CN101825615B - 一种原位聚合蛋白质快速酶解整体柱的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学和蛋白质组学领域，具体涉及一种原位聚合蛋白质毛细管快速酶解整体柱的制备方法，并将此整体柱用于酶解完整蛋白质样品，实现对蛋白质的快速酶解，并对酶解后的肽段直接进行基质辅助激光解析离子化质谱的分析和鉴定。此类毛细管快速酶解整体柱适用于与高效液相色谱的连用，在蛋白质组学的研究中有着巨大的应用潜力。

Description

一种原位聚合蛋白质快速酶解整体柱的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分析化学和蛋白质组学领域，具体涉及一种毛细管快速酶解整体柱，包括其制备方法，以及在蛋白质分析中的应用。

背景技术

90年代中期，在人类基因组计划(Human Genomic Project)研究发展及功能基因组学的基础上，国际上萌发产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)，它以蛋白质组(Proteome)为研究对象。蛋白质组学(proteomics)已经成为功能基因组学研究的重要领域，其重要性和战略意义日益显著。

过去几年里，蛋白质组研究普遍采用的方法是：基于二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)对数千种蛋白质进行分离、染色获得蛋白质二维谱，将蛋白质斑点转移、酶解后通过生物质谱鉴定获得结构信息。但是由于其自身存在许多不足和一些难以克服的缺陷，比如有限的动态范围，疏水蛋白以及极酸极碱蛋白的分辨能力比较差，而且其操作过程费时费力，自动化程度低。为此，人们又发展了蛋白质组研究的其它新技术。其中最引人注目的方法就是基于多维色谱的“鸟枪法”(shot-gun method)，即先将蛋白酶切成肽段，然后用二维液相色谱串联质谱来鉴定蛋白质的方法，显著提高了蛋白质鉴定的通量和自动化程度。然而，由于全蛋白酶解后肽谱的大量重复造成分离和鉴定上的困难，而且这种完全依赖肽段的分离鉴定的技术丢失了大量的完整蛋白质的生物学信息，因此“鸟枪法”也不能完全满足蛋白质组分析的需要。随着技术的发展，有着快速、低成本、保留大量生物学信息等优势的多维液相色谱分离耦合蛋白质酶解及质谱鉴定的技术路线(top-down method)得到了高度重视，即完整蛋白质直接经多维色谱分离后进行快速酶解，酶解成肽段后再经过质谱鉴定。该技术路线的主要挑战就是如何实现蛋白质分离后的快速酶解。固定化酶微反应器技术是目前研究的热点，一旦得以突破，这一技术路线将是shot-gun技术和2D-PAGE技术的有力补充方法或替代方法。

固定化酶微反应器以其本身特有的高的酶/底物比、高的酶解效率、可重复使用并能减少酶的自身降解等优势以及在蛋白质组学和化学酶工程等领域潜在应用前景而得到广泛的关注。固定化酶微反应器融合了固定化酶的高效酶解的特性和微反应器的适宜微量反应及易操作等优点，使得其为实现微量蛋白质的快速酶解成为可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能快速高效酶解蛋白质的毛细管酶解整体柱，及其制备方法，以及在蛋白质分析中的应用。

本发明的目的通过下述方法和步骤实现：

1、蛋白质快速酶解毛细管整体柱的制备：通过丙烯酰基化反应在酶分子表面接上带有双键的活性基团，然后经过自由基引发使单体分子与带有活性基团的酶分子进行原位聚合反应，同时将聚合物固定到事先经过处理的毛细管中，实现毛细管蛋白质快速酶解整体柱的制备。反应示意图如图1所示。

2、快速酶解：将蛋白溶液在蠕动泵的推动下，以一定的流速经过毛细管酶解整体柱进行酶解，酶解后的流出物直接点到192孔的标准靶板上。

3、质谱分析：靶板上的流出液直接与基质均匀混合，无需转移等样品前处理，进行基质辅助激光解析离子化质谱的分析。根据质谱结果，进行蛋白质鉴定。

本发明所述的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱的制备方法如下：

1、毛细管清洗及内壁化学修饰：石英毛细管(内径：75μm、250μm、320μm)截为5-8cm每段，依次用甲醇清洗5min，纯水清洗5min，0.1mol/L氢氧化钠清洗30min，纯水清洗5min，0.1mol/L盐酸清洗30min，纯水清洗5min，甲醇清洗5min，洗去管内杂质，使内壁的硅羟基暴露出来。用微流注射针泵向毛细管中注满50％的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-methacryloxypropyltrimethoxysilane，γ-MAPS)甲醇液，室温下反应24h，使毛细管内壁接上碳碳双键。

2、酶分子表面的化学修饰：称取2.8-28mg N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(N-acryloxysuccinimide，NAS)溶于0.3mL-3.0mL DMSO中，缓慢加入到5mL的胰蛋白酶(Trypsin)溶液中(2mg/mL，新鲜溶解在100mM，PH＝9.0-9.5的硼酸缓冲溶液中)37℃反应三个小时，使NAS的双键接在酶的表面。反应完成后使用Sephadex G-25凝胶柱纯化，冻干浓缩至100μL，保存于零下80℃。

