CN101836152A - 激光激发荧光显微镜 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高效激光激发荧光显微镜。因此，本发明的激光激发荧光显微镜包括激光源部件(10)，放射具有不同波长的至少两种激发光；集光部件(110)，将由激光源部件放射的两种激发光聚集在样本上；高功能二向色镜(22)，位于激光源部件和集光部件之间，反射由激光源部件放射的两种激发光，以使激发光入射在集光部件上，以及透射在样本上根据两种激发光生成的两种荧光；以及检测部件(50)，检测透过高功能二向色镜的光，其中，激发光和荧光相对于高功能二向色镜(22)的入射角θ满足公式0°＜θ＜45°。

Description

激光激发荧光显微镜
技术领域
本发明涉及设置有分离多种激发光和多种荧光的高功能二向色镜的激光激发荧光显微镜。
背景技术
当通过共焦激光扫描荧光显微镜，观察使用多种荧光染料在其上执行多重染色的样本时，将具有不同波长的多种激光用作激发光，以及使用用于分离激发光和根据激发光生成的多种荧光的二向色镜。二向色镜具有存在多个分离波长(从反射带到透射带的上升点)的波长特性。在本说明书中，具有多种分离波长的这种二向色镜称为“高功能二向色镜”。
图20中的实线所示的是在非专利文献1中公开的高功能二向色镜的透射比的波长特性曲线。通常，在其上形成电介质多层的玻璃基板用作高功能二向色镜。为通过高效率地使用电介质多层来分离多种激发光和多种荧光，仅要求设计成，在设计电介质多层的同时，提高反射带中的反射比和透射带中的透射比，以及抑制波长特性曲线的波动。
非专利文献1：Olympus Catalog，Confocal Laser ScanningMicroscope FV 1000 FLUOVIEW UIS2
发明内容
本发明要解决的问题
然而，当强烈地控制电介质多层的特性时，电介质多层的总膜厚度倾向增加。当总膜厚度大时，由于多层的应力，玻璃基板很可能变形，会使激光点的形状变形并降低荧光图像的空间分辨率。
此外，在图20中所示的波长特性曲线中，不可能完全地分离多种激发光和多种荧光，因此，存在例如浪费由该采样生成的一部分荧光以及降低荧光图像的检测灵敏度的可能性。
因此，本发明提供一种高效激光激发荧光显微镜。
本发明的激光激发荧光显微镜特征在于包括激光源部件，放射具有不同波长的至少两种激发光；集光部件，将由激光源部件放射的两种激发光聚集在样本上；高功能二向色镜，位于激光源部件和集光部件之间，反射由激光源部件放射的两种激发光，以使激发光入射在集光部件上，以及透射在样本处根据两种激发光生成的两种荧光；以及检测部件，检测透过高功能二向色镜的光，其中，激发光和荧光相对于高功能二向色镜的入射角θ满足公式0°＜θ＜45°。
注意激发光和荧光相对于高功能二向色镜的入射角θ最好满足公式10°＜θ＜25°。
此外，激发光和荧光相对于高功能二向色镜的入射角θ最好满足公式10°＜θ＜15°。
此外，激发光和荧光相对于高功能二向色镜的入射角θ最好为12°。
此外，在本发明的激光激发荧光显微镜中，高功能二向色镜的分离层最好由电介质多层形成。
此外，本发明的激光激发荧光显微镜的特征在于，包括激光源部件，放射具有不同波长的至少两种激发光；集光部件，将由激光源部件放射的两种激发光聚集在样本上；高功能二向色镜，位于激光源部件和集光部件之间，反射由激光源部件放射的两种激发光，以使激发光入射在集光部件上，以及透射在样本处根据两种激发光生成的两种荧光；以及检测部件，检测透过高功能二向色镜的光，其中，高功能二向色镜的反射比和透射比的波长特性曲线具有：覆盖两种激发光的一个的波长带的第一反射带；覆盖根据两种激发光的一个生成的荧光的一个的波长带的第一透射带；覆盖两种激发光的另一个的波长带的第二反射带；以及覆盖根据两种激发光的另一个生成的荧光的一个的波长带的第二透射带，其中，在第一反射带和第二反射带的每一个中的反射比为95％或以上；在第一透射带和第二透射带的每一个中的透射比为95％或以上；第一透射带的波长宽度T1和第二透射带的波长宽度T2分别为25nm或以上；以及从第一反射带到第一透射带的上升宽度A1和从第二反射带到第二透射带的上升宽度A2均为6nm或以下。
