CN101835804B - 生物质处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明开发了用于处理生物质的方法，所述方法使用设备在非压实状态下将生物质与稀释氨水混合物移动通过反应室。所述设备使用非压实活塞来移动生物质。将所得的经处理的生物质进行糖化以生产可发酵糖。

Description

生物质处理方法
政府权利声明
本发明由美国政府支持，受与能源部签署的合同号04-03-CA-70224和DE-FC36-03GO13146的约束。美国政府拥有本发明的必然权利。
发明领域
提供了一种处理生物质的方法，所述方法包括一种指定设备。该方法使用所述设备以非压实状态将生物质移动进入并通过反应器，其中实施在适度温度和压力下用稀氨水浸渍生物质并与其反应的处理方法。
背景技术
纤维质的和木质纤维质原料以及垃圾例如农业残余物、木材、林业垃圾、来自造纸业的淤渣、和市政及工业固体垃圾，提供了潜力巨大的可再生原料，用于生产有价值的产品如燃料和其他化学制品。由碳水化合物聚合物(包括纤维素、半纤维素、葡聚糖和木质素)组成的纤维质的和木质纤维质的给料以及垃圾一般用多种化学、机械和酶方法进行处理以释放主要的己糖和戊糖，它们然后能进行发酵以产生有用产物。
首先，将生物质原料进行处理以制备糖化酶更易利用的纤维质和木质纤维质材料的碳水化合物聚合物，该过程通常称为预处理。然后将预处理生物质在存在糖化酶的条件下进一步水解以在水解产物中释放低聚糖和/或单糖。用于从预处理生物质中生产可发酵糖的糖化酶通常包括一种或多种糖苷酶例如纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶、和淀粉水解糖苷酶，以及肽酶、脂肪酶、木素酶和/或阿魏酸酯酶。用于生物质处理的糖化酶和方法参见Lynd，L.R.等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66：506-577)。
期望有用于经济有效地大规模处理生物质的系统和/或方法。需要将生物质进行处理使之成为浓缩的高干重材料以经济地生产需要的高浓度可发酵糖，所述可发酵糖用于发酵成产品。因此，包括将生物质高干重部分移动通过反应器，同时保持处理化学品的透过能力和优化制备用于糖化的生物质的能力，此外还使用最少的化学品和能量输入来实施材料移动，这是生物质处理方法的一个挑战。还希望有包括低资本成本设备的方法。不需要搅拌或反应器旋转的反应器的方法可提供更低的资本成本设备和更低的能量输入。
已经描述了不需要搅拌或反应器旋转的系统和用于移动生物质通过反应器的具体设备。US4186658公开了用于传送颗粒物质的设备，所述颗粒物质如木屑、麦秸、蔗渣、和其他纤维材料，该设备将所述物质压实成一种固体“块”状。用螺杆传送器将所述材料进行预压，并用往复活塞进一步压实。压实的块状物非常致密使得它能够有效地防止系统中的倒吹。然后可将所述块给料到设备中用于材料加工。生物质材料致密块将不能使预处理反应物实现最佳的穿透性。
同样的，US4136207公开了用于制备具有提高反刍动物消化性的纤维素材料的方法，该方法从机械压实所述材料开始。然后它在不存在化学试剂的情况下经过高压蒸汽处理，并进一步压实以形成生物质固体块，它阻止蒸汽通过入口逸出。然后排出小部分材料，使之迅速降低压力。将生物质压实成块状将不能使预处理中使用的化学试剂实现最佳的穿透性。
US6176176公开了用于处理纤维素材料的设备，该设备使用安装在挤出机圆筒中的可旋转螺杆。将加压液氨装入圆筒中，并与木质纤维质材料在圆筒中混合，然后使其通过加热模头排出圆筒，液氨变成气体，使得含氨的木质纤维质材料发生爆炸性膨胀。在大规模商业方法中使用挤出机将是非常昂贵的，因此不能提供经济型方法。
在共有的和共同未决的US NA11/402757中公开了用于处理生物质以生产可发酵糖的方法，该方法使用低强度氨水预处理高浓度生物质。
因此需要用于处理生物质的系统和/或方法，其将高干重生物质移动通过低成本的反应器，同时使得化学反应物具有最大穿透性以将生物质预备用于糖化。
发明概述
本发明提供用于在糖化前处理生物质的方法、通过本发明的方法预处理的生物质、以及包含随后通过糖化该预处理生物质制备的可发酵糖的水解产物。在一个方面，用于处理生物质的方法，该方法包括：
a)提供生物质；
b)使用非压实喂料机将(a)的生物质装入设备中，所述设备包括：
i)圆柱形圆筒，该圆柱形圆筒具有配备有活塞的第一末端和配备有排放阀的第二末端；
ii)任选的支管，所述支管在一个支管末端连接到靠近圆柱形圆筒第一末端的圆柱形圆筒上，并且所述支管在未连接的支管末端具有可密封的阀门；
iii)圆柱形圆筒或支管中的至少2个可密封的端口；
iv)任选的阀门，所述阀门在圆柱形圆筒中将圆筒分成单独的第一室和第二室，所述第一室具有配备有活塞的圆筒第一末端，并且所述第二室具有配备有排放阀的圆筒第二末端；以及
v)连接至在圆筒第二末端的排放阀上的闪蒸槽；
其中将所述生物质装入到所述圆柱形圆筒中或任选地装入到连接至所述圆柱形圆筒的所述支管中；
c)关闭所述圆柱形圆筒和支管(如果存在的话)；
d)任选地经由圆柱形圆筒中的至少一个端口施加真空；
e)通过圆柱形圆筒或者支管中的所述至少一个端口加入含氨水溶液，加入的量相对于圆筒中生物质的干重为小于约12重量百分比，从而生成生物质和氨水的混合物，此外其中所述生物质的干重相对于所述生物质与氨水混合物的重量为至少约15重量百分比的高固体浓度，并通过所述圆柱形圆筒或支管(如果存在的话)中的所述第二端口加入蒸汽，以使圆筒内温度达到介于约85℃和约180℃之间。
f)关闭圆柱形圆筒和支管(如果存在的话)中的端口以提供不可渗透的室；
g)在所述不可渗透的室中保持所述生物质与氨水混合物在合适温度下一段时间，所述时间介于约30秒和约4小时之间；
h)任选地通过所述活塞的位移将所述生物质与氨水混合物移动到圆柱形圆筒中的第二室(如果存在的话)中，其中所述生物质不被压实，并保持介于约2分钟和4小时之间的一段时间；以及
i)通过所述活塞将所述生物质与氨水混合物移动通过(g)或(h)的所述不可渗透的圆柱形圆筒并通过排放阀进入到闪蒸槽中；
其中生产出经处理过的生物质。
在另一方面，用于处理生物质的方法，该方法包括：
a)提供生物质和含氨水溶液的混合物，其中生物质的干重相对于生物质与氨水混合物的总重为至少约15重量百分比，并且氨水的量相对于生物质的干重为小于约12重量百分比；
b)使用非压实喂料机将(a)的生物质与氨水混合物装入到设备中，所述设备包括：
i)圆柱形圆筒，该圆筒具有配备有活塞的第一末端和配备有排放阀的第二末端；
ii)任选的支管，所述支管在一个支管末端连接到靠近圆柱形圆筒第一末端的圆柱形圆筒上，并且所述支管在未连接的支管末端具有可密封的阀门；
iii)圆柱形圆筒或支管中的至少2个可密封的端口；
iv)阀门，所述阀门在圆柱形圆筒中将圆筒分成单独的第一室和第二室，所述第一室具有配备有所述活塞的圆筒第一末端，并且所述第二室具有配备有排放阀的圆筒第二末端；以及
v)连接至在圆筒第二末端的排放阀上的闪蒸槽；
其中将所述生物质装入到圆柱形圆筒的第一室中或任选地装入到连接至所述圆柱形圆筒的所述支管中；
c)关闭圆筒中的所述第一室和支管(如果存在的话)；
d)任选地经由所述至少一个端口施加真空；
e)通过第一室或支管中的至少一个第一端口(如果存在的话)加入蒸汽以使所述室内的温度达到介于约85℃和约180℃之间；
f)关闭第一室和支管(如果存在的话)中的端口以提供不可渗透的第一室；
g)在所述不可渗透的第一室中将所述生物质与氨水混合物保持在合适温度下一段时间，所述时间介于约30秒和约4小时之间；
h)任选地，通过活塞的位移将所述生物质与氨水混合物通过开启的阀门移动通过所述不可渗透的第一室进入到圆柱形圆筒中的第二室中，其中所述生物质不被压实，
i)任选地，关闭开启的阀门以形成第二不可渗透的室并保持生物质与氨水混合物介于约2分钟和约4小时之间的一段时间；以及
j)在步骤(g)或步骤(i)之后通过活塞的位移将所述生物质与氨水混合物移动通过排放阀进入到闪蒸槽中；
其中所述生物质不被压实并且以此生产出经处理的生物质。
本发明的附加方面涉及已经依照本发明的方法制备的处理生物质，以及包含通过糖化生物质制备的可发酵糖的水解产物，所述生物质已经通过本发明的方法进行了处理。
生物质指任何纤维质和/或木质纤维质材料，可包括生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、庭院垃圾、木材和林业垃圾或它们的组合。为了减小尺寸、增加暴露的表面积、和/或提高存在于生物质中的纤维素、半纤维素和/或低聚糖的可及性，可在步骤(a)之前对生物质施加能量。
附图说明
图1为用于本发明的设备的一个实施方案的示意图。
图2为用于本发明的设备的第二实施方案的示意图。
图3为用作排放阀的渐进扩展文丘里管的一个实施方案的示意图，所述阀门关闭。
图4为图3的渐进扩展文丘里管的实施方案的示意图，所述阀门开启。
图5为V型端口阀门渐进扩展文丘里管的一个实施方案的示意图。
图6为旋启式止回阀渐进扩展文丘里管的一个实施方案的示意图，所述阀门在A中关闭，在B中开启。
发明详述
申请人特别将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开内容中。此外，当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体数值。
本发明提供用于处理生物质以使其经过糖化来生产可发酵糖的方法。所述糖可经过发酵以生产有价值的产品如燃料和其他化学制品。通过预处理、糖化和发酵步骤，可使用可再生的生物质(包括垃圾生物质)来生产有价值的化学制品，该化学制品可减少对油的需求。