3、原位聚合及固定：称取20-80mg丙烯酰胺、20-80mg甲叉丙烯酰胺、30-120mg聚乙二醇(分子量一万到二万)，加入0.1-0.5mL氯化钠溶液(0.5mol/L)和0.1-0.5mL碳酸氢钠(0.2mol/L)溶液，配成单体溶液。取50μL单体液加入到3μL修饰过的酶液中，超声搅拌后，依次加入0.1μL N，N，N′，N′-四甲基乙烯基二胺(N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED)和0.4μL 5％过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)作引发剂，然后迅速将毛细管插入到溶液中，在虹吸力的作用下毛细管中注满单体溶液，毛细管两头用橡胶垫封口，常温下原位聚合反应40min，于是带有双键的酶分子与单体发生聚合反应，在毛细管中均匀胶连构成整体柱。

本发明中修饰后的酶和凝胶液单体的胶连反应属于自由基反应，因此反应一旦被引发就会加速进行。常温下整体柱的形成只需要五到十分钟，反应时间非常之短。为了降低反应初期的速度，引发反应时可采用冰水浴。

本发明所述的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱，可适用于胰蛋白酶、辣根过氧化酶、枯草杆菌酶等。酶解条件：pH值在8.0-8.5之间，样品浓度是0.5-5ng/μL，流速控制为0.1-10.0μL/min，酶解温度为25-45摄氏度。

本发明所述的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱，其制备方法的特征是，先在酶分子表面接上双键基团，然后在自由基的引发下与单体发生原位聚合，同时固定于毛细管内壁。

本发明所述的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱，在应用于蛋白质分析时，无需进行其它样品转移和洗脱，操作简单，酶解效率高，可重复使用，酶解后的馏分直接与基质混合，进行基质辅助激光解析离子化质谱的分析。本发明是固定化酶技术的一个全新发展，制备方法简单有效，应用过程方便高效，效果好。

附图说明

图1是本发明所述的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱制备反应示意图。

图2是原位聚合法蛋白质快速酶解整体柱的毛细管内部结构的扫描电镜图。

图3是自由的胰蛋白酶分子(A)和表面丙烯酰基化的胰蛋白酶(B)和表面丙烯酰基化的胰蛋白酶与单体发生原位聚合后的聚合物(C)的傅立叶变换红外谱图。将三者的红外图谱比较可见，经过表面修饰和原位聚合后成功制备了以酶分子为核心的聚合物。

图4是马肌红蛋白(A)和牛血清白蛋白(B)经过蛋白质快速酶解毛细管整体柱酶解成肽段后的MALDI-TOF MS谱图。从图上可以看出两种蛋白质的主要特征肽段峰都被检测出来，强度较强，说明该酶解整体柱成功的运用到标准蛋白质的酶解应用中。

具体实施方案

以下结合具体的实施例，对本发明做进一步的阐述。实施例仅用于对本发明做说明而不是对本发明的限制。

实施例1：

蛋白质快速酶解毛细管整体柱的制备：

毛细管清洗与活化：石英毛细管(内径：250μm)截为6cm每段，依次用甲醇清洗5min，纯水清洗5min，0.1mol/L氢氧化钠清洗30min，纯水清洗5min，0.1mol/L盐酸清洗30min，纯水清洗5min，甲醇清洗5min，洗去管内杂质，使内壁的硅羟基暴露出来。用蠕动泵向毛细管中注满50％的γ-MAPS甲醇液，室温下避光反应24h，使毛细管内壁接上碳碳双键。

酶分子表面的化学修饰：10mg的Trypsin溶液中新鲜溶解在5mL，100mmol/L，PH＝9.3的硼酸缓冲溶液中，并加入一定质量的苯甲咪，使其终浓度为0.5mol/L，称取2.5mg NAS溶于300μL DMSO中，缓慢加入到37摄氏度反应三个小时，使NAS的双键接在酶的表面。反应完成后使用Sephadex G-25凝胶柱纯化，冻干浓缩至100μL，保存于零下80摄氏度。

原位聚合反应：称取40mg丙烯酰胺、40mg甲叉丙烯酰胺、60mg聚乙二醇(分子量一万)，加入250μL氯化钠溶液(0.5mol/L)和250μL碳酸氢钠(0.2mol/L)溶液，配成单体溶液。取50μL单体液加入到3μL修饰过的酶液中，超声搅拌后，依次加入0.1μL TEMED和0.4μL 5％APS作引发剂，然后迅速将毛细管插入到溶液中，在虹吸力的作用下毛细管中注满单体溶液，毛细管两头用橡胶垫封口，常温下原位聚合反应40min，于是带有双键的酶分子与单体发生聚合反应，在毛细管中均匀胶连构成整体柱。

