CN101845433B - 一种聚氨酯纳米纤维固定化酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚氨酯纳米纤维固定化酶的制备方法,其特征在于通过如下步骤制备:(1)以聚氨酯为原料,以一定配比的N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃为溶剂,或者以二甲基乙酰胺为溶剂,添加一定比例的LiCl制得电纺液,通过静电纺丝制备出聚氨酯纳米纤维;(2)通过物理吸附的方法将惰性蛋白质吸附在纤维表面,获得表面改性的聚氨酯纳米纤维;(3)利用戊二醛作为交联剂,通过共价键结合的方法将酶固定化在表面改性的纳米纤维上。利用本发明的方法将酶固定化在聚氨酯纳米纤维上,可以有效提高酶的稳定性,尤其是该发明制备的固定化酶具有在有机溶剂中失活或者在高温下失活后,重新放置于缓冲溶液中能够逐步恢复大部分活性的特性,从而使其在有机溶剂中或者高温条件下具有更好的稳定性和更长的使用寿命,并且制备过程简单。
Description
技术领域:
本发明涉及利用聚氨酯纳米纤维膜固定化酶的制备方法,属于生物化工领域。
背景技术:
固定于固体材料上的酶由于具有催化剂回收容易、反应器设计更灵活以及产品纯化相对简单的优点,是生物催化剂应用的主要形式。人们采用多种化学或者物理的方法将酶固定到各种无机或有机的固体载体上,或者包埋酶于中空纤维或微胶囊中,或者通过共价键使酶交联。在众多因素当中,载体材料的结构和表面性质、以及酶与材料的结合方式对于固定化酶的性能至关重要。研究者们一直致力于优化载体材料的结构以制备更为有效的生物催化剂。纳米结构材料可以最大限度地解决比表面积、传质阻力、以及有效酶负载量之间的矛盾。
与其它形态的纳米结构材料,如纳米粒子、纳米管等相比,一维纳米结构的纳米纤维的表面积/体积之比可以达到同样直径等量纳米粒子材料的2/3,并且可以以团状、片状或者分散的纤维形态被方便地利用,或者结合在其它材料的表面或者进行共混,因此除了可以极大克服纳米粒子从反应体系中分离和重复利用困难的缺点外,对于反应器的设计也非常灵活方便,近些年来被广泛用作固定化酶的载体。自从2002年Jia等人(Jia HF,Zhu GY,Vugrinovich B,Kataphinan W,Reneker D H,Wang P.Biotechnol.Progr.2002,18:1027-1032.)首次报道利用静电纺丝法制备带有功能基团的聚苯乙烯纳米纤维,并用于共价固定化酶以来,人们已经开发出了多种制备具有生物活性纳米纤维的方法:(1)首先电纺得到带有活性功能基团的纳米纤维,再将酶通过共价键固定化在纳米纤维表面;(2)直接将酶和高分子聚合物共同置于溶剂中,静电纺丝进行共纺,直接得到含有酶的纳米纤维(Herricks TE,Kim S-H,Kim J,Li D,Kwak JH,Grate JW,Kim SH,Xia Y.J.Mater.Chem.,2005.14:3241-3245.);(3)将酶通过物理吸附固定化在纳米纤维的表面(Ye P,Xu Z-K,Wu J,Innocent C,Seta P.Biomaterials,2006,27,4169-4176.)。其中物理吸附法具有操作简单,但是存在酶容易脱落的问题,而且纳米纤维材料表面与蛋白质之间的非特异性相互作用可能会导致酶分子的构像发生改变,从而影响固定化酶的活性和稳定性。因此对纳米纤维进行表面改性以减少酶与纤维之间的非特异性相互作用,对固定化酶的催化性能是很有必要的。CN100371372C通过电纺丙烯腈/磷脂共聚物,得到磷脂改性的丙烯腈纳米纤维,并通过物理吸附的方法将酶固定化在纳米纤维膜上。美国专利US20070077567A1提供了一种首先将酶单分子层共价键固定化在聚(苯乙烯—马来酸酐)纳米纤维上,然后再利用戊二醛将更多的酶分子与第一层固定化好的酶分子进行交联,在纳米纤维表面形成酶聚集体。Huang等人利用胶原蛋白等生物大分子对聚(丙烯腈—丙烯酸)纳米纤维膜进行表面改性,并用于脂肪酶的固定化,结果表明改性后的纳米纤维固定化酶取得了更好的活性保留(Huang XJ,Yu AG,Jiang J,Pan C,Qian JW,Xu ZK,J.Mol.Catal.B:Enzym.,2009,57:250-256)。
