CN101818142B

CN101818142B - 用于复制核酸序列的方法

Info

Publication number: CN101818142B
Application number: CN2010100020327A
Authority: CN
Inventors: 三好隼人; 岩木义英
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2009-01-09
Filing date: 2010-01-07
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2030-01-07
Also published as: CN101818142A; JP2010158215A; JP5616584B2; US20100184154A1; EP2206789A1

Abstract

本发明的目的是提供使用寡核苷酸引物和DNA聚合酶复制核酸序列的方法。本发明提供用于复制核酸序列的方法，其包括用催化链置换互补链合成反应的聚合酶合成互补链，其中将在两个末端具有由20以上-200以下个连续核苷酸组成的序列A(Ac)的双链模板核酸用作起始点。

Description

用于复制核酸序列的方法

技术领域

本发明涉及用于复制核酸序列的方法。更具体地，本发明涉及用于复制核酸序列的方法，其中聚合酶反应通过使用具有特定结构的模板核酸序列作为起始点温育具有DNA聚合酶的反应溶液而进行。

背景技术

在分子生物学研究中，核酸的扩增通常通过使用DNA聚合酶的酶方法进行。作为用于扩增核酸的方法，聚合酶链式反应(PCR)已被广泛已知。为了扩增目的靶核酸序列，PCR方法包括以下三个步骤：变性作为模板使用的双链DNA以将其转化为单链DNA的步骤(变性步骤)；针对所述单链DNA对引物退火的步骤(退火步骤)；和利用引物作为起始点延长互补链的步骤(延伸步骤)。在一般的PCR法中，使用热循环仪，且变性步骤、退火步骤和延伸步骤以不同的温度进行。然而，所述以3种不同温度类型进行的核酸扩增反应需要复杂的温度控制。而且，PCR法也已经引起一些问题，因为随着循环次数的增加时间损失也增加。

在前述情况下，已经开发了可以在等温条件下进行的核酸扩增方法。所述核酸扩增方法的实例包括RCA(旋转循环扩增：Proc.Natl.Acad.Sci(国际科学院学报)，卷92，4641-4645(1995))，ICAN(等温和嵌合引物起始的核酸扩增)，LAMP(环-介导的等温DNA扩增；Bio Industry(生物工业)，卷18，第2号(2001))，NASBA(基于核酸序列的扩增法；Nature(自然)，350，91-(1991))，和TMA(转录介导的扩增法；J.Clin Microbiol(临床微生物学杂志).卷31，3270-(1993))。

SDA法(日本专利公开(Kokai)号5-130870A(1993))是使用核酸外切酶的循环测定法，其是一种用于利用聚合酶延长反应扩增靶核酸片段目的位点的扩增方法类型。这是一种利用与靶核酸片段的所述目的位点特异性杂交的引物作为起始点进行聚合酶延长反应，并同时，容许5’→3’核酸外切酶在其上作用，从而从反向分解引物的方法。代替分解的引物，新引物与该位点杂交，并再用DNA聚合酶进行延长反应。连续周期性重复这种使用聚合酶的延长反应和随后的使用核酸外切酶解离延长的链的分解反应。于此，使用聚合酶的延长反应和使用核酸外切酶的分解反应可以在等温条件下进行。然而，在该方法中，应该使用了核酸外切酶以及聚合酶。因此，这需要高成本，且还需要设计引物的装置工具。

LAMP方法是扩增靶核酸片段的目的位点的方法，其是近期开发的。该方法使用互补识别靶核酸片段的至少6个特定位点的至少4种类型的引物和不具有5’→3’核酸外切酶活性的链置换型Bst DNA聚合酶，并在释放模板上的双链DNA作为单链DNA的同时催化延长反应，以使得可以在等温条件下将靶核酸片段的目的位点扩增为特定结构。然而，应该使用了识别6个特定位点的至少4种类型的引物，且因此非常难以设计所述引物。

ICAN法也是用于扩增靶核酸片段目的位点的方法，其是近期开发的。这是一种在等温条件下，使用RNA-DNA嵌合引物，具有链置换活性和模板交换活性的DNA聚合酶，和RNA酶H来扩增基因的方法。在所述嵌合引物结合模板后，通过DNA聚合酶合成互补链。其后，RNA酶H裂解嵌合引物-来源的RNA部分，并由裂解位点开始，延长反应伴随链置换反应和模板交换反应发生。通过重复该反应，扩增基因。然而，该方法也需要使用特定的引物，即嵌合引物，且因此很难设计该引物。

