中显示的结果指明柳提取物在口服后提高抗氧化剂活性，如通过由UV照射所产生的色素量的显著降低所证明的。
实施例14-人皮肤中的抗氧化(表面应用)
本实施例描述了对表面施用的柳提取物对人皮肤中的抗氧化的刺激作用的评估。外部应用期为1周。使用含有含水酒精凝胶(含有0.45％卡波姆(carbomer)和4.75％乙醇)中的1％要测试的柳提取物(Ask Intercity Co.，Ltd.)的测试样品。使用含有0.45％卡波姆和4.75％乙醇的安慰剂样品。以0.2g/5cm2的剂量一天两次在下臂上应用含水酒精凝胶。完成应用期后，用水清洗应用位置，并干燥。然后使用太阳模拟器以30至40mJ/cm2的UV(根据小组对UV敏感性调整)照射所述位置。UV照射后6天时，在照射位置处拍摄照片。使用Photoshop Element(Adobe)中的色图实施照片图像数据的自动颜色水平修正后使用Java第1.39版(NIH)中的图像加工和分析来获得色素量(灰度值均值)。
图26中显示的结果指明柳提取物在表面施用后提高抗氧化剂活性，如通过由UV照射所产生的色素量的显著降低所证明的。
其它实施方案
应当理解的是，虽然本发明已经结合其详细的描述进行了描述，上述描述意图例示，而并不限制由所附权利要求书的范围所限定的本发明的范围。其它方面、优点、和修饰在所附权利要求书的范围内。

Claims (34)

1.一种组合物，其包含白柳提取物或其活性级分，其中所述组合物提高阶段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化剂酶基因之一或两者在细胞中的表达。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物提高如下基因的表达：选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰物亚基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的P2D基因；或包括超氧化物歧化酶1(SOD1)的抗氧化剂酶基因。
3.权利要求1的组合物，其中所述组合物还提高FOXO1的表达和/或降低8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)的水平。
4.权利要求1的组合物，其中将所述组合物配制用于口服。
5.权利要求4的组合物，其进一步包含一种或多种口服可接受载体和添加剂。
6.权利要求1的组合物，其中将所述组合物配制用于表面施用。
7.权利要求6的组合物，其进一步包含一种或多种表面可接受载体和添加剂。
8.一种提高柳提取物的阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶增强活性的方法，该方法包括：
提供具有第一水平的P2D或抗氧化剂酶增强活性的柳提取物；
对所述提取物分级，以便获得两种或更多种级分；
选择具有0.5或更大的Rf值的级分；
测定所述级分的P2D或抗氧化剂酶增强活性；并且
若级分具有比P2D或抗氧化剂酶增强活性的第一水平高的P2D或抗氧化剂酶增强活性水平，则选择该级分。
9.权利要求8的方法，其中对所述提取物分级包括使用一种或多种选自下组的方法：柱层析、液液分级、和固液分级。
10.一种鉴定提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶基因在细胞中表达的化合物的方法，该方法包括：
(a)提供表达(i)P2D或抗氧化剂酶基因或(ii)包含P2D或抗氧化剂酶基因启动子的报告物构建体的细胞；
(b)提供植物提取物的级分；
(c)使所述细胞与所述级分接触；并
(d)检测所述级分对所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的影响，
其中提高所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶基因在细胞中表达的化合物。
11.权利要求10的方法，进一步包括：
(e)选择提高所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；
(f)提供表达P2D或抗氧化剂酶基因或包含P2D基因启动子的报告物构建体的细胞；
(g)使所述细胞与所述亚级分接触；并
(h)检测所述亚级分对所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的影响，
其中提高所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的亚级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶基因在细胞中表达的化合物。
12.权利要求11的方法，进一步包括重复步骤(e)至(h)，直至获得纯化的化合物。
13.权利要求12的方法，进一步包括将所述纯化的化合物配制用于口服。
14.权利要求12的方法，进一步包括将所述纯化的化合物配制用于表面施用。
15.权利要求10-14任一项的方法，其中所述细胞是培养细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、成纤维细胞、或秀丽隐杆线虫中的细胞。
16.权利要求10的方法，其中所述植物提取物是柳提取物。
17.权利要求15的方法，其中所述秀丽隐杆线虫中的细胞是ASI细胞。
18.权利要求8-12任一项的方法，其中所述P2D基因选自下组：谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰物亚基(GCLM)，谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)，而所述抗氧化剂酶基因是超氧化物歧化酶1(SOD1)。
19.权利要求8或10的方法，进一步包括：
(e)选择提高所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；
(f)提供表达FOXO1基因或包含FOXO1基因启动子的报告物构建体的细胞；
(g)使所述细胞与所述亚级分接触；
(h)检测所述亚级分对所述FOXO1基因或报告物构建体表达的影响；并选择提高所述FOXO1基因或报告物构建体表达的亚级分。
20.权利要求8或10的方法，进一步包括：
(e)选择提高所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；
(f)使细胞与所述亚级分接触；
(g)检测所述亚级分对所述细胞中的8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平的影响；并
选择降低所述细胞中的8-OHdG水平的亚级分。
21.一种鉴定提高叉头框O1(FOXO1)基因在细胞中表达的化合物的方法，该方法包括：
(a)提供表达(i)FOXO1基因或(ii)包含FOXO1基因启动子的报告物构建体的细胞；
(b)提供茶提取物级分和柳提取物级分之一种或多种；
(c)使所述细胞与所述级分接触；并
(d)检测所述级分对所述FOXO1基因或报告物构建体表达的影响，
其中提高所述FOXO1基因或报告物构建体表达的级分包含提高FOXO1在细胞中表达的化合物。
22.权利要求21的方法，进一步包括：
(e)选择提高所述FOXO1基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；
(f)提供表达FOXO1基因或包含FOXO1基因启动子的报告物构建体的细胞；
(g)使所述细胞与所述亚级分接触；并
(h)检测所述亚级分对所述FOXO1基因或报告物构建体表达的影响，
其中提高所述FOXO1基因或报告物构建体表达的亚级分包含提高FOXO1在细胞中表达的化合物。
23.权利要求22的方法，进一步包括重复步骤(e)至(h)，直至获得纯化的化合物。
24.权利要求23的方法，进一步包括将所述纯化的化合物配制用于口服。
25.权利要求21-23任一项的方法，其中所述细胞是培养细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、成纤维细胞、或秀丽隐杆线虫中的细胞。
26.权利要求25的方法，其中所述秀丽隐杆线虫中的细胞是ASI细胞。
27.一种提高细胞中的阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶基因增强活性的方法，该方法包括对所述细胞施用有效量的植物提取物或其活性级分。
28.一种提高细胞中的阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶基因增强活性的方法，该方法包括对所述细胞施用有效量的包含植物提取物或其活性级分的组合物。
29.权利要求27或28的方法，其中所述植物提取物是柳提取物。
30.权利要求27或28的方法，其中所述提取物降低对所述细胞的氧化损害。
31.权利要求27或28的方法，其中所述细胞在活的哺乳动物中，并且所述提取物降低所述哺乳动物组织中的氧化损害。
32.权利要求31的方法，其中所述细胞是皮肤细胞，并且所述提取物降低对所述哺乳动物皮肤的氧化损害。
33.权利要求31的方法，其中所述细胞是皮肤细胞，并且所述提取物降低源自于暴露于紫外放射的所述哺乳动物皮肤中的色素沉着。
34.权利要求33的方法，其中在暴露于紫外放射前将所述植物提取物应用至所述哺乳动物的皮肤。
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