虽然目前的报道中,固定化在纳米纤维上的酶的热稳定性和在有机溶剂中的稳定性都得到了不同程度的提高,但是都不具备活性恢复的性能,长时间在有机溶剂中或者高温下使用,酶的活性会连续不断地降低。因此开发一种具有活性恢复性能的生物催化剂,对于提高酶在有机溶剂或者高温下使用的寿命具有重要的意义。因此,本发明致力于开发一种具有活性恢复性能的固定化在纳米纤维上的生物催化剂,即当催化剂在有机溶剂中或者高温条件下使用导致活性损失后,将其放置于缓冲溶液中能够使其活性得到一定程度的恢复,从而提高其稳定性和使用寿命。同时本发明还提供一种制备这种具有活性恢复性能的催化剂的简单方法。
发明内容
针对大部分固定化酶在有机溶剂或者高温下使用活性会持续降低的问题,本发明的目的之一在于开发一种具有活性恢复性能的聚氨酯纳米纤维固定化酶。这种酶在有机溶剂或高温下失去大部分活性后,重新放置于水中或缓冲溶液中,能够逐步恢复部分活性。本发明还提供了制备这种具有活性恢复性能的聚氨酯纳米纤维固定化酶的方法。其特征在于通过如下步骤制得:
(1)聚氨酯纳米纤维膜的制备
将聚氨酯溶于有机溶剂中,配成重量百分比为10~20%的溶液,添加相对于聚氨酯重量1~5%的LiCl,充分溶解后,注入到静电纺丝装置中,在电压20~30千伏,喷丝头溶液流量为0.1-0.5毫升/小时、接收距离为10~20厘米的条件下进行静电纺丝,获得纤维直径为100~500nm的聚氨酯纳米纤维膜;将纳米纤维膜在60℃烘箱中干燥24h,再用去离子水中洗涤。
(2)利用蛋白质对聚氨酯纳米纤维膜进行表面改性
将聚氨酯纳米纤维膜投入到含有1~10mg/ml蛋白质的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在4~25℃下震荡2~12h,震荡速度为50~150转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。
(3)将酶固定化于蛋白质表面改性的聚氨酯纳米纤维膜上
将蛋白质表面改性的聚氨酯纳米纤维膜浸入到1含有0.1~2%戊二醛和0.1~5mg/ml酶的缓冲液中,在室温下震荡2~12h,震荡速度为50~150转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。
上述制备方法步骤1:聚氨酯纳米纤维膜的制备方法中,所用的有机溶剂可以是N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃按照体积比80∶20~20∶80组成的混合溶剂,优选体积比为70∶30,所用溶剂也可以是二甲基乙酰胺。
上述制备方法步骤2:利用蛋白质对聚氨酯纳米纤维膜的表面改性方法中,蛋白质通过物理吸附作用吸附在聚氨酯纳米纤维膜的表面,从而实现对纤维的表面改性。通过利用缓冲液充分洗涤后,改性的纳米纤维长期放置在缓冲液中也不会发生蛋白质的泄露。用于改性的蛋白质是牛血清白蛋白,鱼精蛋白中的一种,也可以是二者的混合物。
上述制备方法步骤3:将酶固定化于蛋白质表面改性的聚氨酯纳米纤维膜上的方法中,所用的酶为α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、及氯过氧化物酶中的一种。
本发明的优点是:
1)聚氨酯来源充分,成本低廉,可用于工业化生产;
2)聚氨酯纳米纤维的制备及其固定化酶的方法简单;
3)这种纳米纤维作为固定化酶的载体,易于从反应体系中回收和重复使用;
4)固定化在聚氨酯纳米纤维上的酶具有高的酶负载量、高的活性收率、高的稳定性,尤其是具有独特的活性恢复的性质,非常适合应用于有机相反应,以及高温条件下反应,具有较长的使用寿命;
具体实施方式:
下面以具体化的形式阐述本发明的实施方式,但本发明并不限制于该实施方式中。
1)聚氨酯纳米纤维膜的制备方法:将聚氨酯溶于有机溶剂中,配成重量百分比为10~20%的溶液,添加相对于聚氨酯重量1~5%的LiCl,充分溶解后,注入到静电纺丝装置中,在电压20~30千伏,喷丝头溶液流量为0.1-0.5毫升/小时、接收距离为10~20厘米的条件下进行静电纺丝,获得纤维直径为100~500nm的聚氨酯纳米纤维膜;将纳米纤维膜在60℃烘箱中干燥24h,再用去离子水中洗涤待用。