日本专利公开(Kohyo)号11-509406A(1999)描述在等温条件下，通过使目的区域内的DNA在存在具有链置换能力的DNA聚合酶的条件下与至少一对寡核苷酸引物反应而对其进行扩增的方法。然而，日本专利公开(Kohyo)号11-509406A(1999)中所述的方法已经引起了问题，因为其需要相当长的反应时间。

日本专利公开(Kokai)号2002-233379描述在等温条件下，通过使目的区域内的DNA在存在具有链置换能力的DNA聚合酶的条件下与至少一对寡核苷酸引物反应而对其进行扩增的方法。然而，日本专利公开(Kokai)号2002-233379中所述的方法已经在显著水平的非特异性扩增产物生成方面引起了问题。

发明概述

本发明的目的是提供使用寡核苷酸引物和DNA聚合酶复制核酸序列的方法。本发明的另一个目的是提供用于复制核酸序列的方法，所述方法可以在等温条件下进行并容许以高效率短时间特异性复制核酸序列，其不需要复杂的引物设计或特殊的酶。

作为针对实现前述目的的密集研究的结果，本发明人已经发现了核酸序列可以以高效率特异性扩增，这通过提供具有这样的结构的核酸序列实现，在所述结构中，交替排列由模板核酸序列上的20以上-200以下个连续核苷酸组成的序列A(Ac)和由1以上-100以下个核苷酸组成的与模板核酸序列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，由此完成本发明。Ac和Bc代表A和B的各个互补序列。

本发明提供用于复制核酸序列的方法，其包括用催化链置换互补链合成反应的聚合酶合成互补链，其中将在两个末端具有由20以上-200以下个连续核苷酸组成的序列A(Ac)的双链模板核酸用作起始点。

优选地，按照本发明的用于复制核酸序列的方法包括以下步骤：

(a)提供具有这样的结构的双链模板核酸的步骤，其中交替排列由20以上-200以下个连续核苷酸组成的序列A(Ac)和由1以上-100以下个核苷酸组成的与模板核酸序列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，其中双链模板核酸的特征是其中存在至少两个序列A(Ac)；

(b)解离步骤(a)中提供的模板核酸的全部或一部分的步骤；

(c)在新核酸链和步骤(b)中获得的全部或部分解离的双链模板核酸之间通过序列A(Ac)形成碱基对的步骤；和

(d)用催化链置换互补链合成反应的聚合酶合成互补链的步骤，其中将在步骤(c)碱基配对的一个或两个核酸链的3’-末端用作合成起始点。

(a)提供具有这样的结构的双链模板核酸的步骤，其中交替排列由20以上-200以下个连续核苷酸序列组成的序列A(Ac)和由1以上-100以下个核苷酸组成的与模板核酸序列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，其中双链模板核酸的特征是其中存在至少两个序列A(Ac)；

(b)解离步骤(a)中提供的模板核酸的全部或一部分的步骤；

(c)在步骤(b)中获得的全部或部分解离的双链模板核酸之间通过序列A(Ac)形成碱基对的步骤；和

优选地，所述反应溶液包括与双链模板核酸的一部分互补的寡核苷酸。

优选地，将在步骤(d)中由链置换互补链合成反应获得的产物用作步骤(a)中的双链模板核酸。

优选地，所有步骤在等温条件下进行。

优选地，所有步骤在50℃以上-100℃以下的等温温度下进行。

优选地，催化链置换互补链合成反应的聚合酶选自由源自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的5’→3’核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的5’→3’核酸外切酶缺陷型Bca DNA聚合酶，源自Termococcus litoralis的5’→3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶，和源自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶组成的组。

优选地，所述反应溶液包括至少0.01％以上的表面活性剂。

优选地，所述表面活性剂是非离子表面活性剂。

优选地，所述反应溶液还包括二价阳离子。

优选地，所述反应溶液还包括解链温度调节剂。

优选地，所有步骤在60分钟内进行。

按照本发明，只要提供具有特定结构的模板核酸序列和使用具有链置换活性的DNA聚合酶，则模板核酸序列持续延长。因此，模板核酸序列可以以非常高的效率特异性复制。即，靶核酸序列可以在等温条件下，以高效率短时间复制，其不需要复杂的引物设计或特殊的酶。

