CN101830966A - 一种蛋白质水解工艺及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种蛋白质水解工艺及其应用，涉及蛋白质水解方法技术领域。是将蛋白质置于无机矿物酸和有机酸的混合体系中进行加热水解，得到蛋白质的氨基酸复合液；本发明可显著降低盐酸等矿物酸的用量，得到的水解液进行减压蒸馏可全部回收有机酸；可显著提高含有大量疏水氨基酸的蛋白质的疏水氨基酸的水解得率，具有原理独特、收率高、成本低、污染少、易于进行规模化生产的特点，有较好的经济效益和社会效益；特别适用于疏水氨基酸含量高的蛋白质如角蛋白的水解及其他所有蛋白质如球蛋白、血红蛋白等的高效水解；水解液经进一步处理可得到复合氨基酸，可用于提取其中含有的高价值氨基酸如胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸等。

Description

一种蛋白质水解工艺及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白质水解方法技术领域。

背景技术

蛋白水解成氨基酸后可显著增加动物及人类对蛋白质中氨基酸的吸收率，提高蛋白质的利用效率。把蛋白质水解成氨基酸也是分析蛋白质中的氨基酸成分、以及工业化提取蛋白质中的一些高价值氨基酸(如胱氨酸等)的必需步骤。酸水解(主要采用矿物酸如盐酸、硫酸)是蛋白质水解的经典方法，也是目前实验室研究及工业水解蛋白质的主流方法。蛋白质酸水解的标准方法是使用浓度为5mol/L～10mol/L的盐酸、以及HCl/蛋白质的液固质量比(W/W)为2∶1以上的盐酸在105-120℃常压回流水解8-72小时。实验室蛋白质的水解一般要求在脱氧后的密封石英瓶中进行，操作十分麻烦。现有矿物酸水解工艺的主要缺点是：

1)由于酸水解蛋白质的化学原理是质子(H⁺)催化的肽键(酰胺键)的水解，所以H⁺接近肽键是水解的基本前提。在矿物酸水解蛋白质的过程中，由于极性很低的疏水氨基酸侧链对H⁺的屏蔽效应，H⁺很难接近由疏水氨基酸组成的肽键，所以在矿物酸(H⁺)催化的水解反应中，由疏水氨基酸组成的肽键的水解很困难，造成疏水氨基酸的水解效(收)率较低。

2)矿物酸用量太大造成水解成本高而且污染严重。由于酸水解主要使用的HCl在110℃的水解条件下有大量HCl蒸汽形成，HCl蒸汽对厂房及设备腐蚀严重，泄漏到环境还严重污染环境并危害人体健康，所以HCl蒸汽是蛋白质水解产业的主要污染源之一。目前，这些生产厂家也面临越来越大的环保压力。

3)高浓度的无机酸在高温下水解蛋白质会破坏一些敏感氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺、磷酸丝氨酸、色氨酸)及部分热敏氨基酸如丝氨酸、苏氨酸等)，降低蛋白质的营养价值。

所以，如何在降低矿物酸的用量、减少环境污染的同时达到高效而完全地水解蛋白质(特别是一些难水解蛋白质如角蛋白)一直是蛋白质科学研究及蛋白质水解生产氨基酸产业面临的重要课题之一。前人对此进行了大量研究，对此的解决方法主要有：

1)加大酸的用量，提高水解体系中H⁺的浓度。在一般的蛋白质如球蛋白水解工艺中，一般采用6mol/L的HCl即可。而含有大量疏水氨基酸的蛋白质如角蛋白的水解一般采用高达10mol/L浓度的HCl，而且HCl与蛋白的液固比达到2∶1以上才能达到完全水解。这也是目前胱氨酸生产行业的通用水解条件。这种方法酸用量大、成本高、污染严重。

2)改变水解条件。例如，有人采用微波等来加快水解的速度(例如；H.Y.Zhang；S.L.Marcus；L.Li；J.Am.Soc.Mass Spectrom.，16：471-481，2005)。但由于微波加热的水解反应的不均匀性问题、微波辐射问题，微波-HCl水解目前还是一种研究性的蛋白水解方法，在生产中还未见有大规模应用。有人采用高温超临界水解(Zhu Xian，Zhu Chao，Zhao Liang，Cheng Hongbin；Chinese Journal of Chemical Engineering，16(3)：456-460，2008)。由于此方法成本高昂，难以推广到产业之中。

