CN101824401A - 葡聚糖酶、其编码核酸及其表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及葡聚糖酶、其编码核酸及其表达，尤其是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)来源的β-1，3-1，4葡聚糖酶，其编码序列、重组载体、转化细胞及其表达和生产。

Description

葡聚糖酶、其编码核酸及其表达

技术领域

本发明涉及葡聚糖酶、其编码序列、含有该序列的重组质粒和菌株，以及由所述序列编码的葡聚糖在大肠杆菌中的表达和在酵母细胞中的发酵生产。

背景技术

葡聚糖是禾本科高等植物细胞壁中的结构非淀粉多糖，在谷物(大麦、燕麦、高梁、大米和小麦)的胚乳细胞中含量尤其丰富。

葡聚糖是由D型β构像葡聚糖连接的多糖聚合物，具有线性的空间结构。依据糖苷键连接的不同，β-葡聚糖可以分为1，4-β-葡聚糖，1，3-β-葡聚糖，1，6-β-葡聚糖，1，3-1，6-β-葡聚糖，1，3-1，4-β-葡聚糖等。其中1，3-1，4-β-葡聚糖是由β-1，3和β-1，4混合的糖苷键连接，通常是由β-1，4糖苷键连接葡萄糖形成纤维三糖和纤维四糖，在由β-1，3糖苷键相互连接成直链多聚体形式。在大麦和燕麦等淀粉胚乳的细胞壁中含量在70％左右。

β-1，3-1，4-葡聚糖属植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，是以混合(1→3)和(1→4)-β糖苷键连接形成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于麦类和糠麸中，在大麦整粒和胚乳中的含量高达4％～8％。β-葡聚糖会给啤酒生产带来一系列问题，如降低麦汁分离速度和麦汁浸出量，啤酒混浊度和胶状沉淀物增多，啤酒过滤速度减慢。在啤酒生产过程中添加β-葡聚糖酶能有效地解决上述问题。β-1，3-1，4-葡聚糖主要被3种葡聚糖内切酶分解，它们是β-1，4-葡聚糖酶β-1，3-葡聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶。另外，葡聚糖外切酶也起一定的作用。其中作用最强的是β-1，3-1，4-葡聚糖酶，它分解β-1，3-1，4-葡聚糖中β-1，3-键邻接的β-1，4-键。其水解的主要产物为三糖(3-O-β-纤维二糖-D-葡萄糖)和四糖3-O-β-纤维三糖-D-葡萄糖)。

当含有β-葡聚糖的谷物用作饲料原料时，β-葡聚糖是重要的抗营养因子。β-葡聚糖包括水溶性和非水溶性两类，单胃动物肠道中不能分泌相关的酶消化分解β-葡聚糖。并且，水溶性葡聚糖可以增大食糜的粘性，减少动物消化酶与营养物质的接触，降低消化养分的吸收；食糜粘性增加还造成畜禽粪便含水量和粘稠度增加，影响禽畜舍周围环境；β-葡聚糖可以结合、吸附金属离子、有机质等营养物质，造成其代谢受阻；还能降低其他消化酶的活力，影响脂肪和蛋白质的消化吸收，有害于肠道健康，有利于一些病原菌的繁殖，增加发病率，因此研究能够降解葡聚糖的葡聚糖酶具有重要意义。

纤维素是地球上含量最丰富的可再生利用的多糖，研究表明其完全降解至少需要3类酶系：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和B-葡萄糖苷酶。目前已从40多种细菌和5种以上的真菌中克隆到了纤维素酶基因，且大多数已获得全序列。B-1，4-内切葡聚糖酶可特异性作用于B-1，4-葡萄糖苷键，从而部分酶解纤维素。该酶早期主要应用于啤酒工业中分解大麦及麦芽中的B-葡聚糖凝胶，降低麦汁粘度，提高麦汁的过滤速度及得率。近年来，以B-葡聚糖酶为优势的复合酶制剂在大麦型猪饲粮中得到了广泛的关注，为解决能量饲料资源在饲料工业中的应用开辟了一条新途径。同时，B-1，4-葡聚糖酶也可作为一种重要的畜禽大麦饲料添加剂，以大大提高饲料的生物转化率和减少排泄物对环境的污染。最近，B-1，4-葡聚糖酶在染整及洗涤工业中的应用也逐渐重视，这也给传统的染整及洗涤工业带来了新的发展契机。

β-葡聚糖酶是能分解β-糖苷键链成的葡聚糖聚合物的一类酶的总称。按作用方式不同，β-葡聚糖酶可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶两类。其中内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶可以水解β-1，3-1，4-葡聚糖，专一作用于β-1，3键相连的β-1，4糖苷键，使其降解为低分子量的片段，失去亲水性和粘性。从而改变单胃动物肠道内容物的特性，提高生长性能和饲料转化率，在食品和饲料工业等方面有广阔的应用前景。