附图简述

图1显示用于按照本发明扩增核酸的方法的概述。

图2显示用于按照本发明扩增核酸的方法的概述。

图3显示用于按照本发明扩增核酸的方法的概述。

图4显示在关于β2AR基因的实施例中使用的引物的位置关系。

图5显示通过电泳来自使用引物(1)和引物(3)的复制反应的产物获得的结果。

图6显示通过电泳来自使用引物(2)和引物(3)的复制反应的产物获得的结果。

发明的实施方式

在下文中，更详细地描述本发明。

按照本发明用于扩增核酸的方法是在等温条件下以高效率短时间扩增靶核酸序列的方法，其不需要复杂的引物设计或特殊的酶，其特征在于至少包括以下步骤：

(b)解离步骤(a)中提供的模板核酸的全部或一部分的步骤；

按照本发明用于扩增核酸的方法的概述显示在图1中。

按照本发明，解离模板核酸的全部或一部分的步骤既不需要特殊的试剂，也不需要以高温处理。

优选地，解离模板核酸的全部或一部分的步骤在50℃以上-100℃以下的温度进行。

按照本发明，步骤(c)中的新核酸链可以由全部或部分解离的不同双链模板核酸分子提供(图2)。

按照本发明，步骤(c)中的新核酸链可以由全部或部分解离的原始双链模板核酸分子提供(图3)。

按照本发明，反应溶液可以包括与双链模板核酸的一部分互补的寡核苷酸。

在此，将在下文中描述本发明中使用的成分。

(1)脱氧核苷酸三磷酸酯

将脱氧核苷酸三磷酸酯用作延长反应的底物。具体地，优选使用dATP，dCTP，dGTP和dTTP的混合物。脱氧核苷酸三磷酸酯可以包括dNTP的类似物(例如，7-脱氮-dGTP，等)。

另外，所述脱氧核苷酸三磷酸酯(dATP，dCTP，dGTP和dTTP的混合物)的终浓度在0.1mM-100mM，优选0.75mM-3.0mM，更优选1.0mM-2.0mM，和特别优选1.0mM-1.5mM的范围内。

(2)DNA聚合酶

在本发明中，使用具有链置换能力的聚合酶。术语“链置换能力”在本说明书中用于意指利用核酸序列作为模板进行DNA复制同时置换DNA链从而释放对模板链退火的互补链的活性；即进行链置换的活性。所述具有链置换能力的聚合酶的特殊实例包括源自嗜热脂肪芽孢杆菌的5’→3’核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自热坚芽孢杆菌的5’→3’核酸外切酶缺陷型Bca DNA聚合酶，源自Termococcus litoralis的5’→3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶，和源自酸热脂环酸芽孢杆菌的DNA聚合酶，但实例不仅限于此。所述具有链置换能力的聚合酶可以是天然存在的蛋白或通过遗传工程生成的重组蛋白。

(3)二价阳离子

在本发明中，为了所用酶等的金属性需求使用二价阳离子。作为这样的二价阳离子，可以使用镁盐、钙盐、和其他金属盐。例如，可以使用氯化镁、乙酸镁、硫酸镁等。所述二价阳离子的终浓度在优选1mM-20mM，和更优选2mM-10mM的范围内。

(4)表面活性剂

在本发明中，可以将表面活性剂加入到反应溶液中。使用这样的表面活性剂，可以获得本发明的有利效果，即防止核酸的非特异性扩增。本发明中使用的表面活性剂的类型不受特别的显著。本发明中可以使用的表面活性剂的实例包括：阴离子表面活性剂诸如烷基苯磺酸钠，十二烷基硫酸钠(SDS)，辛基磺基琥珀酸盐或硬脂酸皂；非离子表面活性剂诸如蔗糖脂肪酸酯，POE失水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，等)，脂肪酸链烷醇酰胺，POE烷基醚(Brij 35，Brij 58，等)，POE烷基苯基醚(Triton X-100，Triton X-114，Nonidet P40，等)))，壬基苯酚，月桂醇，聚乙二醇，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，POE烷基胺或POE脂肪酸二苯基醚；和阳离子表面活性剂诸如十六烷基氯化吡啶鎓，月桂基二甲基苄基氯化铵或硬脂基三甲基氯化铵。所用表面活性剂的量不受特别的限制，条件是可以实现本发明的效果。所用表面活性剂的量是优选0.01％以上，更优选0.05％以上，和进一步优选0.1％以上。所用表面活性剂的量的上限不受特别的显著。通常是10％以下，优选5％以下，和更优选1％以下。