注意，第一透射带和第二透射带的每一个中的透射比在波长宽度的90％或以上的范围指示98％或以上的值。
此外，第一透射带和第二透射带间的间隙B为20nm或以下。
此外，激发光和荧光相对于高功能二向色镜的入射角θ最好满足公式0°＜θ＜45°。
此外，激发光和荧光相对于高功能二向色镜的入射角θ最好满足公式10°＜θ＜25°。
此外，激发光和荧光相对于高功能二向色镜的入射角θ最好满足公式10°＜θ＜15°。
此外，激发光和荧光相对于高功能二向色镜的入射角θ最好为12°。
此外，检测部件也可以检测透过高功能二向色镜的光的光谱。
附图说明
图1是显微镜系统的结构图。
图2是光谱检测单元600的结构图。
图3是说明高功能二向色镜22的透射比的波长特性曲线的图。
图4是在入射角θ为12°的条件下设计的高功能二向色镜的结构的图。
图5是图4的延续部分。
图6是在入射角θ为12°的条件下设计的高功能二向色镜的波长特性曲线(s偏振分量，p偏振分量)。
图7是在入射角θ为12°的条件下设计的高功能二向色镜的波长特性曲线(s偏振分量和p偏振分量的平均值)。
图8是示出在入射角θ为15°的条件下设计的高功能二向色镜的结构的图。
图9是图8的延续部分。
图10是在入射角θ为15°的条件下设计的高功能二向色镜22的波长特性曲线(s偏振分量，p偏振分量)。
图11是在入射角θ为15°的条件下设计的高功能二向色镜22的波长特性曲线(s偏振分量和p偏振分量的平均值)。
图12是表示在入射角θ为25°的条件下设计的高功能二向色镜22的结构的图。
图13是图12的延续部分。
图14是在入射角θ为25°的条件下设计的高功能二向色镜22的波长特性曲线(s偏振分量，p偏振分量)。
图15是在入射角θ为25°的条件下设计的高功能二向色镜22的波长特性曲线(s偏振分量和p偏振分量的平均值)。
图16是表示在入射角θ为45°的条件下设计的高功能二向色镜22的结构的图(比较例子)。
图17是图16的延续部分。
图18是在入射角θ为45°的条件下设计的高功能二向色镜的波长特性曲线(比较例子)(s偏振分量，p偏振分量)。
图19是在入射角θ为45°的条件下设计的高功能二向色镜的波长特性曲线(比较例子)(s偏振分量和p偏振分量的平均值)。
图20是在非专利文献1中所公开的高功能二向色镜的透射比的波长特性曲线。
具体实施方式
在下文中，将描述本发明的实施例。本实施例是共焦激光扫描荧光显微镜系统的实施例。
首先，将说明显微镜系统的结构。图1是显微镜系统的结构图。如图1中所示，显微镜系统包括激光器单元10、共焦单元100、显微镜本体110、检测单元50和未示出的控制单元。在上文中，激光器单元10和共焦单元100由光纤18光学地耦合，以及共焦单元100和检测单元50由光纤38光学地耦合。
使用多种荧光染料在其上执行多重染色过程的样本安放在显微镜本体100中。在此，为了简化，将用于染色的荧光染料的类型的数量设置为2，其中，假定使用其激发波长为405nm的第一荧光染料和其激发波长为488nm的第二荧光染料。随便说一下，第一荧光染料具有对应于其激发波长的长波长侧(约在430nm至470nm的范围中)的荧光波长，以及第二荧光染料具有对应于其激发波长的长波长侧(约在510nm至610nm的范围中)的荧光波长。
激光器单元10包括发出具有与第一荧光染料的激发波长(405nm)相同的波长的激光的激光源11、发出具有与第二荧光染料的激发波长(488nm)相同的波长的激光的激光源12、全反射镜15、组合镜(二向色镜)16、AOTF(声光可调谐滤光器)14和光纤耦合器17。随便说一下，由于个体差异，从激光源11发出的激光的波长具有波长400nm至415nm的变化宽度，以及基于相同的原因，从激光源12发出的激光的波长也具有波长486nm至490nm的变化宽度。
共焦单元100包括准直透镜21、全反射镜22A、高功能二向色镜22、光扫描仪(检流计扫描仪等等)23、光瞳投影透镜24、集光透镜27、针孔构件28和中继透镜34。在上述中，通过将电介质多层形成为玻璃基板上的分离层，提供高功能二向色镜22。