定义：
在苯公开中使用了许多术语。给出了如下定义。
“生物质”指任何纤维质或木质纤维质材料，包括包含纤维素的材料，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包括附加组分如蛋白质和/或脂质。如本发明所述，生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如生物质可包括玉米芯和玉米秸秆或纤维的混合物，或草和叶的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米粒、玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱杆、大豆外壳或秆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和反刍动物动物粪肥的研磨物的组分。在一个实施方案中，用于本发明的生物质包括具有相对较高碳水化合物值的生物质，它们相对密集，和/或相对易于收集、运输、贮存和/或处理。在本发明的一个实施方案中，可用的生物质包括玉米芯、玉米秸秆、玉米纤维和蔗渣。
术语“可发酵糖”或“糖”指能易于被发酵成目标化学制品的低聚糖和单糖。
术语“木质纤维质”指包含木质素和纤维素的材料。木质纤维质材料也可包含半纤维素。
术语“纤维质”指包含纤维素的材料。
术语“糖化”指从多糖中生产可发酵糖。
生物质的“干重”是指移除全部或基本上全部水分后的生物质重量。干重通常依照美国材料与试验协会(ASTM)标准E1756-01(Standard TestMethod for Determination of Total Solids in Biomass)或纸浆与造纸工业技术协会，Inc.(TAPPI)标准T-412om-02(Moisturein Pulp，Paper and Paperboard)进行测量。
“含氨水溶液”指在含水介质中使用氨气(NH3)、包含铵离子的化合物(NH4 +)如氢氧化铵或硫酸铵、当降解时释放氨的化合物如尿素、以及它们的组合。
术语“处理”指反应物作用于材料的过程，其中改变了所述材料的物理和/或化学性质。
术语“反应物”指能够在处理方法使用的条件下改变目标材料的物理和/或化学性质的组合物。
用于糖化的“酶聚生体”是能作用于生物质混合物以生产可发酵糖的酶的组合。通常糖化酶聚生体可包括一种或多种糖苷酶，所述糖苷酶可选自纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶和淀粉水解糖苷酶。糖化酶聚生体中的其他酶可包括肽酶、脂肪酶、木素酶和阿魏酸酯酶。
关于生物质的术语“处理”或“预处理”与以下方法相关。用反应物来处理生物质以形成经处理的生物质产品，也可将其称作处理以形成预处理生物质或预处理以形成预处理的生物质。使用“预”来区分在糖化生物质之前进行的生物质处理。
生物质处理方法
在共有的和共同未决的US NA专利申请#11/402757中公开了用于处理生物质以生产可发酵糖的方法，该方法包括使用低强度氨水来预处理高浓度生物质。申请人已经开发了使用低强度氨水和高生物质浓度条件来有效处理生物质的新方法。申请人发现，本发明的方法令人惊讶地很成功，这是因为避免在任何阶段压实生物质，并因此使得在包括生物质压实的系统中处理反应物具有对生物质改善的穿透性。在其中压实生物质的系统中，能够消除生物质的压实状态，改善其与处理反应物的反应，但这需要高能量输入并因此提高了所述系统的成本。在本发明的方法中，不需要消除压实状态的步骤或方法。
为了降低大规模生物质处理的成本，已经开发了本发明的方法，其中在非压实状态下将生物质加入到固定设备中，并将其在非压实状态下移动通过该设备。通过保持生物质的非压实状态，不压碎生物质材料的天然小孔和通道。在本发明的方法中使用的处理反应物包括氨水和蒸汽。这些反应物能够穿过非压实的天然生物质的小孔和通道，对生物质的纤维质和木质纤维质材料提供迅速完全的效应。该处理方法高效生产处理生物质，所述生物质经过有效糖化以生产可发酵糖，因此它导致每酶剂量和单位反应时间内生物质碳水化合物到解聚糖的高转化率。
参考图1和图2中的示意图可最好地理解本发明的生物质处理方法，所述示意图显示活塞/圆筒型设备的两个实施方案，以及以下在本发明处理方法中使用该设备的描述。为图示清楚起见，这些附图进行了简化，其中省略了一些元件如图3和图4中的凸缘。图1中的设备是测试规模的反应器。它包括水平的圆柱形室(10)，所述圆筒室具有开放式第一末端以用于加入生物质(11)，加入生物质后通过插入可移动塞(12)将其密封，将该可移动塞用作某种类型的活塞。圆柱形室具有第一可密封端口(13)以用于加入含氨水溶液、第二可密封端口(14)以用于将蒸汽加入到圆柱形室的生物质中、以及第三可密封端口(15)以用于施加真空。注入蒸汽来提高生物质与氨水混合物的温度以用于处理反应。隔热夹套(16)覆盖所述圆柱形室。
在装入生物质、施加真空、以及加入含氨水溶液和蒸汽之后，密封端口(13、14、和15)并保持所需温度。在一段时间后，通过移动阀门轴(19)开启圆柱形圆筒第二末端(18)中的以前关闭的排放阀(17)。阀门轴延伸穿过在邻近闪蒸槽(21)中的向下的内部分离弯管(20)中的孔，并穿过在闪蒸槽远侧的填料压盖(22)直至致动器(23)。通过将圆柱形圆筒第一末端的塞子朝第一末端移动，把生物质与氨水混合物挤过排放阀(17)。生物质通过排放阀并通过弯管(20)进入到闪蒸槽(21)中。覆盖在闪蒸槽底部开口的上盖(24)允许通向预处理生物质。在闪蒸槽顶部的端口(25)允许蒸汽逸出，并通过管子(26)连接到冷凝器(27)上。
本文实例中的图1所示设备及其在本发明的处理方法中使用的实施方案在下文中进行进一步描述。筒式活塞反应器由配备有水平取向活塞的5.1cm×68.6cm的不锈钢圆筒组成。用四个O形环将活塞密封到筒上，并在排放期间在活塞背面用氮气为活塞加压(最多约5600kPa)。68.6cm的圆筒配备有八个多用途端口，沿着顶部表面和底部表面各4个，它们允许用真空、氨水注射、蒸汽注射、和插入热电偶的方法测量筒内温度。反应器圆筒配备有蒸汽夹套用于圆筒的均匀加热。将反应器圆筒直接连接到垂直取向的15.2cm×61cm的不锈钢闪蒸槽上。通过锥形喷嘴和底座末端剪切阀排列从闪蒸槽上分离圆筒。末端阀剪切模头的直径是3.5cm。锥形喷嘴和底座上的背压是可调的，大多数测试使用～138kPa(测量压力)的背压进行，使其进入10.2cm直径的空气圆筒中，该圆筒与末端剪切阀的锥形嘴相连。末端剪切阀门的锥形嘴能缩回最多1.6cm，允许排放闪蒸槽中的颗粒。末端剪切阀出口的弯管引导处理固体向下进入到闪蒸槽的底部，其中所述固体可通过打开槽底部的圆顶螺栓轻易移除。闪蒸槽的上部汽室凸缘加入一个具有被加工成与闪蒸槽轴线呈直角的狭槽的特殊出口，这引起释放的蒸汽沿着拐角路径进入到排出装置中，有助于防止产生的生物质颗粒遗留和水滴进入到排气冷凝器中。沿着闪蒸槽加上三个带状电加热器(设为60℃)和隔热物，使得热处理的固体闪蒸到加热容器中，更好的模拟商业规模的方法。
在另一个实施方案中，如上所述构建小型筒式活塞反应器，它除了具有45.7cm的圆筒之外，无蒸汽夹套、三个带状电加热器、覆盖有充满硅氧烷的玻璃纤维夹套的2.5cm厚作隔热用的玻璃纤维垫、以及三个多用途端口。其他部件包括用于大型圆筒活塞反应器的闪蒸槽、剪切阀门、和弯管。
图2所示的设备是商业规模的反应器设计。它包括在第一末端(33)装配有活塞(34)并在第二末端(41)装配有排放阀(40)的水平圆柱形圆筒。圆筒进行了隔热处理并具有不可渗透的壁。将支管(31)连接到靠近第一末端处，并且将阀(35)即进料阀定位于支管的未连接末端。将料斗(30)连接到支管的阀门末端。通过料斗加入生物质。可以用非压实的流动引导装置来控制从料斗(30)将生物质加入到支管(31)中。支管具有第一密封端口(36)和第二密封端口(37)，它们用于当氨水和蒸汽移动到圆柱形圆筒中时，将其加入到支管中的生物质中。第二阀门(38)将圆筒分成第一圆柱形室(32)和第二圆柱形室(39)。生物质与氨水混合物通过支管进入第一室，其中通过加入蒸汽达到所需的温度和压力。将活塞移动通过不可渗透的圆筒来推动生物质和氨水混合物从第一室通过开启的第二阀门(38)进入第二室，并将第二室(39)的内容物通过开启的排放阀(40)转移到闪蒸槽(42)中。第二室的内容物是以前移动到该室中并保持在使用条件下处理反应必需时间的生物质与氨水混合物。然后关闭第二阀门(38)并拉回活塞(34)以便第一圆柱形室(32)能够再装载物质并重复循环过程。在闪蒸槽(42)中，生物质移动通过向下的弯管(43)。覆盖在闪蒸槽底部开口的上盖(44)允许通向预处理生物质。在闪蒸槽顶部的端口(45)允许氨蒸汽逸出，并通过管子(46)连接到冷凝器(47)上。
可使用碳钢或不锈钢制造该设备。圆柱形圆筒可以如图1和2所示是水平式的，或者可以是竖式的。如图2所示的具有竖式圆筒的支管和料斗将进行改装以允许将生物质装入到圆筒室中，例如在小于90度的角度。本领域的技术人员将能够容易地配置该具有竖式圆筒的设备。例如，可将竖式圆筒定位在闪蒸槽上面并进行连接，该连接不通过向下的弯管，因为流经排放阀将已经向下定向了。确定闪蒸槽是竖式的还是水平式的也在本领域技术人员的能力范围内。在本发明的方法中竖式槽更适合氨处理，它有利于移除和捕集闪蒸槽中释放的氨气。
图1和2中的两个实施方案功能相似，加入生物质并使其在非压实状态下移动通过反应器。具有一个室的图1的实施方案是一次加工一个生物质样本的分批系统。图2的实施方案具有通过阀门分开的两个室，允许半连续或分批补料运行，其中同时进行多次生物质装载。在该第二实施方案中，第二室满载荷之后，其中每个连续生物质装载进入第二室的每个活塞位移循环伴随通过排放孔来排放对应的体积。第二室中一定时间内活塞位移循环的次数，以及因此的第二室尺寸，与每个生物质样本所需的停留时间有关。停留时间在下文中与参照本发明方法处理的温度和时间进行进一步讨论。