植物和微生物都能产生β-1，3-1，4-葡聚糖酶，在植物种子发芽过程中可以由糊粉层和盾片分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶以分解胚乳细胞壁中的β-葡聚糖。生产中应用较多的是微生物所产生的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，包括细菌(主要为芽孢杆菌)、真菌和瘤胃微生物。目前已经有多种不同来源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因被克隆和表达。包括芽孢杆菌Bacillus sublitis、B.amyloliquefaciens、B.circulans、B.licheniformis，它们所产的β-1，3-1，4-葡聚糖酶都具有相似的核苷酸和氨基酸序列，并且都有一个保守的氨基酸序列。在一些非芽孢杆菌的细菌中也克隆导β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，例如热纤梭菌Clostridium thermocellum、牛链球菌Streptococcus bovis、产琥珀丝状杆菌Fibrobacter succinogenes，以及在厌氧真菌Orpinomyces中分离的β-1，3-1，4-葡聚糖酶序列与芽孢杆菌也很相似。

不同来源的基因在不同的载体和寄主系统中得到表达，包括大肠杆菌、芽孢杆菌、酿酒酵母以及转基因大麦和烟草等，但不同表达系统的葡聚糖酶活性有较大的差异。

综上所述，具有优良特性的新型葡聚糖酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有高比活、良好稳定性和底物特异性的葡聚糖酶可以更好的应用于饲料和啤酒工业，而较高的表达量可以降低生产成本，都是葡聚糖酶应用于饲料工业所必需的。

发明内容

为此，本发明提供了以下技术方案，并获得了良好的技术效果。

本发明涉及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)来源的β-1，3-1，4葡聚糖酶。实施方式之一中，所述酶含有SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

本发明涉及从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中克隆的β-1，3-1，4葡聚糖酶的编码序列。实施方式之一，本发明提取地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌基因组DNA，构建基因组文库，然后通过活性筛选的方法克隆到了编码β-1，3-1，4葡聚糖酶的全长序列。实施方式之一中，所述编码序列包含如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的核酸序列，分别称之为BL-glu、BS-glu和BC-glu。实施方式之一中，所述编码序列是SEQ ID NO：1中的核苷酸1至642，SEQ ID NO：2中的核苷酸1至642或SEQ ID NO：3中的核苷酸1至642所示的核酸序列。

本发明还涉及包含所述β-1，3-1，4葡聚糖酶编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明β-1，3-1，4葡聚糖酶编码序列经NcoI和EcoRI双酶切后与NcoI和EcoRI双酶切的pTrcHis2载体连接，分别得到大肠杆菌重组表达载体pTrcHis2-BLgluE、pTrcHis2-BSgluE和pTrcHis2-BCgluE。另一实施方式中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明β-1，3-1，4葡聚糖酶编码序列经XhoI和XbaI双酶切后与XhoI和XbaI双酶切的pPICZα载体连接，分别得到酵母重组表达载体pPICZα-BLgluE、pPICZα-BSgluE和pPICZα-BCgluE。另一实施方式，将不带内源性信号肽编码序列的本发明β-1，3-1，4葡聚糖酶编码序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，分别得到酵母重组表达载体pPIC9k-BLgluE、pPIC9k-BSgluE和pPIC9k-BCgluE。

本发明还制备包含本发明β-1，3-1，4葡聚糖酶编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌BL21和的毕氏酵母GS115构建表达β-1，3-1，4葡聚糖酶的重组细胞。

本发明还提供了表达β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法，包括：培养前文所述本发明包含β-1，3-1，4葡聚糖酶编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明β-1，3-1，4葡聚糖酶编码序列的酵母(例如毕氏酵母GS115)发酵来生产β-1，3-1，4葡聚糖酶，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

本发明利用基因工程手段制备了能够高效表达并分泌β-葡聚糖酶的重组生产株，实现了β-葡聚糖酶的生产产业化，并获得了优质的β-葡聚糖酶产品。本发明通过酶学性质鉴定进行了酶的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性及比活力等理化性质的分析，证明本发明的β-1，3-1，4葡聚糖酶具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力。