实施例2：

蛋白质快速酶解整体柱对标准蛋白马肌红蛋白(Myo)的酶解和质谱测定：

50μg MYO溶解在50μL的25mM碳酸氢铵溶液中，接着在蠕动泵的推动下以3μL/min的流速通过酶解整体柱，酶解产物流出后直接逐个点到192孔的MALDI靶板上，每个点的体积约为1μL，并于室温下快速风干缩小至约0.5μL时，在每个点上加入0.4μL的基质溶液(α-氰基-4-羟基肉桂酸CHCA)，二者混合风干后用于质谱鉴定。在MALDI-TOF/TOF(4700 Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)；激光器为Nd-YAG激光，波长355nm，激光脉冲频率200Hz；加速电压20KV；正离子模式，反射式TOF检测。由图4A所示，主要特征肽段峰都被检测出来，强度较强，说明该蛋白质经过毛细管酶解整体柱之后得到有效酶解。

实施例3：

配制牛血清白蛋白(BSA)的浓度为1μg/μL，配制方法和其它条件同实例2，重复上述酶解和质谱实验，结果如图4B。同样，BSA的主要特征肽段峰都被检测出来，强度较强，说明该蛋白质经过毛细管酶解整体柱之后得到有效酶解。

实施例4：

如实施例2，调整蠕动泵的流速控制为1、2、3、4、5μL/min，相当于酶解时间分别为147、74、49、37、30秒，其它条件同实例2，进行最佳流速、酶解时间和质谱实验。

实施例5：

如实施例2，调整酶解温度为25、30、37、45摄氏度，pH值为8.0、8.5，其它条件同实例2，进行酶解温度和质谱实验。

Claims (7)

1.一种原位聚合蛋白质快速酶解整体柱的制备方法，其特征在于首先利用丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的活性酯基团与蛋白酶上的氨基发生反应，使酶的分子表面接上双键基团，然后利用原位聚合反应将酶分子进行包埋，同时键合到处理的毛细管中形成整体柱；所述方法包括步骤：

(1)毛细管清洗：石英毛细管截为5-8cm每段，依次用甲醇清洗5min，纯水清洗5min，0.1mol/L氢氧化钠清洗30min，纯水清洗5min，0.1mol/L盐酸清洗30min，纯水清洗5min，甲醇清洗5min，洗去管内杂质，使内壁的硅羟基暴露出来；

(2)毛细管内壁化学修饰：用微流注射针泵向毛细管中注满50％的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷甲醇液，室温下反应24h，使毛细管内壁接上碳碳双键；

(3)酶分子表面的化学修饰：称取2.8-28mg N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于0.3mL-3.0mL DMSO中，缓慢加入到5mL的胰蛋白酶溶液中37℃反应三个小时，使N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的双键接在酶的表面，反应完成后使用Sephadex G-25凝胶柱纯化，冻干浓缩至100μL，保存于零下80℃；

(4)原位聚合反应：称取20-80mg丙烯酰胺、20-80mg甲叉丙烯酰胺、30-120mg聚乙二醇，加入0.1-0.5mL氯化钠溶液和0.1-0.5mL的碳酸氢钠溶液，配成单体溶液，取50μL单体液加入到3μL修饰过的酶液中，超声搅拌后，依次加入0.1μL N，N，N′，N′-四甲基乙烯基二胺和0.4μL 5％过硫酸铵作引发剂，然后迅速将毛细管插入到溶液中，在虹吸力的作用下毛细管中注满单体溶液，毛细管两头用橡胶垫封口，常温下原位聚合反应40min，于是带有双键的酶分子与单体发生聚合反应，在毛细管中均匀胶连构成整体柱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中先在酶分子表面接上双键基团，然后在自由基的引发下与单体发生原位聚合，同时固定于毛细管内壁。

3.根据权利要求1所述的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱的制备方法，其特征在于其中步骤1)的石英毛细管内径为75μm、250μm或320μm。

4.根据权利要求1所述的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱的制备方法，其特征在于其中步骤3)的胰蛋白酶溶液为2mg/mL，其新鲜溶解在100mM，pH＝9.0-9.5的硼酸缓冲溶液中。

5.根据权利要求1所述的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱的制备方法，其特征在于其中步骤4)的聚乙二醇分子量为1-2万，所述的氯化钠溶液为0.5mol/L，所述碳酸氢钠溶液为0.2mol/L。

6.按权利要求1的方法制得的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱在胰蛋白酶、辣根过氧化酶或枯草杆菌酶蛋白质分析中的应用。

7.按权利要求5的应用，其特征在于，所述的蛋白质分析中包括步骤：

(1)制得权利要求1的原位聚合蛋白质快速酶解整体柱；

(2)在蠕动泵的推动下，将蛋白溶液以一定的流速经过毛细管酶解整体柱进行酶解，酶解条件是pH值在8.0-8.5之间，样品浓度是0.5-5ng/μL，酶解温度在25-45摄氏度之间，流速在0.1-10μL/min，流出液直接点在标准的192孔的MALDI靶板上；

(3)靶板上的流出液直接与基质均匀混合，进行基质辅助激光解析离子化质谱的分析，根据质谱结果，进行蛋白质鉴定。

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