3)添加水解促进剂；例如添加三氟乙酸(Trifloroacetic acid，TFA；参考文献如：A.Tsugita & Jean-Jacques Schaffler，Eur.J.Biochem.，124：585-588，1982；A.Tsugita，T.Uchida，H.W.Mewes；T.Ataka.；J.Biochem，1987，102(6)：1593-1597，1987；A.Tsugita，H.W.Mewes；T.Ataka.；US Patent 5049657；Armanet，Jean-Michel，Giddey，Claude，Sachetto，Jean-Pierre，US Patent 4665158)。由于三氟乙酸的价格很高，难以在生产中大规模应用。还有人采用methanesulfonic acid(例如：R.S.Simpson；M.R.Neuberger；T.Y.Liu；J.Bio.Chem.，250(7)：1936-1940，1976；M.Weiss，M.Manneberg，J.F.Juranville，H.W.Lahm，M.Fountoulakis；Journal ofChromatography A，795(2)：263-275，1998)及p-Toluenesulfonic acid(例如：T.Y.Liu；Y.H.Chang.；Journal of Biological Chemsitry.246(9)：2842-2848，1971)进行蛋白水解。以上水解方法均作为研究性的水解方法，由于成本高等原因，尚未在生产中推广。

Rao Pingfan & Fiji Fuzhou采用稀有机酸(0.5-1.5mol/L)用于蛋白质的部分水解成肽(US Patent 5849882，1998)，但是这种方法不能将蛋白质水解成氨基酸，更不可能将角蛋白等含有大量疏水氨基酸的蛋白质完全水解成氨基酸。

有机酸具有催化肽键水解的质子(H⁺)，同时具有与疏水氨基酸侧链结构类似的有机侧链，所以可以有效渗透进入由疏水氨基酸组成的肽键，因而可以促进含有疏水氨基酸的蛋白质的水解。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白质水解工艺及其应用，本发明采用无机矿物酸与有机酸的混合体系中对蛋白进行水解，可显著降低盐酸等矿物酸的用量，显著提高含有大量疏水氨基酸的蛋白质(如角蛋白)水解后氨基酸的收率，可有效保存胱氨酸等热敏感氨基酸。本发明具有原理独特、收率高、成本低、污染少、易于进行规模化生产的特点，具有较好的经济效益和社会效益。此水解工艺特别适用于疏水氨基酸含量高的蛋白质如角蛋白的水解，也适用的其他所有蛋白质如球蛋白、血红蛋白等的水解。其水解液经进一步处理可制得复合氨基酸，此复合氨基酸可用于提取纯化其中含有的高价值氨基酸如胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸等。

本发明之一是这样实现的：一种蛋白质水解工艺，特征在于将蛋白质置于无机矿物酸和水解促进剂一有机酸的混合体系中进行加热水解，得到氨基酸复合液；所述的蛋白质为疏水氨基酸含量高的蛋白质(如角蛋白)和其他所有蛋白质。

所述的无机矿物酸的浓度为5mol/L～10mol/L为较好，用量为角蛋白重量相同较好，即蛋白/无机酸＝1∶1(W/W)；加入无机矿物酸后再加入有机酸，有机酸的添加比例为蛋白质重量的10％～100％较好；混匀后最后加入待水解的蛋白质，然后加热回流水解。

所述的加热水解的温度较佳为80℃～120℃，水解时间较佳为6小时～24小时。

所述的无机矿物酸为HCl、H₂SO₄或H₂PO₄等。

所述的有机酸为甲酸、乙酸(冰乙酸)、丙酸、丁酸、乳酸或柠檬酸等。

所述的有机酸的加入量为角蛋白重量为1％～100％。

所述的疏水氨基酸含量高的蛋白质为角蛋白等。

所述的其他所有蛋白质包括球蛋白或血红蛋白(血粉)等。

本发明之二是这样实现的：上述蛋白质水解工艺的应用，其特征在于用于疏水氨基酸含量高的蛋白质如角蛋白的水解，及其他所有蛋白质的高效水解，水解产物可经进一步处理制的复合氨基酸和其中含有的高价值氨基酸的提取。

所述的疏水氨基酸含量高的蛋白质为角蛋白等；所述的高价值氨基酸为胱氨酸、酪氨酸、精氨酸或亮氨酸等。

本发明的积极效果是：本发明解决了已有技术中长期存在的人们一直想解决而又一直未能解决的问题；无机矿物酸与有机酸的混合体系中对蛋白进行水解，可显著降低盐酸等矿物酸的用量，降低酸水解的成本；对得到的水解液进行减压蒸馏还可全部回收有机酸，回收的有机酸可循环用于蛋白质的水解。本发明可显著提高含有大量疏水氨基酸的蛋白质水解后的疏水氨基酸的收率，同时可有效保存胱氨酸及丝氨酸等热敏感氨基酸，具有原理独特、收率高、成本低、污染少、易于进行规模化生产的特点，具有较好的经济效益和社会效益；此水解工艺特别适用于疏水氨基酸含量高的蛋白质如角蛋白的水解，也适用的其他所有蛋白质如球蛋白、血红蛋白等的水解。上述方法所产生的水解液经过中和、脱盐、可得到液体复合氨基酸，干燥后成为固体复合氨基酸；水解所产生的水解液可应用于提取其中的高价值氨基酸如胱氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等。