附图说明

图1：来自蜡状芽孢杆菌的编码β-葡聚糖酶的核酸序列BC-glu(SEQ ID NO：3)及其编码的氨基酸序列；

图2：来自地衣芽孢杆菌的编码β-葡聚糖酶的核酸序列BL-glu(SEQ ID NO：1)及其编码的氨基酸序列；

图3：来自枯草芽孢杆菌的编码β-葡聚糖酶的核酸序列BS-glu(SEQ ID NO：2)及其编码的氨基酸序列；

图4：三种来源的β-葡聚糖酶的氨基酸序列的比对；

图5：BS-glu、BC-glu和BL-glu序列在大肠杆菌质粒pTrcHis2上构建的重组质粒结构图；

图6：BS-glu、BC-glu和BL-glu序列在酵母质粒pPICZα上构建的重组质粒结构图；

图7：BS-glu、BC-glu和BL-glu序列在酵母质粒pPIC9k上构建的重组质粒结构图；

图8：毕氏酵母表达的BS-glu、BL-glu和BC-glu序列所编码葡聚糖酶的最适反应pH；

图9：毕氏酵母表达的BS-glu、BL-glu和BC-glu序列所编码葡聚糖酶的最适反应温度；

图10：毕氏酵母表达的BS-glu、BL-glu和BC-glu序列所编码葡聚糖酶的pH稳定性；

图11：毕氏酵母表达的BS-glu、BL-glu和BC-glu序列所编码葡聚糖酶的热稳定性；

图12：毕氏酵母表达BS-glu、BL-glu和BC-glu序列所编码葡聚糖酶发酵过程的酶活力；

图13：毕氏酵母表达BS-glu、BL-glu和BC-glu序列所编码葡聚糖酶发酵过程中样品的SDS-PAGE；

图14：经纯化的毕氏酵母表达的BS-glu、BL-glu和BC-glu序列所编码葡聚糖酶的分子量

图15：毕氏酵母表达的BS-glu、BL-glu和BC-glu序列所编码葡聚糖酶的抗蛋白酶活性

具体实施方式

材料与方法

1.菌株和载体：

大肠杆菌BL21、JM109及表达载体pTrcHis2，毕氏酵母GS115及表达载体pPICZα、pPIC9k均购自Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)。

2.酶类及其他生化试剂：

限制性内切酶、DNA Maker、蛋白质Maker均购自Fermentas(MBI)，底物地衣多糖和大麦葡聚糖均购自Sigma公司，其他常规试剂皆为购得，例如可购自为上海生工等。

3.培养基：

使用的培养基：LB培养基，YPD，YPAD，BMDY，BNNY，MM，MD培养基均参照Invitrogen毕氏酵母操作手册。

4.方法

本发明中所用到的生物化学和分子生物学实验技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行：赵永芳等，《生物化学技术原理及其应用(第二版)》；朱检等，《生物化学实验[M]》；J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》。

4.1.β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力的测定

本发明各实施例中所提及的β-葡聚糖酶活性、酶活力或活性均是指β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性，可用主要成分为β-1，3-1，4-葡聚糖的地衣多糖或大麦葡聚糖为底物进行检测和测定。其中，酶活力的定量测定按照国际通用的DNS(3，5-二硝基水杨酸)法进行。

具体地说，将0.45ml 8.0g/L的大麦葡聚糖溶液(乙酸-乙酸钠缓冲溶液，pH5.5)加入试管，放入50℃水浴中预热3min。用乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)将酶液样品做10倍梯度稀释，选定显色效果令人满意的稀释度。将0.05ml按照选定稀释度(N)稀释好的酶液加入到试管中，继续在50℃水浴中反应10min。向试管中加入2ml DNS显色剂(参照朱检等编写的《生物化学实验[M]》配制)终止反应。将试管在沸水中加热5min，立即冷却至室温。室温下放置10min显色。然后于540nm处测定吸光值。

空白对照为先将0.05ml同样稀释度的酶液加入到0.2ml乙酸-乙酸钠缓冲液中，在100℃沸水中煮20min灭活。然后如上所述与底物反应、加入DNS显色并测定吸光值。

如下绘制酶解产物(葡萄糖)显色的标准曲线：将1.0mg/mL葡萄糖标准溶液用乙酸-乙酸钠缓冲液稀(pH5.5)释成0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液，按上述样品测定的操作步骤一起反应。以葡萄糖浓度(C，mg/mL)为纵坐标，以吸光值(A)为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程(C＝KA+b)。

