CN101831469A - 一种利用固定化酶制备栀子红色素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用固定化酶制备栀子红色素的方法，该方法以京尼平苷为原料，通过碱解、酸化、加入固定化酶进行酶解，过滤得酶解液，然后加入伯氨基化合物反应，过滤得栀子红色素溶液；栀子红色素溶液通过酸沉淀，沉淀洗涤中和、脱水、干燥，即得到栀子红色素。本发明的优点在于酶制剂可循环利用，反应条件温和，经酸沉淀法富集，工艺简单、耗能低，产物易分离。经本方法制备的栀子红色素，可明显降低其生产成本。产品最大吸收为530nm，具有良好的水溶性，以及光、热、酸、碱和金属离子稳定性，有利于拓宽栀子色素的应用范围。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用固定化酶制备栀子红色素的方法，尤其是以京尼平苷为原料，通过碱解、固定化酶酶解、酸沉淀富集，制备栀子红色素的方法。
背景技术
随着食品工业的发展和人们生活水平的日益提高，食品色素作为食品添加剂中重要的组成部分已经越来越受到人们的重视。栀子（GardeniaJasminoideEills）在我国南方广泛分布，是一种已可人工栽培的观赏药用植物，具有丰富的资源。栀子红色素是栀子的深加工产品，安全性高，稳定性好，具有良好的开发应用前景。
中华人民共和国发明专利ZL200610038494.8公开了一种生产高纯度栀子苷及高色价栀子黄色素的提纯方法，运用大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法工业化生产高纯度栀子苷及高色价栀子黄色素。
美国专利US4247698公开了栀子红色素及其生产方法，利用化学或微生物或酶的手段制备栀子红色素。该专利采用游离的酶液水解京尼平苷，由于游离酶溶解于反应体系中，使酶无法从反应体系中分离回收，导致栀子红色素的生产成本高，不利于连续的工业化生产；又由于游离酶也参与呈色反应，可能使制得的色素中杂质较多，显色范围加宽，色泽不纯。
固定化酶技术是近十余年发展起来的酶工程技术，经固定化后，酶的稳定性显著提高，且易从反应系统中分离回收，便于重复利用，在工业生产、化学分析和医药等方面得到应用。
目前，国内外对栀子红色素的纯化浓缩过程，均通过大孔树脂吸附和柱层析纯化，再经浓缩实现，该技术有利于连续化工业化生产，但需要对柱填料进行解吸、再生，工艺复杂，生产周期长，并且浓缩过程能耗高，导致生产成本增加，限制了栀子红色素的开发与应用。
本发明将固定化酶技术和酸沉淀富集法用于制备栀子红色素，可降低生产成本，并减少酶液对色素产品造成的杂质污染，有利于提高产品质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种以栀子提取黄色素副产的京尼平苷为原料，通过碱解、固定化酶酶解、酸沉淀富集，制备栀子红色素的方法，可解决传统工艺中酶液不易分离回收，纯化富集过程复杂，成本高，产品色价低的问题，并可提高资源利用率。
本发明以京尼平苷为原料，通过碱解、酸化、加入固定化酶进行酶解，过滤得酶解液，然后加入伯氨基化合物反应，过滤得栀子红色素溶液；栀子红色素溶液通过酸沉淀，沉淀洗涤中和、脱水、干燥，即得到栀子红色素。
首先，在过量的碱作为催化剂的条件下，通过碱解反应使京尼平苷的侧基脱去甲氧基，改变原有的共轭体系，使其吸收波长发生紫移。同时，碱解产物京尼平苷酸会与过量的碱反应，转变成相应的盐，最终使京尼平苷完全水解，避免未水解的京尼平苷与伯氨基化合物反应，影响最终产物的纯度。
碱解结束后，用酸调节溶液pH至适宜酶解的范围，然后利用固定化酶进行酶解，脱去京尼平苷酸侧基上的糖分子，生成京尼平酸，酶解结束后，回收固定化酶，实现酶的循环利用，降低物耗。
将酶解液与伯氨基化合物反应，过滤得到栀子红色素反应液，利用酸沉淀使栀子红色素从反应液中沉淀出来，实现富集的目的；再经碱中和溶解的方法，使栀子红色素酸沉淀物生成易溶于水的羧酸盐，提高色素的水溶性和均匀性，得到水溶性的栀子红色素。其具体转化过程如下：
其中，R基团与参加反应的伯氨基化合物相对应；Me为Na、K和NH4中的一种或几种的混合物。
本发明一种利用固定化酶制备栀子红色素的方法，具体步骤如下：
