CN101808627B

CN101808627B - 抗菌剂

Info

Publication number: CN101808627B
Application number: CN200880108694.3A
Authority: CN
Inventors: T·沃辛顿; T·卡尔帕南
Original assignee: Insight Health Ltd
Current assignee: Insight Health Ltd
Priority date: 2007-08-24
Filing date: 2008-08-21
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2028-08-21
Also published as: US20110117223A1; PL2185142T3; JP2010536836A; ES2441549T3; US20180078597A1; US9861672B2; DK2185142T3; GB0716605D0; WO2009027634A1; JP5739663B2; EP2185142B1; CN101808627A; US10946057B2; HK1147441A1; EP2185142A1

Abstract

本发明是基于氯己定和精油的结合物的意想不到的抗茵性质。已意外地发现，氯己定和精油的结合物可有效地穿透皮肤表面并在皮肤内提供抗茵效应。还已意外地发现，氯己定和桉树油的结合物可有效地作为抗表皮葡萄球菌的抗微生物剂。

Description

抗菌剂

技术领域

本发明涉及抗菌组合物，该组合物尤其适用于对皮肤进行灭菌。

背景技术

切开人皮肤是临床环境中常见的操作，例如在手术、采血或插入血管内装置例如导管的过程中。切开皮肤后(特别是当插入血管内装置时)在医院获得的感染(hospital acquired infection)通常是并发症，通常与皮肤微生物例如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)有关(Richards，et al.，2000；Pfaller，et al.，1999；Rupp and Archer 1994)。

多种因素可导致形成感染，例如皮肤穿刺之前皮肤消毒不彻底(Lafforgue，et al.，1997；Traore，et al.，2000；Langgartner，et al.，2004)以及在临床环境中出现抗性微生物，这经常是由于大量使用包括抗生素、抗菌剂和其他杀生物剂在内的抗微生物剂所致(Koljalq，et al.，2002；Fraise，2002；Block and Furman，2002)。

微生物可以微菌落形式存在于皮肤内，或者以生物被膜的形式原位存在于血管内装置上例如在导管表面上，因此与悬液中的微生物相比对更高浓度的抗微生物剂更加耐受(Rupp and Archer，1994；Gristina，et al.，1989；Saginur，et al.，2006)。

已知许多抗微生物剂可用于治疗皮肤感染。例如，氯己定已知具有大范围的抗微生物剂活性，同时具有快速效果，适合用于侵入步骤(例如CVC插入)前的皮肤预处理(McDonnell and Russell，1999)。

还已经证明一些精油具有抗微生物活性，能有效地抵抗细菌、酵母和病毒(Cowan，1999；Karpanen，et al.，2006)。还已经证明茶树油(TTO)在清除MRSA菌落化(Al-Shuneigat，at al.，2005；Dryden，et al.，2004；Caelli，et al.，2000)及减少手的微生物污染(Messager，et al.，2005)方面的效力。已经研究了其他精油包括桉树油(eucalyptus)和麝香草酚(thymol)的潜在临床应用；已经证明麝香草酚具有抗炎症性质并且加速烧伤伤口的愈合(Dursun，et al.，2003)，并且发现桉树油可改善坏死溃疡的愈合(Warnke，et al.，2006)。

精油与氯己定二葡糖酸盐的结合物是已知的。已经研究了精油与氯己定二葡糖酸盐的结合物对口腔病原体变形链球菌(Streptococcusmutans)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的抗微生物效果(Flioche，et al.，2005)，目的是为了开发新型防龋治疗法。US2006/0105000描述了用于治疗受感染皮肤和粘膜的组合物，含有抗微生物剂和精油。氯己定葡萄糖酸盐在口腔粘膜炎漱口剂、肛裂凝胶剂和压疮洗剂中用作抗微生物剂。

虽然有多种可用抗微生物剂，但是已知许多抗微生物剂(包括氯己定)呈现弱的皮肤渗透性，因此现有的皮肤消毒方法对皮肤深处或皮肤表面之下以及毛囊中的细菌经常不起作用。因此，感染(特别是皮肤中的感染)仍是个问题，原因是抗微生物剂无法穿透皮肤。

已经研究了用于递送皮肤抗菌剂的新方法，例如脂质体、微粒和纳米颗粒，它们可提供抗微生物剂的靶向释放及受控释放(Constant，etal.，2006)。还已经研究了精油作为皮肤渗透增强剂(Biruss，et al.，2007；Reichlich，et al.，2006；Fang，et al.，2004)。然而，精油作为渗透增强剂的效果是有限的，这是因为精油提高皮肤渗透的能力是药物特异性的。因此，仍然有改良抗微生物剂的一般需求，尤其是用于预防及治疗皮下感染的方法和产品。