本文中，将以上反应条件下，单位体积的酶液每分钟分解底物生成1umol的还原糖(葡萄糖)定义为一个酶活力单位(U)。

样品的β-葡聚糖酶活力U按照下面的公式计算：

$U=\frac{K\×(A-A_0)+b}{M\×t\×V}\×V_0\×1000\×N$

式中：

U——样品β-葡聚糖酶活力，U/mL；

K——标准曲线的斜率；

A——样品溶液的吸光值；

A₀——空白对照的吸光值；

b——标准曲线的截距；

M——葡萄糖的摩尔质量M(C₆H₁₂O₆)＝180.2g/mol；

t——反应时间，min；

V——反应体系中酶液的加入量，ml；

V₀——反应体系的总体积，ml；

N——试样稀释倍数；

1000——转化因子，1mmol＝1000umol。

每次测定均取两个平行试验结果的算术平均值，保留整数。

β-葡聚糖酶的比活力按下面的公式计算：

U_c＝U/c

其中：U_c——样品β-葡聚糖酶比活性，U/mg；

U——样品β-葡聚糖酶活力，U/ml；

c——样品溶液中的蛋白质含量，mg/ml。

纯化倍数X按照下面的公式计算：

X＝U_C/U_C0

其中：X——纯化倍数；

U_C——纯化后葡聚糖酶样品的比活力，U/mg；

U_C0——纯化前葡聚糖酶样品的比活力，U/mg。

实施例1β-葡聚糖酶编码序列的克隆

基因组DNA的提取：取37℃培养2天，菌体浓度OD_600nm至0.5～0.8的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，ATCC21610，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC))菌液50ml，10000rpm离心10min，取50mg菌体加500ul无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重新悬浮于500ul 1mg/ml的溶菌酶溶液中，于37℃温浴30min，再补加溶菌酶液100ul于40-50℃继续保温30min，至菌液透明后，加10％SDS至终浓度2％，搅拌约5min至菌液粘度显著下降，15000rpm离心10min去除碎片。上清依次用等体积酚、酚∶氯仿(1∶1)、氯仿抽提。取氯仿抽提所得上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10min。16000rpm离心15min。沉淀用70％乙醇清洗，低速离心，将沉淀晾干后用30ul无菌水溶解，备用。

取提取的基因组DNA 5ug，利用BamHI酶切，与同样酶切的pUC19载体连接，用所得重组质粒转化大肠杆菌DH5α(购自宝生物工程(大连)有限公司，中国辽宁)，构建基因文库。挑取白色的阳性克隆(LB培养基含有100ug/ml Amp、0.5％X-gal和1.5mM IPTG)，转移到活性筛选平板(LB培养基中含有3％的琼脂和1％地衣多糖)上过夜培养。洗去平板上的菌体，用1％刚果红染色，再用0.5M NaCI溶液洗涤脱色。含有β-葡聚糖酶编码序列的克隆能够产生降解圈。挑取产生降解圈的克隆，提取该克隆的质粒，进行测序，得到β-葡聚糖酶的编码序列BL-glu，该序列包括645bp(图1，SEQ ID NO：1)，其中第643-645位为终止密码子TAA、第1-642位编码不含信号肽的成熟蛋白(图1和图4)，该成熟蛋白含有214个氨基酸(SEQ ID NO：4)。

分别用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，CICC 10090，购自中国工业微生物菌株保藏管理中心(CICC))和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus，CGMCC 1.260，购自中国普通微生物菌株保藏管理中心(CGMCC))重复以上过程，得到β-葡聚糖酶的全长编码序列BS-glu(SEQ ID NO：2)和BC-glu(SEQ ID NO：3)及其编码的成熟蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)(图2、3和图4)。

实施例2大肠杆菌重组表达载体的构建及β-葡聚糖酶编码序列在大肠杆菌中的表达和扩增

根据实施例1所得编码β-葡聚糖酶的核酸序列设计引物：

引物1：5′-CCATGGCCCAAACAGGTGGATCGTTC-3′(SEQ ID NO：7)

引物2：5′-GAATTCTTATTTCTTTGTATAGCGC-3′(SEQ ID NO：8)

分别以实施例1中选择和分离得到的含有BL-glu、BS-glu和BC-glu的pUC19重组质粒为模板，PCR扩增3种β-葡聚糖酶的编码序列。PCR扩增条件为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，32个循环；72℃10min。用NcoI和EcoRI进行双酶切，连接到载体pTrcHis2上，分别获得含有3种β-葡聚糖酶编码序列的重组质粒pTrcHis2-BLgluE、pTrcHis2-BSgluE和pTrcHis2-BCgluE(见图5所示)。

取10ul构建好的pTrcHis2-BLgluE、pTrcHis2-BSgluE和pTrcHis2-BCgluE，分别加入到100ul制备好的感受态细胞(大肠杆菌BL21和JM109)中，摇匀置于冰上，冰浴30min；置于42℃水浴中热击90s；将离心管快速移至冰水混合物中冰浴2min；每管加入400ul SOC培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母粉，10mM NaCl，2.5mMKCl，10mM MgCl₂，10mM MgSO₄，20mM葡萄糖，pH7.0～7.2)，用移液器轻吸打散后于37℃摇床上复苏1h(80rpm～200rpm)；离心，4000rpm×5min，除去400ul上清，剩余部分混匀；涂平板(LB-agar平板，含80ug/ml Amp)，37℃正置1h后，倒置培养过夜，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

分别取3种重组质粒阳性克隆的重组大肠杆菌菌株BL21，接种于50ml LB培养液中(250ml三角瓶，含50ug/ml Amp)，37℃250rpm振荡培养1-1.5h，加入IPTG诱导(终浓度为2umol/ml)，37℃250rpm再振荡培养3-3.5h。取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000rpm离心10min，取沉淀用1/5体积pH6.050mM的PBS悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为：60％功率，间隔5s破碎10min，停止10min，再破碎10min。12000rpm离心，收集上清液，测定β-葡聚糖酶活力，并通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果表明三种β-葡聚糖酶的编码基因所编码的β-葡聚糖酶均可在大肠杆菌中表达，且均有β-葡聚糖酶活性，测得酶活力分别达到30U/ml、55U/ml和43U/ml。