2)利用物理吸附的方法将无活性的蛋白质吸附聚氨酯纳米纤维膜的表面实现对其改性,具体的方法是将步骤(1)得到的聚氨酯纳米纤维膜投入到含有1~10mg/ml蛋白质的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在4~25℃下震荡2~12h,震荡速度为50~150转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。
3)利用戊二醛将酶共价偶联在表面改性的聚氨酯纳米纤维表面,具体的方法是将步骤(2)得到的蛋白质表面改性的聚氨酯纳米纤维膜浸入到含有0.1~2%戊二醛和0.1~5mg/ml酶的缓冲液中,在室温下震荡2~12h,震荡速度为50~150转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。
4)聚氨酯纳米纤维固定化酶在有机溶剂中的失活和活性恢复性能的测定:将步骤(3)所制备出的固定化酶置于无水甲醇中一定时间后取出,快速将有机溶剂吹干,测定剩余的活性。再将该纳米纤维酶置于缓冲溶液中,在室温下或4℃冰箱中保存,间隔一定时间测定固定化酶的活性。
5)聚氨酯纳米纤维固定化酶在高温下的失活和活性恢复性能的测定:将步骤(3)所制备的固定化酶置于40℃以上摇床中恒温震荡一定时间后取出测定剩余的活性。再将该纳米纤维酶置于缓冲溶液中,在室温下或4℃冰箱中保存,间隔一定时间测定固定化酶的活性。
6)本发明中纳米纤维的直径采用扫描电镜分析;纳米纤维上面的载酶量通过Bradford方法[Bradford,M.Anal.Biochem.1976,72:248-254.]检测并计算;固定化的α-胰凝乳蛋白酶的活性通过参考文献[Hummel,B.C.W.Can.J.Biochem.Physiol.1959,37,1393-1399.]方法进行测定;固定化脂肪酶的活性通过参考文献[Kwon Y.D.,Rhee J.S.JAOCS,1986,63,89-92.]的方法进行计算;固定化的氯过氧化物酶的活性[Morris,D.R.& Hager,L.P.J.Biol.Chem,1966,241,1763-1768.]参考文献的方法进行计算。
附图说明:
图1聚氨酯纳米纤维扫描电镜(SEM)照片
图中a为实施例2所制备的纳米纤维的SEM照片。b为实施例3利用牛血清白蛋白改性后的聚氨酯纳米纤维扫描电镜照片,c为实施例4利用鱼精蛋白改性后的聚氨酯纳米纤维扫描电镜照片。
图2固定化在纳米纤维上的酶在无水甲醇中失活后的活性恢复性能
图中α-胰凝乳蛋白酶为实施例3所制备,图中脂肪酶Lipase-Ak为实施例5所制备,图中氯过氧化物酶为实施例7所制备
具体实施例
实施例1 聚氨酯纳米纤维的制备
将聚氨酯溶于N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃按照70∶30的体积比组成的溶剂中,配成重量百分比为25%的溶液,添加相对于聚氨酯重量1%的LiCl,混合均匀后,注入到静电纺丝装置中,在电压25千伏,喷丝头溶液流量为0.5毫升/小时、接收距离为20厘米的条件下进行静电纺丝,得到直径为200~300nm的聚氨酯纳米纤维膜。
实施例2 聚氨酯纳米纤维的制备
将聚氨酯溶于N,N-二甲基乙酰胺中,配成重量百分比为20%的溶液,添加相对于聚氨酯重量1%的LiCl,混合均匀后,注入到静电纺丝装置中,在电压20千伏,喷丝头溶液流量为0.5毫升/小时、接收距离为25厘米的条件下进行静电纺丝,得到直径为100~150nm的聚氨酯纳米纤维膜。
实施例3 具有活性恢复性能的α-胰凝乳蛋白酶
将3mg聚氨酯纳米纤维膜投入到1ml含有5mg/ml牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在25℃下震荡2h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。通过物料衡算计算出牛血清白蛋白在纳米纤维上的吸附量为243mg/g膜。将上述3mg牛血清白蛋白改性的聚氨酯纳米纤维浸入到含有0.5%戊二醛和1.0mg/mlα-胰凝乳蛋白酶的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在4℃下震荡2h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。通过物料衡算计算出α-胰凝乳蛋白酶的负载量是52.5mg/g。