在所述表面活性剂中，使用非离子表面活性剂是特别优选的。在非离子表面活性剂中，具有强亲水性的非离子表面活性剂是优选的，且在HLB值方面，具有12以上的HLB值的非离子表面活性剂是优选的。所述HLB值更优选是14以上。优选应用的HLB值的上限是20。HLB值的上限更优选是17以下，和进一步优选是14-17。在结构上，本发明中使用的表面活性剂优选选自聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯烷基醚。在所述聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯中，仅具有一个脂肪酸酯的那些是优选的。所述化合物的实例通过以下结构式表示：

烷基基团的位置不受特别的限制。还可以优选使用以下结构。

由上述通式表示的表面活性剂包括称为聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯的非离子表面活性剂。所述聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯非离子表面活性剂的实例包括聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯，和聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯。(产品名：吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，等)。使用的所述非离子表面活性剂的量不受特别的限制。优选是0.01％以上，更优选0.05％以上，和进一步优选0.1％以上。

(5)寡核苷酸

本发明中使用的寡核苷酸具有基本与模板DNA互补的核苷酸序列，并容许DNA链由其3’端开始延长。因此，由于所述寡核苷酸具有基本与模板DNA互补的核苷酸序列，所以其可以对作为模板使用的DNA退火。作为本发明中使用的寡核苷酸，可以使用由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的寡核苷酸，且所述寡核苷酸还可以包括修饰的核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸。

寡核苷酸的长度不受特别的限制。所述长度由通常约10-100个核苷酸，优选约15-50个核苷酸，和更优选约15-40个核苷酸组成。

所述寡核苷酸可以通过使用可商购的DNA合成器(例如，由AppliedBiosystems(应用生物系统)制造的394型DNA合成器，等)的亚磷酰胺(phosphoamidite)法合成。

反应溶液中使用的所述寡核苷酸的量是优选0.1μM以上，更优选1μM以上，和特别优选1.5μM以上。

(6)解链温度调节剂

可以将解链温度调节剂加入到本发明的反应溶液中。所述解链温度调节剂的具体实例包括二甲亚砜(DMSO)，甜菜碱，甲酰胺，甘油，四烷基铵盐，和这些化合物中两种以上类型的混合物。使用的所述解链温度调节剂的量不受特别的限制。当解链温度调节剂是DMSO，甲酰胺，或甘油时，通常可以以10％以下的百分比包含在反应溶液中。

甜菜碱或四烷基铵盐可以以约0.2-3.0M，和优选约0.5-1.5M的浓度添加到反应溶液中。

(7)缓冲成分

本发明中使用的反应溶液可以包括缓冲成分。所述缓冲成分的类型不受特别的限制。例如，可以使用N-二(羟乙基)甘氨酸，麦黄酮(tricin)，Hepes，Tris，磷酸盐(磷酸钠，磷酸钾，等)，等。缓冲成分的终浓度在5mM-100mM，和特别优选10mM-50mM的范围内。缓冲成分的pH值取决于扩增反应中使用的酶的最佳pH。通常是pH 6.0-9.0，和特别优选是pH 7.0-9.0。

(8)荧光染料

本发明中使用的反应溶液可以包括荧光染料。所述荧光染料的类型不受特别的限制。例如，可以使用SYBRGreen I等。

其次，将描述按照本发明的用于扩增核酸的方法。

在本发明中，扩增核酸的步骤可以优选在基本等温条件下进行。温育反应溶液的温度是优选50℃以上，和更优选55℃以上。反应溶液可以在例如约60℃温育。温度范围是优选约50℃-约70℃，和更优选约55℃-约65℃。