以下结合实例作详述，但不作为对本发明的限定。

具体实施方式

实施例1：

取10mol/L的工业盐酸400克，加入400克冰乙酸，混匀后加入三角烧瓶中，另取人类清洗后的毛发400克装入3升的三角烧瓶中。回流加热，待毛发结构完全崩解后开始计时，保持微沸状态(水解液的温度约110℃)10小时。从4小时开始，每小时取50毫升水解液，活性炭脱色过滤后，用凯氏定氮法测定溶液的蛋白质含量，用Bradford法(考马斯亮蓝法)测定角蛋白的水解程度。以Bradford法(考马斯亮蓝法)测定水解液的颜色为无色时表明角蛋白已经水解完全。采用水温为60℃进行减压蒸馏，冰乙酸将首先被蒸馏。回收冰乙酸后，继续减压蒸馏水解液至浓稠的半固体状，再加入300毫升去离子水，混匀后继续蒸馏，去除盐酸。重复蒸馏去盐酸步骤3次可以去除绝大部分游离盐酸(质子化氨基酸的氨基及羧基的质子(H⁺)无法蒸馏去除)。用碱中和得到复合氨基酸。根据提取氨基酸(如胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、亮氨酸等)的具体需要，用碱(NaOH，KOH，NH₄)中和水解液至所需要的pH后进行氨基酸提取纯化。

实施例2：

取10mol/L(约30％)的工业盐酸400克，加入200克冰乙酸，混匀后加入3升的三角烧瓶中，另取清洗干净的羽毛400克装入的三角烧瓶中。回流加热，待毛发结构完全崩解后开始计时，保持微沸状态(水解液的温度约110℃)10小时。从水解4小时开始，每小时取50毫升水解液，活性炭脱色过滤后，用凯氏定氮法测定溶液的蛋白质含量，用Bradford法(考马斯亮蓝法)测定角蛋白的水解程度。以Bradford法(考马斯亮蓝法)测定水解液的颜色为无色时表明角蛋白已经水解完全。采用水温为60℃减压蒸馏，冰乙酸将首先被蒸馏。回收冰乙酸后，继续减压蒸馏至浓稠的半固体状，再加入300毫升去离子水，混匀后继续蒸馏，去除盐酸。重复蒸馏去盐酸步骤3次可以去除绝大部分游离盐酸(酸化氨基酸氨基及羧基的质子(H⁺)无法蒸馏去除)。用碱(NaOH，KOH，NH₄)中和水解液至pH7.0左右，脱盐后得到液体复合氨基酸，干燥后得到固体复合氨基酸。根据提取高价值氨基酸(如胱氨酸及酪氨酸)的需要，用碱(NaOH，KOH，NH₄)中和水解液至pc.0-5.5，静置48小时后，过滤得到的固体部分用于提取胱氨酸及酪氨酸等氨基酸，液体部分用于精氨酸等的提取。

实施例3～9工艺条件见附表。

实施例3～9工艺条件表附表

注：1、上表中的水解时间表示在上述反应体系及反应温度的条件下蛋白质完全水解成为氨基酸的时间。2、在所述参数范围内，其他实施例效果亦较好(略)。

Claims (10)

1.一种蛋白质水解工艺，特征在于将蛋白质置于无机矿物酸和有机酸的混合体系中进行加热水解，得到蛋白质的氨基酸复合液；所述的蛋白质为疏水氨基酸含量高的蛋白质如角蛋白和其他所有蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质水解工艺，其特征在于所述的无机矿物酸的浓度为5mol/L～10mol/L，用量为角蛋白重量相同为优，即蛋白/无机酸＝1∶1(W/W)；加入无机矿物酸后再加入有机酸，有机酸的添加比例为蛋白质重量的1％～100％；混匀后最后加入待水解的蛋白质，然后加热水解。

3.根据权利要求2所述的蛋白质水解工艺，其特征在于所述的加热水解的温度为80℃～120℃，水解时间为6小时～24小时。

4.根据权利要求2所述的蛋白质水解工艺，其特征在于所述的无机矿物酸为HCl、H₂SO₄或H₂PO₄。

5.根据权利要求2所述的蛋白质水解工艺，其特征在于所述的有机酸为冰乙酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸或柠檬酸。

6.根据权利要求4所述的蛋白质水解工艺，其特征在于所述的冰乙酸加入量为角蛋白重量为1％～100％。

7.根据权利要求1所述的蛋白质水解工艺，其特征在于所述的疏水氨基酸含量高的蛋白质为角蛋白。

8.根据权利要求1所述的蛋白质水解工艺，其特征在于所述的其他所有蛋白质如球蛋白或血红蛋白。

9.根据权利要求1～8中的任一种蛋白质水解工艺的应用，其特征在于用于疏水氨基酸含量高的蛋白质如角蛋白的水解，或其他所有蛋白质的高效水解，水解产物可经进一步处理制取复合氨基酸和其中含有的高价值氨基酸的提取纯化。

10.根据权利要求9所述的蛋白质水解工艺的应用，其特征在于所述的疏水氨基酸含量高的蛋白质为角蛋白；所述的高价值氨基酸为胱氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸或亮氨酸。