CN101848643A - 双歧杆菌菌株用于制备用于预防和/或治疗过敏症状的组合物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及双歧杆菌菌株用于制备组合物的应用，尤其是婴儿配方奶粉的制备，是为了预防和/或治疗过敏型症状。这些组合物是从双歧杆菌培养物中获得的，没有水解乳蛋白。细菌，优选属于短双歧杆菌的种类，可以在处理过程中被杀死或从组合物中被除去。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制备组合物、尤其是婴儿配方奶粉(infant formula)的方法，使得减少过敏型症状成为可能。这些组合物是从双歧杆菌(Bifidobacterium)培养物中获得的，没有水解乳蛋白。
背景技术
几十年来，过敏性疾病的发生率在工业发达的国家不断增长。因此，当前估计发达国家的20％的人口受到过敏症状例如哮喘、遗传过敏性皮炎或其它形式的症状的影响。现今的高发生率将过敏置于公共卫生问题的位置，并因此开展了众多的研究项目，以便试图提供有可能限制病变发展的解决办法。这些研究已经可以确定生命的最初2年是疾病建立的关键时期，并且尤其是通过对过敏原的致敏阶段来确定。在这期间儿童发生致敏作用，处于以后发展成过敏反应的极大的风险中。此外，肠内菌群在过敏反应发病上的作用也开始显现出来。实际上，儿童中肠内菌群的建立决定粘膜免疫系统的发展(Prescottet al.，2005)，并且菌群建立的模式可以影响免疫的取向朝向口服取向、或者相反地朝向致敏(Kalliomaki et al.，2001；Sudo etal.，1997)。
过敏反应更确切地被定义为涉及免疫机理的过敏性反应(Johansson et al.，2001)。过敏性反应引起重现性的症状，通过与抗原接触而引起，此抗原的剂量在正常个体中一般是能容忍的。引起过敏反应的抗原在性质上是非常多种多样的，比如是食物、空气或动物类型等等。同样地，观察到的症状有很多变化，并且主要是皮肤、消化或呼吸类型。建议预防过敏反应的策略的目的是减少过敏反应的新病例(一级预防)，或者当过敏已经建立时限制过敏反应的持续时间和发展(二级预防)。
在母乳喂养的婴儿中，最常见的过敏是食物过敏，并且尤其是牛乳蛋白过敏(CMPA)。风险在特异反应性的个体中更加高(高过敏风险儿童，尤其是由于已知的过敏遗传)，这就证明了在这些儿童中在幼儿期间的食物干预策略是正确的。延长的(＞6个月)单一性的母乳喂养，与逐步多样化的食物相结合，是参照的解决方案，母乳喂养对过敏性疾病出现具有潜在的保护作用(Host and Halken，2005)。对于处在风险中没有母乳喂养有利条件的儿童，推荐另一策略，包括通过部分或大量地水解使牛乳蛋白变性，或利用其他动物或植物蛋白作为它们的替代品(Host et al.，1999)。但是，这些解决方案的预防有效性一直有争论(Osborn and Sinn，2006a；Osborn and Sinn，2006b)，并且水解过程的结果是损害了感官品质和蛋白质的营养质量，被某些儿童拒绝。在法国，被水解的配方奶粉还受到特定的法规制约，完全地限制它们分配至制药系统，这对于处于风险中的儿童的父母是个附加的约束。
Pang等人从机理角度已经描述过发酵牛奶的抗过敏作用。研究的产品是“酸乳”类型的酸化益生菌发酵牛奶(pH＝3.7)。在被阐述的模型中，是由于测试产品的两重组成部分而起到作用：发酵和保持发酵菌活性(＞109cfu/ml)。测试了五中不同类型的发酵菌(3种乳酸杆菌(lactobacilli)、1种嗜热链球菌MC(Streptococcus thermophilus MC)和1种长双歧杆菌属(Bifidobacterium longum))，并且作者观察到取决于所使用的菌株，效果有很大的变化。在动物模型中，在测试的乳酸杆菌菌株上观察到最显著的效果。此外，观察到的效果是纯粹的免疫类型，并非与过敏类型的症状的临床观察直接相关(Penget al.，2007)。此外，应当注意的是，并不是所有的益生菌菌株都适合婴儿营养，D-乳酸是母乳喂养的婴儿不能代谢的。