（1） 固定化酶的制备
高分子化合物载体加水配制成20g/L～80g/L浓度的溶液，在温度为30℃～55℃条件下，搅拌，使其溶解；然后加入与高分子化合物载体质量比为1：1～1：20的酶，搅拌均匀，置于30℃～55℃的恒温摇床上，50～200转/分钟下振荡0.5h～2h；将上述混合液逐滴滴入0.2mol/L～3.0mol/L的氯化钙溶液中，在3℃～5℃条件下静置30min～150min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，并用0.08mol/L～0.3mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶；
（2）栀子红色素的制备
①原料：以京尼平苷为原料；
②碱解：加入2～10倍京尼平苷质量（W/V）的0.5mol/L～5.0mol/L的碱溶液，反应温度控制在20℃～90℃，反应时间为1h～12h；
③酸化：碱解结束后，用1mol/L～6mol/L的可食用酸溶液调节溶液至pH4.0～pH6.0，得到酸化液，
④酶解：向步骤③得到的酸化液中加入步骤（1）制备的固定化酶进行酶解，固定化酶与酸化液的质量比为1：1～1：50，酶解条件为40℃～70℃，pH4.0～pH6.0，酶解时间为4h～20h；
⑤过滤分离：将步骤④酶解处理后的反应液过滤，得到滤液即为酶解液，同时回收固定化酶；
⑥与伯氨基化合物反应：向步骤⑤得到的酶解液中加入伯氨基化合物，伯氨基化合物与酶解液的质量比为1：5～1：25，反应温度为40℃～90℃，反应时间为2h～96h；搅拌速度为10r/min～200r/min；
⑦过滤：将步骤⑥反应液过滤，得到栀子红色素溶液；
⑧酸沉淀：向步骤⑦所得的栀子红色素溶液中加入酸溶液，调节溶液至pH1～pH3，使其沉淀，静置1h～24h后，收集沉淀物；
⑨洗涤、中和：将步骤⑧得到的沉淀物用水洗涤至pH5～pH6，用0.05mol/L～5.0mol/L的碱溶液溶解沉淀物，并调节至pH7～pH9，得到栀子红色素水溶液；
⑩干燥、粉碎：将步骤⑨得到的栀子红色素水溶液进行脱水、干燥处理，得到的干燥粉末即为所制备的栀子红色素。
其中步骤（1）所述的高分子化合物载体为海藻酸钠，以及海藻酸钠与明胶、变性淀粉、果胶和环糊精中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的碱解中的碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液和碳酸氢钠溶液中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的酸化中的可食用酸溶液为柠檬酸溶液、酒石酸溶液、苹果酸溶液、醋酸溶液、碳酸溶液、乳酸溶液、磷酸溶液和已二酸溶液中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的与伯氨基化合物反应中的氨基化合物为氨基酸、蛋白质和氨基糖中的一种或几种的混合物；所述氨基酸包括甘氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸钠等；所述蛋白质包括牛血清蛋白、大豆蛋白、蛋白胨等；所述氨基糖类包括葡糖胺、半乳糖胺等。
步骤（2）所述的酸沉淀中的酸溶液为盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸、磷酸和乳酸中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的洗涤、中和所用的碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液和碳酸氢铵溶液中的一种或几种的混合物。
上述用于酶解的酶为固定化酶，被固定的酶包括纤维素酶、果胶酶和β-葡糖苷酶中的一种或几种的混合物。固定化酶酶解过程为在反应器中进行的搅拌酶解，或是将固定化酶装入填充柱中，再将酸化液泵入填充柱进行的循环酶解。
本发明方法制备的栀子红色素，易溶于水、30％以下乙醇溶液及50％以下丙酮溶剂；具备良好的热稳定性，0℃～120℃环境下对色素无影响；色素在pH>3范围内具有良好的稳定性，氧化剂和还原剂对色素没有不良影响，葡萄糖和蔗糖溶液对色素没有影响，各种常见食品添加剂的使用基本不影响色素的品质，对金属离子稳定。