分别取3种重组质粒阳性克隆所在的重组大肠杆菌菌株JM109，接种于50mlLB培养液中(250ml三角瓶，含50ug/ml Amp)，37℃250rpm振荡培养2-2.5h，取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，提取质粒，酶切回收目的序列备用(质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A.Gel Extraction Kit试剂盒)。

实施例3酵母重组表达载体的构建

根据实施例1所得编码β-葡聚糖酶的核酸序列设计引物：

引物3：5′-CTCGAGCAAACAGGTGGATCGTTCTTTGAC-3′(SEQ ID NO：9)

引物4：5′-TCTAGATTATTTCTTTGTATAGCGCACC-3′(SEQ ID NO：10)

引物5：5′-GAATTCCAAACAGGTGGATCGTTCTTTGACC-3′(SEQ IDNO：11)

引物6：5′-GCGGCCGCTTATTTCTTTGTATAGCGC-3′(SEQ ID NO：12)

以实施例2中从重组大肠杆菌菌株JM109回收的目的序列为模板，分别以引物3和引物4构成的引物对和引物5和引物6构成的引物对PCR扩增各种β-葡聚糖酶的编码序列。PCR扩增条件为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，32个循环；72℃10min。引物3和引物4的PCR产物用XhoI和XbaI进行双酶切后，连接到载体pPICZα上，得到含有各β-葡聚糖酶编码序列的重组质粒pPICZα-BLgluE、pPICZα-BsgluE和pPICZα-BcgluE(图6)。引物5和引物6的PCR产物用EcoRI和NotI进行双酶切后，连接到载体pPICZ9k上，得到含有各种β-葡聚糖酶编码序列的重组质粒pPIC9k-BLgluE、pPIC9k-BSgluE和pPIC9k-BCgluE(图7)。

以所得各pPICZα重组质粒和各pPIC9k重组质粒为模板，分别以引物3和引物4构成的引物对和引物5和引物6构成的引物对进行PCR，同时，以实施例2制备的各pTrcHis重组质粒与引物1和引物2所构成的引物对做PCR，从DNA水平上验证外源基因插入是否正确。PCR所得到的3种产物序列长度均为645bp，与出发菌株枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位点、方向和序列正确。

实施例4毕氏酵母发酵生产重组β-葡聚糖酶

将实施例3制备的重组质粒pPICZα-BLgluE、pPICZα-BsgluE和pPICZα-BcgluE经SacI或者PmeI酶切，得到线性化质粒pPICZα-BLgluE1、pPICZα-BsgluE1和pPICZα-BcgluE1。将实施例3制备的重组质粒pPIC9k-BLgluE、pPIC9k-BSgluE和pPIC9k-BCgluE经SacI或者BglII酶切，得到线性化质粒pPIC9k-BLgluE1、pPIC9k-BSgluE1和pPIC9k-BCgluE1。

分别取构建好的各种线性重组质粒DNA 50ug，直接加入到仍在零度以下的感受态细胞中(毕氏酵母GS115)；加入1.0ml含5ug/ml的鲑鱼精DNA的溶液Ⅱ(40％(w/v)聚乙二醇1000，0.2M N，N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)，或先加入1.0ml的溶液Ⅱ，然后加入5ul 1mg/ml的鲑鱼精DNA并尽量的将两者完全混匀；30℃水浴保温1h以上，每隔15min轻轻的混匀一次；42℃保温10min；室温3000×g离心5min，弃去上清，用1.0ml的溶液Ⅲ(0.15M NaCl，10mM N，N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)重新悬浮菌体；室温3000×g离心5min，移去800ul上清，用剩余的200ul上清重新悬浮菌体；将200ul菌液涂YPD平板(YP和20％D单独灭菌，倒平板之前按1∶9向YP中加入20％D；对pPICZα重组质粒平板筛选抗性为10ug/ml zeocin，对pPIC9k重组质粒平板的筛选抗性为80ug/ml Amp或50ug/ml Kan)，30℃倒置培养3-4天，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

分别取3种pPICZα重组质粒转化的毕氏酵母GS115菌株阳性克隆子，各自接种于150ml YPD培养液中，30℃250rpm振荡培养至OD_600nm＝0.3～0.5(约20hr)，然后接种于3L发酵基本培养基(26.5ml/L磷酸，0.90g/L硫酸钙，18.5g/L硫酸钾，15.0g/L硫酸镁，4.15g/L氢氧化钾，Glucose 40g/L葡萄糖)中，于5L发酵罐中进行发酵。

