CN101821400A - 通过c-端酯交换的化学-酶促肽合成 - Google Patents

通过c-端酯交换的化学-酶促肽合成 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制备任选地N-受保护的氨基酸C-端酯或任选地N-受保护的肽C-端酯的方法，包括在存在水解酶(E.C.3)时用醇(除对应于酯的叔烷基的叔醇之外)对氨基酸的C-端叔烷基酯或肽的C-端叔烷基酯进行酯交换。本发明还涉及制备肽的方法，包括在存在催化肽键形成的酶时，使活化的、N-受保护的氨基酸C-端酯或任选地N-受保护的肽C-端酯与任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽通过肽键偶联。

Description

通过C-端酯交换的化学-酶促肽合成
本发明涉及制备肽的方法，包括偶联活化的N-受保护的氨基酸C-端酯或任选地N-受保护的肽C-端酯。本发明还涉及用于制备N-受保护的氨基酸C-端酯或任选地N-受保护的肽C-端酯的方法。
肽(尤其是寡肽)具有许多应用，例如用作药物、食物或饲料成分、农用化学品或化妆品成分。
就本发明的目的而言，肽表示两个或更多个氨基酸的任何链。就本发明的目的而言，“寡肽”表示基于2-200个氨基酸、尤其基于2-100个氨基酸、更尤其基于2-50个氨基酸的肽，优选地为2-200个氨基酸、更优选地为2-100或2-50个氨基酸的任何线性链。术语“多肽”用于表示与针对寡肽所规定的数量相比基于更大数量的氨基酸的肽。
化学-酶促肽合成就本发明的目的而言被定义为其中肽键通过酶促偶联反应形成的肽合成，其具有优于化学肽合成的若干优点。例如，由于不需要或仅需要有限的氨基酸侧链保护，在大规模生产情况下的成本更低。另外，该方法对环境更加友好。例如，不需要化学计量用量的毒性化学试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘化物(EDCI)。另外，这类方法可以使用更少的有机溶剂进行。另外，酶催化的偶联没有外消旋化(见例如Sewald和H.-D.Jakubke，“Peptides：Chemistry and Biology”，第1次重印，Ed.Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim 2002，第250页)，导致更纯的产物和/或更容易的分离。
对化学-酶促偶联方法而言，有两种产生肽键的可能途径。在所谓的热力学(或平衡控制)途径中，羧基组件带有游离的羧酸官能度，而在动力学控制的途径中使用活化的羧基组件，优选地为烷基酯形式，例如为甲酯形式。
术语“活化的”被用于表示在动力学酶促偶联反应中C-端羧基显示强反应性，尤其是与C-端受保护的羧基(例如C-端叔烷基酯)相比更高的反应性，所述反应中氨基酸或肽与C-端羧基偶联。活化的酯基尤其包括氨基酸或肽的C-端任选地取代的正烷基酯，例如任选地取代的甲酯、乙酯、正丙基酯、正丁基酯等等；芳烷基酯，尤其是任选地取代的苯甲基酯；和任选地取代的芳基酯，尤其是任选地取代的苯基酯。取代基可尤其选自包含一个或多个杂原子(例如氧、硫和氮)的任选地受保护的官能团。其例子包括羟基、氢硫基和氨基。
热力学途径具有三种主要的缺点：i)平衡通常位于肽键切割一侧，从而偶联产率较低；ii)通常需要大量酶；iii)反应速率通常非常低。在动力学控制的途径中，需要烷基酯作为起始材料，但是需要少得多的酶，反应时间显著更短，并且最重要的是，可获得的最大产率通常显著更高。因此对工业应用而言，基于动力学途径(即使用活化的羧基组件)的酶促肽合成概念是最有吸引力的(见例如N.Sewald and H.-D.Jakubke，in：“Peptides：Chemistry and Biology”，第1次重印，Ed.Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim 2002，第4.6.2节)。
化学-酶促肽合成可以以C→N端方向或者以N→C端方向进行。
C→N端方向的化学-酶促肽合成的一个例子在流程图1中给出。
流程图1
Figure GPA00001094820300021
在流程图1中，P代表N-端保护基。R1、R2和R3各自独立地代表氨基酸侧链。如流程图1所示，C→N端方向的酶促合成以式II的C-端受保护的氨基酸与式Ia的N-受保护的氨基酸的酶促偶联开始，所述式Ia的N-受保护的氨基酸被C-活化，在这个例子中通过甲酯被C-活化。
术语“C-端受保护的”在本文中用于表示对C-端羧基提供保护基，所述保护基一般基本上保护羧基不与另一分子的氨基偶联。特别地，C-端保护基可以是C-端酯，从而在使用的肽合成条件下至少基本上保护所述C-端羧基不与氨基偶联。通常，在根据本发明的方法中使用叔烷基作为保护基。
术语“N-端受保护的”在本文中用于表示对N-端氨基提供保护基，所述保护基一般基本上保护N-端氨基不参与C-端羧基与N-端氨基的偶联。
然后可以将形成的式III的肽N-脱保护，随后可以使得到的带有游离氨基官能团的式IV的肽与另一式Ib的N-受保护(且C-活化)的氨基酸构建块酶促偶联，导致形成式V的肽。可以重复该N-脱保护和偶联循环，直至获得期望的肽序列，之后可以去除N-和C-端保护基，得到期望的(不受保护的)肽。当然也可能将式Ia的N-受保护的氨基酸与C-端受保护的肽偶联来代替与式II的C-端受保护的氨基酸偶联。
C→N端方向的肽合成的一个主要缺点是在每个循环后去除N-保护基，以允许再添加一个N-受保护的氨基酸残基。在氨基酸(酯)上引入(昂贵的)N-保护基和在肽偶联后去除并通常丢弃该(昂贵的)N-保护基使得C→N方向的肽合成从实践和经济的角度看来不具吸引力。
N→C端方向酶促肽合成的一个例子在流程图2中给出。
流程图2
Figure GPA00001094820300031
在流程图2中，P表示N-端保护基。R1、R2和R3各自独立地代表氨基酸侧链。如流程图2所示，N→C端方向的酶促合成也以式IIa的C-端受保护的氨基酸与式I的N-受保护的氨基酸的酶促偶联开始，所述式I的N-受保护的氨基酸被C-活化，在这个例子中通过甲酯被C-活化。然后可以对形成的式III的二肽进行C-脱保护(见下文)。
然后可以使得到的带有游离羧酸官能团的式VI的二肽“再活化”，形成式VII的N-受保护的肽C-端烷基酯，在流程图2的情况下为甲基C-端酯。典型地使用醇(例如甲醇)和例如硫酸或亚硫酰氯的试剂，通过化学转化进行该酯化。随后可以将式VII的N-受保护的肽烷基酯与另一式IIb的C-端受保护的氨基酸偶联，这会导致形成式VIII的三肽。可以重复该C-脱保护和偶联循环，直至获得期望的氨基酸序列，之后可以去除N-端和C-端保护基，得到期望的(不受保护的)肽。当然也可能将式I的N-受保护的氨基酸与C-端受保护的肽偶联来代替与式IIa的C-端受保护的氨基酸偶联
N→C端方向的肽合成不需要重复添加和去除(昂贵的)N-保护基。然而，为了允许再添加一个氨基酸残基，需要两个反应步骤：C-端需要被选择性地脱保护，之后应当将其选择性地活化，例如通过对所形成的羧酸基酯化来活化。因此，对N→C端方向肽合成而言，对N-受保护的肽添加一个氨基酸残基需要总计三个反应步骤(脱保护、活化和偶联)。
适用于式III的肽的C-端脱保护方法可以根据使用的保护性基团X来选择。例如在X为叔丁基或另一叔烷基的情况下，典型地使用强酸、尤其是三氟乙酸(TFA)来化学切除叔烷基。
通过使用TFA对C-端叔烷基脱保护会在生长的肽链中导致多种副反应，尤其是存在痕量水时。这类副反应的例子是侧链基团的叔烷基化、侧链基团的脱保护、酸不稳定官能团的N-脱保护和水解，例如肽键的水解。
完全或几乎完全去除TFA是费力(和昂贵)的，但是这种去除在要再活化C-端羧酸的情况下(例如为了在与下一个C-端受保护的氨基酸酶促偶联中使用)是至关重要的。
因此，在本领域中认为使用羧基酰胺作为C-端保护基(流程图2中的X＝NH2)是有利的。使用羧基酰胺作为保护基时，例如可以通过将氨基酸甲酯化之后在一锅法中用氨进行酰胺化来制备式IIa的氨基酸构建块，所述制备是简单且低成本的。使用强矿物酸的水性溶液通过常规手段进行的羧基酰胺切割同时引起肽键的部分切割。然而，可以酶促完成羧基酰胺保护的肽C-端的选择性脱保护而不切割肽键。EP-A 0 456 138和EP-A 0759 066分别公开了使用来自橘皮或来自Xanthomonas(Stenotrophomonas)maltophilia的酰胺酶的酶促方法，其中N-(不)受保护的二肽C-端羧基酰胺的羧基酰胺基被水解形成相应的C-端羧酸，从而使二肽的肽键保持完整。
然而，EP-A 0 456 138和EP-A 0 759 066中所述方法的一个缺点是，用氨基酸对肽链的每次进一步延长都需要对所形成的相应的羧酸进行单独酯化，从而活化所述羧酸基团。另一缺点是存在例如硫酸或亚硫酰氯的试剂时，羧酸的该酯化需要基本无水的条件，然而C-端羧基酰胺的酶促脱保护反应在水性溶液中进行。因此需要大量的萃取和干燥操作。