本发明的方法尤其适合处理相对于处理反应的生物质、氨水和蒸汽混合物重量的生物质干重较高的生物质。期望的是处理高干重浓度的生物质以提供糖化后将生产高糖浓度水解产物的生物质。提供上述生物质的本发明方法的特点是不挤压，因此允许有效处理高干重浓度的生物质。本发明的方法使用的生物质的初始干重为生物质与氨水混合物总重的至少约15％。更典型的，生物质干重为至少约20％并可以是为至少约30％，45％，50％，或更高。生物质的干重百分比可以变化，并且不同类型生物质的最佳百分比可以不同。例如，当使用玉米芯时，期望至少约24％的干重百分比，以提供糖化的预处理生物质来生产浓度足以发酵成乙醇的可发酵糖。更合适的是至少约30％的玉米芯生物质。本领域的技术人员易于决定用于生产高糖水解产物的本发明方法中的特定类型生物质的优选干重百分比。
可直接使用获取自来源的生物质，或施加能量到生物质上以减小尺寸、增加暴露的表面积、和/或提高存在于生物质中的纤维素、半纤维素和/或低聚糖的可用性。用于此目的的能量设备包括那些不压碎或压实生物质的设备，以便不破坏生物质的超微结构。例如，可切碎、剁碎、或削碎生物质。当以不压碎超微结构的方式剪切生物质时也可使用颚式破碎机。在以本发明的方法预处理之前也可使用齿状盘式精炼器来减小生物质尺寸。
在本发明的处理方法中使用非压实喂料机将生物质移动到圆柱形圆筒中。在最简单的情况下，非压实喂料机指用手将生物质装入到圆柱形圆筒的开启的第一末端中。如果在圆筒中有两个室，可装载到第一室中。该方法描述于本文实施例中，使用如图1所示的反应器。在图2的反应器中示出的非压实喂料机是料斗。料斗可以是自卸式，和/或可配备有不提供压实力的流动引导装置。例如可使用多种类型的活底箱导流轮，随后是流量计量输送器如多种类型的牵引链、链斗升降机、或螺旋旋转输送器(如Acrison
Figure GPA00001032437900111
装置)。在第一圆柱形室中装入的生物质的量是有限的，以便留出允许生物质膨胀的空间，所述膨胀可能在加入氨水和蒸汽时发生。
可将真空加入到包含生物质的圆柱形圆筒上。如果在圆筒中有两个室，可将真空施加于包含生物质的第一室。通常如果施加真空，则压力减少至小于约20kPa。通过圆柱形圆筒或者支管中的一个或多个端口将含氨水溶液加入，加入的量使得氨相对于室中生物质的干重为小于约12重量百分比。更适合使用分布好的一个以上的端口以便氨溶液基本上平均分配到生物质中与其接触。如果在圆筒中有两个室，将氨溶液加入到包含生物质的第一室中。更合适加入氨的量也可以是相对于室中生物质的干重介于约4％和约6％之间。可预热氨溶液，这将有助于提高生物质的温度。在一个可供选择的实施方案中，氨水溶液在装入第一圆柱形室之前与生物质混合。生物质和氨水可在容器中混合并装入到第一圆柱形室中。例如，可将氨水泵入并通过一个内嵌式加热器，然后进入包含生物质的桨式搅拌器中。然后将生物质与氨水混合物装入第一圆柱形室中，其中在关闭室后注入蒸汽。作为另外一种选择，可预混生物质、氨、和蒸汽并把它们加入到第一圆柱形室中。在下文所述的温度和压力下，许多氨水将蒸发成蒸汽，蒸汽渗透到进行预处理的生物质中。此外，可将收集自闪蒸槽的循环湿氨蒸汽注入以形成总加入氨的一部分。
在本发明的方法中，含氨水溶液也任选地包含至少一种附加的碱，如氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、和碳酸钾。可加入所述至少一种附加碱，加入的量相对于生物质干重为最多10重量百分比。例如可利用附加碱来中和生物质中的酸，从而提供金属离子以用于糖化酶或发酵培养基。
因为在本发明的方法中生物质未被压实，它不会阻塞蒸汽通道，而在使用压实生物质的系统中则会阻塞蒸汽通道。因此加入蒸汽的室在蒸汽注入前关闭。密封除一个或多个加入蒸汽的端口之外的其他端口。将圆筒第一末端的活塞或作为活塞使用的塞子就位并关闭阀门。使用的阀门可以是任何开启或关闭型阀门，如提升阀或旋转刀闸阀。
通过圆柱形圆筒中的一个或多个阀门或者支管将蒸汽加入，需要加入的蒸汽量能提高生物质与氨水混合物温度至所需温度点。如果在圆筒中有两个室，则将蒸汽加入到包含生物质的第一室中。更合适的是使用一个以上的端口，并且端口间有一定间距，以便蒸汽分配到生物质中与其接触。加入蒸汽以使生物质与氨水混合物的温度提高至介于85℃和约180℃之间。如需要的话，可通过第二圆柱形室(如果存在的话)中的端口加入附加蒸汽以保持所需温度。所述设备可包括加热夹套、蒸汽夹套、带状加热器、或隔热夹套以利于提高和/或保持温度。加热夹套或蒸汽夹套尤其适合小型反应器，而隔热夹套适合大型反应器。加热可在不同阶段进行，包括在处理或预处理前预热圆筒。
在低于85℃的温度下，用低强度氨水进行处理所需的时间将非常长。处理所需的时间随温度升高而减少。例如，在85℃下进行处理可能需要的时间介于约两小时和约四小时之间，而在180℃下进行处理可能仅需几分钟。在图2反应器中使用的分批给料循环功能需要足够的时间来进行多次给料。因此期望选择用于有时间限制的时间和温度组合，该组合的时间足够使用反应器的实施方案发挥功能，而适中的温度可提供经济型方法。在适中温度下，可使用成本更低的低压蒸汽。更合适的条件是在介于约120℃和约160℃的温度下处理介于约60分钟和约5分钟之间，时间随着温度升高而减少。尤其合适的条件是在介于约140℃和约150℃的温度下处理介于约30分钟和约10分钟之间，时间随着温度升高而减少。要预处理的生物质的类型也能影响本发明的方法中处理的最佳时间和温度，本领域的技术人员能够容易地对其进行评估。
反应器室中的生物质保持在所需温度的时间是停留时间。当使用只有第一室的反应器时，则停留时间发生在第一室中。当使用具有第一室和第二室的反应器时，则第一室中的时间仅仅足以在将混合物移动至第二室之前使生物质和反应物结合，停留时间发生在第二室中。在该情况下，第一室中的时间可以是约30秒，第二室中的时间可以介于约2分钟和4小时之间。
在本发明的方法中使用蒸汽使生物质达到所述温度导致反应器室中压力介于约60kPa和约750kPa之间。更典型，压力介于约300kPA和600kPA之间。相对于其他已知的预处理方法如US 5037663所述的AFEX方法，其中使用1150kPa至4250kPa的压力，或者如US 4461648所述的使用蒸汽喷射的方法，其中使用约1800kPa至约5600kPa的压力(如本文图1所示)，这些压力是相对低的压力。在更适中的压力下运行本发明的方法提供成本较低的系统，因为可使用压力更低的蒸汽。
在本发明的方法中，在非压实状态下将生物质移动通过第一室和第二室(如果存在的话)。这可使用活塞和不可渗透的圆柱形室来完成。对于本公开内容而言，活塞可包括任何可用作活塞的制品，如推入室中的塞子，以及任何类型的标准活塞。可以使用任何施加足以移动生物质的压力的方法，将图1中例示的反应器类型的塞子推入室中。尤其合适的方法是在插入塞子后提供室末端的静态闭合，例如有螺栓的圆柱体头部，然后在闭合和塞子之间导入氮气以积聚压力并移动塞子。所述塞子可通过其他装置移动，例如使用连接到液压式、气动式、或电动式致动器上的推杆。
所述设备的圆筒是不可渗透的(闭合所有端口和阀门)，其中无未密封的壁渗透，因此液体不流出圆筒。液体保留使得活塞在不压实生物质的情况下移动它们。本发明的处理方法中的液体是有限的，它可润滑室壁，使得非压实的流动响应于活塞压力发生。事实上，活塞压力可临时轻微地挤压生物质，如同海绵一样，不把生物质挤压到小孔和通道塌陷的程度。移除活塞压力之后，生物质可再吸收液体进入不受挤压的小孔和通道中。为了帮助生物质流动，可将润滑液体如植物油皂导入室中。可通过在室内壁上制作膛线来提高流动性，其中加装不连续部分如成角的凹槽可减少摩擦，因此降低屈服应力并改善生物质流动性。非压实的生物质移动保持了处理生成的充满液体的孔，这会促进随后的糖化。
在本发明的方法中，在所需温度处理所需时间后，将生物质与氨水混合物移动通过圆柱形圆筒末端的排放阀进入到闪蒸槽中。生物质在所需温度与氨水反应期间关闭排放阀，然后开启排放阀使生物质通过。如图2所示，在活塞在第一室中产生压力之后，为了用第一室内容物置换第二室的全部内容物，在两室反应器中排放阀开启与在第一和第二室之间的阀门开启同时进行。
可使用的排放阀用V型端口回转阀、旋启式止回阀、和提升排放阀进行例示。如图1所示，在小型反应器中尤其有用的是活塞驱动的提升阀型排放阀，其中阀门底座的硬面上游侧是排放孔，而阀门底座的较软下游侧密封件靠着硬面的阀门压杆，当阀门压杆缩回开启阀门时，阀门底座以外的流动区域持续增加。
最合适的提升阀型排放阀将连接一个渐进扩展文丘里管。渐进扩展文丘里管提升阀的一个实施方案在图3中示出，该文丘里管排放阀适用于如图1所示的小型反应器。这个阀门加上圆锥形喷嘴和底座末端剪切阀排列。为了避免堵塞，设计如图3(关闭位置)和图4(打开位置)所示的渐进扩展文丘里管以加速固体通过文丘里管的固定外圆锥(50)和文丘里管的可移动内圆锥(51)之间的平稳扩大的间隙，其中将可移动内圆锥安装在阀门轴(52)的末端上。文丘里管外圆锥是夹在反应器室(54；等同于图1中的10)出口的凸缘(53)和闪蒸槽入口凸缘(55)之间的一般呈环形的文丘里管。文丘里管内圆锥(51)是在反应器出口阀门轴(52)末端的鼻形物。文丘里管内圆锥和阀门轴位于排放弯管(56；等同于图1中的20)内部，排放弯管位于闪蒸槽(57；等同于图1中的21)内部。将阀门轴连接到致动器(58)上以控制移动。致动器可以是能够前后平移动阀门轴的任何装置，如电动式、气动式或液压式马达、气动式阀门致动器、或液压式活塞。当阀门轴在其最远的左侧位置时，内圆锥底座的外边缘靠着外圆锥内边缘以在处理期间密封反应器的排放末端。当排放反应器的时候，向右移动阀门轴以提供闪蒸文丘里管所需大小的开口。