本发明方法制备的栀子红色素可以用于纺织工业、塑胶工业和印刷业的着色；可以作为食品着色剂用于粮食、肉制品、水产品等行业加工的着色，可用于配制酒、碳酸饮料、果汁(味)型饮料、果酱、糖果、糕点等；可以用于医药品和化妆品等行业的加工着色。
本发明同传统方法相比较，具有以下优点：
1、反应原料易得，价格低廉。生产工艺简单，反应条件温和，产物易分离，使整个反应过程绿色环保、耗能低。
2、利用固定化酶进行酶解，使酶的稳定性增加，易从反应系统中分离回收，可节省资源，降低成本。
3、本发明栀子红色素的制备方法，通过酸沉淀和碱性溶液溶解来实现对栀子红色素的纯化富集，可降低能耗。
采用本发明方法制备的栀子红色素，其最大吸收波长为530nm，色价E530nm 1% 1cm高于160，色素得率（以京尼平苷重量计）为65% 以上。
关键技术说明：
1、固定化酶酶解技术
将高分子化合物载体以20g/L～80g/L的浓度加到水介质中，在温度为30℃～55℃条件下，搅拌，使其溶解。然后加入与高分子化合物载体质量比为1：1～1：20的酶，搅拌均匀，置于30℃～55℃的恒温摇床上，50r/min～200r/min下振荡0.5h～2h。再将该混合液逐滴滴入0.2mol/L～3.0mol/L的氯化钙溶液中，在3℃～5℃条件下静置30min～150min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，并用0.08mol/L～0.3mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶。所用的高分子化合物载体包括海藻酸钠，以及海藻酸钠与明胶、变性淀粉、果胶和环糊精中的一种或几种的混合物。所述的酶为固定化酶，被固定的酶包括纤维素酶、果胶酶和β-葡糖苷酶中的一种或几种的混合物。
固定化酶酶解条件为40℃～70℃，pH4.0～pH6.0，酶解时间为4h～20h；固定化酶与酸化液的质量体积比为1：1～1：50；酶解过程为在反应器中进行的搅拌酶解，或是将固定化酶装入填充柱中，再将酸化液泵入填充柱进行的循环酶解。固定化酶重复利用20次仍保持90%以上的酶解得率。
2、酸沉淀法纯化富集栀子红色素
通过加酸调节pH至一定范围，使栀子红色素沉淀出来，然后通过用碱溶液来处理沉淀物，使栀子红色素酸沉淀物生成易溶于水的羧酸盐，增强色素的亲水性，提高了色素的水溶性和均匀性，从而实现了对色素的纯化和浓缩过程。该方法纯化栀子红色素的回收率高于95%。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术进行进一步说明。
实施例1：
（1）固定化酶的制备
将30g的海藻酸钠与20g明胶混合，加到1L水中，在40℃条件下，搅拌溶解，加入40g的纤维素酶，搅拌混匀，在40℃恒温摇床上，100r/min振荡0.5h，然后将该混合液逐滴注入1.5mol/L的氯化钙溶液中，在4℃条件下静置60min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.2mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶。
（2）栀子红色素的制备
称取0.5Kg京尼平苷粉末溶于3L浓度为4mol/L的氢氧化钠溶液中，在55℃的摇床上反应8小时，反应结束后，用5mol/L的柠檬酸溶液调节反应液至pH4.5，加入湿重为100g的固定化纤维素酶，于50℃摇床酶解12小时后过滤，回收固定化酶，向酶解液中加入0.3Kg的谷氨酸，在50℃摇床反应48小时，过滤，得栀子红色素反应液。用5mol/L的磷酸溶液调节反应液至pH2.7，放置2小时，过滤，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.1mol/L的碳酸钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH8，经喷雾干燥，即得栀子红色素粉末。
实施例2
（1）固定化酶的制备
