CN101849981A - 一种具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位及其制备方法和其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位及其制备方法和其应用,它是通过以下方法制备得到的,取没药用乙醇等溶剂采用超临界流体萃取法、浸渍法或回流法提取,得醇提液,浓缩,浓缩物加水悬浮,用乙醚、石油醚或正己烷等低级性溶剂萃取,得低极性溶剂萃取液,浓缩即得含有重量百分比0%~50%的倍半萜和0%~30%的二萜酸类成分的没药有效部位。本发明以现代提取分离手段和药理活性筛选相结合的方法确定最佳有效部位,所得有效部位活性成分更清楚,活性成分含量高,且经过体外抗肿瘤实验结果表明,本发明提供的没药有效部位对多种妇科肿瘤细胞具有很好的抑制和杀灭作用,且用药剂量较少,有望开发成疗效显著、且不良反应低的中药新药。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域,具体涉及没药有效部位及其制备方法和其在制备抗妇科肿瘤药物中的应用。
背景技术
妇科肿瘤是危害妇女健康的重大疾病,是育龄女性的常见病,常见的恶性肿瘤包括子宫内膜癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等,常见的良性肿瘤包括子宫肌瘤、卵巢囊肿等。现今,发达国家每年有近1500万妇女被诊断为癌症,其中50%发生在生殖器官,80%发生于绝经后妇女。我国仅子宫颈癌患病率和病死率约占世界三分之一。
治疗妇科肿瘤国内外医学界常规采用的治疗方案为化学药物治疗、放射治疗及手术切除等。该方案在取得一定临床疗效的同时,也因化学药物的毒副作用、放疗造成的辐射伤害,以及手术方案性器官的全切或部分切除等导致的医源性问题和相应疾病,给患者带来了巨大的痛苦,严重影响着女性的生命健康和生活质量。
随着现代社会医疗模式的改变,从传统医学领域寻求对策、优化治疗方案和发现有效药物已成为重大的科学和社会命题。临床实践表明,中医药在妇科肿瘤发生、发展的不同病理阶段均具有明显的特色优势,尤其是在经医学筛查可早期发现妇科肿瘤(子宫内膜癌、子宫颈癌)的早期治疗和干预;实质性肿瘤期间的中医药治疗和协同放/化疗的增效减毒;术后促愈及妇科性腺器官和功能保护等方面均显得十分重要和必要。
中医认为妇科肿瘤的形成是由于正虚邪实,中医扶正祛邪为治疗妇科肿瘤的大法。肿瘤为实证,是因湿热瘀毒外袭内蕴所致。根据《内经》“坚者削之,结者散之,留者攻之,滞者导之”的原则,当以攻邪为治,但恶性肿瘤又有内虚的一面,“邪之所凑,其气必虚”。根据中医理论,从血瘀证立论,针对细胞黏附、侵袭、血管形成的病理模式,以化瘀消徵药为主阻断这一过程,通过抗黏附、抗侵袭、抗血管形成,达到减灭和消除异位病灶、减少和避免复发的治疗效果并取得了突破性的进展。
没药为橄榄科植物没药树及同属植物树干皮部渗出的油胶树脂,亦名末药。中医药认为其性苦、平,归肝、脾、心、肾经,有活血止痛、消肿生肌的功效,临床上常用于活血祛瘀类中药,主治胸腹瘀痛、痛经、经闭、癥瘕、跌打损伤、痈肿疮疡、肠痈、目赤肿痛等。
中国发明专利200410058013.0,200410018778.1,200710163373.0,200710016109.4和200910118808.9等都公开了含有没药的抗肿瘤中药复方,组成复杂,用药量大,且未公开针对妇科肿瘤疾病的治疗,现代化学成分研究表明,没药主要化学成分为树脂、挥发油和树胶,其主要活性成分包括没药倍半萜类、二萜类、三萜类等化合物,另外还含有少量苦味质,没药酸及氧化酶等多种成分,探索没药提取物的药效,并研究开发出没药抗肿瘤活性部位具有重要价值。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种有效物质明确、疗效好、副作用小且服用方便的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位,本发明另一个目的是提供该没药有效部位的制备方法和其在制备治疗妇科肿瘤药物中的应用。
技术方案:为了实现以上目的,本发明采取的技术方案为:
一种具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位,它是通过以下方法制备得到的,取没药用醇提取,得醇提液,浓缩,浓缩物加水悬浮,用低级性溶剂萃取,得低极性溶剂萃取液,浓缩即得。
作为其它方案,本发明提供的没药有效部位,可以取没药直接采用低级性溶剂如乙醚、正己烷等溶剂,采用冷浸法或热回流提取法提取,得提取液,浓缩,纯化,即得。
作为优选方案,以上所述的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位,本发明通过采用HPLC-MS/MS对没药有效部位的总离子流图中的化学色谱峰通过与对照品化合物色谱图保留时间、提取离子的丰度或峰面积、质谱碎片离子以及紫外吸收特征,分析表明本发明提供的没药有效部位主要含有重量百分比0%~50%的倍半萜和0%~30%的二萜酸类成分,作为更优方案,所得没药有效部位中含有重量百分比10%~50%的倍半萜和10%~30%的二萜酸类成分。倍半萜主要有2-甲氧基-8,12-环氧吉玛-1(10),7,11三烯-6酮,2-甲氧基-5-乙酰基-4-呋喃吉玛-1(10)-烯-6-酮等,二萜酸类成分主要有香松胶脂酸、枞酸和脱氢枞酸化合物。
作为优选方案,以上所述的提取溶剂醇为浓度10~95%的甲醇、乙醇、丙醇或丁醇,提取方法为浸渍法、加热提取法及含有一定量夹带剂的超临界CO2萃取法等,本发明所得的没药有效部位经HPLC-MS/MS分析表明主要含有倍半萜和/或二萜酸酸类化合物,这些成分为低极性成分,具有一定的挥发性,因此,本发明采用常温浸渍法或热回流提取的方法提取可以保留活性成分原有结构,作为更优方案,本发明采用超临界流体萃取法,超临界流体萃取法是一种新型提取分离方法,针对低极性化合物具有良好的提取效率,且所用有机溶剂少,提取完全,且该方法在较低温度下进行萃取分离纯化,可以有效提取挥发性、热不稳定性和结构易变的化合物。
作为优选方案,以上所述的低极性溶剂优选乙醚、石油醚或正己烷,由于没药有效成分的极性较低,因此,本发明根据相似相溶的原理,对提取物采用乙醚、石油醚或正己烷进一步萃取纯化得到有效部位。
本发明提供的以上具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)取没药粗粉,加入总药材6~10倍量的醇溶液,采用浸渍法或加热回流提取法提取1~3次,合并提取液,减压浓缩得浓缩物;
(2)取步骤(1)得到的浓缩物加入1~10倍量水悬浮,然后加入3~10倍量的乙醚、石油醚或正己烷萃取1~3次,合并乙醚、石油醚或正己烷萃取液,浓缩,得没药有效部位。
以上制备方法中,所述的醇为浓度10~95%的甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。
本发明提供的以上具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位的另一种制备方法,具体包括以下步骤:
(1)取没药,粉碎过20目筛,用没药量20~50%的纯乙醇做夹带剂,采用超临界二氧化碳方法萃取,萃取温度为30~40℃,萃取压强为20~30Mpa,萃取时间为1~3小时,得到二氧化碳萃取物,在低于60℃减压回收得浓缩物,备用;
(2)取步骤(1)得到的超临界二氧化碳萃取浓缩物加入1~10倍量水悬浮,然后加入3~10倍量的乙醚、石油醚或正己烷萃取1~3次,合并乙醚或石油醚萃取液,浓缩,得没药有效部位。
作为优选方案,以上所述的制备方法中,超临界二氧化碳萃取条件为,萃取温度为30℃,萃取压强为30Mpa,萃取时间为2小时,
本发明提供的没药有效部位在制备治疗妇科肿瘤药物中的应用;作为优选方案,所述的妇科肿瘤为人卵巢癌、人宫颈癌、人子宫内膜癌或乳腺癌。
作为优选方案,把没药有效部位和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、脂肪乳剂、栓剂、微囊或透皮控释贴剂剂型的药物。