该设计提供一定长度的闪蒸区域，该区域在流动方向上平稳地扩展。在该设计中，生物质固体沿着渐进开口的环形锥形嘴的轴线加速，这避免了导致堵塞的突然径向扩展。
渐进扩展文丘里管的另一个实施方案在图5中示出，该文丘里管适合作为排放阀使用，尤其是在如图2所示的大型反应器中使用。这是V型端口旋塞的实施方案，其中将闪蒸扩展文丘里管机器加工到阀体中。在闪蒸文丘里管固定主体(70)中有从反应室(72)出口端开始的狭窄部分(71)和扩展至闪蒸槽(74)入口的扩展部分(73)。在旋塞的旋转中心(75)是成角度的开口(76)，它当在开口位置时与反应器室狭窄部分(71)对齐，并扩展至闪蒸槽(73)。将旋转中心(75)旋上一半以阻止靠近阀门的旋塞的对齐。
渐进扩展文丘里管的另一个实施方案在图6中示出，该文丘里管适合作为排放阀使用，尤其是在如图2所示的大型反应器中使用。这是旋启式止回阀的实施方案，它有锥形嘴(80)，适合在反应器室(72)和闪蒸槽(74)入口之间的狭窄接头(81)(图6A)。该锥形嘴位于连接到轴(83)的臂(82)上，所述轴穿过填料压盖直至回转阀致动器。该轴的旋转方向如虚线箭头所示，它逆时针旋转移动臂以开启接头，形成渐进扩展的文丘里管(图6B)。在用于渐进扩展文丘里管的旋启式止回阀的另一个实施方案中，锥形嘴的直径可以是若干英尺，它逆时针移动一段距离以开启仅有几英寸的阀门(小于8cm)。
生物质和氨混合物移动通过排放阀进入闪蒸槽中，该闪蒸槽能够保持真空。在闪蒸槽中氨从处理生物质中释放出来并冷却生物质，为糖化作准备。可使用任何典型的闪蒸槽，其具有切向或涡形入口，为分离弯管提供最合适的功能。尤其合适的是以不同压力依次施加数次闪蒸，以从预处理生物质中释放氨。例如，第一次闪蒸的压力接近大气压，通常移除大多数游离氨并将材料冷却至约100℃。第二次闪蒸压力小于约20kPa，移除剩余的游离氨并将材料冷却至约50℃，该温度是糖化所需的温度。
在闪蒸槽中从通过排放阀的生物质和氨混合物中释放的氨蒸汽可从闪蒸槽中回收，并可循环利用。来自低压闪蒸的蒸汽可以使用无中间冷却的标准蒸汽再压缩设备(如涡轮或蒸汽喷射泵)循环利用。因此氨蒸汽可不冷凝直接循环用于处理，或者可以在再使用前进行冷凝。在后一种情况下，将收集的蒸汽加到如图1所示的冷凝器中。
减少处理生物质中的氨将会降低pH并减少酸用量，所述酸用于调节pH使其达到令糖化酶活性使人满意的水平。这是令人期望的，因为大量加入酸可导致形成盐，其浓度对糖化酶或对微生物生长造成抑制。另一方面，生物质中残留的氨可作为氮源使用，以维持发酵期间微生物的生长。因此剩余的氨可减少或消除在发酵期间用氮源补充培养基的需要。通常移除至少一部分氨，这降低了pH但留下一些氮，这些氮用于为随后的发酵提供此种营养物质。
当预处理生物质在闪蒸槽底部积聚时，可以用桨式搅拌器搅拌，所述桨式搅拌器可连接到闪蒸槽底部。通常通过打开槽底部的覆盖件从闪蒸槽底部移除预处理生物质。用于连续提取预处理生物质的活底机械装置尤其适用。为了在本发明的设备中处理多批生物质，一批生物质和氨可以在圆筒室内，然而另一批在闪蒸槽内。在两室设备中，数批物料可以同时在两室内和闪蒸槽内。此外，可以在移除前在闪蒸槽内收集多批预处理生物质。
在处理后，产品通常包括氨的混合物、部分降解的生物质和一些可发酵糖。可以从闪蒸槽中移除包括可溶性部分和不溶性部分的全部预处理生物质并在糖化反应中利用它们。作为另外一种选择，在糖化前可以从预处理生物质混合物中排走一些液体以便糖化反应中的生物质干重保持高水平。处理后可能存在过多的液体，尤其是当需要大量蒸汽提高并维持生物质处理的温度时更是如此。
在另一个可供选择的实施方案中，生物质固体可在本发明的方法中通过处理再循环。
糖化
用本发明的方法处理的生物质在存在糖化酶(可称为糖化酶聚生体)的情况下进一步进行水解，以释放水解产物中的低聚糖和/或单糖。用于生物质处理的糖化酶和方法参见Lynd，L.R.等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66：506-577)。
在糖化之前，可处理经预处理的生物质以改变pH、组合物或温度使得糖化酶聚生体中的酶将有活性。可通过加入固体或液体形式的酸来改变pH。作为另外一种选择，可利用可从发酵中回收的二氧化碳(CO2)来降低pH。例如，如果存在足够液体，可从发酵罐中收集CO2并将其通入闪蒸槽中的预处理产物顶部空间或起泡通过预处理生物质，同时监控pH直至达到所需的pH。可使温度达到下文提到的适合糖化酶活性的温度。可加入糖化过程中使用的酶活性所需的任何辅因子。
糖化酶聚生体包括一种或多种酶，所述酶主要选自(但非排他性地)“糖苷酶”类，所述酶水解二糖、单糖、和多糖的醚键，存在于广义“水解酶”(EC 3.)的分类酶EC 3.2.1.x中(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego，CA with Supplement 1(1993)，Supplement 2(1994)，Supplement 3(1995，Supplement 4(1997)andSupplement5[分别在Eur.J.Biochem.(1994)223：1-5，Eur.J.Biochem.(1995)232：1-6，Eur.J.Biochem.(1996)237：1-5，Eur.J.Biochem.(1997)250：1-6，和Eur.J.Biochem.(1999)264：610-650中])。本发明的方法中可用的糖苷酶可根据它们水解的生物质组分进行分类。本发明的方法可用的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内葡聚糖酶、外葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如，木聚糖酶、内木聚糖酶、外木聚糖酶、β-木聚糖苷酶、阿拉伯糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸酶)、和淀粉水解糖苷酶(例如，淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。此外，可将其他活性剂加入到糖化酶聚生体中，如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)、和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)，以帮助从生物质的其他组分中释放多糖。本领域熟知的是，生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，如纤维素降解，该活性由若干种酶或一组具有不同底物特异性的酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶，所有酶可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂如纤维素酶可包括多种酶。因此，本发明方法的糖化酶聚生体可包括酶活性剂例如“纤维素酶”，然而人们认识到该活性可被一种以上的酶催化。糖化酶可商业获取，如获取自SpezymeCP的纤维素酶(GenencorInternational，Rochester，NY)和Multifect
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木聚糖酶(Genencor)。此外，糖化酶可通过生物方法制备，包括使用重组微生物方法。
本领域的技术人员将懂得如何测定在酶聚生体中使用的酶的有效量，以及如何调节条件以获得最佳酶活性。本领域的技术人员也将懂得如何优化在酶聚生体中的此类酶的所需活性，以在选择条件下获得给定预处理产物的最佳糖化效果。
优选地，糖化反应在糖化酶的最佳温度和pH下或接近此最佳pH和温度的条件下进行。在本发明的方法中，糖化酶聚生体使用的最佳温度在约15℃至约100℃的范围内。在另一个实施方案中，最佳温度在约20℃至约80℃的范围内。最佳pH可在约2至约11的范围内。另一个实施方案中，在本发明的方法中，糖化酶聚生体使用的最佳pH在约4至约10的范围内。
糖化可进行约若干分钟至约120小时，优选约若干分钟至约48小时。反应时间将取决于酶浓度和比活性、已经使用的底物和环境条件例如温度和pH。本领域的技术人员能够容易地决定特定底物和糖化酶聚生体使用的温度、pH和时间的最佳条件。
糖化可分批进行或以连续方法进行。糖化也可一步进行或多步进行。例如，糖化所需的不同酶可表现出不同的最佳pH或温度。可用酶在某个温度和pH下进行首次处理，随后使用不同酶在不同温度和/或pH下进行第二次或第三次(或更多次)处理。此外，用不同酶在连续步骤中进行的处理可以在相同pH和/或温度下进行，或在不同pH和温度下进行，例如使用在较高pH和温度下稳定的和活性更高的半纤维素酶处理，随后用在较低pH和温度下有活性的纤维素酶处理。
糖化之后的生物质的糖的溶解度可通过测量释放的单糖和低聚糖进行监控。测量单糖和低聚糖的方法是本领域熟知的。例如，还原糖的浓度可使用1，3-二硝基水杨酸(DNS)检测分析法(Miller，G.L.，Anal.Chem.(1959)31：426-428)进行测定。作为另外一种选择，如本文在一般方法部分所述，可通过HPLC使用合适柱来测量糖。
发酵