Terpend等人更具体地研究通过短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和嗜热链球菌发酵的牛奶的特性。这个研究结果表明了肠道屏障对抗乳蛋白的增强作用。然而，这些作者没有证明这种发酵牛奶的直接抗过敏作用(Terpend et al.，1999)。
发明内容
在本文，发明人已经开发出适合婴儿营养的配方，至少可以部分地克服现有技术描述的产品的缺点，使得可以给有过敏风险的儿童的食物安排上提供了一个不同的方法。
被选中的带来益处的方法包括：通过来源于生物转化或者来源于通过双歧杆菌菌株发酵的免疫调节活性物质，直接调节儿童的菌群和肠免疫系统的建立。在以下实验部分中阐述的结果证明了在过敏症状上的直接益处。
因此，本发明首先涉及双歧杆菌菌株用于制备用于预防和/或治疗过敏型症状的组合物的应用。根据本发明优选的实施方式，使用的双歧杆菌菌株来源于人的肠内菌群。更优选地，该菌株属于短双歧杆菌种类。特别适合进行本发明的菌株是菌株BbC50，达能
日尔维公司(Compagnie Gervais Danone)于1999年5月31日保藏在法国培养物和微生
物国家保藏中心(CNCM)，编号是I-2219。
根据本发明的用于制备用于预防和/或治疗过敏症状的组合物的方法，优选包括在双歧杆菌菌株存在的情况下发酵牛奶底物的步骤。在上述的双歧杆菌属菌株存在的条件下用于发酵牛奶底物的步骤可以在有氧或厌氧条件下进行。
“牛奶底物”的表述被理解为指的是至少包含一种乳清蛋白组分和乳糖的含水培养基。在适当的时候，乳清蛋白可以被天然的乳清蛋白水解和/或富集。乳清渗透物也可以被合并入牛奶底物。作为牛奶底物的非限制的例子，可以是提及的牛奶、牛奶浓缩物、婴儿乳制食品基质、酸乳基质等等。
在本发明的优选的实施方式中，根据本发明，用于制备用于预防和/或治疗过敏症状的组合物的方法包括通过双歧杆菌菌株来生物转化牛奶底物的步骤，此步骤是在不利于被所述菌株产生酸的条件下进行的，如在专利WO 2001/001785中所描述的那样。这种生物转化，对应于非酸化或微弱酸化的发酵，也允许活性代谢物的产生。关于特别的发酵的详细条件显示在以下部分。
“不利于被双歧杆菌产生酸的条件”的表述定义为：在此条件下，通过双歧杆菌在8小时温育下对于最初接种大于每毫升1×107菌落形成单位(CFU)，培养基的酸化不超过0.5pH个单位。本领域的技术人员通过简单的实验，通过改变尤其是培养基的通气、它的渗透压和/或培养温度，以及通过在培养的开始和结束时测量pH，可以容易地确定此条件。
对于很多双歧杆菌菌株，此条件可以是尤其通过下面所描述的方法获得：
-使用来源于指数生长期后面阶段的接种物的细菌种群；
-在有氧条件下维持，例如伴随搅拌；
-在渗透压相当于水活度(WA)0.93至0.97时维持培养基；
-在温度40至48℃下维持；
以及这些不同的条件的组合。
在本发明的实施方式中，牛奶底物和双歧杆菌可以以每毫升牛奶底物107至109CFU的比率相接触，并且在生物转化反应结束时，最终的双歧杆菌种群数在每毫升产品105和109CFU之间。
牛奶底物在与细菌接触期间的pH值优选6.0至7，并且在生物转化反应结束时产物的pH值优选5.8至7。
取决于使用的条件，用于生物转化步骤的牛奶底物和细菌的接触时间可以是4小时和24小时之间。
当然，在根据本发明的方法中，如上所述的生物转化和发酵步骤是互不排斥的。例如，这种方法可以包括通过双歧杆菌对牛奶底物进行生物转化的步骤(亦即或大或小程度地酸化)、继之以通过相同细菌进行酸性发酵的步骤。可供选择地，两个反应可以在两个不同的牛奶底物上平行进行，然后将两个反应的产物合并成最终的抗过敏组合物。
取决于想要得到的抗过敏组合物的本质，可以将不同的附加处理应用于通过双歧杆菌对牛奶底物进行生物转化和/或发酵的产物。尤其是，在发酵或生物转化步骤结束时优选可以有灭菌和/或分离双歧杆菌的步骤，尤其是为了获得具有长时间保存期限的产物。同样地，取决于想要得到的最终组合物的本质，可以进行各种过滤、脱水或者色谱分离步骤。