将4g的海藻酸钠溶液与2g的变性淀粉混合，加到100ml水中，在40℃条件下，搅拌溶解，加入2g的β-葡糖苷酶，搅拌混匀，在37℃恒温摇床上，50r/min振荡1h，然后将该混合液逐滴注入2.0mol/L的氯化钙溶液中，在4℃条件下静置120min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.2mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶。
（2）栀子红色素的制备
称取15g京尼平苷粉末溶于90ml浓度为3.5mol/L的氢氧化钠溶液中，在50℃的摇床上反应12小时，反应结束后，用5mol/L的柠檬酸溶液调节反应液至pH4.5，加入湿重为5g的固定化β-葡糖苷酶，于50℃摇床酶解8小时后过滤，回收固定化酶，向酶解液中加入8g的谷氨酸钠，在50℃摇床反应36小时，过滤，得栀子红色素反应液。用5mol/L的柠檬酸溶液调节反应液至pH2.5，放置8小时，离心，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH8，经喷雾干燥，即得栀子红色素粉末。
实施例3
（1）固定化酶的制备
将100g海藻酸钠加到8L水中，在38℃下搅拌溶解，加入50g的果胶酶，搅拌混匀，在37℃恒温摇床上，80r/min振荡0.6h，将该混合液逐滴注入2.0mol/L的氯化钙溶液中，在3℃条件下静置100min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.15mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶。
（2）栀子红色素的制备
称取1Kg京尼平苷粉末溶于4L浓度为5mol/L的碳酸钠溶液中，在60℃的摇床上反应12小时，反应结束后，用5mol/L的醋酸溶液调节反应液至pH4.7，加入湿重为150g的固定化果胶酶，于50℃摇床酶解12小时后过滤，回收固定化酶，向酶解液中加入0.8Kg的甘氨酸，在50℃摇床反应48小时，过滤，得栀子红色素反应液。用5mol/L的盐酸溶液调节反应液至pH2.0，放置4小时，过滤，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.3mol/L的碳酸钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH8，经喷雾干燥，即得栀子红色素粉末。
实施例4
（1）固定化酶的制备
将30g海藻酸钠与20g环糊精加到1L水中，在37℃下搅拌溶解，加入30gβ-葡糖苷酶和10g果胶酶，搅拌混匀，在37℃恒温摇床上，120r/min振荡0.5h，将该混合液逐滴注入1.0mol/L的氯化钙溶液中，在5℃条件下静置30min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.2mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶，将固定化酶装入玻璃柱中，制成固定化酶柱；
（2）栀子红色素的制备
在不锈钢反应器中，将1Kg京尼平苷粉末溶于8L浓度为3mol/L的氢氧化钾溶液中，60℃的间歇搅拌反应12小时，反应结束后，用5mol/L的磷酸溶液调节反应液至pH4.7，将反应液泵入固定化酶柱进行酶解，酶解流出液回到不锈钢反应器中，如此循环反应，反应温度55℃，酶解时间8小时，酶解结束后，收集酶解液，向酶解液中加入0.5Kg的半乳糖胺，在55℃下间歇搅拌，反应30小时，过滤，得栀子红色素反应液。用6mol/L的盐酸溶液调节反应液至pH2.0，放置6小时，离心，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.3mol/L的碳酸氢钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH8，经喷雾干燥，即得栀子红色素粉末。
实施例5
（1）固定化酶的制备