测定该实例中制备的负载在聚氨酯纳米纤维上的酶的活性恢复性能的实施方法:将酶膜放置于无水甲醇中2h后取出,利用氮气将甲醇吹干后,测定剩余活性为初始活性的35%。之后将酶膜在4℃下放置于Tris-HCl(pH 7.5)缓冲溶液中,间隔一定时间测定酶膜的活性。30min后,活性恢复至初始活性的60%。
另取一块该实例中制备的负载有α-胰凝乳蛋白酶的纳米纤维膜,将其放置于Tris-HCl(pH7.5)缓冲溶液中,在50℃摇床中保温2h后取出,测定剩余活性为初始活性的77%。之后将酶膜在4℃下放置于Tris-HCl(pH 7.5)缓冲溶液中,间隔一定时间测定酶膜的活性。2h后,活性恢复至初始活性的84%。
实施例4 具有活性恢复性能的α-胰凝乳蛋白酶
将3mg聚氨酯纳米纤维膜投入到1ml含有5mg/ml鱼精蛋白的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在25℃下震荡2h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。通过物料衡算计算出鱼精蛋白在纤维上的吸附量为150mg/g。将上述3mg鱼精蛋白改性的聚氨酯纳米纤维浸入到含有0.5%戊二醛和1.0mg/mlα-胰凝乳蛋白酶的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在4℃下震荡2h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。通过物料衡算计算出α-胰凝乳蛋白酶的负载量是42.8mg/g。
测定该实例中制备的负载在聚氨酯纳米纤维上的酶的活性恢复性能的实施方法:将酶膜放置于无水甲醇中2h后取出,利用氮气将甲醇吹干后,测定剩余活性为初始活性的10%。之后将酶膜在4℃下放置于Tris-HCl(pH 7.5)缓冲溶液中,间隔一定时间测定酶膜的活性。30min后,活性恢复至初始活性的20%。
实施例5 具有活性恢复性能的脂肪酶
将3mg聚氨酯纳米纤维膜投入到1ml含有5mg/ml牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在25℃下震荡2h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。通过物料衡算计算出牛血清白蛋白在纳米纤维上的吸附量为243mg/g膜。将3mg牛血清白蛋白改性的聚氨酯纳米纤维浸入到含有0.5%戊二醛和3.5mg/ml脂肪酶AK,蛋白酶的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在4℃下震荡2.5h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。脂肪酶AK的负载量为48mg/g。
测定该实例中制备的负载在聚氨酯纳米纤维上的酶的活性恢复性能的实施方法:将酶膜放置于无水甲醇中2h后取出,利用氮气将甲醇吹干后,测定剩余活性为初始活性的40%。之后将酶膜在4℃下放置于水中,间隔一定时间测定酶膜的活性。30min后,活性恢复至初始活性的85%。
实施例6 具有活性恢复性能的脂肪酶
将3mg聚氨酯纳米纤维膜投入到1ml含有2.5mg/ml牛血清白蛋白和2.5mg/ml鱼精蛋白的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在25℃下震荡2h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。通过物料衡算计算出两种蛋白在纳米纤维上的吸附总量为178mg/g膜。将3mg牛血清白蛋白改性的聚氨酯纳米纤维浸入到含有0.5%戊二醛和3.5mg/ml脂肪酶AK,蛋白酶的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在15℃下震荡2.5h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。脂肪酶AK的负载量为55mg/g。