合适的微生物可使用生物质释放的可发酵糖来生产目标化学制品。在糖化之后，但是在发酵之前，可通过例如蒸发浓缩糖化混合物以提高可发酵糖的浓度。任选地，在糖化产物中的液体可从分批或连续方法中的固体中分离。任选地，液体或全部糖化产物可在发酵前灭菌。取决于发酵期间使用的微生物和糖化期间使用的pH，可将pH调节至适于发酵的水平。此外，可用微生物生长所需的附加营养物质来补充糖化混合物。补充剂可包括例如酵母提取物、特定氨基酸、磷酸盐、氮源、盐、和痕量元素。也可包括通过特定生物催化剂来生产特定产品所需的组分，如用于保留质粒的抗生素或酶催化反应所需的辅因子。也可包括附加的糖以提高总糖浓度。可使用糖化混合物作为发酵肉汤的组分，例如，制备介于约100％和约10％之间的最终培养基。
取决于发酵微生物使用的条件，也可调节温度和/或顶部空间气体。发酵可以是有氧的或厌氧的。发酵可以在糖化之后发生，或可以通过同步糖化和发酵过程(SSF)使其与糖化同时发生。SSF能够使糖化生产的糖含量保持低水平，因此减少潜在的糖化酶产物抑制，减少污染微生物的糖可用性，并改善预处理生物质向单糖和/或低聚糖的转化。
可通过发酵制备的目标化学制品包括例如酸、醇、烷烃、烯烃、芳族、醛、酮、生物高聚物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素、和药物。醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、赤藓醇、木糖醇、和山梨醇。酸包括乙酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙酸、丁酸、葡萄糖酸、衣康酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酰丙酸。氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸。附加的目标化学制品包括甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。
可通过一种或多种合适的生物催化剂在一步或多步发酵中把糖发酵成目标化学制品。生物催化剂可以是选自细菌、丝状真菌和酵母的微生物。生物催化剂可以是野生型微生物或重组微生物，并包括埃希氏菌属、发酵单胞菌属、糖酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、链霉菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌、和梭菌属。在另一个实施方案中，生物催化剂可以选自重组大肠杆菌、运动发酵单胞菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、啤酒糖酵母、嗜热梭菌、高温产氢菌、和树干毕赤酵母。
已经描述了多种用于发酵生产目标化学制品的生物催化剂，并可发现、通过突变生产、或通过重组方法来工程化其他生物催化剂。任何使用利用本发明的方法糖化处理生物质生产的可发酵糖的生物催化剂可以被用于制备已知可通过发酵生产的目标化学制品。
生产包括乙醇和丁醇在内的生物燃料的生物催化剂是尤其受关注的。例如，通过产溶剂梭菌将碳水化合物发酵成丙酮、丁醇、和乙醇(ABE发酵)是为人熟知的(Jones和Woods(1986)Microbiol.Rev.50：484-524)。US 5192673描述了用于使用丙酮丁醇梭菌突变株生产高含量丁醇、丙酮和乙醇的发酵方法。US 6358717描述了用于使用拜氏梭菌突变株生产高含量丁醇、丙酮和乙醇的方法。共有的和共同未决的专利申请WO2007/041269和WO 2007/050671分别公开了遗传工程的微生物宿主中生产1-丁醇和异丁醇。共有的和共同未决的美国专利申请#11/741892和#11/741916公开了在遗传工程的微生物宿主中来生产2-丁醇。通过微生物宿主按照公开的方法可从使用本发明的方法生产的水解产物中发酵生产异丁醇、1-丁醇或2-丁醇。
已经使用遗传修饰的大肠杆菌菌株作为乙醇生产的生物催化剂(Underwood等人，(2002)Appl.Environ.Microbiol.68：6263-6272)。在US 2003/0162271A1中描述了已经改善了乙醇生产的遗传修饰运动发酵单胞菌菌株。在共有的和共同未决的美国专利申请60/847813和60/847856中分别描述了用于乙醇生产的进一步工程化的运动发酵单胞菌乙醇生产菌株及其作用。通过运动发酵单胞菌按照公开的方法可以从使用本发明的方法生产的水解产物中发酵生产乙醇。
通过大肠杆菌重组菌株(Zhou等人，(2003)Appl.Environ.Microbiol.69：399-407)、芽孢杆菌属天然菌株(US20050250192)、和米根霉(Tay和Yang(2002)Biotechnol.Bioeng.80：1-12)在发酵过程中生产乳酸。已经使用大肠杆菌重组菌株作为生物催化剂在发酵中生产1，3丙二醇(US 6013494，US 6514733)和己二酸(Niu等人，(2002)Biotechnol.Prog.18：201-211)。使用重组梭菌(Cheryan等人，(1997)Adv.Appl.Microbiol.43：1-33)和新鉴定的酵母菌株(Freer(2002)World J.Microbiol.Biotechnol.18：271-275)通过发酵制备乙酸。在US 6159738中公开了通过重组大肠杆菌和其他细菌生产琥珀酸，在Lin等人((2005)Metab.Eng.7：116-127)中公开了通过突变型重组大肠杆菌生产琥珀酸。已经通过光滑球拟酵母突变株(Li等人，(2001)Appl.Microbiol.Technol.55：680-685)和大肠杆菌突变株(Yokota等人，(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58：2164-2167)制备了丙酮酸。已经使用大肠杆菌重组菌株作为生物催化剂用于生产对-羟基肉桂酸(US20030170834)和奎尼酸(US20060003429)。
已经在发酵过程中使用丙酸丙酸杆菌突变株生产丙酸(Suwannakham和Yang(2005)Biotechnol.Bioeng.91：325-337)，并已经使用酪丁酸梭菌制备丁酸(Wu和Yang(2003)Biotechnol.Bioeng.82：93-102)。已经通过发酵从梭菌属菌株17crl(Janssen(2004)Arch.Microbiol.182：482-486)的苏氨酸中制备了丙酸盐和丙醇。已经使用酵母样普鲁兰出芽短梗霉(Anantassiadis等人，(2005)Biotechnol.Bioeng.91：494-501)通过曲霉菌曲霉突变株(Singh等人，(2001)Indian J.Exp.Biol.39：1136-43)制备葡萄糖酸。通过氧化葡萄糖酸杆菌突变株制备5-酮基-D-葡萄糖酸(Elfari等人，(2005)Appl Microbiol.Biotech.66：668-674)，通过土曲霉突变株制备衣康酸(Reddy和Singh(2002)Bioresour.Technol.85：69-71)，通过曲霉菌曲霉突变株生产柠檬酸(Ikram-Ul-Haq等人，(2005)Bioresour.Technol.96：645-648)，并通过高里假丝酵母FTI 20037生产木糖醇(Mus satto和Roberto(2003)J.Appl.Microbiol.95：331-337)。通过重组红串红球菌和富养罗尔斯通氏菌(Gorenflo等人，(2001)Biomacromolecules 2：45-57)生产包含4-羟基戊酸乙酯和显著量3-羟基丁酸3-羟基戊酸的生物聚酯。通过重组大肠杆菌(Ui等人，(2004)Lett.Appl.Microbiol.39：533-537)制备L-2，3-丁二醇。
可通过使用棒状杆菌、短杆菌、和沙雷氏菌的营养缺陷型菌株和氨基酸类似物抗性菌株发酵生产氨基酸。例如，日本专利公布56008596描述了使用组氨酸类似物抗性菌株生产组氨酸，EP 136359描述了使用重组菌株生产组氨酸。日本专利公布47004505和51019037描述了使用色氨酸类似物抗性菌株生产色氨酸。日本专利公布47038995、51006237、54032070描述了使用异亮氨酸类似物抗性菌株生产异亮氨酸。日本专利公布56010035描述了使用苯基丙氨酸类似物抗性菌株生产苯基丙氨酸。已经描述了使用需要苯基丙氨酸生长的酪氨酸抗性菌株(Agr.Chem.Soc.Japan 50(1)R79-R87(1976)，或重组菌株(EP263515，EP332234)生产酪氨酸，以及使用L-精氨酸类似物抗性菌株生产精氨酸(Agr.Biol.Chem.(1972)36：1675-1684，日本专利公布54037235和57150381)。也通过在大肠杆菌菌株ATCC31882、31883、和31884中通过发酵生产苯基丙氨酸。US 6962805描述了在重组棒状杆菌中生产谷氨酸。在Okamoto和Ikeda(2000)J.BiosciBioeng 89：87-79中描述了通过大肠杆菌突变株生产苏氨酸。通过百合棒状杆菌突变株生产甲硫氨酸(Kumar等人，(2005)Bioresour.Technol.96：287-294)。
通过生物催化剂也已经制备出有用的肽、酶、和其他蛋白质(例如参见US6861237、US6777207、US6228630)。
在本文实施例5中举例说明预处理和糖化生物质成可发酵糖，随后将所述糖发酵成目标化学制品用于从预处理玉米芯中生产乙醇，使用运动发酵单胞菌作为将糖发酵成乙醇的生物催化剂。本发明的方法也能用于从生物质中生产1，3-丙二醇。如共有的和共同未决的美国专利申请#11/403087的实施例10所述，使用本发明的方法处理的生物质可进行糖化；在糖化之后，使用大肠杆菌来生产1，3-丙二醇。