发明内容

本发明是基于这样的发现，即氯己定在与至少一种精油结合使用的时候显示出增强的抗微生物性质和皮肤渗透性，并且皮肤渗透的增加令人惊讶。因此，精油和氯己定的具体结合物可用于预防和/或治疗皮肤层(例如真皮)内的感染，尤其是由侵入性医学步骤例如插入导管引起的感染。

本发明还基于这样的发现，即氯己定在与桉树油结合使用的时候令人意外地表现出抗表皮葡萄球菌及表皮葡萄球菌生物被膜的良好抗微生物活性。因此，这种结合物可用于预防和/或治疗表皮葡萄球菌感染，尤其是侵入性的医学步骤例如插入导管的感染。

因此，本发明的第一方面提供了氯己定和精油的结合物在制备用于预防和/或治疗角质层下皮肤中感染的药剂中的用途。

本发明的第二方面提供了氯己定和桉树油的结合物在制备用于预防和/或治疗表皮葡萄球菌感染的药剂中的用途。

本发明的另一方面涉及氯己定和精油的结合物用于预防和/或治疗角质层下皮肤中感染。

本发明的另一方面涉及氯己定和桉树油的结合物用于预防和/或治疗表皮葡萄球菌感染。

本发明的另一方面涉及一种用于预防和/或治疗角质层下皮肤中感染的方法，包括使皮肤与氯己定和精油的结合物相接触。

本发明的另一方面涉及一种用于预防和/或治疗表皮葡萄球菌感染的方法，包括使表皮葡萄球菌与氯己定和桉树油的结合物相接触。

附图说明

参考以下附图对本发明进行了描述，其中：

图1的曲线图显示了在全厚度人皮肤(full thickness human skin)中进行2％(w/v)CHG(有或无50％(v/v)桉树油)的皮肤渗透研究后，从多个深度的皮肤提取的CHG浓度(μg)(根据皮肤样品的重量对结果进行了调整)；以及

图2显示了暴露于70％(v/v)IPA和2％(w/v)CHG的结合物(有或无10％(v/v)桉树油)2分钟(A图)和30分钟(B图)后，从全厚度人皮肤的多个深度处每mg皮肤提取的CHG浓度(μg)，对于除2％CHG/70％IPA/10％桉树油暴露2分钟(此时n＝10)之外的所有情况n＝15。

具体实施方式

根据需要，以下的优选方案可相互结合。

精油

精油在现有技术中是已知的，术语“精油”取其通常意义。为了避免歧义，精油为萜和经氧化的化合物例如醇、醛、酮、酯和醚的挥发性混合物，这些化合物来源自植物材料。它们记载于例如Williams，etal.，2004中。精油可依照本领域中已知的任何技术来生产；最常见的技术有从植物原料蒸馏、冷压或溶剂萃取精油。

在本发明涉及使用氯己定和至少一种精油的实施方案中，可使用单独一种精油或者不同精油的组合。在一个优选的实施方案中，使用单独一种精油。它更优选地为桉树油。

精油的实例包括但不限于，桉树油、麝香草酚、茶树油、藜油(chenopodium)、依兰油(ylang ylang)、肉桂油、麦卢卡茶树油(manuka oil)、薄荷醇、葡萄柚油、山金车油(arnica oil)、小茴香油、天竺葵油、薰衣草油、柠檬油、留兰香油、松油、薄荷油、罗勒油和迷迭香油。

精油优选地为麝香草酚、桉树油或茶树油。

考虑到抗微生物性质，当与氯己定结合使用时，精油最优选地为桉树油。

本发明的最优选结合物是氯己定葡萄糖酸盐(CHG)和桉树油的结合物。

氯己定

氯己定(CAS第55-56-1号)是现有技术中公知的化学抗菌剂。可使用游离碱形式或者盐形式的氯己定。所述盐优选地为可药用的盐，许多这样的盐是本领域中公知的，最优选氯己定二葡糖酸盐(CAS第18472-51-0号)，本文中称作“CHG”。

感染

已经发现，氯己定和精油的结合物在渗透进入皮肤方面有意想不到的效果，从而可在皮肤内提供抗微生物效应。因此，本发明的第一方面涉及氯己定和精油的结合物在制备用于预防和/或治疗皮肤中感染的药剂中的用途。术语“皮肤中”是指感染不是在皮肤表面，而是在皮肤器官内，即在表层之下。因此，所述感染可以是任何形式出现于上层皮肤(被称作角质层)之下的皮肤感染。