本发明提供的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位制成片剂时把没药有效部位和载体乳糖或玉米淀粉,需要时加入润滑剂硬脂酸镁,混合均匀,然后压片制成片剂。本发明提供的没药有效部位制成胶囊剂时把具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀,整粒,然后装胶囊制成胶囊剂。本发明提供的没药有效部位制成颗粒剂时,把没药有效部位和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀,整粒,干燥,制成颗粒剂。
有益效果:本发明提供的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位和现有技术相比具有以下优点:
(1)本发明提供的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位,以现代分离手段和药理活性筛选相结合的方法确定最佳有效部位,所得有效部位活性成分更清楚,活性成分含量高,且经过体外抗肿瘤实验结果表明,本发明提供的没药有效部位对多种妇科肿瘤细胞具有很好的抑制和杀灭作用,且用药剂量较低,不良反应低,且本发明提供的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位可以方便和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物,方便临床服用。
(2)本发明提供的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位的制备方法,可操作性强,尤其采用超临界流体法萃取没药有效成分,活性成分提取效率高,且制备方法成本低、环保、可实现工业化大生产。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 没药有效部位的制备
取没药粗粉末,用6倍量的95%乙醇加热回流提取三次,合并提取液,在60℃,700mmHg回收乙醇,浓缩至近无乙醇味,加生药重量0.8倍的水悬浮,然后加等量的石油醚(60℃~90℃)萃取3次,合并石油醚萃取液,浓缩,得没药有效部位,得率为15.40%。
取以上没药有效部位0.2g,加入淀粉0.01g,乳糖0.5g,微晶纤维素0.5g,硬脂酸镁0.02g和滑石粉0.01g,将上述成分混合均匀制成颗粒过20~80目筛,于40~80℃干燥,压片制得片剂。
实施例2 没药有效部位的制备
取没药粗粉末加8倍量的85%乙醇浸渍提取8小时,过滤得滤液,滤渣再加入8倍量的85%乙醇浸渍提取8小时,过滤,合并滤液,在60℃,700mmHg条件下回收乙醇,浓缩至近无乙醇味,加生药重量0.8倍水悬浮,然后加等量的乙醚(60℃~90℃)萃取3次,回收乙醚溶剂,得没药有效部位,得率约为16.56%。
取以上没药有效部位提取物0.2g,加入淀粉0.01g,乳糖0.5g,微晶纤维素0.5g,硬脂酸镁0.02g和滑石粉0.01g,将上述成分混合均匀,过筛整粒,40~80℃干燥,制成颗粒剂。
实施例3 没药有效部位的制备
(1)取没药,粉碎过20目筛,用没药量50%的纯乙醇做夹带剂,采用超临界二氧化碳方法萃取,萃取温度为30℃,萃取压强为30Mpa,萃取时间为2小时,得到二氧化碳萃取液,在低于60℃减压回收得浓缩物,备用;
(2)取步骤(1)得到的超临界二氧化碳萃取浓缩物加入8倍量水悬浮,然后加入3倍量的乙醚萃取3次,合并乙醚萃取液,浓缩,得没药有效部位,得率约为23.38%。。
实施例4 没药有效部位的制备
(1)取没药,粉碎过20目筛,用没药量30%的纯乙醇做夹带剂,采用超临界二氧化碳方法萃取,萃取温度为35℃,萃取压强为25Mpa,萃取时间为2小时,得到二氧化碳萃取液,在低于60℃减压回收得浓缩物,备用;
(2)取步骤(1)得到的超临界二氧化碳萃取浓缩物加入8倍量水悬浮,然后加入5倍量的石油醚萃取3次,合并乙醚萃取液,浓缩,得没药有效部位,得率约为20.18%。所得没药有效部位中含有重量百分比40%的倍半萜和30%的二萜酸类成分。
取以上所得没药有效部位提取物0.1g,加入淀粉0.02g,乳糖0.3g,微晶纤维素0.8g,硬脂酸镁0.01g,将上述成分混合均匀制成颗粒过20~80目筛,于40~80℃干燥,装入胶囊制备得到胶囊剂。
实施例5 没药有效部位的制备