显微镜本体110包括集光透镜25、物镜26和未示出的支撑样本S的级。在将物镜26聚焦在样本S上的情况下，能使样本S、光纤18的出射端、针孔构件28和光纤38的入射端彼此光学共轭。
检测单元50包括准直透镜51、二向色镜52、发射滤光器53和56、集光透镜54和55以及光电倍增管(PMT)57和58。
在上述显微镜系统中，将激光器单元10、共焦单元100、显微镜本体110和检测单元50耦合到未示出的控制单元。在控制单元中，装配控制各个部件的控制电路、执行图像处理的计算电路等等。此外，控制单元经计算机耦合到输入设备和显示设备。
接着，将描述显微镜系统的操作。
在激光器单元10中，从激光源12发出的激光透过组合镜16，经AOTF 14和光纤耦合器17入射在光纤18上，并被导向共焦单元100。此外，在由全反射镜15反射后，由组合镜16反射从激光源11发出的激光，并被引向与从激光源12发出的激光共用的光路。注意，由AOTF14实施从激光器单元10导向共焦单元100的激光的波长选择和光强度调整。
在共焦单元100中，从光纤18的出射端发出的激光在由准直透镜21变成平行光束后，入射在全反射镜22A上。入射在全反射镜22A上的激光由全反射镜22A反射并入射在高功能二向色镜22上。
将高功能二向色镜22的分离波长设置成包括第一荧光染料的激发波长(405nm)的长波长侧和第二荧光染料的激发波长(488nm)的长波长侧(稍后将描述详情)。因此，由高功能二向色镜22反射包括在从激光源11发出的激光中的激发光(其波长为405nm)和包括在从激光源12发出的激光中的激发光(其波长为488nm)。
由高功能二向色镜22反射的激发光入射在光扫描仪23上。由光扫描仪23的两个可移动镜顺序地反射入射在光扫描仪23上的激发光并从光扫描仪23出射。从光扫描仪23发出的激发光经光瞳投影透镜24被导向显微镜本体110。
入射在显微镜本体110上的激发光经集光透镜25入射在物镜26上。由物镜26聚集入射在物镜26上的激发光来在样本S上形成激光点。如果在这种情况下，驱动光扫描仪23，则激光点二维扫过样本S。
在样本S上的激光点上生成荧光。荧光沿形成激光点的激发光的光路在相反方向中前进，并经物镜26、集光透镜25、光瞳投影透镜24和光扫描仪23，入射在高功能二向色镜22上。荧光相对于高功能二向色镜22的入射角与由全反射镜22A反射的激光相对于高功能二向色镜22的入射角相同。
如上所述，将高功能二向色镜22的分离波长设置成包括第一荧光染料的激发波长(405nm)的长波长侧和第二荧光染料的激发波长(488nm)的长波长侧(稍后描述详情)。因此，入射在高功能二向色镜22上的大量荧光透过高功能二向色镜22并被导向集光透镜27。
将入射在集光透镜27上的荧光聚集到针孔构件28的针孔。在聚集到针孔的荧光中，由针孔构件28截断入射在针孔外的区域上的不必要的光线，以及入射在针孔上的必要光线通过针孔构件28并被导向中继透镜34。入射在中继透镜34上的荧光入射在光纤38上并被导向检测单元50。
在检测单元50中，从光纤38的出射端发出的荧光由准直透镜51转变成平行光束并入射在二向色镜52上。将二向色镜52的分离波长设置成包括第一荧光染料的荧光波长(430nm至470nm)和第二荧光染料的荧光波长(510nm至610nm)间的波长。因此，在入射在检测单元50上的荧光之间，由二向色镜52反射由第一荧光染料生成的荧光(第一荧光)，以及由第二荧光染料生成的荧光(第二荧光)透过二向色镜52。