在如WO 2007/045470中公开的一个改进的方法中，通过使用特定的酶使得肽C-端羧基酰胺与烷基醇在存在肽酰胺酶时反应，克服了这类缺点。肽酰胺酶可尤其来自于柑橘果皮，并通常不容易大量获得。对要活化的肽酰胺酶而言，反应优选地在存在水(通常多于0.5重量％，最优选地至少为5重量％)时进行。另外形成氨。常常需要氨的络合剂从而在反应期间去除氨，驱动反应平衡朝向酯合成一侧。用于进行反应的额外试剂或助剂的添加使得系统更加复杂和/或可能在产物中引入杂质。
仍然需要用于肽合成和/或用于制备可用于肽合成的中间产物化合物的替代性方法。这类方法可例如提供另外的策略，所述策略提高肽合成中的灵活性和/或允许合成使用已知的策略不能或者难以获得的特定肽。
特别地，仍然需要对环境相对友好的、相对简单的方法。
还会期望提供相对简单的方法，其中氨基酸或肽的C-端叔烷基酯，尤其是其肽C-端叔丁基酯可以被转化为另一C-端酯而不需要对要转化的C-端酯进行化学水解。
特别地，会期望提供一种方法，其中可以以高产率(在可接受的反应时间内)和/或良好的选择性，用与要制备的氨基酸酯或者肽酯不同的氨基酸C-端酯或肽C-端酯制备氨基酸C-端酯或肽C-端酯。在下述肽的制备中会特别期望使用这类方法，所述肽尤其是用作药物、食物或饲料成分、农业化学品或化妆品成分的肽，或者是药物、食物或饲料成分、农业化学品或化妆品成分的制造中使用的肽。
目前发现，通过在存在特定酶时使N-受保护的氨基酸或任选地N-受保护的肽(其C-端羧基受叔烷基保护)进行反应可能获得N-受保护的氨基酸C-端酯或肽C-端酯，尤其是C-活化的N-受保护的氨基酸或C-活化的肽(其任选地N-受保护)。
还发现可以在N→C方向上通过氨基酸或肽与另一氨基酸或肽的偶联来合成肽，而不需要羧酸官能团的化学C-端脱保护和随后的化学活化。
因此，本发明涉及制备肽的方法，包括偶联活化的、N-受保护的氨基酸C-端酯或活化的任选地N-受保护的肽C-端酯，所述方法包括：
-在存在水解酶时用活化醇对第一N-受保护的氨基酸的C-端酯或第一任选地N-受保护的肽的C-端酯进行酯交换，从而形成第二N-受保护的氨基酸C-端酯或第二任选地N-受保护的肽C-端酯；和
-在存在催化肽键形成的水解酶时，将第二酯与任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽偶联形成肽键，所述酶与用于酯交换的酶相同或不同。
通常，第一氨基酸或第一肽的C-端酯是叔烷基酯。
本发明还涉及制备肽的方法，包括在存在水解酶时用活化醇活化N-受保护的氨基酸的C-端羧酸基(或其盐)或任选地N-受保护的肽的C-端羧酸基(或其盐)，并在存在水解酶时使任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽与活化的氨基酸或肽偶联，所述酶可以与用于活化的酶相同或不同。
术语“活化醇”在本文中用于下述醇，其在酯化(或酯交换)后提供活化的C-端羧基酯基。
C-端受保护的氨基酸或肽通常是叔烷基酯，尽管在最终产物为二肽的情况下尤其如此，但是C-端基原则上可以用另一保护基保护。
催化肽键形成的酶可以与用于酯交换的酶不同，或者相同(在后者能够催化肽键形成时)。
本发明还涉及制备N-受保护的氨基酸C-端酯或任选地N-受保护的肽C-端酯的方法，包括在存在水解酶时用醇对N-受保护的氨基酸的C-端叔烷基酯或任选地N-受保护的肽的C-端叔烷基酯进行酯交换，所述醇是与第一酯的叔烷基对应的叔烷基醇不同的其他醇。
除非另有说明，要被酶促活化、酯化或酯交换的化合物在下文中可以称作“底物”。
图1A和1B显示使用(A)CH3CN∶MeOH 85∶15 v/v；(B)tBuOH∶MeOH9∶1v/v，通过
Figure GPA00001094820300071
将Z-Phe-OtBu酯交换成为Z-Phe-OMe的转化率作为反应时间的函数。
图2显示通过
Figure GPA00001094820300072
将Z-Phe-OtBu酯交换成为Z-Phe-OEt的转化率作为反应时间的函数。
图3显示通过
Figure GPA00001094820300073
将Z-Phe-OtBu酯交换成为Z-Phe-OBn的转化率作为反应时间的函数。
图4显示反应流程图，其阐述了通过或者肽键切割进行的模型二肽的酯化、酯交换和水解。
图5A和5B显示A)通过和共沸水去除使Z-Phe-OH成为Z-Phe-OtBu的转化率；和B)与时间相应的反应的水含量。
注意到Liu和Tam在‘Organic Letters，2001，Vol 3，No.26，p4157-4159’中报道了枯草杆菌蛋白酶Carlsberg能够在1，3-丙二醇和1，4-丁二醇中催化某些Boc-氨基酸和肽的C-α-羰基3羟丙基或4羟丁基酯的形成。未公开通过下述方法来制备肽，其中氨基酸C-端叔烷基酯或肽C-端叔烷基酯被活化，然后与另一氨基酸或肽偶联。
令人惊讶地发现，可以使用水解酶将叔烷基酯(叔烷基适合用作羧酸官能团的保护基从而尤其适用于肽合成)酯交换为不同的酯基，尤其是活化的酯基。
尤其令人惊讶的是水解酶(更尤其是单一水解酶)可以被用于受保护的酯转变为活化酯的酯交换，以及活化的氨基酸或肽与另一氨基酸或肽的偶联。尤其令人惊讶的是利用本发明的水解酶时酯交换产率高到足以允许有效的肽合成。
因此，根据本发明的酯交换尤其提供了下述优点，其不仅提供了对叔烷基(一种具有良好保护特性的保护基)保护的末端羧基脱保护而不需使用强酸例如TFA(由于上文给出的原因TFA的使用是不利的)的方法，并且叔烷基保护的末端羧基的C-脱保护和C-活化基本被组合在一个步骤中，或者至少可以通过单一酶的催化而发生。尤其发现可能以高产率(即反应结束时活化的酯的摩尔数/C-末端受保护的酯的初始摩尔数)在一个步骤中实现脱保护以及活化。
另外，发现可能以工业规模实施本发明。
在一个有利的实施方案中，本发明的方法允许以高产率将第一酯酯交换成为第二酯，所述产率尤其为至少70％，更尤其为至少80％，进一步更尤其为至少90％。
原则上叔烷基可以是任何保护性叔烷基。优选地，叔烷基选自叔丁基(2-甲基-2-丙基)、叔戊基(2-甲基-2-丁基)和叔己基(2，3-二甲基-2-丁基)。用叔丁基尤其取得了良好的结果。
术语“水解酶”在本文中用于来自类别E.C.3的酶。优选地，使用选自羧酸酯水解酶(E.C.3.1.1)、硫酯水解酶(E.C.3.1.2)和肽酶(E.C.3.4)的一种或多种水解酶。
尤其可以使用肽酶(E.C.3.4)。优选的肽酶是选自丝氨酸型羧肽酶(E.C.3.4.16)、金属羧肽酶(E.C.3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(E.C.3.4.18)、丝氨酸内肽酶(E.C.3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(E.C.3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(E.C.3.4.23)和金属内肽酶(E.C.3.4.24)的肽酶，尤其是选自丝氨酸内肽酶(E.C.3.4.21)的肽酶。用枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg实现了尤其好的结果。
可以使用任何形式的水解酶。例如，可以作为粗制酶、作为可商业获得的酶、作为从可商业获得的制剂中进一步纯化的酶、作为通过与已知纯化方法组合从其来源获得的酶、在天然或通过遗传修饰具有水解活性的完整(任选地被通透化或固定化)细胞中、或在具有这类活性的细胞裂解物中，使用例如分散液、乳液、溶液或固定化形式(例如负荷在支持物如微粒或整块载体材料上)的水解酶。
水解酶可得自或来自任何生物，尤其是来自动物、植物、细菌、霉菌、酵母或真菌。
本领域普通技术人员应当明白，在根据本发明的方法中也可以利用具有水解活性的天然存在的(野生型)酶的突变体。可以通过使用本领域技术人员已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因改组等)修饰编码野生型酶的DNA，使得所述DNA编码与野生型酶至少有一个氨基酸不同的酶或者编码与野生型相比更短的酶，或者通过影响藉此修饰的DNA在合适的(宿主)细胞中的表达，来制造野生型酶的突变体。水解酶的突变体可具有例如关于一个或多个以下方面的改进的特性：底物选择性、活性、稳定性、溶剂抗性、pH谱、温度谱、底物谱。；
涉及来自具体来源的酶时，来源于第一生物但实际上在(经遗传修饰的)第二生物中生产的重组酶特定地也包括在来自第一生物的酶范围内。