取没药粗粉末加8倍量的正己烷浸渍提取24小时,过滤得滤液,滤渣再加入8倍量的正己烷浸渍提取12小时,过滤,合并滤液,在40℃条件下减压回收正己烷,浓缩,残渣加5倍量的乙醚(60℃~90℃)萃取3次,回收乙醚溶剂,得没药有效部位,得率约为18.78%。所得没药有效部位中含有重量百分比30%的二萜酸类成分。
取以上没药有效部位提取物0.1g,加入淀粉0.01g,乳糖0.3g,微晶纤维素0.2g,硬脂酸镁0.01g和滑石粉0.01g,将上述成分混合均匀,过筛整粒,40~80℃干燥,制成颗粒剂。
实施例6 没药有效部位体外抗肿瘤实验研究
一、实验材料和药物
1、实验材料:96孔板购自Costar公司;RMPI1640培养基购自Gibco公司;DMEM培养基购自Gibco公司;McCoy′s 5A培养基购自SIGMA公司;新生牛血清购自杭州四季青公司;噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司;DMSO购自Amresco公司。
2、实验仪器:超净工作台,苏州净化 型号SW-CJ-1FD;CO2培养箱SANYO型号:XD-101;酶标仪BIO-RAD Model NO.550Serial NO.16971。
3、受试药物及处理方法:实施例1制备得到的批号001和实施例3制备得到的批号003没药有效部位,采用DMSO溶解,给药前用完全培养基配制成所需浓度。阳性对照药物 紫杉醇注射液(厂家:海口市制药厂有限公司;批号:080502)。
4、肿瘤细胞株:人卵巢癌细胞A2780、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人宫颈癌细胞SiHa、人子宫内膜癌细胞shikawa和人乳腺癌细胞由南京凯基生物科技发展有限公司提供。
二、实验方法
实验步骤为:细胞消化、计数、制成浓度为5X104个/ml的细胞悬液,96孔板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔5X103个细胞);将96孔板置于37℃,5%CO2培养箱中培养24小时;然后用完全培养基稀释药物至所需浓度,每孔加入100μL相应的含药培养基,同时设立阴性对照组,溶媒对照组,阳性对照组;将96孔板置于37℃,5%CO2培养箱中培养72小时;然后每孔加入20μL MTT(5mg/ml),在培养箱继续培养4小时;弃去培养基,每孔加入150μL DMSO溶解,摇床10分钟轻轻混匀;在λ=490nm,酶标仪读出每孔的OD值,计算抑制率。
三、实验结果
1、没药有效部位对人卵巢癌细胞A2780的抑制率及IC50值
由下表1可看出没药有效部位能显著抑制人卵巢癌细胞A2780的增殖,在浓度为50μg/ml的剂量下,对人卵巢癌细胞A2780的抑制率达到69.6%~81.85%,其IC50为20μg/ml左右。说明该有效部位具有潜在的抗卵巢癌的活性,且具有较好的量效关系。
表1 没药有效部位对人卵巢癌细胞A2780的抑制作用
2、没药有效部位对人卵巢癌细胞SK-OV-3的抑制率及IC50值
由下表2可看出该有效部位能显著抑制人卵巢癌细胞SK-OV-3的增殖,在浓度为50μg/ml的剂量下,抑制率达到47.75%~73.06%,其IC50为30μg/ml左右。说明该有效部位具有潜在的抗卵巢癌的作用,且具有较好的量效关系。
表2 没药有效部位对人卵巢癌细胞SK-OV-3的抑制作用
3、没药有效部位对人宫颈癌细胞SiHa的抑制率及IC50值
由下表3可看出该有效部位能显著抑制人宫颈癌细胞SiHa的增殖,在浓度为50μg/ml的剂量下,抑制率达到75.23%,其IC50为23μg/ml左右。说明该有效部位具有潜在的抗宫颈癌的作用。
表3没药有效部位对人宫颈癌细胞SiHa的抑制率作用
4、没药有效部位对人子宫内膜癌细胞shikawa的抑制率及IC50值
由下表4可看出该有效部位能显著抑制人子宫内膜癌细胞shikawa的增殖,在浓度为50μg/ml的剂量下,抑制率达到60.23~37.56%,其IC50为40μg/ml左右。说明该有效部位具有潜在的抗子宫内膜癌的作用,并呈现较好的量效关系。
表4 没药有效部位对人子宫内膜癌细胞shikawa的抑制作用
5、没药有效部位对人乳腺癌细胞的抑制率及IC50值