在起始阶段——菌体生长阶段，发酵过程中用25％的氨水调节pH，使其维持在5.5，并且以4.2ml/hr的速度流加PTM1(25mM硫酸铜，0.55mM碘化钠，17.7mM硫酸锰，0.82mM钼酸钠，0.31mM硼酸，2.2mM氯化钴，0.15mM氯化锌，0.24mM硫酸亚铁，1.7mM生物素，0.19M硫酸)，进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24hr，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100％，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80％，此时菌湿重可达到80-100g/L。

进入碳源饲喂阶段，以25ml/hr的速度流加用蒸馏水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持续流加4-6hr，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到代该阶段的末期，菌湿重可达到170-210g/L。

在诱导阶段，以20-30ml/hr的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下。在诱导阶段的发酵过程中每隔10-15hr取样10ml，10000rpm离心5min，收集上清液测定葡聚糖酶活力并进行SDS-PAGE分析，结果分别如图12和图13所示。发酵达167hr时，菌湿重可达到250-300g/L，BS、BL和BC来源的葡聚糖酶的表达水平(以发酵液上清的酶活力表示)可分别达到240U/ml、450U/ml和300U/ml，这说明3种来源的β-葡聚糖酶基因均在毕氏酵母中得到了表达和积累。

实施例5重组β-葡聚糖酶的纯化

将实施例4所制备的发酵培养液(167hr后回收所得)10000rpm离心10min去除菌体，取上清液作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至80％(w/v)，13000rpm离心15min，取沉淀，用pH8.0，0.05mM Tris-HCl缓冲液重新溶解，进一步用色谱进行纯化。

经硫酸铵沉淀后上TOSOH Toyopearl EDAE-650C阴离子柱。先用pH8.0，0.05mM Tris-HCl缓冲液平衡柱子，然后流加样品，再用相同缓冲液配置的0-0.8mol/L NaCl梯度洗脱5个柱体积，流速为1ml/min，用部分收集器收集，每管3ml。然后对收集管中的溶液测定葡聚糖酶活力及蛋白电泳分析。

收集离子交换分离后的活性峰，浓缩、脱盐、冻干后，再用pH7.020mM PBS缓冲液溶解，上TOSOH Toyopearl HW-50s HPLC柱。先用pH7.020mM PBS缓冲液洗脱平衡柱子，然后上样，用pH7.020mM PBS缓冲液洗脱1.5个柱体积，流速为0.25ml/min，按峰收集，然后对收集的样品测定葡聚糖酶活力及进行蛋白质电泳分析。SDS-PAGE结果(图14)表明，3种来源的β-葡聚糖酶纯化后的β-葡聚糖酶蛋白仅有单一的条带，分子量均约为32kDa。

纯化完成后，BS-glu编码的β-葡聚糖酶比活性从粗酶液的346U/mg提高到纯酶的3043U/mg，纯化倍数为8.8；BL-glu编码的β-葡聚糖酶比活性从粗酶液的147U/mg提高到纯酶的1217U/mg，纯化倍数为8.3；BC-glu编码的β-葡聚糖酶比活性从粗酶液的327U/mg提高到纯酶的3122U/mg，纯化倍数为9.5。

实施例6重组β-葡聚糖酶的酶学性质分析

用上述毕氏酵母167hr发酵液上清进行以下酶学性质分析。

按照前所DNS法，在不同的pH下进行酶促反应，法测定酶活力，由此确定其最适pH。所用缓冲液为pH3.0-10.0的Britton-Robinson缓冲液，50℃下测定pH的适性结果。结果表明，BS-glu、BL-glu及BC-glu编码的β-葡聚糖酶的最适pH均在6.0左右(图8)。

将酶液在不同pH值的Britton-Robinson缓冲液中于室温下静置30min，测定残余酶活性以研究β-葡聚糖酶的pH稳定性。结果表明(图10)，在pH4.0-10.0之间，BS-glu编码的β-葡聚糖酶残余活性在85％以上；在pH5.0-10.0的范围内，BL-glu编码的β-葡聚糖酶的残余活性在90％以上；在pH3.0-10.0的范围内，BC-glu编码β-葡聚糖酶的残余活性在85％以上。这说明BS-glu、BL-glu及BC-glu编码的β-葡聚糖酶均有很好的pH稳定性。

最适反应温度的测定在乙酸-乙酸钠(pH6.0)缓冲体系及不同温度下(30℃-70℃)进行，按照前述DNS法进行酶促反应和活力测定。结果表明(图9)，BS-gluβ-葡聚糖酶和BL-gluβ-葡聚糖酶的最适反应温度在40℃左右，BC-gluβ-葡聚糖酶的最适反应温度在50℃左右。

热稳定性研究为在不同温度下静置60min，再进行DNS法酶活性测定。结果标明(图11)，在30℃-50℃范围内，残余酶活力都维持在70％以上，在50℃和60℃下保温30min，残余酶活力为80％左右。说明3种来源的β-葡聚糖酶均有较好的热稳定性。