可作为水解酶来源的生物的例子包括Trichoderma sp，如Trichodermareesei；Rhizopus sp.，如Rhizopus oryzae；Bacillus sp，如Baccilluslicheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillusclausii、Bacillus lentus、Bacillus alkalophilus、Bacillus halodurans；Aspergillus sp.，如Aspergillus oryzae或Aspergillus niger；Streptomycessp.，如caespitosus Streptomyces或Streptomyces griseus；Candida sp.；真菌；Humicola sp；Rhizoctonia sp.；Cytophagia；Mucor sp.；和动物组织，尤其是胰腺，例如猪胰腺、牛胰腺或绵羊胰腺。
如上文所述，一种优选的酶是枯草杆菌蛋白酶。多种枯草杆菌蛋白酶是本领域已知的，见例如US 5,316,935和其中引用的参考文献。枯草杆菌蛋白酶A是来自Novozymes的可商业获得的枯草杆菌蛋白酶。
尤其优选的是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
发现
Figure GPA00001094820300091
尤其适合在本发明的方法中使用。该产品可从Novozymes(Bagsvaerd，丹麦)获得。
Figure GPA00001094820300092
是Bacillus licheniformis生产的廉价并且可以工业获得的蛋白水解酶混合物(含有枯草杆菌蛋白酶Carlsberg作为主要的酶成分)。使用经纯化的枯草杆菌蛋白酶的实验证实，枯草杆菌蛋白酶催化酯交换、活化和肽键形成。
可商业获得的酶如
Figure GPA00001094820300101
可以由供应商作为液体提供，尤其是作为水性液体提供。在这样的情况下，优选地首先将酶从不想要的液体(例如过量的水、醇，其引起不想要的副反应、尤其是引起不想要的酯交换等等)中分离出来。这可适当地通过沉淀(通常之后将固体从液体中分离出来和/或干燥)来完成。沉淀可使用醇完成，所述醇例如为叔丁醇或本发明的方法中使用的醇。在使用另一醇的情况下，应当注意这类醇对C-端酯交换或另一反应步骤无不利影响。
之后可将酶溶解和/或重悬于醇中，所述醇例如为叔丁醇或本发明的方法中使用的醇。
注意到肽的C-端叔丁基酯的酶水解是已知的。例如WO 2007/082890涉及BsubpNBE、CAL-A或枯草杆菌蛋白酶水解这类酯的用途。然而，出人意料的是可以用具有水解活性的酶有效地完成热力学不利的相反方向的酯化反应或者叔烷基酯成为伯烷基酯或仲烷基酯或任选地取代的芳烷基酯或任选地取代的芳基酯的酯交换。特别出人意料的是大于80％的产率是可行的。
另一合适的水解酶可选自以下可商业获得的产品以及这类酶的功能类似物。功能类似物表示所述类似物能够在本发明方法中催化至少一种以下功能：酯交换、活化和肽键形成，优选地催化两种或所有这三种功能。
Novozymes(Bagsvaerd，丹麦)供应ovozyme、liquanase、
Figure GPA00001094820300102
(在碱性pH下尤其有效)、duramyl、esperase、kannase、savinase、savinase ultra、termamyl、termamyl ultra、novobate、polarzyme、neutrase、novoline、pyrase、novocor(细菌碱性蛋白酶)。
蛋白酶-K可得自New England Biolabs，Ipswich(MA)，美国。
Novo Nordisk Biochem North America Inc(Franklinton NC，美国)供应Protease Bacillus species(Esperase 6.0 T；Savinase 6.0 T)、Protease Bacillussubtilis(Neutrase 1.5 MG)、Protease Bacillus licheniformis(Alcalase 3.0T)。
Amano International Enzyme Co(Troy，Va，美国)供应Protease Bacillussubtilis(Proleather；Protease N)和Protease Aspergillus oryzae(Prozyme 6)。
可能在下述混合物中进行反应，所述混合物包含用于酯化(酯交换)或活化的醇，和任选的惰性有机溶剂例如乙腈或醚，例如甲基-叔丁基醚(MTBE)。
在醇对酶的稳定性或活性有不利影响的情况下，在包含所述醇和惰性溶剂的混合物中进行酯化(酯交换)或活化是尤其有利的。用于酯化(酯交换)或活化的醇的浓度可尤其是99.9重量％或更少(以总液体为基础)、99重量％或更少、95重量％或更少、75重量％或更少、50重量％或更少、30重量％或更少、20重量％或更少或10重量％或更少。
尤其对于甲醇而言，发现在与作为主要溶剂的另一(惰性)有机溶剂的混合物中使用甲醇对于良好的酶稳定性是有利的，即将主要的酶活性维持足够的时间从而以期望的产率获得要制备的酯。
通常，为了得到有利的反应速率，用于酯化(酯交换)或活化的醇的浓度至少为0.1重量％，尤其至少为0.5重量％，优选地至少为1重量％、至少2重量％或至少4重量％。
可以使用下述反应介质进行本发明的方法，所述反应介质中用于酯化、酯交换或活化的醇是主要的溶剂。作为主要的溶剂，以总液体为基础其浓度通常为50-100重量％，尤其高达99.5重量％。反应介质通常基本不含可能对反应有害(可与反应中的醇竞争)的其他醇，所述其他醇是除所述醇和在酯交换的情况下从C-端酯上替换下来的叔醇之外的其他醇。实践中可存在小量其他醇，例如少于5重量％、尤其少于2重量％、更尤其少于0.5重量％的其他醇。
本发明的方法通常在基本无水的条件下进行。技术人员应当理解，取决于酶可能期望有小量的水使酶正确地发挥其催化活性。为了得到良好的催化活性，可能期望存在痕量的水，例如以液相为基础至少0.001重量％的水。水浓度尤其至少为0.02重量％或至少0.05重量％。
期望的水浓度上限取决于特定的酶、肽的性质(例如大小、作为肽基础的氨基酸)、期望的最终转化率和期望的酯交换或活化反应速率。
至少在活化或酯化(酯交换)开始时，反应介质通常含有以反应介质中液体重量为基础少于10重量％的水。反应介质可分散于第二液相中，或者可以将另一液相分散于反应介质中。在两相或多相体系中，特定的水含量以相中液体的重量为基础，其中酯化(酯交换)或活化反应(至少主要地)以其中溶解了氨基酸或肽的液相为基础而发生。
水浓度尤其可以少于4重量％，至少在活化或酯化(酯交换)开始时如此。有利地，所述方法可以在(至少在反应开始时)含有少于2重量％水、尤其是1重量％或更少水、更尤其0.5重量％或更少水、例如约0.2重量％或更少水的介质中发生，同时仍然保持主要的期望的酶活性，和低的、或甚至不可检测的、不期望的水解。
在一个有利的方法中，可以连续或间断的去除形成的醇或水，尤其是在酯化(酯交换)期间形成的醇或水。原则上去除可以用本领域已知的方式进行。使用分子筛取得了尤其良好的结果。还非常适用于去除的是蒸发，例如使用真空或蒸馏的共沸去除。
氨基酸C-端酯(其是N-受保护的，至少在酯交换反应期间如此)或任选地N-受保护的肽C-端烷基酯尤其可由式IX的化合物表示。
Figure GPA00001094820300121
其中P表示H或N-端保护基，其中n是至少为1的整数。在n为1的情况下，P通常是N-端保护基，因为其不存在时从一种酯到另一种酯的互变可能难以完成，这取决于使用的酶。
n尤其可以至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为8、至少为9或至少为10。n尤其可以是100或更少、75或更少、50或更少、25或更少、20或更少、15或更少或10或更少，例如5或更少。
每个RA和每个RB独立地表示H或有机片段，优选地为氨基酸侧链。因此，不需要RA在所有n个氨基酸单元中均相同。类似地，不需要RB在所有n个氨基酸单元中均相同。
在式IX表示要进行酯交换的酯的情况下，R典型地代表任选地取代的叔烷基，优选地为叔丁基。烷基可尤其包含取代基，所述取代基含有杂原子，更尤其含有选自N、O和S的杂原子。例如，取代基可以是任选地受保护的羟基、氢硫基或氨基。
合适的N-保护基是可用于合成(寡)肽的N-保护基。这类基团是本领域技术人员已知的。合适的N-保护基的例子包括羰基型保护基，例如‘Z’(即苄氧羰基)、‘Boc’(即叔丁氧羰基)、‘For’(即甲酰基)和‘PhAc’(即苯乙酰基)和FMOC(9-芴基甲氧羰基)。可以分别使用酶Peptide Deformylase或PenG酰基酶将基团For或PhAc酶促引入和切割。化学切割方法是本领域中公知的。