优选地，皮肤中感染是由这样的一种或多种微生物引起，所述微生物出现在皮肤之上及之中并由侵入性医学步骤(例如向体内插入导管)引入至角质层下的更深皮肤层。

可被本发明(的第一方面)靶向的皮肤中感染的实例包括但不限于，局部性皮肤感染(例如与插入血管内装置(如主静脉导管、外周血管导管、PD导管、分流器)有关的感染)、痤疮、皮肤疖、痈、疹、皮肤癣菌感染、手术部位感染、溃疡和烧伤。优选地，所述感染与插入血管内装置有关。这些感染起源于皮肤表面，但会扩展以引起对更深层皮肤的损伤。

引起皮肤中感染及可被本发明靶向的微生物包括但不限于，需氧及厌氧的革兰氏阳性球菌(例如葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肠球菌(enterococci))、需氧及厌氧的革兰氏阳性杆菌(例如梭菌(clostridia)、杆状菌(bacillus)、丙酸杆菌(propionibacteria))、需氧及厌氧的革兰氏阴性球菌(例如奈瑟菌(neisseria)、韦荣球菌(veillonella))、好氧及厌氧的革兰氏阴性球菌(例如肠细菌(entrobacteria)、假单胞菌(pseudomonad)、类杆菌(bacteroides))、真菌、酵母和霉菌(例如假丝酵母(candida)、皮肤癣菌(dermatophyte))。

优选地，根据本发明的第一方面，皮肤中感染为葡萄球菌感染。更优选地，所述感染是由表皮葡萄球菌引起的感染。

具体地，还已发现氯己定和桉树油的结合物有作为抗表皮葡萄球菌的抗微生物剂的意外效果。因此，本发明的第二方面涉及氯己定和桉树油的结合物在制备用于预防和/或治疗表皮葡萄球菌(S.epidermidis)感染的药剂中的用途。表皮葡萄球菌是一种在人和动物皮肤上和皮肤中经常出现的革兰氏阳性菌。表皮葡萄球菌的多个菌株可在皮肤内形成微菌落并且可在装置(例如静脉内导管)上形成保护性生物被膜。因此，氯己定和桉树油的结合物可有效预防及治疗表皮葡萄球菌生物被膜。术语“生物被膜”是本领域中公知的，并且取其通常意义。为了避免歧义，生物被膜是在活性表面或惰性表面上、无生命表面上，微生物(在本例中为表皮葡萄球菌)在自形成聚合基质内的结构化群落。优选地，所述表面是无生命的，它更优选地为固体表面。最优选地，所述固体表面为导管，更优选地为静脉内导管例如主静脉导管。防止或减少导管上的生物被膜可预防或治疗患者体内由生物被膜细菌引起的感染。

本文描述的氯己定和桉树油的结合物可用于预防和/或治疗表皮葡萄球菌感染，这是通过使所述表皮葡萄球菌与氯己定和桉树油相接触实现。优选地，氯己定/桉树油的结合物可用于预防和/或治疗出现在皮肤之上和之内并可引起感染的表皮葡萄球菌株。所述表皮葡萄球菌株优选地为生物被膜形成菌株，例如RP62A。由表皮葡萄球菌引起的感染优选地为皮肤感染。本发明人已发现，氯己定和桉树油的结合物对表皮葡萄球菌生物被膜具有协同的抗微生物活性，该活性与仅氯己定或桉树油的抗微生物活性相比有意料之外的提高。

根据本发明的第一方面或者根据本发明的第二方面的一个优选实施方案，皮肤感染为一种出现在因暴露而形成身体表表面的皮肤内的感染。这种外部皮肤不包括例如内膜，例如出现在例如口腔或鼻道中(例如颊膜、舌和齿龈)的皮肤和粘膜。为了避免歧义，术语皮肤不包括口腔上皮膜。

在一个优选的实施方案中，与本发明的组合物接触的皮肤是完整的，即未破、未割伤、未裂、未撕开、未烧伤或未受其他伤。为了避免歧义，完整皮肤是指完整的角质层，即皮肤是封闭的。应指出的是，对于创伤或割伤的愈合过程中的皮肤，一旦该皮肤细胞封闭伤口，并藉此提供新的完整的角质层，则认为所述皮肤是“完整的”。还应指出的是，当插入导管通过皮肤的时候，皮肤经常会生长以将导管封闭在适当位置。因此，皮肤是封闭的，这被涵盖于术语“完整皮肤”的范围内。