由二向色镜52反射的第一荧光经发射滤光器53和集光透镜54，入射在光电倍增管57上，以及透过二向色镜52的第二荧光经发射滤光器56和集光透镜55，入射在光电倍增管58上。这里，发射滤光器53、56的每一个是由电介质多层形成的干涉滤光器，以及是有选择地仅透过荧光波长并遮蔽具有其他波长的光的滤光器。为此，将发射滤光器53的透射波长带设置成430nm至470nm，以及发射滤光器56的透射波长带设置成510nm至610nm。这些滤光器遮蔽具有第一荧光染料的激发波长(405nm)以及第二荧光染料的激发波长(488nm)的光。因此，即使在样本S上的激光点反射的激光混合在荧光中并通过同一路径，也防止作为不必要的激光入射在光电倍增管57、58上。光电倍增管57，58的每一个与光扫描仪23一起地由未示出的控制单元控制，并生成表示入射光量的电信号。因此，在上述二维扫描的时段期间，由光电倍增管57反复生成的电信号表示由从样本S生成的第一荧光形成的荧光图像，以及在上述二维扫描的时段期间，由光电倍增管58反复生成的电信号表示由从样本S生成的第二荧光形成的荧光图像。经控制单元，这些荧光图像取入到计算机中，并显示在显示设备上并存储在计算机中的存储部件(硬盘驱动器等等)中。
注意在上述显微镜系统中，也可以使用图2中所示的光谱检测单元600代替检测单元50。如图2所示，光谱检测单元600包括准直透镜61、反射型光栅62、集光镜63，以及多通道光电倍增管64。光电倍增管64的光接收通道的数量是例如32。
在光谱检测单元600中，将从光纤38的出射端发出的荧光由准直透镜61转变成平行光束并入射在光栅62上。在对每一波长渐渐偏离的方向中，反射入射在光栅62上的荧光。各个波长的荧光入射在集光镜63上并由集光镜63反射。由集光镜63反射的各个波长的荧光被聚集在光电倍增管64的相互不同的光接收通道上，并分别转换成电信号。注意，尽管在样本S上的激光点反射的激光也混合在荧光中并通过同一路径，但是，由于具有不同于荧光的波长，其大部分被聚集在光电倍增管64的光接收通道外，并且不会转换成电信号。在上述二维扫描的时段期间由光电倍增管64反复生成的每一通道的电信号表示样本S的荧光光谱图像。经控制单元，将荧光光谱图像取入计算机中，并在显示设备上显示并存储在计算机中的存储部件(硬盘驱动器等等)中。
注意，接受荧光光谱图像的计算机也可以基于由试剂制造商公开的第一荧光染料的发射光谱数据和由试剂制造商公开的第二荧光染料的发射光谱数据，从荧光光谱图像分离(分解)由第一荧光形成的荧光图像和由第二荧光形成的荧光图像。
接着，将描述高功能二向色镜22。
如图1所示，将高功能二向色镜22的姿态设置成激光和荧光相对于高功能二向色镜22的入射角θ变为小于45°。位于高功能二向色镜22的前一级的全反射镜22A是设置成偏转高功能二向色镜22的入射光路的光偏转镜22。
如果如上所述，使入射角θ小于45°，高功能二向色镜22的反射-透射的波长特性变为不易由入射光的偏振方向而定。由于此，变得易于降低获得所需波长特性必要的电介质多层的总膜厚度。实际上，当使入射角θ小于45°时，能使高功能二向色镜22的电介质多层的总膜厚度减小到低于19.3193μm。
此外，由于电介质多层变薄，膜应力变弱，以及保持高功能二向色镜22的平坦，所以也优选地保持激光点的形状，导致高标准地保持荧光图像的空间分辨率。此外，与电介质多层的厚度的减小一致地，层数被降低，导致降低高功能二向色镜22的制造成本。
随便说一下，当入射角θ越小时，变得更易于降低电介质多层的厚度。例如，如果使入射角θ小于25°，总膜厚度能减小到低于13.43647μm，以及如果使入射角θ小于15°，能将总膜厚度减小到低于10.27728μm。此外，如果使入射角θ为12°，能将总膜厚度减少到9.42428μm。
然而，优选入射角θ不是太小，并且最小10°。这是因为，如果入射角θ等于或小于10°，则变得有必要确保从高功能二向色镜22到其周边中的光学元件(全反射镜22A或光扫描仪23)的大距离以防止滤去必要光线，导致增加共焦单元100的大小。
因此，在本实施例中，将入射角θ设置成在0°＜θ＜45°的范围内，优选在10°＜θ＜25°的范围内，并且最好在10°＜θ＜15°的范围内(例如，约12°)。
此外，在本实施例中，通过利用高功能二向色镜22的波长特性，变得易于控制，控制波长特性如下。
接着，将描述高功能二向色镜22的波长特性满足的条件。图3是说明高功能二向色镜22的透射比的波长特性曲线的图。