按照本发明的用于扩增核酸的方法可以在基本等温条件下进行。在本发明中，术语“等温条件”意指在不显著改变各个步骤中的反应温度的条件下，在基本恒定的温度下进行各个步骤。

在本发明中，在基本等温条件下温育反应溶液所需的时间不受特别的限制，条件是可以扩增靶核酸序列。温育时间是，例如，5分钟-12小时。温育时间是优选5分钟-2小时，更优选5分钟-60分钟，和进一步优选5分钟-30分钟。还可以设置为5分钟-15分钟。

在基本等温条件下扩增核酸的步骤是有利的，因为其不需要增高或降低温度。在常规PCR方法中，必需增高或降低温度，且因此需要反应器诸如热循环仪。然而，当扩增核酸的步骤在基本等温条件下进行时，所述步骤可以仅利用维持恒定温度的装置进行。

将描述使用按照本发明扩增核酸的方法的方法。

按照本发明的扩增核酸的方法可以用于检测核酸，标记、确定核苷酸序列，检测核苷酸突变(包括检测单核苷酸多态性等)，等。由于本发明的用于扩增核酸的方法不需要使用能够温度控制的反应容器，因此扩增反应可以利用大量反应溶液进行。

通过本发明的扩增核酸的方法获得的扩增产物可以通过本领域中技术人员已知的方法检测。例如，根据凝胶电泳，可以通过使用溴化乙锭染色凝胶检测特定尺寸的反应产物。作为用于检测扩增产物的检测系统，可以使用荧光偏振、免疫测定、荧光能量转移、酶标记(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶，等)、荧光标记(例如，荧光素、若丹明，等)、化学发光、生物发光等。还可能利用Taqman探针或分子信标(Molecular Beacon)检测扩增产物。还可能利用用生物素等标记的标记核苷酸检测扩增产物。在这种情形中，扩增产物中包含的生物素可以利用荧光标记的抗生物素蛋白或酶标记的抗生物素蛋白检测。而且，使用本领域中技术人员已知的氧化还原嵌入剂，可以用电极检测扩增产物。此外，扩增产物还可以利用SPR检测。

通过检测焦磷酸镁，可以检测核酸扩增。在这种情形中，扩增产物可以通过本领域中技术人员已知的其他方法，诸如检测浊度来检测。

本发明将在以下实施例中更加具体地描述。然而，这些实施例不意欲限制本发明的范围。

实施例

<实施例1>复制β2AR基因序列

(1)制备含有靶核酸序列的核酸样品溶液

将3.0ng人基因组DNA(由Clonetech制造)在98℃加热3分钟，以生成单链。随后，在以下条件下扩增β2AR基因中的序列。

<引物>

使用以下引物，从而由包含靶核酸序列的样品获得具有这样的结构的双链模板核酸，其中交替排列由20以上-200以下个连续核苷酸组成的序列A(Ac)和由3以上-100以下个核苷酸组成的与模板核酸序列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，其中双链模板核酸的特征是其中存在至少两个序列A(Ac)。

各种引物的序列显示如下。

引物(1)：

5’-CCACGACGCTTGCTGGCACCCAATA3’(SEQ ID NO：1)

引物(2)：

5’-TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA-3’(SEQ ID NO：2)

引物(3)：

5’-CCGGCGCATGGCTT-3’(SEQ ID NO：3)

前述引物与β2AR基因的位置关系的详细信息显示在图4中。

在此，引物(1)和(2)中每一种的5’端处的8个核苷酸与基本互补于引物(3)的序列的5’端侧存在的序列基本互补。

(2)核酸序列的复制反应

扩增反应利用具有以下组成的反应溶液，在60℃进行60分钟。作为酶，使用由NEB制造的Bst.DNA聚合酶。

<反应溶液的组成>

10×Bst缓冲液(DF) 1.0μL

100mM MgSO4 0.6μL

10％(v/v)吐温20 0.1μL

100％DMSO 0.5μL

25mM各种dNTP 0.56μL

SYBRGreen I(2000-倍稀释) 0.2μL

50μM引物(1)或(2) 0.64μL

50μM引物(3) 0.64μL

Bst.聚合酶 0.4μL

在(1)中获得的核酸片段样品 3.0ng

纯化水 4.96μL

10.0μL

(3)通过电泳检测

利用3wt％琼脂糖凝胶和0.5×TBE缓冲液(50mM Tris，45mM硼酸，0.5mM EDTA，pH8.4)，以100V进行电泳60分钟。结果显示在图5和6中。