通过生物催化剂在发酵过程中制备的目标化学制品可使用多种本领域已知的方法进行回收。可通过离心、过滤、微量过滤、和纳滤从其他发酵组分中分离产品。可通过离子交换、溶剂萃取、或电透析提取产品。可使用絮凝剂帮助产品分离。一个具体实例是可使用ABE发酵领域已知的方法从发酵培养基中分离生物生产的1-丁醇(参见例如Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及本文参考)。例如，可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后，可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离1-丁醇。通过使反应混合物经过有机溶剂、蒸馏、和柱层析提取，可以从发酵培养基中纯化1，3-丙二醇(美国专利5,356,812)。就此方法而言尤其好的一种有机溶剂是环己烷(美国专利5,008,473)。氨基酸可以通过如离子交换树脂吸附和/或结晶的方法从发酵培养基中收集。
实施例
一般方法和材料
使用以下缩写：
“HPLC”是高效液相色谱，“C”是摄氏度，“kPa”是千帕斯卡，“m”是米，“mm”是毫米，“kW”是千瓦，“μm”是微米，“μL”是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“min”是分钟，“mM”是毫摩尔，“cm”是厘米，“g”是克，“kg”是千克，“wt”是重量，“hr”是小时，“temp”或“T”是温度，“theoret”是理论，“pretreat”是预处理，“DWB”是生物质的干重，“ASME”是美国机械工程师学会(AmericanSociety of Mechanical Engineers)，“s.s.”是不锈钢，“in”或“″”是英寸。
硫酸、氢氧化铵、乙酸、乙酰胺、酵母提取物、葡萄糖、木糖、山梨醇、MgSO4·7H2O、磷酸和柠檬酸从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)商购获得。
在所述实施例中将处理称为预处理。
小型筒式活塞反应器
小型筒式活塞反应器(活塞/筒式反应器)由配备有水平取向活塞的5.1cm×45.7cm的不锈钢圆筒组成。用四个O形环将活塞密封到筒上，并在排放期间在活塞背面用氮气为活塞加压。45.7cm的圆筒配备有三个多用途端口，允许用真空、氨水注射、蒸汽注射、和插入热电偶的方法测量筒内温度。当注入蒸汽时为了避免蒸汽冷凝过多，用三个带状加热器加热圆筒外部，并用一个覆盖有充满硅氧烷的玻璃纤维夹套的2.5cm厚的玻璃纤维垫隔热。
将反应器圆筒直接连接到垂直取向的15.2cm×61cm的不锈钢闪蒸槽上。通过锥形喷嘴和底座末端剪切阀排列从闪蒸槽上分离圆筒。末端阀剪切模具的直径是3.5cm。将锥形喷嘴和底座上的背压调节至约138kPa(测量压力)的背压，使其进入10.2cm直径的空气圆筒中，该圆筒与末端剪切阀的锥形嘴相连。末端剪切阀门的锥形嘴能缩回最多1.6cm，允许排放闪蒸槽中的颗粒。在末端剪切阀出口的弯管引导预处理固体向下进入闪蒸槽的底部，其中所述固体可通过打开槽底部的圆顶螺栓轻易移除。闪蒸槽的上部汽室凸缘加入一个具有被加工成与闪蒸槽轴线呈直角的狭槽的特殊出口，这引起释放的蒸汽沿着拐角路径进入排出装置中，有助于防止产生的生物质颗粒遗留和水滴进入到排气冷凝器中。
大型筒式活塞反应器
将活塞反应器(印有代码ASME)的第二圆筒加工成直径相同(5.1cm)，但长度更长(68.6cm)以保持附加体积的生物质。用四个O形环将活塞密封到筒上，并在排放期间在活塞背面用氮气为活塞加压。68.6cm的圆筒配备有八个多用途端口，沿着顶部表面和底部表面各4个，它们允许用真空、氨水注射、蒸汽注射、和插入热电偶的方法测量筒内温度。反应器圆筒配备有蒸汽夹套用于圆筒的均匀加热。将反应器圆筒直接连接到垂直取向的15.2cm×61cm的不锈钢闪蒸槽上。通过锥形喷嘴和底座末端剪切阀排列从闪蒸槽上分离圆筒。末端阀剪切模具的直径是3.5cm。锥形喷嘴和底座上的背压是可调的，大多数测试使用～138kPa(测量压力)的背压进行，使其进入10.2cm直径的空气圆筒中，该圆筒与末端剪切阀的锥形嘴相连。末端剪切阀门的锥形嘴能缩回最多1.6cm，允许排放闪蒸槽中的颗粒。在末端剪切阀出口的弯管引导预处理固体向下进入闪蒸槽的底部，其中所述固体可通过打开槽底部的圆顶螺栓轻易移除。闪蒸槽的上部汽室凸缘加入一个具有被加工成与闪蒸槽轴线呈直角的狭槽的特殊出口，这引起释放的蒸汽沿着拐角路径进入到排出装置中，有助于防止产生的生物质颗粒遗留和水滴进入到排气冷凝器中。沿着闪蒸槽加上三个带状电加热器(设为60℃)和隔热物，使得热预处理的固体闪蒸到加热容器中，更好的模拟商业规模的方法。
蒸汽喷射反应器分批消化系统
4升蒸汽喷射反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)是带夹套的蒸汽反应器，由长度为102mm schedule 80的Hastelloy
Figure GPA00001032437900251
管组成，用两个球形阀闭合。将附加电加热器置于反应器所有暴露的、不带夹套的表面上，并将温度控制至预设温度。也可直接注入蒸汽以使生物质迅速达到预处理温度。调节并控制汽压以保持所需的预处理温度。将反应器底部颈缩至51mm。所有预处理材料通过反应器底部的可置换模头放出，并收集在一个尼龙(Hotfill
Figure GPA00001032437900252
)0.21m3袋中，该尼龙袋套在一个厚壁、带夹套的低温闪蒸槽中。
预处理和酶水解反应器(PEHReactor)
9-L PEHReactor(产自NREL，Golden，CO；参见共同未决的美国专利申请11/402464)具有大约15cm×51cm的不锈钢反应容器，而3.2LPEHReactor具有15cm×18cm不锈钢反应容器。每个容器具有穿过反应容器的纵向中心用于导入处理反应物的喷枪。使用旋转接头将喷枪连接到容器一端覆盖件的端口上，该容器具有用于容器连接的附加端口。四个导流板与容器壁等长，垂直连接到壁上。当容器旋转时，导流板和3.2cm×3.2cm的陶瓷研磨介质滚筒(E.R.Advanced Ceramics，East Palestine，OH)、在容器中的自由漂浮物一起对生物质和反应物施加机械混合，促使反应物同化到生物质中。在小型反应器中使用七个滚筒，在大型反应器中使用二十二个滚筒。将PEHReactor置于提供旋转机构的Bellco Cell-ProductionRoller Apparatus(Bellco Technology，Vineland，NJ)上，该反应器具有滚轴设备，位于提供加热的温度控制舱中。可通过将外部来源连接到上盖中的喷枪连接端口上来对反应容器施加真空和压力。
分批补料糖化反应器
分批补料糖化反应器是一个15-L发酵罐(B.Braun BiotechInternational，Allentown，PA)，通过BioStat ED数据控制单位对其进行控制，并且关联控制模块，所述模块包含循环泵、酸泵和碱泵、螺线管阀门、用于温度控制的换热器、蒸汽供应、处理水、供气控制阀门和过滤、和背压控制阀门以及排气过滤器。该发酵罐配备有两个11.4cm直径的三叶高效Ligntnin A-310叶轮。底部叶轮距反应器底部7.6cm(它不能更靠近底部，因为靠近轴底部存在一个大的密封件系统用于底部-传动轴渗透)，上部叶轮距反应器底部22.9cm。该发酵罐容器具有19.0cm的直径和55.9cm的最大高度。安装四个可移除的导流板，每个导流板具有1.6cm的宽度和48.3cm的长度，并且从容器底部至顶部～7.6cm。将由APV凸轮泵(M1/028/06型)、1-1/2-英寸(3.81cm)的挠性软管和特氟隆流动观测指示器组成的泵循环回路接到发酵罐系统的顶部和底部端口上。泵循环回路用具有CF8M阀体、316s.s.球体、和PTFE底座的1-1/2英寸(3.81cm)Valmicro和SVF全端口球形阀从发酵容器上分离。此外，V形端口剪切阀(Triac控制)位于凸轮泵下游，在将泵从发酵罐顶部端口分离的球形阀之前。在再循环期间，该阀门逐渐接近最多60°以提供更大的再循环预处理固体剪切。
分析方法
纤维素定量
使用本领域熟知的方法如ASTM E1758-01“Standard method for thedetermination of carbohydrates by HPLC”测定在每个起始生物质样本中的纤维素的量。
测量糖、乙酰胺、乳酸和乙酸含量
通过HPLC(Agilent Model 1100，Agilent Technologies，PaloAlto，CA)使用Bio-Rad HPX-87P和Bio-Rad HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)以及合适的保护柱来测量糖化液体或发酵肉汤中的可溶性糖(葡萄糖、纤维二塘、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、和甘露糖)、乙酸、和乙醇。如需要的话，测量样本pH并用硫酸将其调节至5-6。然后使样本通过0.2μm的注射过滤器直接进入HPLC小瓶中。HPLC运行条件如下：
HPX-87P(用于碳水化合物)：
注射体积：10-50μL，取决于浓度和检测器限制
流动相：HPLC级水，0.2μm，过滤并脱气
流速：0.6mL/分钟
柱温：80-85℃，保护柱柱温＜60℃
检测器温度：尽可能的接近主要柱柱温