根据本发明，用于制备用于预防和/或治疗过敏症状的组合物的产物的例子，尤其是在专利申请WO 2001/001785(在下面实施例1中使用的产物)、WO 2004/093898和WO2004/093899(实施例2)、以及WO 2006/040485中被描述。当然，根据本发明也可以使用这些产物的混合物。
在适当的时候，通过本发明的方法获得的组合物，除了通过双歧杆菌菌株发酵或者生物转化牛奶底物的产物之外，还可能包括通过嗜热链球菌菌株比如菌株ST065发酵牛奶底物所产生的物质，嗜热链球菌菌株ST065由达能日尔维公司于1995年8月23日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(CNCM)，编号是I-1620。根据本发明获得的组合物可以优选地包含通过在专利申请WO 96/06924中所描述的方法所获得的组分。
根据本发明的优选的实施方式，获得的组合物是保健食品(或功能食品)，即有健康益处的食物或食物成分，此情形是为了预防或治疗过敏症状。举例来说，组合物可以是酸乳类型的鲜奶产物、制备好的食物、调味料等等。组合物也可以是有长时间保存期限的被灭菌和/或被脱水的产物。
根据本发明优选的实施方式，获得的组合物目的是用于婴儿营养。例如，它可能是婴儿牛奶(处于脱水的或未脱水的状态)。根据本发明获得的婴儿牛奶的非限制的例子是达能集团销售的商品名是Gallia Calisma(1岁或2岁)的牛奶。
重要的是，要注意到根据上述方法中的一种和在下面实施例2中获得的组合物可以作为成分合并入任何类型的食物组合物。因此，根据本发明获得的食物组合物的特征可以在于如下事实：它包含至少一种根据如上所述的方法之一或在下面实施例2中获得的组合物作为成分。这种食物组合物是为了用于人的消耗品或作为动物饲料，并且可以被提供为尤其是发酵或未发酵、牛奶或非牛奶、动物或植物来源的制品形式，包括尤其是婴儿配方奶粉或用于成人和老年人的配方奶粉，以及尤其是婴儿牛奶制品、液体或者奶粉、新鲜的产品、谷类、饼干(填充)、婴儿食品罐头、甜食等等的形式，或者用于成人的食物或者食物产品的形式，包括医院产品。
可供选择地，根据本发明获得的组合物可以被提供为一种营养增补剂。
根据另一个实施方式，本发明涉及一种用于制备用于预防和/或治疗过敏型症状的药物组合物的方法。根据本发明获得的药物组合物的特征在于如下事实：它包含至少一种根据如上所述的方法之一或在下面实施例2中获得的组合物作为活性成分、以及至少一种药学可接受的载体。“药学可接受的”的表述被理解为指的是如下任何载体：其在保持根据如上所述的方法或者在下面实施例2中获得的组合物的特性同时，可以运载上述组合物。
根据本发明获得的营养增补剂或者药物组合物可以被提供为希望用于人或动物口服给药的任何未精炼的药物(galenic)形式，如糖浆或溶液的液体形式，喷雾，或者如粉末、片剂、硬胶囊、软胶囊、喷雾粉末、胶、膏剂、颗粒的固体形式，以用于它们即释或控释的各种形式，或适合口服给药的任何其他形式。根据本发明获得的药物组合物可以另外被配制成用于人或动物的局部用药，比如呈护肤霜、洗剂、肥皂、溶液、凝胶、奶液、油类的形式；或者用于人或动物的肛门用药，比如呈栓剂的形式。
根据本发明的方法获得的组合物优选是为了用于人的消耗品，并且有利于有过敏易患病体质的任何人。受过敏型症状折磨的个体、新生儿、母乳喂养的婴儿或者年纪小的儿童(最大5岁)，他们的父母之一有过敏和/或特异反应性的易患病体质，这些人组成了一个群体，该组合物对于该群体是有极大的益处的。受食物、呼吸或接触过敏折磨的个体，以及特异反应性的个体，也可以看见他们健康状况的好转，是通过本发明方法获得的组合物作为日常消耗品的结果。
在下面实施例中阐述的研究结果尤其表明，根据本发明获得的婴儿制品，在一方面，可使得预防出现许多高过敏风险的儿童的牛乳蛋白过敏(CMPA)成为可能，在另一方面，可以治疗母乳喂养的婴儿的过敏型皮肤症状。因此双歧杆菌菌株用于制备用于预防牛乳蛋白过敏的组合物的应用、和/或用于制备用于预防和治疗母乳喂养的婴儿的过敏型皮肤症状(湿疹、脱皮、耳后裂痕、红斑、发痒等等)的组合物的应用，构成了本发明的完整部分。