通过组合引物(1)和引物(3)，获得由序列A(Ac)的42个碱基对和序列B(Bc)的1对碱基对组成的模板核酸序列。利用由具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)结构的85对碱基对的模板核酸序列作为起始点，通过图1、图2、或图3中所示的反应机制，假定应该复制由128个碱基对、171个碱基对、214个碱基对、和257个碱基对(此后，将由43个碱基对聚合)组成的核酸序列。图5中所示的结果对应于预期的条带尺寸。因此，该结果证明核酸序列的复制反应以A(Ac)B(Bc)A(Ac)结构作为起始点进行。具有最小分子量的条带是被夹在引物之间的区域(42个碱基对)。

通过组合引物(2)和引物(3)，获得由序列A(Ac)的42个碱基对和序列B(Bc)的32个碱基对组成的模板核酸序列。利用由具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)结构的116个碱基对的模板核酸序列作为起始点，通过图1或图2中所示的反应机制，假定应该复制由190个碱基对，264个碱基对，338个碱基对，和1412个碱基对(此后，将由74个碱基对聚合)组成的核酸序列。图6中所示的结果对应于预期的条带尺寸。因此，该结果证明核酸序列的复制反应以A(Ac)B(Bc)A(Ac)结构作为起始点进行。具有最小分子量的条带是被夹在引物之间的区域(42个碱基对)。

(4)复制反应产物的测序分析

复制反应产物利用NucleoSpin(注册商标)Extract II(由MACHEREY-NAGEL制造)和然后利用TOPO TA克隆试剂盒(由Invitrogen制造)纯化，将其引入载体。随后，用该载体转化大肠杆菌(Escherichiacoli)。转化的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养。

利用QIAprep Miniprep(由Qiagen制造)，从培养的大肠杆菌中回收质粒DNA。

对回收的质粒DNA进行测序，以确定其核苷酸序列。所述测序利用ABI PRISM 310基因分析仪(由ABI制造)进行。作为引物，使用M13反向引物。

M13反向引物

5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID NO：4)

作为测序的结果，发现具有以下序列的核酸可以通过组合引物(1)和引物(3)获得。

(1)

5’-CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG-3’

3’-GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC-5’

(42个碱基对)(SEQ ID NO：5)

(2)

5’-CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC-3’

3’-GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG-5’

5’-GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGG-3’

3’-CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCC-5’

(85个碱基对)(SEQ ID NO：6)

(3)

5’-CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC-3’

3’-GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG-5’

5’-GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGGACCAC GACGTTCTTG-3’

3’-CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCCTGGTG CTGCAAGAAC-5’

5’-CTGGCACCCA ATAGAAGCCA TGCGCCGG-3’

3’-GACCGTGGGT TATCTTCGGT ACGCGGCC-5’

(128个碱基对)(SEQ ID NO：7)

作为测序分析的结果，发现复制反应产物中存在具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)结构的核酸序列的85个碱基对和具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)B(Bc)A(Ac)结构的核酸序列的128个碱基对。

由前述结果，发现序列A(Ac)和序列B(Bc)可以从具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)结构的模板核酸序列开始以高效率特异性复制。

作为测序的结果，发现具有以下序列的核酸可以通过组合引物(2)和引物(3)获得。

(1)

5’-TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG-3’

3’-ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC-5’

(42个碱基对)(SEQ ID NO：8)

(2)

5’-TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC-3’

3’-ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG-5’

5’-GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCT GGCACCCAAT

3’-CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCAC CAAAGAACGAC CGTGGGTTA

5’-AGAAGCCATG CGCCGG-3’

3’-TCTTCGGTAC GCGGCC-5’

(116个碱基对)(SEQ ID NO：9)

(3)

5’-TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC-3’

3’-ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG-5’

5’-GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCT GGCACCCAAT-3’

3’-CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCAC CAAAGAACGA CCGTGGGTTA-5’

5’-AGAAGCCATG CGCCGGACCA CGACGTCACG CAGGAAAGGG ACGAGGTGTG-3’