检测器：折射指数
运行时间：35分钟数据采集时间加上15分钟运行后时间(对后来的洗脱化合物进行可能的调节)
Biorad Aminex HPX-87H(用于碳水化合物、乙酸和乙醇)
注射体积：5-10μL，取决于浓度和检测器限制
流动相：0.01N硫酸，0.2μm，过滤并脱气
流速：0.6mL/分钟
柱温：55℃
检测器温度：尽可能的接近柱温
检测器：折射指数
运行时间：25-75分钟的数据采集时间
运行结束后，根据标准曲线测定每个化合物在样本中的浓度。
实施例1
在小型筒式活塞反应器中预处理玉米芯
用颚间距为大约0.95cm的颚式粉碎机(2.2kW马达)处理完整玉米芯，然后用破碎机(1.5kW马达，Franklin Miller Inc.，Livingston，NJ)处理，随后用配备有1.9cm美国标准筛网的Sweco筛网进行筛分，使完整玉米芯破碎成更小的块。在小型筒式活塞反应器(如一般方法所述)中装入115g(基于干重)破碎的玉米芯，用手将玉米芯置于移除活塞的反应器末端。把活塞放回原处以堵上末端。将反应容器抽真空以减压至＜10kPa(0.1bar)，将稀释氢氧化铵溶液注入到反应器中，使氨浓度为4g或6g每100g生物质干重(如表1所示)，生物质干重浓度为50g每100g总生物质氨水混合物。在注入氨溶液后，将蒸汽注入到反应器中以将温度升至145℃。生物质在该温度下保持20分钟，然后开启活塞将其排入闪蒸槽中。在20分钟预处理期间监控温度，如需要的话注入蒸汽。通过闪蒸槽底部来收获预处理的玉米芯。移除过多的游离液体，剩余下来的固体用于糖化。
如一般方法所述，将约470g的预处理生物质加入到3.2-L PEHR反应器中用于糖化。通过注入pH4.8的1M柠檬酸缓冲液加上加入柠檬酸一水合物，将内容物的pH调节至大约5.5。一旦达到所需的pH，将12.9mg/g纤维素或25.8mg/g纤维素的Spezyme
Figure GPA00001032437900271
CP纤维素酶(GenencorInternational，Rochester，NY)和4.2mg活性蛋白/g纤维素或8.4mg活性蛋白/g纤维素的半纤维素酶酶聚生体(Diversa；San Diego，CA)加入到反应器中，所述酶聚生体由β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木聚糖苷酶和阿拉伯糖苷酶组成。加入缓冲液、酶和水使得反应器中的最终混合物由23g干生物质/100g预处理生物质与糖化酶聚生体的混合物组成。反应器在培养箱中50℃、19rpm旋转下培养72小时。下表1中给出的收率是以理论收率百分比形式给出的释放量。
表1：在小型筒式活塞反应器中预处理的玉米芯糖化后的收率。
实施例2
不同时间在大型筒式活塞反应器中的预处理
将蒸汽加到圆筒夹套中将大型筒式活塞反应器的圆筒(如一般方法所述)预热至～130℃。用带状加热器将闪蒸接收器预热至～60℃。如实施例1所述制备破碎玉米芯。用手将这些的玉米芯(175g，基于干重)装入到大型筒式反应器中，置于移除活塞的反应器末端。把活塞放回原处以堵上末端。将反应容器和闪蒸接收器抽真空以减压至＜10kPa，将稀释氢氧化铵溶液注入到反应器中，使氨浓度为6g/100g生物质干重，生物质干重浓度为45g/100g总生物质氨水混合物。注入氨水之后，将蒸汽注入到反应器中以将温度升至145℃。通过监控温度以及如需要的话注入蒸汽，使混合物该温度下保持10或20分钟，然后开启活塞将其排入预热闪蒸槽中。将闪蒸槽抽真空直至闪蒸接收器达到～59℃。进行三个10分钟预处理和六个20分钟预处理，最后将所有材料进行相同时间的预处理。当从闪蒸接收器收获产品时，将游离液体从预处理固体中分离出，并且不把它们再加回去用于糖化。随后如实施例1所述在小型PEHReactor中糖化预处理玉米芯的样本。所有糖化用12.9mg/g纤维素的Spezyme
Figure GPA00001032437900292
CP纤维素酶和4.2mg活性蛋白/g纤维素的半纤维素酶聚生体(Diversa)在50℃，pH5.5条件下进行72小时，所述酶聚生体包含木聚糖酶、、β-木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、和β-葡萄糖苷酶。下表2中给出的收率是以理论收率百分比形式给出的释放量。
表2：在大型筒式活塞反应器中预处理的玉米芯糖化后的收率。
预处理时间(分钟)   萄萄糖单体释放量(％理论值)   总葡萄糖释放量(％理论值)   木糖单体释放量(％理论值)   总木糖释放量(％理论值)
  10   68.2   79.5   32.1   77.0
  20   68.0   83.2   39.1   84.3
实施例3
在大型筒式活塞反应器中进行预处理，与蒸汽喷射进行比较
如实施例1所述制备粒度减小的玉米芯。如实施例2所述在大型筒式活塞反应器中进行预处理。为了在蒸汽喷射中进行预处理，首先把玉米芯装入到9-L PEHReactor中。通过外表面旋转接触冰将反应器冷却至4℃。将反应容器抽真空并将稀释氢氧化铵溶液注入到反应器中，所述氢氧化铵溶液在4℃冷室中预冷并通过浸入冰水浴中的管子，反应器中氨浓度为6g/100g生物质干重，生物质干重浓度为45g/100g总生物质与氨水混合物。在旋转反应容器表面施加冰并在4℃下旋转30分钟，将装入氨和玉米芯的PEHReactor冷却至4℃。此时将内容物转移到如一般方法所述的蒸汽喷射反应器中。在蒸汽喷射反应器中加入氨与玉米芯混合物之后，通过直接注入蒸汽使温度上升至145℃。玉米芯与氨混合物在该温度下保持20分钟，然后将混合物排入闪蒸槽中。
从大型筒式活塞反应器和蒸汽喷射反应器中采集预处理玉米芯样本，如实施例1所述进行糖化。糖化用12.9mg/g纤维素的Spezyme
Figure GPA00001032437900301
CP纤维素酶(Genencor)和4.2mg活性蛋白/g纤维素的半纤维素酶聚生体(Diversa)进行，所述酶聚生体由β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、和阿拉伯糖苷酶组成。反应器在培养箱中50℃、19rpm下培养72小时。在每个反应器中的预处理材料所得的葡萄糖收率如下表3所示。
表3：在大型筒式活塞反应器或蒸汽喷射反应器中预处理的玉米芯的糖 化收率。
预处理反应器 反应器中DWBconc 预处理时间(分钟) 预处理温度(℃)   葡萄糖单体释放量(％理论值)   总葡萄糖释放量(％理论值)   木糖单体释放量(％理论值)   总木糖释放量(％理论值)
  活塞反应器 50％ 20 145 68.0 83.2 39.1 84.3
  蒸汽喷射 60％ 40 150 65 77 48 82
实施例4
在大型筒式活塞反应器中预处理玉米芯和纤维共混物
如实施例1所述制备破碎玉米芯。在大型筒式活塞反应器中单独预处理破碎玉米芯，以及预处理破碎玉米芯和Cargill Bran 80(Cargill，Minnetonka，MN)的共混物。将破碎玉米芯和Cargill Bran 80玉米纤维合并，使得所述纤维占混合样本总干生物质的大约33％。在任何情况下，将175g(基于干重)的原料加入到反应器中。基本如实施例2所述进行预处理。然而，在这些实验中，在加入氨溶液后，在注入蒸汽以将温度升至145℃之前保持反应器内容物10分钟。在注入蒸汽后，通过在需要时注入蒸汽使温度保持在145℃下10分钟。在预处理后，开启活塞将样本排入闪蒸槽中。
从大型筒式活塞反应器的闪蒸槽中采集预处理玉米芯和玉米芯与纤维共混物的样本，并在如实施例1所述的小型PEHReactor中进行糖化。将生物质加入，直至充满反应器体积的20％。用12.9mg/g纤维素的Spezyme
Figure GPA00001032437900311
CP纤维素酶(Genencor)和15mg/g纤维素的Multifect木聚糖酶(Genencor)进行糖化。PEHReactor在培养箱中50℃、19rpm培养72小时。预处理材料的所得葡萄糖和木糖收率如下表4所示。
表4：在大型筒式活塞反应器中预处理的玉米芯以及玉米芯与麸皮样本 的糖化收率。
原料   反应器中DWB conc   葡萄糖单体释放量(％理论值)   总葡萄糖释放量(％理论值)   木糖单体释放量(％理论值)   总木糖释放量(％理论值)
 仅玉米芯   45％   40.2   67.2   29.4   83.9
 玉米芯+麸皮80 45％ 37.0 65.4 21.6 77.2
实施例5
从在大型筒式活塞反应器中预处理的玉米芯中生产乙醇
如实施例2所述预处理玉米芯10分钟。进行总共17次此类预处理。将得自4次预处理的预处理玉米芯注入以用于糖化，从而提供用于分批补料糖化的初始水解产物。将得自其余13次生产运行的预处理玉米芯注入以用于分批补料糖化。
为了开始分批补料糖化，在如一般方法所述的分批补料糖化反应器中首先加入水解产物以装满反应器第一叶轮的底部。该水解产物通过在2.8-L摇瓶中糖化预处理玉米芯进行制备。这些摇瓶装入465g预处理固体，1000mL去离子水，以及28.4mg SpezymeCP/g纤维素和4.2mg活性蛋白/g纤维素的半纤维素酶聚生体(Diversa)，该酶聚生体包括b-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、b-木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶。在加入酶之前，用8.5％H3PO4将pH调节至5。将摇瓶保持在50℃下并在旋转振荡器中以150rpm振荡48小时，此时将水解产物装入分批补料反应器中。