通过随后的附加描述，阐明婴儿牛奶Gallia Calisma在有过敏易患病体质的母乳喂养的婴儿上的抗过敏作用，能够更加清晰地理解本发明。也同样描述了根据本发明可以被使用的其他制品。
实施例
实施例1：婴儿牛奶Gallia Calisma的抗过敏作用
用于母乳喂养的婴儿的制品(Calisma 1岁类型的)和随后形成的牛奶(Calisma 2岁类型的)并入前瞻性的、长期的、多中心的有2个平行组的随机双盲研究中。用于制备这些组合物的方法在图1中用示意图表示。
目的是与非生物转化的配方奶粉(SF)相比，确定经生物转化的婴儿牛奶(FF)在预防新生儿和母乳喂养的婴儿的牛乳蛋白过敏反应(CMPA)、出现对过敏原的致敏作用上的有效性。
高特异反应性风险的儿童被招募来参加这项研究。妈妈在怀孕的第5个月前被招募进来，儿童被监控直到12个月。从出生到1岁或者母乳喂养的儿童从断奶开始被给予FF或者SF。根据目前的建议，进行食物的监控是从怀孕的第5个月直到儿童第12个月时后期饮食的多样化。在儿童第一年的监控期间，符合食物过敏的症状被记录下来。
在4个月和12个月时同样进行系统性临床检查以及针对牛乳(CM)、大豆、鸡蛋、小麦、鳕鱼、花生、屋尘螨(D.pteronyssinus)、链格孢属(Alternaria)、猫、狗、以及草和桦树花粉的点刺试验(皮肤试验显示出对特定的过敏原的敏感性)。如果被怀疑是CMPA，中断牛乳蛋白的任何摄入并且进行针对CM的口服激发试验(OPT)。
129个儿童入选，其中115个被监控直到12个月，他们当中59个食用FF并且56个食用SF。115个病人中，83个呈现出符合食物过敏的症状(72.2％)。在FF组中，观察到的消化和呼吸的症状的百分比在统计上比SF组的低(p＜0.05)。这些结果显示在图2和图3中。
此外，对于这115个儿童，7％显示出对牛奶的致敏作用(阳性点刺试验)，在FF组和SF组之间(分别是1.7％和12.5％)具有显著差异(p＜0.05)(图4)。
这项研究第一次证明了经生物转化的配方奶粉的使用在预防出现食物过敏和对牛乳蛋白的致敏作用的症状上的价值。
FF也在前瞻性的、长期的、多中心的、开放研究项目期间被测试，评估在轻微的皮肤症状处理中此配方奶粉的价值。
与标准牛奶相比较，当用发酵的配方奶粉代替标准牛奶时，通过测定在母乳喂养的婴儿中轻微的皮肤症状的变化，这项研究评估特定的经生物转化的配方奶粉(Calisma)的作用。
4个月以下的健康的母乳喂养的婴儿，显示相当于首次症状发作的过敏型皮肤症状，这些婴儿被招募进来。显示的皮肤症状列在下面；脱皮、耳后裂痕、红斑、发痒。
在吃了经生物转化的配方奶粉一个月后，由儿科医生或通过父母来评估这些轻微的皮肤症状的变化(性质、部位和强度)。
35个儿童入选这项研究中。在吃了经生物转化的配方奶粉1个月后，有94％的儿童被观察到症状的好的变化，包括71％的儿童症状完全消失(图5)。
这些结果表明了产品在过敏种类的症状处理上的有效性。
实施例2：其他抗过敏组合物的制备
其他抗过敏组合物也可通过包括下面步骤的方法而获得：
a-在有氧或厌氧条件下和在大约30和40℃之间的温度下，包含至少短双歧杆菌I-2219菌株的双歧杆菌在pH大约是6和8之间的含水底物中接种和温育，并且底物至少包括以下成分：
i)乳清渗透物，
ii)乳清蛋白水解产物，
iii)乳糖
b-从含水底物中去除双歧杆菌；
c-含水底物在具有100和300kDa之间的截留的滤膜上超滤以便获得浓缩的滞留液；
在适当的时候用下面的步骤d-和e-进行补充：
d-浓缩的滞留液的脱水；
e-脱水的滞留液在缓冲液中的溶解。
最后，可以进行下面的步骤f-和g-以便从滞留液中获得活性组分：
f-柱凝胶排阻色谱分离，其具有滞留液溶液的600kDa排阻阈值；
g-在色谱分离结束时，排阻的组分和/或过滤的组分的回收。
更确切地说，产物可以使用如下所述的流程来获得。
制备的培养基包含以下成分：
-50g/l乳清渗透物，
-10g/l乳清蛋白水解产物，
-20g/l乳糖，
-2g/l酵母提取物，
-2.5g/l磷酸二氢钾，
-0.3g/l盐酸半胱氨酸，
-0.3g/l NaOH.