3’-TCTTCGGTAC GCGGCCTGGT GCTGCAGTGC GTCCTTTCCC TGCTCCACAC-5’

5’-GGTGGTTTCT TGCTGGCACC CAATAGAAGC CATGCGCCGG-3’

3’-CCACCAAAGA ACGACCGTGG GTTATCTTCG GTACGCGGCC-5’

(190个碱基对)(SEQ ID NO：10)

作为测序分析的结果，发现复制反应产物中存在具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)结构的核酸序列的116个碱基对和具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)B(Bc)A(Ac)结构的核酸序列的190个碱基对。

序列表

<110>富士胶片株式会社

<120>用于复制核酸序列的方法

<120>FA9174A

<160>10

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>1

ccacgacgct tgctggcacc caata 25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>2

tgggtggtct tgctggcacc caata 25

<210>3

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>3

ccggcgcatg gctt 14

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>4

caggaaacag ctatgac 17

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>5

ccacgacgtt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc gg 42

<210>6

<211>85

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>6

ccacgacgtt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc ggaccacgac gttcttgctg 60

gcacccaata gaagccatgc gccgg 85

<210>7

<211>128

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>7

ccacgacgtt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc ggaccacgac gttcttgctg 60

gcacccaata gaagccatgc gccggaccac gacgttcttg ctggcaccca atagaagcca 120

tgcgccgg 128

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>8

tgggtggttt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc gg 42

<210>9

<211>116

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>9

tgggtggttt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc ggaccacgac gtcacgcagg 60

aaagggacga ggtgtgggtg gtttcttgct ggcacccaat agaagccatg cgccgg 116

<210>10

<211>190

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>10

tgggtggttt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc ggaccacgac gtcacgcagg 60

aaagggacga ggtgtgggtg gtttcttgct ggcacccaat agaagccatg cgccggacca 120

cgacgtcacg caggaaaggg acgaggtgtg ggtggtttct tgctggcacc caatagaagc 180

catgcgccgg 190

Claims

1.用于复制DNA序列的方法，其包括使用催化链置换互补链合成反应的聚合酶合成互补链，其中将在两个末端具有由20以上-200以下个连续核苷酸组成的第一序列及其互补序列的双链模板DNA用作起始点，其中所述反应是在反应溶液中进行，其中所述方法包括以下步骤：

(a)提供具有这样的结构的双链模板DNA的步骤，其中交替排列由20以上-200以下个连续核苷酸组成的第一序列及其互补序列和由1以上-100以下个核苷酸组成的与在模板DNA序列上的第一序列及其互补序列不同的第二序列及其互补序列，其中所述双链模板DNA的特征是其中存在至少两个第一序列及其互补序列；

(b)解离步骤(a)中提供的模板DNA的全部或一部分的步骤；

(c)在新DNA链和步骤(b)中获得的全部或部分解离的双链模板DNA之间通过第一序列及其互补序列形成碱基对的步骤，其中所述新DNA链由全部或一部分解离的不同双链模板DNA分子提供；或在步骤(b)中获得的全部或部分解离的双链模板DNA之间通过第一序列及其互补序列形成碱基对的步骤；和

(d)用催化链置换互补链合成反应的聚合酶合成互补链的步骤，其中将在步骤(c)碱基配对的一个或两个DNA链的3’-末端用作合成起始点，

其中所有步骤在50℃以上-70℃以下的等温温度下进行。

2.按照权利要求1的方法，其中将在步骤(d)中由链置换互补链合成反应获得的产物用作步骤(a)中的双链模板DNA。

3.按照权利要求1的方法，其中催化所述链置换互补链合成反应的聚合酶选自由源自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的5’→3’核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)的5’→3’核酸外切酶缺陷型Bca DNA聚合酶，源自Termococcus litoralis的5’→3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶和源自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶组成的组。

4.按照权利要求1的方法，其中所述反应溶液包括0.01％-1％的非离子表面活性剂。

5.按照权利要求1的方法，其中所述反应溶液还包括二价阳离子。

6.按照权利要求1的方法，其中所述反应溶液还包括解链温度调节剂。

7.按照权利要求1的方法，其中所有步骤在60分钟内进行。