本发明的组合物可渗透通过皮肤上层，以治疗或预防皮肤内的感染。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的组合物为仅用于外部、局部使用。

本领域技术人员可理解，预防或治疗一个区域(即皮肤)内的感染可防止(由该皮肤感染引起的)更严重的感染或其他区域的感染。这种继发感染经常是指医院获得的感染或医院内感染。例如，预防或治疗局部感染例如皮肤感染将降低出现系统感染的可能性。可由初始的局部感染引起的常见系统感染为血液感染，血管感染经常是指血液中毒或血液败血病。因此，根据本发明的预防局部感染还有利于降低更严重感染例如系统感染的发生率。一个实例为将导管插入至患者体内；初始感染通常是皮肤感染，但除非经过治疗，否则这种感染会迅速变得更严重并且可引起血液中毒。本发明的组合物能有效地减少这些继发感染的出现。

皮肤结构

皮肤主要有两层，表皮和真皮。这些层在不同身体部位的厚度是不同的。

表皮是最外层并且是药物吸收的主要屏障。表皮厚度大约50-100μm，其中角质层(主要的屏障层)厚度大约10μm。表皮不含血管，主要包含角质形成细胞。有不同的5个层：角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层。

真皮层在表皮之下，厚度大约1000μm，但厚度随身体部位不同可在100μm和3000μm之间变化。真皮主要由结缔组织组成并含有血管、淋巴管和感觉受体。真皮还含有毛囊、皮脂腺和汗腺。有两种类型的生汗腺体：开口至毛囊腔的顶质分泌腺和直接开口至皮肤表面的外分泌腺。

真皮之下是包含脂肪组织的下皮层或皮下层。

本文所述具有良好渗透性的氯己定和精油的结合物必须能够渗透通过作为抗菌剂皮肤渗透主要屏障的角质层，并且/或者能够渗透至毛囊中。毛囊可能藏匿细菌，这些细菌不能通过现有的抗菌步骤清除，并且可能在侵入性步骤过程中引起感染。

本发明人已发现，氯己定(优选CHG)和至少一种精油(优选桉树油)的结合物呈现了以前未曾发现或研究过的优良渗透性。因此，如上文所述，本发明的第一方面涉及氯己定和至少一种精油的结合物在制备用于预防皮肤层中一定深度处的皮肤感染的药剂中的用途。

根据本发明的第一方面待预防和/或治疗的感染出现在角质层之下。

在一个实施方案中，待预防和/或治疗的感染出现在皮肤层上最深至3000μm的深度处，优选上最深至2000μm的深度处，更优选最深至1000μm的深度处。

在另一个实施方案中，待预防和/或治疗的感染出现在皮肤层中超过100μm的深度处，优选超过480μm的深度处。

待预防和/或治疗的感染优选地出现在皮肤层中100μm至3000μm的深度处。在一个实施方案中，待预防和/或治疗的感染出现在皮肤层中480μm至3000μm的深度处。在一个实施方案中，待预防和/或治疗的感染出现在皮肤层中480μm至1000μm的深度处。本发明人还意外地发现，来自于CHG和至少一种精油的结合物的CHG浓度在深度超过480μm的皮肤层中随深度增加而增大。CHG和至少一种精油的结合物在480μm以上深度处的渗透出乎意料地好。

在另一个实施方案中，待预防和/或治疗的感染出现在真皮中。

在另一个实施方案中，待预防和/或治疗的感染出现在毛囊中。

结合物

在本发明的第一方面中，氯己定可与任何精油结合使用。所述精油可以是上文所述的任一种，优选麝香草酚、桉树油或茶树油，最优选桉树油。氯己定可与任一种精油结合，或者与不同精油的组合结合。在一个优选的实施方案中，氯己定与单独一种精油结合。最优选地，精油为桉树油。

在本发明的第二方面中，氯己定具体地与桉树油结合。在本发明的两个方面中，氯己定与精油的结合物均还可与另一种可药用成分结合，如下文所述。一种优选的额外成分是异丙醇(IPA)。

在一个优选的实施方案中，氯己定和精油以及任选地IPA是所使用的仅有的抗微生物剂，即在本发明的组合物中不需要其他抗微生物剂。优选地，在本发明的第一方面的组合物中仅有的活性成分——即仅有的抗微生物成分——是氯己定和精油，以及任选地有IPA。类似地，根据本发明的第二方面，一个优选的实施方案提供了一种组合物，其中仅有的活性(即抗微生物)成分是氯己定和桉树油，以及任选地IPA。