测定该实例中制备的负载在聚氨酯纳米纤维上的酶的活性恢复性能的实施方法:将酶膜放置于无水甲醇中2h后取出,利用氮气将甲醇吹干后,测定剩余活性为初始活性的35%。之后将酶膜在4℃下放置于水中,间隔一定时间测定酶膜的活性。30min后,活性恢复至初始活性的78%。
实施例7 具有活性恢复性能的氯过氧化物酶
将3mg聚氨酯纳米纤维膜投入到1ml含有5mg/ml鱼精蛋白的磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.1M),在25℃下震荡2h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用磷酸盐缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。通过物料衡算计算出鱼精蛋白在纤维上的吸附量为150mg/g。将3mg鱼精蛋白改性的聚氨酯纳米纤维浸入到含有0.5%戊二醛和3.5mg/ml氯过氧化物酶的柠檬酸盐缓冲液中(pH4.5,0.05M),在4℃下震荡3h,震荡速度为100转/分钟。取出聚氨酯纳米纤维膜,用柠檬酸缓冲液充分洗涤直至清洗液中没有蛋白质被检测出。氯过氧化物酶的负载量为65.6mg/g.
测定该实例中制备的负载在聚氨酯纳米纤维上的酶的活性恢复性能的实施方法:将酶膜放置于无水甲醇中2h后取出,利用氮气将甲醇吹干后,测定剩余活性为初始活性的12.3%。之后将酶膜在4℃下放置于水中,间隔一定时间测定酶膜的活性。30min后,活性恢复至初始活性的18%。
Claims (4)
1.一种聚氨酯纳米纤维固定化酶的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)聚氨酯纳米纤维膜的制备:
将聚氨酯溶于有机溶剂中,配成重量百分比为10~20%的溶液,添加相对于聚氨酯重量1~5%的LiCl,充分溶解后,注入到静电纺丝装置中,在电压20~30千伏,喷丝头溶液流量为0.1-0.5毫升/小时、接收距离为10~20厘米的条件下进行静电纺丝,获得纤维直径为100~500nm的聚氨酯纳米纤维膜;将纳米纤维膜在60℃烘箱中干燥24h,再用去离子水洗涤;
(2)利用蛋白质对聚氨酯纳米纤维膜进行表面改性:
将聚氨酯纳米纤维膜投入到含有1~10mg/ml蛋白质的pH7.0,0.1M磷酸盐缓冲液中,在25℃下震荡2~12h,震荡速度为50~150转/分钟;取出聚氨酯纳米纤维膜,用缓冲液充分洗涤,直至清洗液中没有蛋白质被检测出;所述蛋白质是牛血清白蛋白、鱼精蛋白或二者的混合物;所述蛋白质通过物理吸附作用吸附在聚氨酯纳米纤维膜的表面实现对其改性;
(3)将酶固定化于蛋白质表面改性的聚氨酯纳米纤维膜上:
将蛋白质表面改性的聚氨酯纳米纤维膜浸入到含有0.5%戊二醛和0.1~5mg/ml酶的缓冲液中,在4℃或15℃下震荡2~12h,震荡速度为50~150转/分钟;取出聚氨酯纳米纤维膜,用缓冲液充分洗涤,直至清洗液中没有蛋白质被检测出;所述缓冲液为pH7.0,0.1M的磷酸盐缓冲液或pH4.5,0.05M的柠檬酸盐缓冲液。
2.一种如权利要求1的制备方法,其特征在于所述步骤1)中的有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃按照体积比80∶20~20∶80组成的混合溶剂,或是二甲基乙酰胺。
3.一种如权利要求1的制备方法,其特征在于所述步骤1)中的有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃按照体积比70∶30组成的混合溶剂。
4.一种如权利要求1的制备方法,其特征在于所述步骤3)用于固定化的酶为α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶或氯过氧化物酶。
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