CN101831479B - 生物转化制备4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微生物生物转化制备4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，所述方法包括：在以4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷为底物、利用面包酵母、深红酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗头孢中的一种，于温度25-35℃下进行对称还原反应；反应结束后得到所述的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷。本发明在单一水相体系中催化4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷生成4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷，反应条件温和，设备简单，能耗低，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种重要的活性物质前体4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的生物转化制备的方法，属于生物转化技术领域。
背景技术
莱菔硫烷(sulforaphane)是迄今为止从蔬菜中发现的最具抗癌活性的化合物，大量研究证明，莱菔硫烷对食道癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌及大肠癌等都有很好的预防效果。其前体物4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷主要存在于十字花科蔬菜西兰花种子当中。目前，莱菔硫烷主要是通过水解西兰花种子中的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷，然后经过分离纯化制备而得。
目前，4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷主要通过天然产物提取的方法获得：将十字花科植物西兰花种子高温灭酶，以沸水或醇水体系作回流提取溶剂，将提取液过滤蒸干得到硫代葡萄糖苷粗提物，制备高纯度硫代葡萄糖苷，可采用酸性氧化铝色谱柱、大孔强碱性阴离子交换树脂以及制备色谱等技术进一步除杂纯化。
在所有十字花科植物种子中，4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷在西兰花种子中含量最高，但西兰花种子价格比较昂贵，原料成本较高，严重限制工业化生产。莱菔子容易获得且价格低廉，其价格是西兰花种子的三十分之一。其主要硫甙4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷的侧链结构为直链烷基，与4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷结构相似，仅在3、4位相差一个C＝C。所以由4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷向4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的转化工艺将会大大减少生产莱菔硫烷的生产成本，可促进莱菔硫烷的工业化生产的实现。
现有技术中，已有一项美国专利7,371,419中报道，通过对从莱菔子中提取得到的4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷粗品进行化学合成催化加氢也生成了4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷，该方法使用的高压反应釜作为反应容器，钯碳等作为化学催化剂，并通入氢气，在高压环境下进行多次化学合成反应。由于4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷在高压下极易分解变质，导致催化效率波动范围较大，反应不稳定，重复性较差，且该反应对设备耐压耐热要求较高，能耗高，存在大量的副反应。
发明内容
本发明为克服上述缺点，提出采用生物催化生成4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，取代原有化学催化。该方法工艺简单，反应条件温和，易于工业化生产。其反应式如下：
1：4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷
2：4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种生物转化制备4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，所述方法包括：在以4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷为底物、以面包酵母、深红酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗头孢中的一种菌种的发酵产物为酶源的反应体系中，于温度25-35℃下进行生物转化，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷；所述发酵产物为所用菌种经发酵获得的发酵液或湿菌体；可将湿菌体加入含有底物4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷底物的缓冲溶液中作为反应体系，或直接按需要量将底物加入发酵液中作为反应体系。
所述的微生物催化合成4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，其特征在于所述菌种为面包酵母、深红酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗头孢。
所述发酵液或者湿菌体由如下方法制备得到：将面包酵母、深红酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗头孢其中一种接种至发酵培养基，于该菌体常规适宜生长温度下培养16～48小时后，得发酵液，将发酵液于5000r/min离心10分钟得到湿菌体。所述发酵培养基为常规适用于该菌种的液体发酵培养基。
所述反应体系中底物初始浓度为10-100mg/ml，发酵产物加入量以所含湿菌体的湿重计为50～400g/l。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重。
所述反应体系中添加有终浓度为10-100g/L的葡萄糖作为辅助底物，可以促进反应进行。
优选的，所述反应体系的溶剂为0.1M，pH8.0的磷酸盐缓冲液，将底物和湿菌体加入磷酸盐缓冲液中，作为反应体系。
所述对称还原反应的反应温度为25～35℃，反应时间为24～120小时，在此条件下所得的转化液进行液相色谱、质谱分析测定表明，转化产物主要组分4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖。
所述的具体实验方法如下：
(1)斜面培养：适用于所用菌种的斜面培养基接种该菌株，30℃斜面培养3～5天，作为斜面种子；