分别在3种来源酶溶液中加入0.05ml胰蛋白酶(0.1mg/ml，用pH7.0 PBS缓冲液配置)和胃蛋白酶(0.1mg/ml，用pH2.0甘氨酸-HCL缓冲液配置)于37℃反应120min，测定β-葡聚糖酶活性。经胰蛋白酶和胃蛋白酶分别处理120min后，酶残余酶活力均在65％以上(图15)，说明3种基因来源的β-葡聚糖酶均具有较好的抗蛋白酶水解能力。

序列表

<110>福建福大百特科技发展有限公司

<120>葡聚糖酶、其编码核酸及其表达

<130>090230

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>645

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400>1

caaacaggtg gatcgttctt tgaccctttt aacggctata actccggttt ttggcaaaaa     60

gcagatggtt attcgaatgg aaatatgttc aactgcacgt ggcgggctaa taacgtatca    120

gtgacgtcat tgggtgaaat gcgtttagcg ctaacaagcc catcttataa caagtttgac    180

tgcggggaaa accgttctgt tcaaacatat ggctatggac tttatgaagt cagaatgaaa    240

ccagctaaaa acacagggat cgtttcatcg ttctttactt acacaggtcc aacagatgga    300

actccttggg atgagattga tatcgaattt ttaggaaaag acacaacaaa ggttcaattt    360

aactattata caaatggtgc aggaaaccat gagaagattg ttgatctcgg gtttgatgca    420

gccaatgcct atcatactta tgcattcgat tggcagccaa actctattaa atggtatgtc    480

gacgggcaat taaaacatac tgcaacaaac caaattccga caacacctgg aaagatcatg    540

atgaacttgt ggaatggtac gggtgtcgat gaatggcttg gctcctacaa tggtgtaaat    600

ccgctatacg ctcattatga ttgggtgcgc tatacaaaga aataa                    645

<210>2

<211>645

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>2

caaacaggtg gatcgttctt tgaccctttt aacggctata actccggttt ttggcaaaaa    60

gcagatggtt attcgaatgg aaatatgttc aactgcactt ggcgggctaa taacgtatca  120

atgacgtcat tgggtgaaat gcgtttagcg ctaacaagcc catcttataa caagtttgac  180

tgcggggaaa accgttctgt tcaaacatat ggctatggac tttatgaagt cagaatgaaa  240

ccagctaaaa acacagggat cgtttcatcg ttcttcactt acacaggtcc aacagatgga  300

actccttggg atgagattga tatcgaattt ttaggaaaag acacaacaaa ggttcaattt  360

aactattata caaatggtgc aggaaaccat gagaagattg ttgatctcgg gtttgatgca  420

gccaatgcct atcatactta tgcgttcgat tggcagccaa actctattaa atggtatgtt  480

gatgggcaat taaaacatac tgcaacaaac caaattccga caacacctgg aaagatcatg  540

atgaacttgt ggaatggcac gggtgtcgat gaatggcttg gctcctacaa cggtgtaaat  600

ccgctatacg ctcattatga ttgggtgcgc tatacaaaga aataa                  645

<210>3

<211>645

<212>DNA

<213>蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)

<400>3

caaacaggtg gatcgttctt tgaccctttt aacagctata actccggatc atggcaaaaa   60

gcaaatggtt attcgaatgg aaatatgttc aactgcactt ggcgtgcaaa taacgtatca  120

atgacgtcat taggtgaaat gcgtttggcg ctaacaagtc catcttataa caagtttgac  180

tgcggggaaa accgctctgt tcaaacatat ggctatggac tttatgaagt cagaatgaaa  240

ccagctaaaa acgtagggat cgtttcatcg ttcttcactt acacaggtcc aacggatgga  300

actccttggg atgagattga tatcgaattt ttaggaaaag acacaacaag ggttcaattt  360

aactattata caaatggtgt aggaaaccgt gagaagattg tggatctcgg atttgatgca  420

gccaatgcca atcatacgta tgcgttcgat tggcagccaa actctattaa atggtatgtc  480

gatgggcaat taaaacatac tgcgacaagc caaattccga caacaccagg taagatcatg  540

atgaacttgt ggaatggtac gggtgtagat gaatggctcg gttcctacaa tggtgtaaca  600

ccgctatacg ctcattacga ttgggtgcgc tatacaaaga aataa                  645

<210>4

<211>214

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400>4

Gln Thr Gly Gly Ser Phe Phe Asp Pro Phe Asn Gly Tyr Asn Ser Gly

1                5                  10                  15

Phe Trp Gln Lys Ala Asp Gly Tyr Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys

            20                  25                  30

Thr Trp Arg Ala Asn Asn Val Ser Val Thr Ser Leu Gly Glu Met Arg

        35                  40                  45

Leu Ala Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn

    50                  55                  60

Arg Ser Val Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly L6u Tyr Glu Val Arg Met Lys