在本发明的上下文中，“氨基酸侧链”表示任何蛋白质原(proteinogenic)或非蛋白质原的氨基酸侧链。氨基酸侧链中的反应性基团可以通过氨基酸侧链保护基保护，或者可以被脱保护。蛋白质原氨基酸是由遗传密码子编码的氨基酸。蛋白质原氨基酸包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸。
非蛋白质原氨基酸的例子是苯基甘氨酸和4-氟-苯丙氨酸。
原则上可以在宽范围内选择使用的pH，只要选择使酶显示足够活性的pH即可。这样的pH对于要使用的酶而言通常是已知的，可以其在水性溶液中已知的水解活性为基础，或可以利用已知反应条件下酶的已知底物来常规测定。pH尤其可以被选择为约为中性。需要时可以根据酶而使用碱性或酸性条件。需要时可使用酸和/或碱调节pH，或用酸和碱的合适组合缓冲pH。合适的酸和碱尤其是在反应介质中可溶的酸和碱，例如来自氨和可溶于醇的酸，所述酸例如为乙酸和甲酸。可以通过使用自动化pH-稳定系统控制反应的pH。本领域技术人员通过常规实验能够容易地鉴定最适pH条件。
原则上使用的温度不是关键的，只要选择使酶显示足够活性和稳定性的温度即可。这样的温度针对要使用的酶而言通常是已知的，或者可以在已知的反应条件下利用酶的已知底物来常规测定。通常，温度可以至少为0℃，尤其至少为15℃或至少25℃。具体地，如果使用来源于嗜热生物的酶，则温度优选地至少为40℃。期望的最高温度取决于酶。通常这类最高温度是本领域已知的，例如在可商业获得的酶的情况下在产品数据表中标明，或者可以基于公知常识和本文公开的信息来常规地确定。温度通常为70℃或更少，尤其是60℃或更少，或45℃或更少。然而，具体地如果使用来自嗜热生物的酶时，可以选择更高的温度，例如高达90℃的温度。
基于公知常识和本文公开的信息，本领域技术人员通过常规实验可以容易地鉴定特定酶的最适温度条件。例如对枯草杆菌蛋白酶、尤其是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(例如
Figure GPA00001094820300141
中)而言，温度可有利地在25-60℃的范围内。
如上文所述，本发明还提供了制备肽的方法。具体地，这类方法包括以下步骤：
使用水解酶作为催化剂，通过将氨基酸或肽转化为具有活化的C-端羧基的氨基酸酯或肽酯，来活化包含游离末端羧酸基的N-受保护的氨基酸或任选地N-受保护的肽或C-端叔烷基酯。结果是氨基酸C-端酯或肽C-端酯适合参与动力学肽偶联(术语“肽偶联”表示通过形成肽键偶联)。活化可尤其用正烷基醇(尤其是甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇等等)、任选地取代的芳基醇(例如苯酚)或任选地取代的芳烷基醇(例如苯甲醇)来完成。
之后，使包含活化的C-端羧基的氨基酸C-端酯或肽C-端酯与任选地C-端受保护的氨基酸或肽接触，从而使任选地C-端受保护的氨基酸或肽的N-端氨基与活化的C-端羧基偶联形成肽键，所述接触通常在存在催化肽偶联的酶(其可与用于活化的酶相同或不同)时进行。C-端受保护的氨基酸或肽的保护基优选地为叔烷基，更优选地为叔丁基，在要通过一个或多个其他氨基酸或肽延长得到的肽的情况下尤其如此。需要时可以通过如本文所公开的酯交换用活化基团代替C-端叔烷基，之后可以偶联其他任选地C-末端受保护的氨基酸或肽。可以根据需要重复这些反应，以获得具有期望的氨基酸序列的肽。
因此，本发明还提供了用于合成肽的方法，所述方法允许使用C-端用叔烷基、优选地用叔丁基保护的氨基酸或肽在N→C端方向上进行肽合成。所述方法比需要脱保护步骤和单独的活化步骤的已知方法需要更少的反应步骤，因为存在酶时C-端被有效地同时脱保护和活化而不需要化学(非酶促)的脱保护方法。这类常规化学方法是进一步不利的，因为其通常还需要纯化，例如用于C-端羧酸中间产物的大量萃取和脱水步骤。因此，本发明有利地允许用于以N→C端方向合成肽的完全酶促的方法，因为肽链延伸和N-端氨基官能团的保护和脱保护均可完全酶促进行。因此，例如就简化方法的原因而言和/或就环境视角来看，与同样利用叔烷基保护羧酸基团的先前所述的方法相比，本发明的方法更有吸引力。
关于肽键形成可以使用相同的水解酶，只要其能够催化肽键形成即可。如果酶能够催化肽键形成，则使用该相同的酶用于偶联以及酯交换是有利的，因为这样可以在肽键形成之后进行酯交换来活化形成的肽的C-端末端，而不需要首先分离受保护的肽。这可简单地通过在将第一种反应改变为第二种反应时改变溶剂(溶剂更换)来完成。例如，活化的氨基酸C-端酯与C-端受保护的氨基酸叔烷基酯的偶联可以在叔醇(例如叔丁醇)中发生。偶联后可以用水性液体替换溶剂，以便于保护基的水解。将溶剂更换为醇之后得到的游离酸基可以被活化，所述醇在酯化后形成活化的C-端酯基。优选地，用醇直接替换其中发生偶联的溶剂，所述醇在酯交换后形成活化的C-端酯基。
然而，可以使用不同的酶用于肽键形成。用于催化肽键形成的合适的酶是技术人员已知的，并且包括蛋白水解酶。蛋白水解酶(其他名称：蛋白酶、肽酶、肽水解酶，E.C.3.4)是天然水解肽键的酶。这些酶可在多种生理学过程和免疫系统中起重要作用，所述生理学过程例如为蛋白质降解、血凝固、细胞凋亡(细胞死亡)。将肽激素和酶前体加工成生理学活性或催化活性形式时，这些酶也发挥活化剂的作用。
蛋白酶可被进一步分为两个亚类：仅作用于肽末端的外肽酶，和在肽内部作用的内肽酶。
在肽N-端作用的外肽酶释放单个氨基酸(氨肽酶E.C.3.4.11)或二肽(二肽酶，E.C.3.4.13)或二肽和三肽(二肽基肽酶或三肽基肽酶，E.C.3.4.14)。在肽C-端作用的肽酶被称作羧肽酶，并且释放单个氨基酸(羧肽酶，E.C.3.4.16-18)或二肽(肽酰基-二肽酶，E.C.3.4.15)。羧肽酶根据它们的催化机制分类，例如丝氨酸型羧肽酶(E.C.3.4.16)、金属羧肽酶(E.C.3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(E.C.3.4.18)，或者切割被取代、环化、或具有异构肽键(涉及侧链的肽键)的末端氨基酸(ω-肽酶，E.C.3.4.19)。
内肽酶(E.C.3.4.21-25和E.C.3.4.99)可以被分为以下的亚类：丝氨酸内肽酶(E.C.3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(E.C.3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(E.C.3.4.23)和金属内肽酶(E.C.3.4.24)。E.C.3.4.99针对具有未知催化机制的蛋白酶。
在文献中还报道了催化肽键形成的脂肪酶(三酰基甘油水解酶，E.C.3.1.1.1)，例如来自猪胰腺的脂肪酶(PPL)。
需要时，可以在C-端和/或在N-端和/或在至少一个氨基酸侧链(存在至少一个氨基酸侧链保护基时)上对期望的氨基酸的任选地N-受保护的(寡)肽C-端叔烷基酯进行脱保护，之后可以回收受保护的或脱保护的肽。
形成的N-受保护的肽C-端叔烷基酯或N-受保护的C-端脱保护的肽的N-端保护基的脱保护可以通过本领域技术人员已知的方法来进行。
在一个实施方案中，酶促去除N-端保护基。
能够引入和去除肽的N-端保护基的酶是技术人员已知的，这类酶的例子包括penG酰基酶或肽去甲酰酶。
还可能化学去除N-端保护基，例如通过合适的酸来去除，或者在存在钯碳(Pd on carbon)氢化催化剂时使用H2通过氢化来去除。合适的条件是本领域已知的。
原则上可以用强酸例如TFA去除C-端叔烷基酯官能团，所述强酸可能是有负面影响的(见上文)。因此，可以优选地通过使用水解酶(例如上文鉴定的水解酶)进行所形成的任选地N-受保护的肽C-端叔烷基酯的C-端叔烷基酯官能团的脱保护。
如果最后的肽偶联步骤之后获得的不具有或具有一个或若干个氨基酸侧链的N-受保护的肽C-端叔烷基酯是期望的终产物，则可以例如使用本领域技术人员已知的萃取或结晶方法将其直接回收。如果部分受保护的肽是期望的终产物，则可以进行一个或多个期望的脱保护反应，并且任选地在后处理步骤后能够回收期望的部分受保护的终产物。
当终产物是完全脱保护的肽时，可以通过连续的N-脱保护、C-脱保护和(在最后的肽偶联步骤后存在一个或若干个氨基酸侧链保护基时)氨基酸侧链脱保护步骤获得该肽。本领域技术人员可以常规地确定最终回收完全脱保护的肽的步骤。例如可以使用一个或多个选自萃取、色谱分离和结晶的纯化技术。
优选地，在(最终)偶联反应后从反应混合物中回收肽。