由下表5可看出没药有效部位能显著抑制人乳腺癌细胞的增殖,在浓度为50μg/ml的剂量下,抑制率达到62.10~75.38%,批号001的IC50为30μg/ml左右,批号003的IC50为25μg/ml左右,说明没药有效部位较好的抗子宫内膜癌的作用,并呈现较好的量效关系。
表5 没药有效部位对人乳腺癌细胞的抑制作用
由以上实验结果表明本发明提供的没药有效部位具有很好的抗妇科肿瘤的作用,并从实验结果看出本发明提供的批号003的没药有效部位比批号001的没药有效部位具有更好的抗肿瘤活性。
本发明提供的没药有效部位中有效成分更清楚,含量更高,活性更强,临床上用药更少更安全,不良反应更低,且没药药用资源较为丰富,可以实现产业化,因此本发明提供的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位有望开发成为新一代抗妇科肿瘤的药物。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位,其特征在于,它是通过以下方法制备得到的,取没药用醇提取,得醇提液,浓缩,浓缩物加水悬浮,用低级性溶剂萃取,得低极性溶剂萃取液,浓缩即得。
2.根据权利要求1所述的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位,其特征在于,所得没药有效部位中含有重量百分比0%~50%的倍半萜和0%~30%的二萜酸类成分。
3.根据权利要求2所述的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位,其特征在于:所得没药有效部位中含有重量百分比10%~50%的倍半萜和10%~30%的二萜酸类成分。
4.根据权利要求1所述的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位,其特征在于,所述的提取溶剂醇为浓度10~95%的甲醇、乙醇、丙醇或丁醇,提取方法为超临界流体萃取法、浸渍法或加热回流提取法。
5.根据权利要求1所述的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位,其特征在于,所述的低极性溶剂为正己烷、石油醚或乙醚。
6.一种制备权利要求1至3任一项所述的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)取没药粗粉,加入总药材6~10倍量的醇溶液,采用浸渍法或加热回流提取法提取1~3次,合并提取液,减压浓缩得浓缩物;
(2)取步骤(1)得到的浓缩物加入1~10倍量水悬浮,然后加入3~10倍量的乙醚、石油醚或正己烷萃取1~3次,合并乙醚、石油醚或正己烷萃取液,浓缩,得没药有效部位。
7.一种制备权利要求1至3任一项所述的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)取没药,粉碎过20目筛,用没药量20~50%的纯乙醇做夹带剂,采用超临界二氧化碳方法萃取,萃取温度为30~40℃,萃取压强为20~30Mpa,萃取时间为1~3小时,得到二氧化碳萃取物,在低于60℃减压回收得浓缩物,备用;
(2)取步骤(1)得到的超临界二氧化碳萃取浓缩物加入1~10倍量水悬浮,然后加入3~10倍量的乙醚、石油醚或正己烷萃取1~3次,合并乙醚、石油醚或正己烷萃取液,浓缩,得没药有效部位。
8.权利要求1至3任一项所述的具有抗妇科肿瘤作用的没药有效部位在制备防治妇科肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的没药有效部位在制备防治妇科肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述的妇科肿瘤为人卵巢癌、人宫颈癌、人子宫内膜癌或乳腺癌。
10.根据权利要求9所述的没药有效部位在制备防治妇科肿瘤药物中的应用,其特征在于,把没药有效部位和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、脂肪乳剂、栓剂、微囊或透皮控释贴剂剂型的药物。
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