治疗和预防

本发明的第一方面提供了氯己定和精油(优选桉树油)的结合物，所述结合物可用于制备用于预防和/或治疗(优选预防)皮肤中感染的药剂。

本发明的第二方面提供了氯己定和桉树油在预防和/或治疗表皮葡萄球菌感染中的用途。

在本文预防感染的上下文中使用的术语“预防”是指用于尚未患有病症但处于患有所述病症风险中的患者，以防止所述病症出现。例如，预防包括皮肤感染的预防、降低皮肤感染的发病率等。对感染的预防还包括灭菌。灭菌优选地包括向皮肤区域施用氯己定和精油的结合物，以从该皮肤区域清除微生物；在本发明的第一方面中，(角质层之下的)皮肤中的微生物被清除，而在本发明第二方面中，皮肤内和皮肤上的表皮葡萄球菌都被清除。

优选地，本发明第一方面或第二方面的结合物在侵入性手术之前使用，以防止来自皮肤表面上的微生物的潜在感染，所述微生物包括存在于手术器械上、在手术过程中被引入皮肤表面之下的微生物。

在本文治疗病症的上下文中使用的术语“治疗”通常是指无论人或动物(例如在兽医应用中)的治疗和疗法，其中达到一些需要的治疗效果，例如抑制所述病症发展，并且所述治疗效果包括放缓发展速度、使发展速度停止、缓解所述病症症状、改善所述病症以及治愈所述病症。

优选地，将氯己定和精油的结合物施用于皮肤外表面，并使其渗透至皮肤层内。优选地，氯己定和精油的结合物渗透至真皮和/或毛囊中。如果氯己定和精油的结合物用于在打算进行侵入性医学步骤(例如插入导管)的患者中预防皮肤感染，那么该结合物应在所述步骤之前被施用于患者皮肤。

本文使用的术语“治疗有效量”所指的活性化合物的量或者含活性化合物的材料、组合物或剂型的量，所述量在依照所需治疗方案被给予的时候，能有效地产生一些所需的、与合理的效益风险比相称的治疗效果(包括预防)。

为了避免歧义，在本发明的一个实施方案中，一种预防或治疗皮肤中感染的方法包括使皮肤与氯己定和精油(优选桉树油)相接触。在一个实施方案中，氯己定和精油被同时施用。在该实施方案中，氯己定和桉树油可在织物材料或非织物材料中或其上被施用。例如，含氯己定和精油的敷料、海绵、绷带、膏药或类似材料可用于预防或治疗皮肤中的感染。优选地，使用一台施用装置施用所述组合物。合适的施用装置一般包括用于保留所述组合物(直至需要施用时)的工具以及将所述组合物施用于皮肤的工具。用于保留所述组合物的工具优选为一种容器，例如管或安瓿。用于将所述组合物施用于皮肤的工具优选地为海绵，更优选地为泡沫海绵。合适的施用装置可购自InsightHealth Limited，UK。

在另一个实施方案中，氯己定和精油被依次施用。优选地，在依次施用的时候，将氯己定施用于皮肤，随后施用精油。在该实施方案中，精油优选地是通过含精油的材料施用，所述材料例如织物或非织物补片(patch)，例如敷料、海绵、绷带、膏药或类似物。如上文所述的施用装置可用于施用所述氯己定和/或所述精油。

本发明的第二方面涉及氯己定和桉树油作为抗表皮葡萄球菌的杀生物剂的用途。一个优选的实施方案包括含氯己定和桉树油的织物或非织物材料，例如海绵、毛巾、湿餐巾纸、抹布(wipe)、布或类似物。这种材料可用于使表皮葡萄球菌与氯己定和桉树油相接触，并提供杀生物效果。优选地，所述织物或非织物材料为硬表面抹布，更优选织物硬表面抹布。

剂量

本领域技术人员应了解，氯己定和精油组分的适合剂量会随患者的不同而变化。确定最佳剂量通常包括治疗效果水平与任何的有害副作用风险之间的平衡。所选的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于所述具体组合物的活性，给药途径，所述化合物的排出率，治疗持续时间，结合使用的其他药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，患者的种(species)、性别、年龄、体重、状态、健康状况和既往治疗史。所述化合物的量及给药途径将最终将由内科医生、兽医或临床医生确定，但通常所选择的剂量可在作用部位达到局部浓度，该局部浓度可达到所需效果而不引起实质的伤害性副作用或有害副作用。