本发明的方法尤其适合于通过N→C端方向的线性合成来合成肽。在线性合成中，通过逐步延伸制备肽，其中向肽上逐步添加单个氨基酸，直至形成具有期望长度和氨基酸组成的肽(见例如上文流程图2)。通过本发明方法生产的肽优选地包含2-50个氨基酸的线性链，尤其是2-20个氨基酸的线性链，更尤其是2-10个氨基酸的线性链。
如果需要，之后可以偶联通过线性合成制备的两个或更多肽。偶联可以通过化学方法、酶促方法或其组合完成。例如可以使用化学连接，例如天然的化学连接。
合适的化学连接方法例如描述于“Dawson，P.E.，Muir，T.W.，Clark-Lewis，I.and Kent，S.B.H.，Science，1994，266，p.776”、“Dawson，P.E.andKent，S.B.，Annu.Rev.Biochem.，2000，69，p.923或Hacken，T.M.，Griffin，J.H.，Dawson，P.E.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，10068中。
本发明接着通过以下的实施例来阐述。
实施例
一般描述
除非另有说明，化学品从商业来源获得并且直接使用而不经进一步的纯化。在Bruker Avance 300MHz NMR(300.1MHz)仪器上记录1H NMR谱，并且以ppm(δ)为单位给出相对于CDCl3(7.26ppm)或D2O(4.79ppm)的化学移位。通过Karl Fischer滴定法测定水含量。
在预涂覆的硅胶60 F254平板(Merck)上进行薄层色谱(TLC)；使用UV光、茚三酮或Cl2/TDM(N，N，N′，N′-四甲基-4，4′-二氨基二苯甲烷)使斑点显影。
除非另有说明，在减压下200℃下活化
Figure GPA00001094820300181
分子筛(8到12目，Acros)，并将叔丁醇(tBuOH)储存在这些分子筛上。使用前将tBuOH预热成为液体(45℃)。
使用硅胶(Merck级别9385
Figure GPA00001094820300182
)进行柱色谱。在40℃下使用反相柱(Inertsil ODS-3，C18，5μm，150×4.6mm内径)，在HP1090 LiquidChromatograph上记录分析性HPLC谱图。使用UV-VIS 204 Linear光谱仪在220nm下进行UV检测。梯度程序为：0-25分钟线性梯度从5％变化到98％的洗脱液B，从25.1-30分钟达到5％洗脱液B(洗脱液A：H2O中0.5mL/L甲磺酸(MSA)，洗脱液B：乙腈中0.5mL/L MSA)。0-25.1分钟流速为1mL/分钟，25.2-29.8分钟流速为2mL/分钟，然后变回为1mL/分钟并在30分钟时停止。注射体积为20μL。
在与分析性HPLC相同的条件下装有相同柱的、以正电离模式运行的Agilent 1100系列系统上进行液相色谱电喷射电离质谱。
如下制备正丁醇中的Alcalase悬浮液：用10mL tBuOH沉淀12.5mLAlcalase(Novozymes，
Figure GPA00001094820300183
2.5L，DX型，PLN04810)，振荡5分钟并以4500rpm离心10分钟。弃去上清液并将先前所述步骤重复两次。最后通过振荡5分钟将沉淀物重悬于10mL tBuOH中。使用叔戊醇(tAmOH)代替tBuOH，类似地制备tAmOH中的Alcalase悬浮液。
如下制备叔丁醇中的Esperase、Everlase或Savinase悬浮液：用50mLtBuOH沉淀10.0mL酶溶液(Novozymes，
Figure GPA00001094820300184
8.0L，PEN00103或16L，EX型，RCN00042或
Figure GPA00001094820300186
16L，EX型，PXN09325)，振荡5分钟并以4500rpm离心10分钟。弃去上清液并将先前所述步骤重复两次。最后通过振荡5分钟将沉淀物重悬于10mL tBuOH中。
如下制备Alcalase-CLEA悬浮液：将1g交联的Alcalase-CLEA(CLEA-technologies，650AGEU/g，3.5重量％水)悬浮于10mL tBuOH中并用铲勺压碎。过滤后在使用前将酶重悬于10mL tBuOH中。
如下制备Polarzyme悬浮液：将1g Polarzyme(Novozymes，
Figure GPA00001094820300191
12 T，PGVG000905)悬浮于10mL tBuOH中。过滤后在使用前将酶重悬于10mL tBuOH中。
实施例1：从相应的N-受保护的氨基酸羧酸制备N-受保护的氨基酸 C-端 t Bu和 t Am酯
使用下文所示方案1-3之一制备氨基酸的若干叔丁基(tBu)和叔戊基(tAm)酯。
方案1：从Z-保护的氨基酸合成Z-保护的氨基酸C-端 t Bu酯
向0.167mmol Z-保护的氨基酸和1g(未活化的)
Figure GPA00001094820300192
分子筛中添加3mL如上文所述制备的Alcalase悬浮液。将混合物在50℃、150rpm下摇动24小时。随后添加3mL MeOH，通过过滤去除固体，并用10mL乙酸乙酯(EtOAc)洗涤。在4500rpm下将合并的有机相离心10分钟，并真空浓缩上清液。
将粗产物溶于50mL二氯甲烷中，用25mL饱和的NaHCO3水溶液(3x)、25mL饱和的NaCl水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，真空浓缩，并用10mL CHCl3(2x)和10mL甲苯(2x)共蒸发。
方案2：从Z-保护的氨基酸合成Z-保护的氨基酸C-端 t Bu酯
向0.167mmol Z-保护的氨基酸、0.5g分子筛中添加如上文所述(但是在活化的分子筛上储存tBuOH)制备的1mL Alcalase悬浮液，并用2mL tBuOH稀释。将该混合物在50℃、150rpm下摇动24小时。
方案3：使用Alcalase-CLEA从N-受保护的-Phe合成N-受保护的-Phe t Bu酯
向0.167mmol X-Phe-OH和0.1g活化的
Figure GPA00001094820300201
分子筛(其中X代表N-端保护基)中添加如上文所述制备的3mL Alcalase-CLEA悬浮液。将混合物在50℃、150rpm下摇动24小时。
通过过滤去除固体后，真空蒸发滤液并将粗产物再溶于20mL EtOAc中，用10mL饱和的NaHCO3水溶液、10mL盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，真空浓缩并与10mL CHCl3(2x)共蒸发。
Z-Phe-O t Bu
根据方案2制备Z-Phe-OtBu。HPLC分析表明24小时后成为tBu酯的转化率为88％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.28-7.05(m，10H)，5.22(d，1H，J＝7.9Hz)，5.01(s，2H)，4.45(m，1H)，2.98(d，2H，J＝6.0Hz)，1.30(s，9H)。
Z-Phe-O t Bu
根据方案1制备Z-Phe-OtBu，不同之处是使用Esperase悬浮液代替Alcalase悬浮液。HPLC分析表明24小时后成为tBu-酯的转化率为38％。
Z-Phe-O t Bu
根据方案1制备Z-Phe-OtBu，不同之处是使用Savinase悬浮液代替Alcalase悬浮液。HPLC分析表明24小时后成为tBu-酯的转化率为43％。
Z-Phe-O t Bu
根据方案1制备Z-Phe-OtBu，不同之处是使用Everlase悬浮液代替Alcalase悬浮液。HPLC分析表明24小时后成为tBu-酯的转化率为24％。
Z-Phe-O t Bu
根据方案1制备Z-Phe-OtBu，不同之处是使用Polarzyme悬浮液代替Alcalase悬浮液。HPLC分析表明24小时后成为tBu-酯的转化率为17％。
Z-Phe-O t Am
根据方案2制备Z-Phe-OtAm，不同之处是使用tAmOH代替tBuOH。HPLC分析表明24小时后成为tAm-酯的转化率为93％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.30-7.01(m，10H)，5.20(d，1H，J＝7.8Hz)，5.00(s，2H)，4.46(m，1H)，3.04-2.92(m，2H)1.72-1.49(m，2H)，1.31(s，3H)，1.28(s，3H)，0.74(t，3H，J＝7.5Hz)。
Z，Z-Lys-O t Bu
根据方案1制备Z，Z-Lys-OtBu。HPLC分析表明24小时后成为tBu酯的转化率＞90％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.25-7.16(m，10H)，5.31(d，1H，J＝5.6Hz)，5.01(s，4H)，4.81(s，1H)，4.15(d，1H，J＝5.1Hz)，3.08(m，2H)，1.72(m，2H)，1.57(m，2H)，1.43(m，2H)，1.37(s，9H)。