(2)种子培养：适用于所用菌种的种子培养基接入斜面种子，25～35℃，摇床转速100～250r/min，培养10～30小时，作为种子液；
(3)发酵培养：种子液以5～10％体积比接种量接种至适用于所用菌种的发酵培养基，25～35℃，摇床转速100～250r/min，培养16～48小时，作为种子液；
(4)微生物转化：将发酵液于5000r/min离心10分钟，将湿菌体转入0.1M，PH8.0的磷酸盐缓冲液中，同时加入底物4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，使底物浓度为10-100mg/ml，菌体浓度为50～400g/l，并添加终浓度为10～100g/l的葡萄糖作为辅助底物，于25～35℃、100～250r/min反应24～120小时；反应结束后，离心除去菌体，浓缩干燥，得到所述的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷。
优选的，所述方法如下：
(1)斜面培养：培养基组成为(终浓度)：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，pH 6.5，其余为水。121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却菌种，菌种为面包酵母或深红酵母菌株，30℃斜面培养3～5天，作为斜面种子；
(2)种子培养：培养基组成为(终浓度)：麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4CL5g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，pH 6.5，其余为水。装液量为250ml三角瓶装液60ml，120℃灭菌20分钟，灭菌后接入斜面种子，置旋转式摇床，100-250r/min，25～35℃，培养10～30小时，作为种子液；
(3)发酵培养：培养基组成为(终浓度)：麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4CL5g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，pH6.5，其余为水。装液量为250ml三角瓶装液60ml，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，以5％-10％体积比接种种子液，25～28℃，摇床转速100～250r/min，培养16～48小时，得发酵液；
(4)微生物转化：将发酵液于5000r/min离心10分钟，收集菌体，用0.1M，PH8.0的磷酸盐缓冲液洗涤后，将湿菌体转入0.1M，PH8.0的磷酸盐缓冲液中，同时加入底物4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，使底物浓度为10-100mg/ml，菌体浓度为50～400g/l，并添加终浓度为10～100g/l的葡萄糖作为辅助底物，于25～35℃、100～250r/min反应24～120小时；反应结束后，离心除去菌体，浓缩干燥，得到所述的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷。
本发明的有益效果是：本发明通过菌种优选，确定面包酵母、深红酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗头孢作为产酶菌株，在单一水相体系中催化还原4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷生成4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷。原有化学合成技术中使用的高压反应釜作为反应容器，钯碳等作为化学催化剂，并通入氢气，在高压环境下进行多次化学合成反应。由于4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷在高压下极易分解变质，导致催化效率低下，且该反应对设备耐压耐热要求较高，能耗高，且存在大量的副反应。本发明取代原有的化学合成技术，在单一水相中进行反应，反应温和且催化效率高，无副反应；并且在常温常压下进行，不需要加热设备，操作简单，能耗较低且对环境无污染，适宜于进行大规模工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
面包酵母对4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷的生物转化实验
斜面培养：培养基组成为(终浓度)：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，pH 6.5，其余为水。121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却菌种，菌种为面包酵母菌株，28℃培养48小时，作为斜面活化种子。
种子培养：培养基组成为(终浓度)：麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4CL5g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，pH 6.5，其余为水。装液量为250ml三角瓶装液60ml，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，置旋转式摇床，200rpm，30℃培养24小时，作为种子液；
发酵培养：培养基组成为(终浓度)：麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4CL5g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，pH6.5，其余为水。装液量为250ml三角瓶装液60ml，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种种子液(接种量5％体积比)，置旋转式摇床，200rpm，30℃培养48小时，使菌体旺盛生长；
上述发酵液离心10分钟(5000r/min)收集菌体，用磷酸钠缓冲液(0.1M，pH8.0)洗涤两次，将面包酵母湿菌体转入60ml相同组成的缓冲液中，同时加入底物40mg 85％4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，加入0.7g葡萄糖，于30℃，200r/min下反应96小时。反应结束，离心除去菌体得上清液。上清液用0.22μm水膜过滤后进行液相色谱分析4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷和4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷含量。结果显示，面包酵母对4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷具有催化还原能力，其转化率为54.5％。
实施例2：
深红酵母对4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷的生物转化实验