给药可以一个剂量、连续地或间歇地(例如以适当间隔的分开剂量)在整个治疗或预防过程中发挥效应。确定最有效给药方式和剂量的方法是本领域技术人员公知的，并且将随用于治疗的制剂、治疗的目的、待治疗的靶感染及待治疗的受试者的不同而有变化。可用治疗医生、兽医或临床医生所选的剂量水平和模式进行单次给药或多次给药。

将氯己定和精油的结合物以治疗有效量给药。氯己定(优选CHG)的量优选地在以重量(w/v)计0.1％-5％的区间内，更优选以重量计0.5％-4％，还更优选以重量计0.5％-2.5％，最优选以重量计2％。精油的量优选地在以所述组合物的体积(v/v)计5％-60％的区间内，更优选以体积计10％-50％，还更优选以体积计10％-30％，最优选以体积计10％-16％，例如以体积计10％。实验已表明，在增强CHG递送通过皮肤的能力方面，10％(v/v)的桉树油与50％(v/v)的桉树油相当。氯己定和精油的结合物的合适剂量优选地为以重量计2％的氯己定和以体积计50％的精油，更优选以重量计2％的氯己定和以体积计30％的精油，并且优选以重量计2％的氯己定和以体积计10％或16％的精油。

如果所使用的氯己定二葡糖酸盐为盐、酯、酰胺、前药等形式，那么给药量是基于母体化合物计算，因此实际使用重量按比例增加。

所述结合物的组分可同时加入或依次加入。在一个实施方案中，所述化合物的结合物被以单个制剂的形式施用。一种优选的单个制剂组合物含有CHG、桉树油和异丙醇。

在一个分开的实施方案中，氯己定和精油被单独给药。更优选地，将氯己定直接施用于皮肤，然后使含精油的材料与经氯己定涂覆的皮肤相接触。所述含精油的材料可以是织物或非织物，例如补片、膏药、绷带或敷料。异丙醇可任选地在加入氯己定之前、之后或与之同时加至皮肤上。

为了避免歧义，根据本发明的两方面之一的一种预防或治疗感染的方法包括：使患者皮肤与氯己定和精油的结合物相接触。如本文中所详述的，使皮肤与氯己定和精油相接触可治疗或预防感染。在一个实施方案中，使皮肤同时与氯己定和精油(优选桉树油)相接触。更优选地，施用含氯己定和精油的单个制剂。在一个分开的实施方案中，所述预防或治疗感染的方法包括使患者皮肤与氯己定相接触，并单独地使所述经氯己定涂覆的皮肤与精油(优选桉树油)相接触。在该实施方案中，优选地将液体形式的氯己定施用于皮肤，精油优选在含所述精油的织物或非织物材料上被施用，所述织物或非织物材料例如补片、膏药、绷带或伤口敷料。因此，在氯己定之后施用精油的两步施用过程是本发明优选的实施方案。

制剂

虽然氯己定和精油的结合物可以单独给药，但它优选地采用药物制剂(例如组合物、制品、药剂)的形式，所述药物制剂至少含有如上文定义的氯己定与至少一种精油的结合物，以及本领域技术人员公知的一种或多种其他可药用成分，所述可药用成分包括但不限于可药用的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、助溶剂、表面活性剂(例如湿润剂)、掩蔽剂、着色剂、矫味剂和增甜剂。所述制剂还可含有其他活性剂，例如其他治疗剂或预防剂。

用于被包括在根据本发明的第一和第二方面的组合物中的一种优选活性剂为异丙醇(IUPAC名：丙-2-醇)。因此，一种最优选的组合物含有CHG、桉树油和异丙醇，并任选地基本上仅由CHG、桉树油和异丙醇组成。IPA可以任何有效水平存在，即以可有效作为抗微生物剂的任何水平。一个优选的量为所述组合物中含有50％-90％(v/v)的IPA，更优选60％-80％(v/v)的IPA，最优选70％(v/v)的IPA。因此，一种优选的组合物含有2％(w/v)的CHG、70％(v/v)的IPA和10％(v/v)的桉树油。一种含异丙醇的组合物是特别优选的，这是因为所述组合物可提供一种速效抗微生物效果(归因于异丙醇)以及一种延长的、持续的抗微生物效应(归因于氯己定和精油)。已发现该结合物是有效的；这一点是特别出乎意料的，因为以前曾认为异丙醇会抑制氯己定(尤其是CHG)向皮肤内的渗透。本发明人已发现，如实施例和图2中详述的，精油(尤其是桉树油)的存在可消除这种对渗透的抑制。