Z-Leu-O t Bu
根据方案1制备Z-Leu-OtBu。HPLC表明24小时后成为tBu酯的转化率＞90％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.27-7.19(m，5H)，5.10(d，1H，J＝8.1Hz)，5.03(s，2H)，4.19(m，1H)，1.60(m，2H)，1.45(m，1H)，1.38(s，9H)，0.88(m，6H)。
Z-Ala-O t Bu
根据方案1制备Z-Ala-OtBu。HPLC表明24小时后成为tBu酯的转化率＞90％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.31-7.18(m，5H)，5.29(d，1H，J＝6.0Hz)，5.03(s，2H)，4.18(t，1H，J＝7.2Hz)，1.38(s，9H)，1.29(d，3H，J＝7.1Hz)。
Z-Met-O t Bu
根据方案1制备Z-Met-OtBu。HPLC表明24小时后成为tBu酯的转化率＞90％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.30-7.19(m，5H)，5.33(d，1H，J＝7.60Hz)，5.04(s，2H)，4.29(m，1H)，2.45(m，2H)，2.01(s，3H)，1.87(m，2H)，1.39(s，9H)。
Z-Ser-O t Bu
根据方案1制备Z-Ser-OtBu。HPLC表明24小时后成为tBu酯的转化率为82％。最终纯化需要额外的柱色谱(正庚烷/EtOAc，1/1)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.30-7.19(m，5H)，5.57(s，1H)，5.06(s，2H)，4.25(m，1H)，3.86(m，2H)，2.09(s，1H)，1.41(s，9H)。
Z-DOPA-O t Bu
向3g(9.1mmol)Z-DOPA-OH和10g
Figure GPA00001094820300211
分子筛中添加如上文制备的10mL Alcalase溶液，并用20mL tBuOH稀释。将混合物在50℃、150rpm下摇动，并使用可商业获得的Z-DOPA-OtBu作为参照物通过HPLC分析，显示24小时后成为tBu酯的转化率＞90％。
For-Phe-O t Bu
根据方案3制备For-Phe-OtBu。HPLC表明24小时后成为tBu酯的转化率为98％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ8.04(s，1H)，7.22-7.07(m，5H)，4.99(d，1H，1H，J＝7.3Hz)，4.75(m，1H)，3.02(d，2H，J＝5.6Hz)，1.33(s，9H)。
Boc-Phe-O t Bu
根据方案3制备Boc-Phe-OtBu。HPLC表明24小时后成为tBu酯的转化率为98％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.28-7.16(m，5H)，4.99(d，1H，J＝7.8Hz)，4.45(m，1H)，3.04(d，2H，J＝6.0Hz)，1.42(s，9H)，1.40(s，9H)。
PhAc-Phe-O t Bu
根据方案3制备PhAc-Phe-OtBu。HPLC表明24小时后成为tBu酯的转化率为94％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.29-6.87.(m，10H)，5.77(d，1H，J＝7.8Hz)，4.66(m，1H)3.53(s，2H)，3.45(d，2H，J＝6.1)，1.30(s，9H)。
实施例2：Z-Phe-O t Bu到相应甲基(Me)、乙基(Et)和苯甲基(Bn)酯的酯 交换
Z-Phe-O t Bu到Z-Phe-OMe的酯交换
Figure GPA00001094820300221
如一般描述章节中所述制备Alcalase，不同之处在于沉淀物不重悬于tBuOH中，而是重悬于10mL CH3CN∶MeOH 85∶15 v/v或tBuOH∶MeOH 9∶1v/v中。向50mg Z-Phe-OtBu和0.5g of
Figure GPA00001094820300222
分子筛中添加3mL该悬浮液。
将混合物在50℃以150rpm摇动，并使用相应的化学合成的参照化合物通过HPLC分析。
结果展示于图1A和1B中。本文中显示，使用tBuOH作为共溶剂(120小时后转化率77％)能够获得比乙腈更高的产率和更快的转化。
Z-Phe-O t Bu到Z-Phe-OEt的酯交换
Figure GPA00001094820300231
如一般描述章节中所述制备Alcalase，不同之处在于沉淀物不重悬于tBuOH中，而是重悬于10mL乙醇(EtOH)中。向50mg Z-Phe-OtBu中添加3mL该悬浮液(不使用分子筛)。将混合物在50℃以150rpm摇动，并使用相应的化学合成的参照化合物通过HPLC分析。
结果显示于图2中。96小时的反应时间后，73％的Z-Phe-OtBu被转化为相应的乙基酯。
Z-Phe-O t Bu成为Z-Phe-OBn的酯交换
Figure GPA00001094820300232
如一般描述章节中所述制备Alcalase，不同之处在于沉淀物不重悬于tBuOH中，而是重悬于10mL苯甲醇(BnOH)中。向50mg Z-Phe-OtBu和0.5g
Figure GPA00001094820300233
分子筛中添加3mL该悬浮液。将混合物在50℃以150rpm摇动，并使用相应的化学合成的参照化合物通过HPLC分析。
结果展示于图3中。与成为相应Me和Et酯的酯交换反应(见上文)相比，反应速率显著更高(72小时中转化率87％)。
实施例3：二肽水平上的酯交换反应(Z-Phe-Leu)
在特定的情况下，当底物为肽时，特别是当水解酶为二肽酶时，应当预期在酯交换或活化期间，会同时发生肽键水解。这是否发生过。因此进行下述实验来检验在本发明的方法是否发生该有害作用。
将Z-Phe-Leu衍生物作为模型底物与枯草杆菌蛋白酶Carlsberg组合使用，因为该肽酶能够通过肽键形成来催化这些二肽衍生物的合成，因此这些肽也是观察任何肽键切割的良好的模型底物。首先，通过溶液相化学肽合成来合成所有参照化合物。
反应途径阐述于图4中，其中R1、R2是H、活化基团或叔烷基，取决于进行图中所示的何种反应，例如酯交换时R1＝H且R2为活化基团或叔丁基；酯化时R1＝叔丁基且R2为活化基团；水解R1基团时R1是活化基团或叔丁基且R2是氢。
Z-Phe-Leu-O t Bu(参照化合物的化学合成)
将500mg(1.7mmol)Z-Phe-OH溶于10mL CH2Cl2中。随后添加415mg N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺.HCl(EDCl，2.2mmol，1.3当量)、250mg 7-氮杂-N-羟基苯并三唑(HOAt，1.8mmol，1.1eq)、478μL三乙胺(TEA，1.8mmol，1.1当量)和344mg H-Leu-OtBu(1.8mmol，1.1当量)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。随后添加20mL EtOAc，并用15mL饱和的Na2CO3水溶液(2x)、15mL饱和的NaHCO3水溶液(2x)、15mL盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，真空浓缩并与10mL甲苯(2x)共蒸发得到765mg(98％)Z-Phe-Leu-OtBu。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：.7.09-7.31(m，10H)，6.13(d，1H，J＝8.0Hz)，5.23(d，1H，J＝6.8)，5.01(s，2H)，4.36(m，2H)，3.02(m，2H)，1.45(m，3H)，1.37(s，9H)，0.84(m，6H)。
Z-Phe-Leu-OH(参照化合物的化学合成)