如图3所示，在高功能二向色镜22的波长特性曲线中，从短波长侧，按顺序排列第一反射带301、第一透射带401、第二反射带302和第二透射带402。
在上文中，第一反射带301覆盖两种荧光染料的一种荧光染料的激发波长，以及第二反射带302覆盖另一荧光染料的激发波长。
此外，第一透射带401覆盖两种荧光染料的一种荧光染料的荧光波长，以及第二透射带402覆盖另一荧光染料的荧光波长。
因此，第一反射带301和第一透射带401间的边界波长对应于高功能二向色镜22的一个分离波长，以及第二反射带302和第二透射带402间的边界波长对应于高功能二向色镜22的另一分离波长。
这里，第一反射带301中的反射比、第二反射带302中的反射比、第一透射带401中的透射比和第二透射带402中的透射比的每一个为95％或以上，以及第一透射带401的波长宽度T1和第二透射带402的波长宽度T2的每一个为25nm或以上。
因此，通过使用高功能二向色镜22，可以将两种荧光染料的每一激发光有效地引入到显微镜本体110中，以及还将由样本S产生的两种荧光的每一个有效地引入到检测单元50(或光谱检测单元600)中。因此，本实施例的显微镜系统能高灵敏度地检测两种荧光图像的每一个。
注意，为进一步增强检测灵敏度，最好是，第一反射带301中的反射比沿该带的波长宽度R1的90％或以上指示98％或以上的值，第二反射带302中的反射比沿该带的波长宽度R2的90％或以上指示98％或以上的值，第一透射带401中的透射比沿该带的波长宽度T1的90％或以上指示98％或以上的值，以及第二透射带402中的透射比沿该带的波长宽度T2的90％或以上指示98％或以上的值。
此外，从第一反射带301到第一透射带401的上升宽度A1为6nm或以下，以及从第二反射带302到第二透射带402的上升宽度A2为6nm或以下。具体地，从第一反射带301到第一透射带401的上升边缘和从第二反射带302到第二透射带402的上升边缘分别是陡的。
因此，即使两种荧光染料的任一或两者的斯托克斯位移试验性地短，也没有可能降低两种荧光图像的检测灵敏度。
此外，将第一透射带401和第二透射带402间的间隙B减小到20nm或以下。此外，由于如上所述，第一透射带401和第二透射带402的每一个中的透射比达到95％或以上，所以，可以认为，在第一透射带401和第二透射带402的每一个中不生成波动。
因此，在由光谱检测单元600(图2)检测到荧光光谱图像时，从样本S生成的荧光的几乎所有光谱被反射。由于此，高精度地执行上述分解。
此外，由于第一反射带301和第二反射带302的每一个中的反射比高达95％或以上，多余激光入射在检测单元50(或光谱检测单元600)上的概率低。
因此，检测单元50(或光谱检测单元600)能通过高SN比检测荧光图像(或荧光光谱图像)。由于作为防止不必要激光入射在多通道光电倍增管64上的手段的最有效手段，由电介质多层形成的干涉滤光器不能用在该单元中，并且因而难以通过高SN比检测荧光光谱图像，所以，尤其在光谱检测单元600中实现高效率。
接着，将描述高功能二向色镜22的实施例。
图4和5是表示在入射角θ为12°的条件下设计的高功能二向色镜22的结构的图。该结构为，在石英玻璃基板上，交替地形成由Nb2O5制成的电介质层和由SiO2制成的电介质层。注意图5是图4的延续部分。如图4和5所示，在入射角θ为12°的条件下，电介质多层的总膜厚度能减小到9.42428μm。
图6和7是在入射角θ为12°的条件下设计的高功能二向色镜22的波长特性曲线。图6分别地示出相对于s偏振分量的特性和相对于p偏振分量的特性，以及图7示出相对于s偏振分量的特性和相对于p偏振分量的特性的平均。如图6所示，在θ为12°的条件下，相对于p偏振分量的特性和相对于s偏振分量的特性间的变化小，因此，优选如图7所示的波长特性曲线的形状。注意，在此所述的“优选形状”是指具有小的波动的形状，其中，反射带中的反射比高，透射带中的透射比高，从反射带到透射带的上升边缘陡，以及透射带的每一个之间的间隙小。