本文使用的术语“可药用的”是指这样的化合物、成分、材料、组合物、剂型等，即在合理的医学判断范围内，它们适合用于与待研究受试者(例如人)的组织相接触，而无过度毒性、刺激性、过敏反应或者其他问题或并发症，同时具有合理的效益风险比。在与所述制剂的其他成分相溶方面，每种载体、稀释剂、赋形剂等也必须是“可用的”。

合适的载体、稀释剂、赋形剂等可参见标准的药物教科书，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，18^th edition，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，1990；以及Handbook of PharmaceuticalExcipients，2nd edition，1994。

所述制剂可通过药学领域中公知的任何方法制备。这样的方法包括将所述活性化合物与载体混合在一起的步骤，所述载体构成一种或多种辅助成分。通常，所述制剂是通过以下方式制备的：将所述活性化合物与载体(例如液体载体、细分的固体载体等)均匀且紧密地混合在一起，然后根据需要对产品进行定形。

可制备所述制剂，以提供快速或慢速释放；立即、延迟、定时或持续释放；或者它们的结合。

本发明的制剂优选地为局部制剂。制剂可合适地为以下形式：液体、溶液(例如水性、非水性)、悬液(例如水性、非水性)、乳剂(例如水包油型、油包水型)、凝胶剂、糊剂、软膏剂、乳膏、洗剂、油剂、泡沫剂、喷雾剂、雾剂或气溶胶。优选地，所述制剂为乳剂。更优选地，所述制剂为乳剂并以单个制剂形式提供。

所提供的制剂可合适地为以下形式：补片、粘附性膏药、绷带、敷料等，它们浸有一种或多种活性化合物及任选的一种或多种其他可药用成分，所述可药用成分包括例如除精油以外的穿透、渗透和吸收促进剂。所提供的制剂还可以合适地为药库或储库形式。优选地，将氯己定局部施用于皮肤，然后施用含至少一种精油的材料，优选补片，更优选生物补片。

氯己定和精油的结合物可溶解、悬浮于一种或多种其他可药用成分中或者与之混合。

适合于透真皮给药的制剂除了包括补片、粘附性膏药、绷带、敷料、药库和储库外，还包括凝胶剂、糊剂、软膏剂、乳膏、洗剂和油剂。

软膏剂通常是由氯己定和精油的结合物与石蜡软膏基质或水可混溶性软膏基质制备。

霜剂通常是由氯己定和精油的结合物与水包油型霜剂基质制备。根据需要，霜剂基质的水相可包括例如至少约30％w/w的多元醇，即具有两个或多个羟基的醇，例如丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇以及它们的混合物。局部制剂可以被希望包括除精油外的增强活性化合物吸收或穿透通过皮肤或其他感染区域的化合物。这样的皮肤穿透增强剂的实例包括二甲基亚砜及相关类似物。

乳剂通常是由氯己定(优选CHG)和一种油相制备，所述油相可任选地仅包含乳化剂(或者称为乳化试剂)或者它可以包含至少一种乳化剂与脂肪和/或油的混合物。优选地，所述油相包含至少一种精油。优选地包括亲水性乳化剂以及充当稳定剂的亲脂性乳化剂。还优选地同时包括油和脂肪两者。总之，具有或不具有稳定剂的乳化剂构成所谓的乳化蜡，而该蜡与油和/或脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，所述软膏基质又形成乳膏制剂的油性分散相。

合适的乳化剂和乳剂稳定剂包括吐温60、司盘80、十八醇十六醇混合物、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和月桂硫酸钠。对适合用于所述制剂的油或脂肪的选择是基于所需获得的外观特性，因为活性化合物在大多数可能用于药物乳剂制剂的油中的溶解度可能非常低。因此，乳膏应优选地为非油脂性、非染色和可洗的产品，该产品具有合适的稠度以避免从管或其他容器中泄漏。可使用直链或支链、一元或二元烷基酯，例如二异己二酸酯、硬脂酸异十六烷基酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙脂、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或被称为Crodamol CAP(辛酸鲸蜡硬脂酯和肉豆蔻酸异丙酯)的支链酯混合物，优选后三种酯。这些酯可被单独使用或者结合使用，这取决于所需的特性。或者，可使用高熔点脂质，例如白色软石蜡和/或液体石蜡或者其他矿物油。