向5mL CF3COOH中添加100mg Z-Phe-Leu-OtBu，所述CF3COOH中已添加了一滴水。将混合物在室温下搅拌2小时，真空浓缩并与10mL甲苯(2x)共蒸发，以定量的产率获得Z-Phe-Leu-OH。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：.7.31-7.04(m，10H)，6.82(d，1H，J＝6.6Hz)，5.79(d，1H，J＝7.3Hz)，4.93(s，2H)，4.44(m，2H)，2.94(m，2H)，1.51(m，3H)，0.77(m，6H)。
Z-Phe-Leu-OMe(参照化合物的化学合成)
将364mg(2.0mmol)HCl·H-Leu-OMe溶于20mL CHCl3和699μL二异丙基乙胺(DIPEA，4mmol，2当量)中。将该溶液添加进599mg(2mmol，1当量)Z-Phe-OH、403mg EDCl(2.1mmol，1.05当量)和300mgHOAt(2.2mmol，1.2当量)在20mL CHCl3中的溶液(0℃)中。
将混合物在室温下搅拌16小时。将溶液真空浓缩，残余物再溶于20mL EtOAc中，用15mL HCl水溶液(pH＝3)、15mL盐水、15mL饱和的Na2CO3水溶液、15mL盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。
额外的柱色谱(EtOAc/正庚烷，1/1)得到625mg(80％)的Z-Phe-Leu-OMe。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.32-7.11(m，10H)，6.06(d，1H，J＝8.0Hz)，5.22(d，1H，J＝11.7Hz)，5.02(s，2H)，4.50(m，1H)，4.36(m，1H)，3.62(s，3H)3.04(m，2H)，1.47(m，3H)，0.80(m，6H)。
Z-Phe-Leu-OBn(参照化合物的化学合成)
将1.57g(4mmol)对甲苯磺酸H-Leu-OBn溶于20mL CH2Cl2和1.4mL DIPEA(8mmol，2当量)中。将该溶液添加至1.20g(2mmol，1当量)Z-Phe-OH、805mg EDCl(4.2mmol，1.05当量)和599mg HOAt(4.4mmol，1.2当量)在20mL CH2Cl2中的溶液(0℃)中。将混合物在室温下搅拌16小时。将溶液真空浓缩，残余物再溶于40mL EtOAc中，用25mLHCl水溶液(pH＝3，2x)、25mL盐水、25mL饱和Na2CO3水溶液(2x)、25mL盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。
额外的柱色谱(EtOAc/正庚烷，1/1)得到2.0g(100％)的Z-Phe-Leu-OBn。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.42-7.17(m，10H)，6.15(d，1H，J＝8.1Hz)，5.29(d，1H，J＝4.3)，5.14(s，2H)，5.09(s，2H)，4.61(m，1H)，4.41(m，1H)，3.07(m，2H)，1.57(m，1H)1.46(m，2H)，0.87(m，6H)。
Z-Phe-Leu-O t Bu水解成
向1.5mL 50mM水性Tris/HCl缓冲液(pH＝8)、1.5mL tBuOH和100mg Z-Phe-Leu-OtBu的混合物中添加300mg Alcalase-CLEA。将反应混合物在37℃下摇动16小时，并用相应的参照化合物(如上文所述制备)通过HPLC分析。
HPLC分析显示，98％的tBu酯已被水解，但是没有可检测的肽键切割。
Z-Phe-Leu-OH酯化成为Z-Phe-Leu-OMe
如前文所述制备Alcalase-CLEA，不同之处在于将酶重悬于10mLMTBE中5体积％的MeOH中。将3mL该悬浮液添加至100mg Z-Phe-Leu-OH和0.1g的
Figure GPA00001094820300251
分子筛中。将混合物在37℃下以100rpm摇动16小时，并用相应的参照化合物(如上文所述制备)通过HPLC分析。
HPLC分析显示酯化基本完全(98％Me酯)，但是没有可检测的肽键切割。
Z-Phe-Leu-OMe酯交换成为Z-Phe-Leu-OBn
如先前所述制备Alcalase-CLEA，不同之处在于将酶重悬于10mLBnOH中。将3mL该悬浮液添加至100mg Z-Phe-Leu-OMe和0.1g的
Figure GPA00001094820300261
分子筛中。将混合物在37℃下以100rpm摇动24小时，并用相应的参照化合物(如上文所述制备)通过HPLC分析。
HPLC分析显示成为Bn酯的转化率为84％，但是没有可检测的肽键切割。
Z-Phe-Leu-O t Bu酯交换成为Z-Phe-Leu-OMe
如先前所述制备Alcalase-CLEA，不同之处在于将酶重悬于10mLMTBE中5体积％的MeOH中。将3mL该悬浮液添加至100mg Z-Phe-Leu-OtBu和0.1g的
Figure GPA00001094820300262
分子筛中。将混合物在37℃下以100rpm摇动24小时，并用相应的参照化合物(如上文所述制备)通过HPLC分析。
HPLC分析显示Z-Phe-Leu-OtBu被转化为Z-Phe-Leu-OMe(81％)，但是没有肽键切割。
实施例4：通过共沸去除水和醇的酯化
将Z-Phe-OH转化为Z-Phe-OtBu，同时通过在减压(以完成共沸水去除)下进行反应去除水。
因此，在含7.5g Alcalase-CLEA(用tBuOH洗涤一次)、75mLtBuOH和1.25g Z-Phe-OH的圆底烧瓶中进行反应。将混合物在50℃下搅拌，同时每隔1小时(例如在t＝20-21h和22-23h之间，图5B)应用真空(直至沸腾，P≈600mbar)。将蒸发的溶剂收集在气阱中。
每小时取样(2mL)，通过HPLC监测酯化反应的进程(图5A)并测定反应混合物的水含量(图5B)。1小时真空后，将反应混合物在氮气下搅拌1小时(50℃)，来研究水含量是否会由于产物形成而提高(例如在t＝21-22h和23-24h之间，图5B)。因为反应体积由于蒸发和取样而减小，所以需要时(例如t＝24-25h之间，图5B)添加新鲜的tBuOH(至50mL的体积)。显然，水含量和真空之间(应用真空时水含量降低，图5B)以及水含量和产物产率之间(水含量降低后产率急剧提高，图5A)都存在强的相关性。
因此，应用真空证明是成功的去除水的方法，并且获得了与
Figure GPA00001094820300271
分子筛(96％)可比较的Z-Phe-OtBu酯产率(92％，图5A)。
实施例5：酶回收
将用30mL tBuOH洗涤过一次的1g Alcalase-CLEA添加至10mLtBuOH和150mg Z-Phe-OH。将混合物在50℃下以150rpm摇动24小时。HPLC表明Z-Phe到Z-Phe-OtBu的转化率为60％。随后过滤反应混合物，并将Alcalase-CLEA重悬于10mL tBuOH和150mg Z-Phe-OH中。将混合物在50℃下以150rpm摇动24小时。HPLC表明Z-Phe到Z-Phe-OtBu的转化率为77％。将该步骤重复两次(分别有77％和76％酯化成为Z-Phe-OtBu)。过滤后将酶在4℃储存2天，之后重悬于10mL tBuOH和150mgZ-Phe-OH中。将混合物在50℃下以150rpm摇动，24小时后HPLC表明Z-Phe到Z-Phe-OtBu的转化率为75％。这证明回收期间几乎没有任何酶失活。
实施例6：使用C-端叔丁基酯的酯交换合成三肽
Figure GPA00001094820300272
Z-Phe-Leu-O t Bu
通过搅动将10mL Alcalase溶液(Novozymes，Alcalase 2.5L，DX型)悬浮于无水叔-BuOH(25mL)中。离心得到的混合物并通过倾析去除溶剂。将该步骤使用叔-BuOH重复两次，使用MTBE重复两次。最后将酶悬浮于MTBE(30mL)中，并将6mL得到的混合物添加至Z-Phe-OMe(94mg，0.3mmol)和H-Leu-OtBu(169mg，0.9mmol)的混合物中。
将反应混合物在50℃下搅拌三天，直至分析性HPLC分析表明成为二肽的转化完成。通过过滤去除酶并真空去除溶剂。将残余物再溶于EtOAc(20mL)中，随后用HCl水溶液(10mL，pH＝3，2x)、盐水(10mL)、饱和的NaHCO3水溶液(10mL，2x)和盐水(10mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。
通过快速柱色谱(洗脱液：EtOAc/正庚烷1∶1 v/v)从粗产物(115mg，82％)中分离Z-Phe-Leu-OtBu(55mg，39％)，其为静置后固化的澄清油。