将30g海藻酸钠和20g果胶加到1L水中，在45℃下搅拌溶解，加入10g的纤维素酶和10gβ-葡糖苷酶，搅拌混匀，在45℃恒温摇床上，150r/min振荡1h，将该混合液逐滴注入2mol/L的氯化钙溶液中，在4℃条件下静置120min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.1mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶；
（2）栀子红色素的制备
称取0.5Kg京尼平苷粉末溶于1L浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液中，在60℃的摇床上反应12小时，反应结束后，用5mol/L的酒石酸溶液调节反应液至pH4.5，加入湿重为80g的前述制备的固定化酶，于50℃摇床酶解12小时后过滤，回收固定化酶，向酶解液中加入0.5Kg的苯丙氨酸，在50℃摇床反应50小时，过滤，得栀子红色素反应液。用6mol/L的硫酸溶液调节反应液至pH2.5，放置6小时，过滤，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.1mol/L的碳酸氢钠溶液溶解沉淀物，并调节至pH8，经喷雾干燥，即得栀子红色素粉末。
实施例6
（1）固定化酶的制备
将15g海藻酸钠和25g由变性淀粉、环糊精和明胶按任意比例混合所组成的混合物加到1L水中，在50℃下搅拌溶解，加入10g的纤维素酶、5gβ-葡糖苷酶和10g果胶酶，搅拌混匀，在45℃恒温摇床上，200r/min振荡0.6h，将该混合液逐滴注入1.0mol/L的氯化钙溶液中，在4℃条件下静置30min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，用0.2mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集凝胶小球得到固定化酶；
（2）栀子红色素的制备
在不锈钢反应器中，称取0.5Kg京尼平苷粉末溶于2L浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液中，在60℃下反应8小时，连续搅拌，反应结束后，用4mol/L的已二酸溶液调节反应液至pH4.0，加入湿重为50g的前述制备的固定化酶，于50℃下酶解12小时，连续搅拌，过滤，回收固定化酶，向酶解液中加入0.4Kg的牛血清蛋白，在50℃反应60小时，搅拌，反应结束后过滤，得栀子红色素反应液。用5mol/L的醋酸溶液调节反应液至pH2.0，放置3小时，离心，收集沉淀，水洗沉淀至pH5，用0.2mol/L的碳酸钾溶液溶解沉淀物，并调节至pH8，经喷雾干燥，即得栀子红色素粉末。
上述实施例1～6中，高分子化合物载体包括海藻酸钠，以及海藻酸钠与明胶、变性淀粉、果胶和环糊精中的一种或几种的混合物；被固定的酶包括纤维素酶、果胶酶和β-葡糖苷酶中的一种或几种的混合物；用于碱解的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种或几种的混合物；用于酸化的可食用酸包括柠檬酸、酒石酸、苹果酸、醋酸、碳酸、乳酸、磷酸和已二酸中的一种或几种的混合物；酶解过程为在反应器中进行的搅拌酶解，或是将固定化酶装入填充柱中，再将酸化液泵入填充柱进行的循环酶解；参与反应的伯氨基化合物包括氨基酸、蛋白质和氨基糖中的一种或几种的混合物；用于富集栀子红色素的酸包括盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸、磷酸和乳酸中的一种或几种的混合物；用于中和并溶解酸沉淀物的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾和碳酸氢铵中的一种或几种的混合物；其用量及固定化酶的循环使用次数应视具体情况来做适当的调整。
Claims (5)
1.一种利用固定化酶制备栀子红色素的方法，其特征在于：以京尼平苷为原料，通过碱解、酸化、加入固定化酶进行酶解，过滤得酶解液，然后加入伯氨基化合物反应，过滤得栀子红色素溶液；栀子红色素溶液通过酸沉淀，沉淀洗涤中和、脱水、干燥，即得到栀子红色素。
2.根据权利要求1所述的利用固定化酶制备栀子红色素的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