65                  70                  75                  80

Pro Ala Lys Asn Thr Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly

                85                  90                  95

Pro Thr Asp Gly Thr Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly

            100                 105                 110

Lys Asp Thr Thr Lys Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Ala Gly

        115                 120                 125

Asn His Glu Lys Ile Val Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Tyr

    130                 135                 140

His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser Ile Lys Trp Tyr Val

145                 150                 155                 160

Asp Gly Gln Leu Lys His Thr Ala Thr Asn Gln Ile Pro Thr Thr Pro

                165                 170                 175

Gly Lys Ile Met Met Asn Leu Trp Asn Gly Thr Gly Val Asp Glu Trp

            180                 185                 190

Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Asn Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp

        195                 200                 205

Val Arg Tyr Thr Lys Lys

    210

<210>5

<211>214

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>5

Gln Thr Gly Gly Ser Phe Phe Asp Pro Phe Asn Gly Tyr Asn Ser Gly

1               5                   10                  15

Phe Trp Gln Lys Ala Asp Gly Tyr Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys

            20                  25                  30

Thr Trp Arg Ala Asn Asn Val Ser Met Thr Ser Leu Gly Glu Met Arg

        35                  40                  45

Leu Ala Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn

    50                  55                  60

Arg Ser Val Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys

65                  70                  75                  80

Pro Ala Lys Asn Thr Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly

                85                  90                  95

Pro Thr Asp Gly Thr Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly

            100                 105                 110

Lys Asp Thr Thr Lys Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Ala Gly

        115                 120                 125

Asn His Glu Lys Ile Val Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Tyr

    130                 135                 140

His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser Ile Lys Trp Tyr Val

145                 150                 155                 160

Asp Gly Gln Leu Lys His Thr Ala Thr Asn Gln Ile Pro Thr Thr Pro

                165                 170                 175

Gly Lys Ile Met Met Asn Leu Trp Asn Gly Thr Gly Val Asp Glu Trp

            180                 185                 190

Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Asn Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp

        195                 200                 205

Val Arg Tyr Thr Lys Lys

    210

<210>6

<211>214

<212>PRT

<213>蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)

<400>6

Gln Thr Gly Gly Ser Phe Phe Asp Pro Phe Asn Ser Tyr Asn Ser Gly

1               5                  10                  15

Ser Trp Gln Lys Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys

            20                  25                  30

Thr Trp Arg Ala Asn Asn Val Ser Met Thr Ser Leu Gly Glu Met Arg

        35                  40                  45

Leu Ala Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn

    50                  55                  60

Arg Ser Val Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys

65                  70                  75                  80

Pro Ala Lys Asn Val Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly

                85                  90                  95

Pro Thr Asp Gly Thr Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly

            100                 105                 110

Lys Asp Thr Thr Arg Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Val Gly

        115                 120                 125

Asn Arg Glu Lys Ile Val Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Asn

    130                 135                 140

His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser Ile Lys Trp Tyr Val

145                 150                 155                 160

Asp Gly Gln Leu Lys His Thr Ala Thr Ser Gln Ile Pro Thr Thr Pro

                165                 170                 175

Gly Lys Ile Met Met Asn Leu Trp Asn Gly Thr Gly Val Asp Glu Trp

            180                 185                 190

Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Thr Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp

        195                 200                 205

Val Arg Tyr Thr Lys Lys

    210

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

ccatggccca aacaggtgga tcgttc        26

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

gaattcttat ttctttgtat agcgc         25

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

ctcgagcaaa caggtggatc gttctttgac    30

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

tctagattat ttctttgtat agcgcacc           28

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

gaattccaaa caggtggatc gttctttgac c       31

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

gcggccgctt atttctttgt atagcgc            27

Claims (10)

1.β-3-1，4葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQID NO：6所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的β-1，3-1，4葡聚糖酶，较好的是，其序列如SEQ ID NO：1中的核苷酸1至642，SEQ ID NO：2中的核苷酸1至642或SEQ ID NO：3中的核苷酸1至642所示。

3.包含权利要求2所述核酸分子的载体。

4.如权利要求3所述的载体，是大肠杆菌质粒或酵母质粒。

5.如权利要求3所述的载体，选自pTrcHis2-BLgluE、pTrcHis2-BSgluE、pTrcHis2-BCgluE、pPICZα-BLgluE、pPICZα-BSgluE、pPICZα-BCgluE、pPIC9k-BLgluE、pPIC9k-BsgluE或pPIC9k-BCgluE。

6.包含权利要求2所述核酸分子的细胞，优选大肠杆菌细胞或酵母细胞。

7.如权利要求6所述的细胞，用权利要求3-5中任一项所述载体转化而得。

8.如权利要求6或7所述的细胞，是包含所述核酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌BL21或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母GS115。

9.一种生产β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法，包括：培养权利要求7或8所述的细胞，诱导其表达，收获表达产物。

10.如权利要求9所述的方法，还包括纯化表达产物的步骤。

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