Rf＝0.53(洗脱液：EtOAc/正庚烷1∶1 v/v)，Rt＝24.17分钟，1H-NMR(CDCl3)δ7.30-7.10(m，10H)，6.11(d，J＝8.03Hz，1H)，5.21(br s，1H)，5.01(s，2H)，4.36(m，2H)，3.02(m，2H)，1.50(m，3H)，1.37(s，9H)，0.82(dd，J＝2.23Hz，J＝3.82Hz，6H)。
Z-Phe-Leu-OMe
用tBuOH(25mL)将750mg的Alcalase-CLEA洗涤一次，之后添加进MTBE/MeOH(6mL，97∶3 v/v)中的Z-Phe-Leu-OtBu(30mg)溶液中。将反应混合物在50℃下摇动16小时，直至HPLC分析表明成为甲酯的转化率＞97％。通过过滤去除酶，并通过真空浓缩去除溶剂。
Rf＝0.39(洗脱液：EtOAc/正庚烷 1∶1 v/v)，Rt＝20.67分钟，1H-NMR(CDCl3)δ7.32-7.11(m，10H)，6.08(d，J＝8.03Hz，1H)，5.22(br s，1H)，5.02(s，2H)，4.49(m，1H)，4.36(m，1H)，3.62(s，3H)，3.01(m，2H)，1.47(m，3H)，0.81(m，6H)。
Z-Phe-Leu-O t Bu
通过搅动将10mL Alcalase溶液(Novozymes，Alcalase 2.5L，DX型)悬浮于无水tBuOH(25mL)中。离心得到的混合物并通过倾析去除溶剂。将该步骤使用tBuOH重复两次并使用MTBE重复两次。最后，将酶悬浮于MTBE(30mL)中，并将6mL得到的混合物添加至Z-Phe-Leu-OMe(128mg，0.3mmol)和H-Gly-OtBu(118mg，0.9mmol)的混合物中。
将反应混合物在50℃搅拌。两天后HPLC分析表明成为三肽的转化率约为50％并终止反应。通过过滤去除酶并真空浓缩溶液。通过快速柱色谱(洗脱液：梯度EtOAc/正庚烷1∶3 v/v→EtOAc/正庚烷1∶1 v/v)分离产物(43mg，28％)，所述产物为静置后固化的澄清油。Rf＝0.28(洗脱液：EtOAc/正庚烷1∶1 v/v)，
Rt＝22.02分钟，1H-NMR(CDCl3)δ7.30-7.10(m，10H)，6.46(br s，1H)，6.32(d，J＝8.03Hz，1H)，5.29(d，J＝7.27Hz，1H)，5.00(s，2H)，4.39(m，2H)，3.77(m，2H)，3.01(m，2H)，1.61(m，3H)，1.39(s，9H)，0.83(m，6H)。
TFA.H-Phe-Leu-Gly-OH
首先，通过在存在钯(活性炭上10％)时用氢气(1 bar)处理THF/H2O(4mL，1∶1 v/v)中的Z-Phe-Leu-Gly-OtBu(59mg，0.11mmol)溶液来去除Z-保护基。将反应混合物在室温下搅拌16小时，并通过在Decalite上过滤去除催化剂。真空浓缩得到的溶液，随后将残余物与甲苯和氯仿共蒸发。通过HPLC分析证实Z-保护基被完全去除。
随后用TFA/CH2Cl2(6mL，1∶1 v/v)在室温下将残余物处理3小时以去除tBu酯。真空浓缩混合物，随后将残余物与氯仿共蒸发并用Et2O研磨，得到呈白色固体的三肽产物(41mg，80％)。
通过HPLC-MS和1H-NMR光谱证实产物为TFA.H-Phe-Leu-Gly-OH。Rt＝6.39分钟，针对C17H25N3O4计算的ESMS为335.18，测试为336[M+H]+。1H-NMR(D2O)δ7.35-7.20(m，5H)，4.34(m，1H)，4.20(m，1H)，3.86(m，2H)，3.15(m，2H)，1.53(m，3H)，0.82(m，6H)。
实施例7：用枯草杆菌蛋白酶-A酯化N-受保护的氨基酸。
将冻干的枯草杆菌蛋白酶A(1g，Novozymes)溶于10mL Tris/HCl缓冲液(pH＝8)中，并用20mL tBuOH沉淀。离心(10分钟，4500rpm)后弃去上清液，并将沉淀物重悬于20mL tBuOH中。将该步骤重复两次。最终倾析后，将200mg沉淀物重悬于3mL tBuOH中，并添加50mg Z-Phe-OH和100mg
Figure GPA00001094820300291
分子筛。将该混合物在50℃以150rpm摇动。16小时后的HPLC分析表明成为tBu酯的转化率＞60％。

Claims (17)

1.制备肽的方法，包括偶联活化的、N-受保护的氨基酸C-端酯或活化的、任选地N-受保护的肽C-端酯，所述偶联包括：
-通过与活化醇进行酯交换来活化第一N-受保护的氨基酸的叔烷基C-端酯，或第一任选地N-受保护的肽的叔烷基C-端酯，从而形成第二N-受保护的氨基酸C-端酯或第二任选地N-受保护的肽C-端酯，所述活化由水解酶催化；和
-使第二酯与任选地C-端受保护的氨基酸或任选地C-端受保护的肽偶联形成肽键，所述偶联由催化肽键形成的酶催化，所述酶可与用于催化酯交换的酶相同或不同。
2.根据权利要求1的方法，其中所述氨基酸或肽的C-端叔烷基酯选自叔丁基酯、叔戊基酯和叔己基酯。
3.根据权利要求1或2的方法，其中连续进行一个或多个另外的酯交换步骤和偶联步骤，直至获得具有期望的氨基酸序列的肽。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中连续进行一个或多个另外的活化步骤和偶联步骤，直至获得具有期望的氨基酸序列的肽。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述活化或者酯交换发生在包含活化醇的液相中，所述液相含有以液相总重为基础少于4重量％的水，尤其是2重量％或更少的水，更尤其是1重量％或更少的水。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述活化醇选自任选地取代的正烷基醇、任选地取代的芳烷基醇和任选地取代的芳基醇，尤其选自C1-C6的正烷基醇、C6-C12芳基醇和C7-C18的芳烷基醇，优选地选自甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇和苯甲醇。
7.用于制备N-受保护的氨基酸C-端酯或任选地N-受保护的肽C-端酯的方法，包括在存在水解酶时用下述醇对N-受保护的氨基酸的C-端叔烷基酯或任选地N-受保护的肽的C-端叔烷基酯进行酯交换，所述醇是不同于对应于第一酯的叔烷基的叔烷基醇的其他醇。
8.根据权利要求7的方法，其中所述酯交换在包含所述醇的液相中进行，其中所述液相包含少于4重量％的水，尤其是2重量％或更少的水，更尤其是1重量％或更少的水。
9.根据权利要求7或8的方法，其中所述醇选自伯烷基醇、仲烷基醇、任选地取代的芳基醇和任选地取代的芳烷基醇，尤其选自C1-C6伯烷基醇或仲烷基醇、C6-C12芳基醇和C7-C18芳烷基醇。
10.根据权利要求7-9中任一项的方法，其中所制备的C-端酯是活化的酯，其适用于通过动力学肽偶联使另一氨基酸或肽与所述氨基酸或肽偶联，优选地为甲酯、乙酯、正丙基酯、正丁基酯、任选地取代的苯基酯或任选地取代的苯甲基酯。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述酯交换进行到至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％的C-端叔烷基酯被酯交换。
12.制备N-受保护的氨基酸C-端叔烷基酯或任选地N-受保护的肽C-端叔烷基酯的方法，包括在存在水解酶时用叔烷基醇酯化N-受保护的氨基酸的C-端羧酸或者任选地N-受保护的肽的C-端羧酸。
13.根据权利要求12的方法，其中使用包含所述醇的液相进行酯化，所述液相包含以液相总重为基础少于4重量％的水，尤其包含2重量％或更少的水，更尤其包含1重量％或更少的水。
14.根据权利要求7-13中任一项的方法，其中所述叔烷基选自叔丁基、叔戊基和叔己基。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使用选自羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、脂肪酶和肽酶的水解酶，尤其是选自脂肪酶和肽酶的水解酶。
16.根据权利要求15的方法，其中所述酶是选自丝氨酸型羧肽酶、金属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸内肽酶和金属内肽酶的肽酶，尤其是选自丝氨酸内肽酶的肽酶。
17.根据权利要求16的方法，其中所述丝氨酸内肽酶是枯草杆菌蛋白酶，优选地是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
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