图8和9是表示在入射角θ为15°的条件下设计的全功能二向色镜22的结构的图。该结构为，在石英玻璃基板上，交替地形成由Nb2O5制成的电介质层和由SiO2制成的电介质层。注意图9是图8的延续部分。如图8和9所示，在入射角θ为15°的条件下，电介质多层的总膜厚度能减小到10.27728μm。
图10和11是在入射角θ为15°的条件下设计的高功能二向色镜22的波长特性曲线。图10分别地示出相对于s偏振分量的特性和相对于p偏振分量的特性，以及图11示出相对于s偏振分量的特性和相对于p偏振分量的特性的平均。如图10所示，在θ为15°的条件下，相对于p偏振分量的特性和相对于s偏振分量的特性间的变化小，因此，优选如图11所示的波长特性曲线的形状，尽管不比在θ为12°的情形下更优。
图12和13是表示在入射角θ为25°的条件下设计的全功能二向色镜22的结构的图。该结构为，在石英玻璃基板上，交替地形成由Nb2O5制成的电介质层和由SiO2制成的电介质层。注意图13是图12的延续部分。如图12和13所示，在入射角θ为25°的条件下，电介质多层的总膜厚度能减小到13.43647μm。
图14和15是在入射角θ为25°的条件下设计的高功能二向色镜22的波长特性曲线。图14分别地示出相对于s偏振分量的特性和相对于p偏振分量的特性，以及图15示出相对于s偏振分量的特性和相对于p偏振分量的特性的平均。如图14所示，在θ为25°的条件下，相对于p偏振分量的特性和相对于s偏振分量的特性间的变化小，因此，优选如图15所示的波长特性曲线的形状，尽管不比在θ为15°的情形下更优。
图16和17是表示在入射角θ为45°的条件下(比较例子)设计的全功能二向色镜的结构的图。该结构为，在石英玻璃基板上，交替地形成由Nb2O5制成的电介质层和由SiO2制成的电介质层。注意图17是图16的延续部分。如图16和17所示，在入射角θ为45°的条件下，电介质多层的总膜厚度大，为19.3193μm。
图18和19是在入射角θ为45°的条件下(比较例子)设计的高功能二向色镜的波长特性曲线。图18分别地示出相对于s偏振分量的特性和相对于p偏振分量的特性，以及图19示出相对于s偏振分量的特性和相对于p偏振分量的特性的平均。如图18所示，在θ为45°的条件下，相对于p偏振分量的特性和相对于s偏振分量的特性间的变化大，因此，不优选如图19所示的波长特性曲线的形状。
从上述图4至图19，证明当入射角θ越小，电介质多层变得更薄，并且波长特性曲线的形状变得更优选。因此，很显然，只要通过使相对于高功能二向色镜22的入射角θ小于45°，能同时实现防止高功能二向色镜22的失真和高功能二向色镜22的高性能。
(其他特征)
注意在本实施例的显微镜系统中，最好，通过假定改变染色样本S的多种荧光染料(在这种情况下，两种)的组合的可能性，图1中所示的激光器单元10、高功能二向色镜22以及二向色镜52的每一个是可互换的。在这种情况下，在其上装配分别具有分离波长的不同组合的多种高功能二向色镜的转动架(轮状切换机构)装配在例如共焦单元100上。
随便说一下，通常，由于根据二向色镜的数量扩大轮的直径，所以使切换机构尺寸增加，但当如本实施例的显微镜系统中一样，相对于二向色镜的入射角θ小于45°时，也可以减小二向色镜的尺寸，并且由此能相应地减小切换机构的尺寸。
此外，在本实施例中，假定染色样本S的荧光染料的类型的数量为2，但也可以将数据增加至3个或更多。在这种情况下，能由激光器单元10发出的激光类型的数量被设置成三个或更多，高功能二向色镜22的分离波长的数量也设置成三个或更多，以及能由检测单元50检测的荧光图像的数量(或能由计算机分解的荧光图像的数量)也设置成三个或更多。即使如上当荧光染料的类型的数量为三个或更多时，仅通过使相对于高功能二向色镜22的入射角θ小于45°，也能获得与上述实施例相同的效果。

Claims (13)

1.一种激光激发荧光显微镜，包括：
激光源部件，放射具有不同波长的至少两种激发光；
集光部件，将由所述激光源部件放射的所述两种激发光聚集在样本上；
高功能二向色镜，位于所述激光源部件和所述集光部件之间，反射由所述激光源部件放射的所述两种激发光，以使所述激发光入射在所述集光部件上，以及透射在所述样本处根据所述两种激发光生成的两种荧光；以及