加入初始水解产物之后，将预处理生物质与氨混合物(～700g)的第一等分试样加入到反应器中。加入8.5％H3PO4将pH保持设定值5.5。将pH再调节至设定值之后，加入28.4mg Spezyme
Figure GPA00001032437900322
CP/g纤维素和4.2mg活性蛋白/g纤维素的半纤维素酶聚生体(Diversa)，该酶聚生体包括b-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、b-木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶。在t＝4、8、12、22、26、30和34小时加入预处理的生物质与氨混合物的附加等分试样、Spezyme
Figure GPA00001032437900323
CP纤维素酶和半纤维素酶酶聚生体。一般在加入酶约1小时后开启泵循环回路，并运行约1小时直至在第22小时加入固体。在26小时和30小时加料后，在加入酶后约50分钟开启泵并运行30分钟。在34小时加料后，在加入酶后约3小时开启泵并运行30分钟。泵也在t＝29、33、47和49小时运行30分钟。总糖化时间为120小时。此时水解产物包含～60g/L葡萄糖单体、25g/L木糖单体和10g/L乙酸。
该水解产物用于运动发酵单胞菌菌株ZW800或ZW658(ATCC#PTA-7858)发酵。ZW658是运动发酵单胞菌菌株，它已经被工程化用于将木糖发酵成乙醇，在共有的和-共同未决的美国专利申请60/847813中对此进行了描述。ZW658通过经由序列转座事件将两个操纵子整合到ZW1(ATCC#31821)基因组中，然后通过包含木糖的选择培养基筛选进行构建，所述操纵子是Pgapxy1AB和Pgaptaltkt，它们包含四个编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的木糖利用基因。ZW800是具有编码葡萄糖果糖氧化还原酶灭活基因的ZW658菌株，它也在共有的和共同未决的美国专利申请60/847813中进行了描述。
发酵在灭菌的1升发酵罐(BIOSTAT
Figure GPA00001032437900331
B-DCU系统，Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)中进行，初始工作体积为500mL。将种菌加入到发酵罐中，含量为10％(v/v)，使得加样后肉汤的OD600～1。水解产物与水的平衡比例为80％或40％(v/v)。加入附加葡萄糖和木糖以使它们在肉汤中的终浓度各为92g/L和82g/L。肉汤也补充有10mM山梨醇和1g/L MgSO4·7H2O。在33℃、pH5.8、搅拌速度150rpm的条件下进行72小时的发酵。ZW800菌株的最终乙醇滴定度为在40％的水解产物中8g/L，在80％的水解产物中7g/L。ZW658的最终乙醇滴定度为在40％的水解产物中8g/L，在80％的水解产物中6.5g/L。

Claims (22)

1.用于处理生物质的方法，所述方法包括：
a)提供生物质；
b)使用非压实喂料机将所述(a)的生物质装入到设备中，所述设备包括：
i)圆柱形圆筒，所述圆柱形圆筒具有配备有活塞的第一末端和配备有排放阀的第二末端；
ii)任选的支管，所述支管在一个支管末端连接到靠近所述圆柱形圆筒第一末端的圆柱形圆筒上，并且所述支管在未连接的支管末端具有可密封的阀门；
iii)所述圆柱形圆筒或支管中的至少2个可密封的端口；
iv)任选的阀门，所述阀门在所述圆柱形圆筒中将圆筒分成单独的第一室和第二室，所述第一室具有配备有所述活塞的圆筒第一末端，并且所述第二室具有配备有排放阀的圆筒第二末端；以及
v)连接至在所述圆筒第二末端的排放阀上的闪蒸槽；其中将所述生物质装入到所述圆柱形圆筒中或任选地装入到连接至所述圆柱形圆筒的所述支管中；
c)关闭所述圆柱形圆筒和支管，如果存在的话；
d)任选地经由所述圆柱形圆筒中的至少一个端口施加真空；
e)通过所述圆柱形圆筒或者支管中的所述至少一个端口加入含氨水溶液，加入的量相对于所述圆筒中生物质的干重为小于12重量百分比，从而制备生物质与氨水的混合物，并且此外其中所述生物质的干重相对于所述生物质与氨水混合物的重量为至少15重量百分比的高固体浓度，并通过所述圆柱形圆筒或支管中的所述第二端口加入蒸汽，如果所述支管存在的话，以使所述圆筒内温度达到介于85℃和180℃之间；
f)关闭所述圆柱形圆筒和支管中的端口，如果所述支管存在的话，以提供不可渗透的室；
g)在所述不可渗透的室中将所述生物质与氨水混合物保持在合适温度下一段时间，所述时间介于30秒和4小时之间；
h)任选地通过所述活塞的位移将所述生物质与氨水混合物移动到所述圆柱形圆筒中的第二室，如果存在的话，其中所述生物质不被压实，并保持介于2分钟和4小时之间的一段时间；以及
i)通过所述活塞将所述生物质与氨水混合物移动通过(g)或(h)的所述不可渗透的圆柱形圆筒并通过所述排放阀进入到所述闪蒸槽中；
其中生产出经处理的生物质。
2.用于处理生物质的方法，所述方法包括：
a)提供生物质和含氨水溶液的混合物，
其中所述生物质的干重相对于所述生物质与氨水混合物的总重为至少15重量百分比，并且所述氨水的量相对于生物质的干重为小于12重量百分比；
b)使用非压实喂料机将所述(a)的生物质与氨水混合物装入到设备中，所述设备包括：
i)圆柱形圆筒，所述圆柱形圆筒具有配备有活塞的第一末端和配备有排放阀的第二末端；
ii)任选的支管，所述支管在一个支管末端连接到靠近所述圆柱形圆筒第一末端的圆柱形圆筒上，并且所述支管在未连接的支管末端具有可密封的阀门；
iii)所述圆柱形圆筒或支管中的至少2个可密封的端口；
iv)阀门，所述阀门在所述圆柱形圆筒中将圆筒分成单独的第一室和第二室，所述第一室具有配备有所述活塞的圆筒第一末端，并且所述第二室具有配备有排放阀的圆筒第二末端；以及
v)连接至在所述圆筒第二末端的排放阀上的闪蒸槽；其中将所述生物质装入到所述圆柱形圆筒的所述第一室中或任选地装入到连接至所述圆柱形圆筒的所述支管中；
c)关闭所述圆筒中的所述第一室和支管，如果存在的话；
d)任选地经由所述至少一个端口施加真空；
e)通过在所述第一室或支管中的至少一个第一端口加入蒸汽，如果所述支管存在的话，以使所述室内的温度达到介于85℃和180℃之间；
f)关闭所述第一室和支管中的端口以提供不可渗透的第一室，如果所述支管存在的话；
g)在所述不可渗透的第一室中将所述生物质与氨水混合物保持在合适温度下一段时间，所述时间介于30秒和4小时之间；
h)任选地，通过活塞的位移将所述生物质与氨水混合物移动通过开启的阀门从所述圆柱形圆筒中的不可渗透的第一室进入到第二室中，其中所述生物质不被压实；
i)任选地，关闭所述开启的阀门以形成第二不可渗透的室并保持所述生物质与氨水混合物介于2分钟和4小时之间的一段时间；以及
j)在步骤(g)或步骤(i)之后通过所述活塞的位移将所述生物质与氨水混合物移动通过所述排放阀进入到所述闪蒸槽中；
其中所述生物质不被压实并且以此生产出经处理的生物质。
3.权利要求1的方法，其中步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、和(h)中的一个或多个步骤在步骤(i)之前重复至少一次。
4.权利要求2的方法，其中步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、和(i)中的一个或多个步骤在步骤(j)之前重复至少一次。
5.权利要求1或2的方法，其中不包括消除压实状态的步骤。
6.权利要求1或2的方法，其中所述氨水相对于生物质的干重为介于4％和6％之间。
7.权利要求1或2的方法，其中所述生物质的干重相对于将要制备的生物质与氨水混合物的重量为至少20％。
8.权利要求7的方法，其中所述生物质的干重相对于将要制备的生物质与氨水混合物的重量为至少30％。
9.权利要求8的方法，其中所述生物质的干重相对于将要制备的生物质与氨水混合物的重量为至少50％。
10.权利要求1或2的方法，其中所述合适的温度为介于120℃和160℃之间。
11.权利要求10的方法，其中所述合适的温度为介于140℃和150℃之间。
12.权利要求1或2的方法，其中所述(b)的非压实喂料机是配备有非压实导流轮的料斗。
13.权利要求1或2的方法，其中所述第一圆柱形室用至少一个阀门关闭。
14.权利要求13的方法，其中所述第一室用第一阀门关闭以关闭所述非压实喂料机并用第二阀门关闭以关闭(h)的所述第二室。
15.权利要求1或2的方法，其中所述排放阀是渐进扩展文丘里管。
16.权利要求1或2的方法，其中所述生物质选自柳枝稷、废纸、来自造纸业的淤渣、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分。
17.权利要求16的方法，其中所述获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分选自玉米粒、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、稻秆、蔗渣、高粱和大豆。
18.权利要求16的方法，其中生物质选自玉米纤维、蔗渣、锯末、柳枝稷、小麦秸秆、稻秆和草。
19.权利要求17或18的方法，其中所述玉米纤维是玉米芯、玉米壳或玉米秸秆；所述草是干草。
20.权利要求18的方法，其中生物质选自玉米纤维、锯末和蔗渣。
21.权利要求20的方法，其中所述玉米纤维是玉米芯或玉米秸秆。
22.权利要求1或2的方法，其中所述生物质来源于多种原料。
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