培养基是在PALL公司销售的
柱上超滤，柱体上配有截留是300kDa的聚醚砜膜，并且渗透物在120℃下高压灭菌30分钟。通过稀释一半的氨水溶液将培养基的pH值调整为6.5。
然后用双歧杆菌接种培养基，以6‰(v/v)的比率接种短双歧杆菌CNCM I-2219菌株的冷冻浓缩物，每毫升冷冻浓缩物包含1.1×1011CFU的双歧杆菌。初始的细菌种群是每毫升培养基中有3×108CFU的双歧杆菌。双歧杆菌在厌氧条件下、温度35和40℃之间培养。在培养期间，通过稀释一半的氨水溶液将培养基的pH调节为6.5。培养时间是15小时，并且在培养结束时双歧杆菌种群大约是每毫升培养基2×107CFU。
在培养结束时，通过在3000g下离心1小时，将细菌从发酵培养基中除去。通过在75℃下进行热处理3分钟，破坏离心上清液中含有的残留酶活性。
将上清液在大约40℃下在PALL公司销售的
柱上超滤，柱体上配有截留是300kDa的聚醚砜膜。上清液被浓缩3倍，然后用去离子水洗涤3次。在最后一次洗涤期间，通过膜保留的部分被浓缩了7倍。这样获得了称作为滞留液的浓缩物。通过冷冻干燥脱水滞留液，然后放置在pH 8的Tris-NaCl缓冲溶液中。
浓缩的滞留液，被预先放置在pH 8的Tris-NaCl缓冲溶液中，进行制备色谱分离。通过在Amersham生物科学公司销售的
200凝胶柱上的色谱法进行分离，此凝胶柱具有50mm的直径，100cm的长度，以每分钟5ml的流速进样，具有600kDa的排阻阈值。每10ml收集组分并且在280nm下测定它们的吸光度。
这样两个组分被分离：
-从凝胶上被排阻的组分具有大于600kDa的分子量(滞留时间130至180分钟+/-10％)，
-被过滤的组分，具有200与600kDa之间的分子量(滞留时间是187-370分钟+/-10％)。
被排阻的组分用蒸镏水透析，然后被稀释，以便回复到滞留液的浓度。那么这个组分可以以冷冻或冷冻干燥的形式被储存。被过滤的组分也可以以同样的方式被储存。
通过色谱分离法分离的滞留液或任何组分，以及它们的混合物，可用于预防、减轻或者治疗过敏型症状。
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Claims (14)
1.一种用于制备用以预防和/或治疗过敏型症状的组合物方法，其特征在于，使用了双歧杆菌菌株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌菌株来源于人的肠内菌群。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌菌株属于短双歧杆菌种类。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌菌株是菌株BBC50，于1999年5月31日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(CNCM)，编号是I-2219。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，它包括在所述双歧杆菌菌株存在的情况下发酵牛奶底物的步骤。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，它包括借助于所述双歧杆菌菌株的培养物对牛奶底物进行生物转化的步骤，该步骤通过保持所述底物与所述培养物接触、在不利于被所述菌株产生酸的条件下进行。
7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其特征在于，它包括在所述发酵或生物转化步骤结束时用于灭菌和/或分离所述双歧杆菌的步骤。
8.如在前权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物进一步包含来自于通过嗜热链球菌菌株对牛奶底物进行发酵的物质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述嗜热链球菌菌株是菌株ST065，于1995年8月23日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(CNCM)，编号是I-1620。
10.如在前权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物是保健食品，食品补充剂或药物组合物。
11.如在前权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，用于制备用于婴儿营养的组合物。
12.如在前权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，用于组合物的制备，该组合物是为了用于受过敏型症状折磨的个体、用于特异反应性的个体、或用于父母之一有过敏和/或特异反应性的易患病体质的儿童。
13.如权利要求11和12所述的方法，其特征在于，用于制备用于有过敏型皮肤症状的母乳喂养的婴儿的组合物。
14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其特征在于，用于组合物的制备，该组合物是为了用于预防牛乳蛋白过敏的出现。
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