检测部件，检测透过所述高功能二向色镜的光，其中，
所述激发光和所述荧光相对于所述高功能二向色镜的入射角θ满足公式0°＜θ＜45°。
2.如权利要求1所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述激发光和所述荧光相对于所述高功能二向色镜的入射角θ满足公式10°＜θ＜25°。
3.如权利要求1所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述激发光和所述荧光相对于所述高功能二向色镜的入射角θ满足公式10°＜θ＜15°。
4.如权利要求1所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述激发光和所述荧光相对于所述高功能二向色镜的入射角θ为12°。
5.如权利要求1到4的任何一个所述的激光激发荧光显微镜，其中，
由电介质多层形成所述高功能二向色镜的分离层。
6.一种激光激发荧光显微镜，包括：
激光源部件，放射具有不同波长的至少两种激发光；
集光部件，将由所述激光源部件放射的所述两种激发光聚集在样本上；
高功能二向色镜，位于所述激光源部件和所述集光部件之间，反射由所述激光源部件放射的所述两种激发光，以使所述激发光入射在所述集光部件上，以及透射在所述样本处根据所述两种激发光生成的两种荧光，所述高功能二向色镜由电介质多层形成；以及
检测部件，检测透过所述高功能二向色镜的光，其中，
所述高功能二向色镜的反射比和透射比的波长特性曲线具有：
覆盖两种激发光的一个的波长带的第一反射带；
覆盖根据所述两种激发光的所述一个生成的所述荧光的一个的波长带的第一透射带；
覆盖所述两种激发光的另一个的波长带的第二反射带；以及
覆盖根据所述两种激发光的所述另一个生成的所述荧光的一个的波长带的第二透射带，其中：
在所述第一反射带和所述第二反射带的每一个中的反射比为95％或以上；
在所述第一透射带和所述第二透射带的每一个中的透射比为95％或以上；
所述第一透射带的波长宽度T1和所述第二透射带的波长宽度T2均为25nm或以上；以及
从所述第一反射带到所述第一透射带的上升宽度A1和从所述第二反射带到所述第二透射带的上升宽度A2均为6nm或以下。
7.如权利要求6所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述第一透射带和所述第二透射带的每一个中的透射比在所述波长宽度的90％或以上的范围指示98％或以上的值。
8.如权利要求6或7所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述第一透射带和所述第二透射带之间的间隙B为20nm或以下。
9.如权利要求6至8的任何一个所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述激发光和所述荧光相对于所述高功能二向色镜的入射角θ满足公式0°＜θ＜45°。
10.如权利要求6至8的任何一个所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述激发光和所述荧光相对于所述高功能二向色镜的入射角θ满足公式10°＜θ＜25°。
11.如权利要求6至8的任何一个所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述激发光和所述荧光相对于所述高功能二向色镜的入射角θ满足公式10°＜θ＜15°。
12.如权利要求6至8的任何一个所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述激发光和所述荧光相对于所述高功能二向色镜的入射角θ为12°。
13.如权利要求6至12的任何一个所述的激光激发荧光显微镜，其中，
所述检测部件检测透过所述高功能二向色镜的光的光谱。
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