（1） 固定化酶的制备
高分子化合物载体加水配制成20g/L～80g/L浓度的溶液，在温度为30℃～55℃条件下，搅拌，使其溶解；然后加入与高分子化合物载体质量比为1：1～1：20的酶，搅拌均匀，置于30℃～55℃的恒温摇床上，振荡0.5h～2h；将上述混合液逐滴滴入0.2mol/L～3.0mol/L的氯化钙溶液中，在3℃～5℃条件下静置30min～150min，使其凝聚固化，收集凝胶小球，并用0.08mol/L～0.3mol/L的氯化钠溶液洗涤，抽滤除去游离水分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶；
（2）栀子红色素的制备
①原料：以京尼平苷为原料；
②碱解：加入2～10倍京尼平苷质量（W/V）的0.5mol/L～5.0mol/L的碱溶液，反应温度控制在20℃～90℃，反应时间为1h～12h；
③酸化：碱解结束后，用1mol/L～6mol/L的可食用酸溶液调节溶液至pH4.0～pH6.0，得到酸化液，
④酶解：向步骤③得到的酸化液中加入步骤（1）制备的固定化酶进行酶解，固定化酶与酸化液的质量比为1：1～1：50，酶解条件为40℃～70℃，pH4.0～pH6.0，酶解时间为4h～20h；
⑤过滤分离：将步骤④酶解处理后的反应液过滤，得到滤液即为酶解液，同时回收固定化酶；
⑥与伯氨基化合物反应：向步骤⑤得到的酶解液中加入伯氨基化合物，伯氨基化合物与酶解液的质量比为1：5～1：25，反应温度为40℃～90℃，反应时间为2h～96h；
⑦过滤：将步骤⑥反应液过滤，得到栀子红色素溶液；
⑧酸沉淀：向步骤⑦所得的栀子红色素溶液中加入酸溶液，调节溶液至pH1～pH3，使其沉淀，静置1h～24h后，收集沉淀物；
⑨洗涤、中和：将步骤⑧得到的沉淀物用水洗涤至pH5～pH6，用0.05mol/L～5.0mol/L的碱溶液溶解沉淀物，并调节至pH7～pH9，得到栀子红色素水溶液；
⑩干燥、粉碎：将步骤⑨得到的栀子红色素水溶液进行脱水、干燥处理，得到的干燥粉末即为所制备的栀子红色素。
3.根据权利要求2所述的利用固定化酶制备栀子红色素的方法，其特征在于：步骤（1）所述的高分子化合物载体为海藻酸钠，以及海藻酸钠与明胶、变性淀粉、果胶和环糊精中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的碱解中的碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液和碳酸氢钠溶液中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的酸化中的可食用酸溶液为柠檬酸溶液、酒石酸溶液、苹果酸溶液、醋酸溶液、碳酸溶液、乳酸溶液、磷酸溶液和已二酸溶液中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的与伯氨基化合物反应中的氨基化合物为氨基酸、蛋白质和氨基糖中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的酸沉淀中的酸溶液为盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸、磷酸和乳酸中的一种或几种的混合物；
步骤（2）所述的洗涤、中和所用的碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液和碳酸氢铵溶液中的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求2所述的一种利用固定化酶制备栀子红色素的方法，其特征在于：步骤（1）所述的酶为纤维素酶、果胶酶和β-葡糖苷酶中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求2所述的一种利用固定化酶制备栀子红色素的方法，其特征在于：步骤（2）所述的酶解过程为在反应器中进行的搅拌酶解，或是将固定化酶装入填充柱中，再将酸化液泵入填充柱进行的循环酶解。
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