斜面培养：培养基组成为(终浓度)：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，pH 6.5，其余为水。121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却菌种，菌种为深红酵母菌株，30℃培养48小时，作为斜面活化种子。
种子培养：培养基组成为(终浓度)：麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4CL5g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，pH 6.5，其余为水。装液量为250ml三角瓶装液60ml，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，置旋转式摇床，200rpm，30℃培养24小时，作为种子液；
发酵培养：培养基组成为(终浓度)：麦芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4CL5g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，pH6.5，其余为水。装液量为250ml三角瓶装液60ml，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种种子液(接种量5％体积比)，置旋转式摇床，200rpm，30℃培养24小时，使菌体旺盛生长；
在上述发酵液中加入底物35mg 90％4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，于30℃，200r/min下反应72小时。反应结束，离心除去菌体得上清液。上清液用0.22μm水膜过滤后进行液相色谱分析4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷和4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷含量。结果显示，面包酵母对4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷具有催化还原能力，其转化率为75.3％。
实施例3：
束梗头孢对4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷生物转化实验
所有培养及转化实验均在土豆培养基中进行。土豆培养基的配制方法：将200g去皮土豆切成小块，加适量水煮沸30分钟后，用纱布将过滤，滤液中加入20g葡萄糖，加水定容至1升，分装，116℃灭菌30分钟，备用。
斜面培养：固体土豆培养基，pH 6.5，116℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入菌种，28℃培养72小时，作为斜面活化种子。
种子培养：液态土豆培养基，pH 6.5，装液量为250ml三角瓶装液60ml，116℃灭菌30分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，置旋转式摇床，160rpm，30℃培养24小时。
发酵培养：接种种子液(接种量3％体积比)接入250ml三角瓶(装有60ml土豆培养基)中，160rpm、28℃下震荡培养48小时，得发酵液。
上述发酵液离心10分钟(5000r/min)收集菌体，用磷酸钠缓冲液(0.1M，pH8.0)洗涤两次，将得到湿菌体转入60ml相同组成的磷酸钠缓冲液中，同时加入底物80mg 85％4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，加入0.8g葡萄糖，于28℃，160r/min下反应120小时。反应结束后，离心除去菌体得上清液。上清液用0.22μm水膜过滤后进行液相色谱分析4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷和4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷含量。结果显示，束梗头孢对4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷具有催化还原能力，其转化率为74.6％。
实施例4：
白地霉、白僵霉、黑曲霉4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷生物转化实验。
所有培养及转化实验均在土豆培养基中进行。
斜面培养：同实施例3
种子培养：方法同实施例3，具体参数见表1
发酵培养：方法同实施例3，具体参数见表1
在发酵培养所得的发酵液中，直接加入底物，进行反应；反应结束，离心除去菌体得上清液。上清液用0.22μm水膜过滤后进行液相色谱分析4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷和4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷含量。具体参数及相应结果见表2.
表1.白地霉、白僵霉、黑曲霉种子培养和发酵培养条件参数
表2.白地霉、白僵霉、黑曲霉对底物转化条件及转化率
| 菌种名称 | 底物加入量/mg | 底物纯度/％ | 底物有效加入量/mg | 反应时间/h | 转化率/％ |
| 白地霉 | 100 | 47.5 | 47.5 | 96 | 40.3 |
| 白僵霉 | 50 | 91.2 | 45.6 | 108 | 91.9 |
| 黑曲霉 | 60 | 70.3 | 42.2 | 120 | 84.1 |
Claims (5)
1.一种生物转化制备4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤如下：
在以4-甲基亚硫酰基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷为底物、以面包酵母、深红酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗头孢中的一种菌种的发酵产物为酶源的反应体系中，于温度25-35℃下反应24～120小时得到转化液；反应结束后转化液经分离浓缩得到所述的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷；
所述发酵产物为所用菌种经发酵获得的发酵液或湿菌体；直接将底物添加到菌种发酵所获得的发酵液中进行反应；或者将发酵液过滤得到湿菌体，并添加葡萄糖作为辅助底物，在磷酸盐缓冲液中进行转化反应。
2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于反应体系中底物初始浓度为10-100mg/L，发酵产物加入量以所含湿菌体的湿重计为50～400g/l。
3.如权利要求1中所述的方法，其特征在于所述发酵产物由如下方法制备得到：菌体接种至发酵培养基，于温度25-35℃下培养16-48小时后，得到发酵液，或者将发酵液在5000r/min离心10分钟过滤得到湿菌体。
4.如权利要求1中所述的方法，其特征在以所述反应体系中添加葡萄糖浓度为10～100g/l。
5.如权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为0.1M，pH8.0的磷酸盐缓冲液。
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