下文将以如下的非限制性实施例对本发明进行描述。

生物学实施例

(1)抗微生物研究

生物以及细菌生物被膜的制备

因其形成生物被膜的能力而使用表皮葡萄球菌RP62A(Sadovskaya，et al.，2005)。细菌在使用前于-70℃下保存在珠子(MicroBank，Pro-Lab Diagnostics，Cheshire，UK)上。通过在CongoRed琼脂(Freeman，et al.，1989)上培养来确认所述菌株形成粘泥(slime)的能力。为了形成所述微生物生物被膜，首先将菌株接种至Muller-Hinton琼脂(MHA)(Oxoid，Basingstoke，UK)上，并于37℃下在空气中孵育18-20小时。将来自该培养板的10个菌落悬浮于无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS，Sigma，Dorset，UK)中。通过以无菌的PBS稀释该培养物并在570nm下测量OD(在研究之前绘制表皮葡萄球菌cfu相对于570nm下OD的校正曲线，数据未显示)，将细菌浓度调整至1×10＊8cfu/mL。将该悬液进一步用补充2％(w/v)葡萄糖(FisherScientific，Leicester，UK)的Muller-Hinton肉汤(MHB)稀释，以得到含1×10＊5cfu/mL的接种物。将200μL等分的细菌悬液加至白色壁、透明底、经组织培养物处理的96-孔微滴定板(Corning Incorporated，NY，USA)的孔中。将所述板最后一列的孔作为对照，仅含200μL补充2％(w/v)葡萄糖的MHB。将微滴定板于37℃下在空气中孵育48小时。

用于通过悬浮测定法评价抗微生物效率的测试接种物的制备

用于悬浮测定法的测试接种物是通过以下方式制备的：将来自在MHA上过夜培养的10个表皮葡萄球菌RP62A菌落悬浮于无菌的PBS中。通过以无菌的PBS稀释该培养物并在570nm下测量OD(在研究之前绘制表皮葡萄球菌cfu相对于570nm下OD的校正曲线，数据未显示)，将细菌浓度调整至1×10＊8cfu/mL。将该悬液进一步以MHB稀释，以得到含1×10＊7cfu/mL的接种物，用于进行协同测定；或者含1×10＊6cfu/mL的接种物，用于测试单独的CHG和油在悬液中的抗微生物活性。

抗微生物剂的制备

以MHB稀释水性氯己定二葡糖酸盐(CHG)、茶树油(TTO)、桉树油(EO)和麝香草酚(都来自Sigma-Aldrich)，以得到512mg/mL的精油储备溶液以及512μg/mL的CHG储备溶液。将5％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich)添加至精油储液中，以增大精油在悬液中的溶解度。

ATP生物发光的校正曲线和细菌菌落计数

在进行抗微生物敏感性研究之前，绘制了相对光单位(RLU)相对于细菌cfu/mL的标准曲线。如上文所述，在96-孔微滴定板中以补充2％(w/v)葡萄糖的MHB培养表皮葡萄球菌，以得到细菌生物被膜。将已形成细菌生物被膜的微滴定板的孔以无菌PBS洗涤3次，并且使用“刮洗法(scrape and wash method)”(Adams，2006)从这些孔上移出生物被膜。简而言之，每个孔中加入200μL无菌PBS，用无菌的吸量管尖对每个孔的壁刮大约10次，并在水平、竖直和交叉每个方向上都对底部刮大约10次。将悬液移出并收集于无菌的Eppendorf管中，再重复该步骤4次以得到每管1000μL的终体积。在3个孔上分别进行该步骤。通过旋转混合所述悬液，并以无菌的PBS进行连续稀释。将100μL等分的稀释前悬液和10^-1-10^-5稀释液加至白色壁、透明底微滴定板的孔中。向每个孔加入100μL bactolyse。然后将所述板漂浮于水浴超声仪中，以50Hz对所述板进行超声处理30分钟以裂解细胞并释放细菌ATP。将20μL萤光素酶加入每个孔中，并且通过发光计读取发光值。通过滴计数方法(drop count method)确定每种悬液和稀释液中的细菌cfu。结果表示为cfu相对于RLU。

TTO、EO、麝香草酚和CHG对悬液中表皮葡萄球菌的抗微生物活性

水性CHG、TTO、EO和麝香草酚的最小抑制浓度(MIC)和最小细菌浓度(MBC)是通过微量肉汤稀释测定法(NCCLS，1997)确定的。简言之，将等分的抗微生物剂加至透明、圆底96-孔微滴定板(Serowell Bibby-Sterlin，Staffordshire，UK)的第一列中，在接下来的列中以MHB进行连续2倍稀释。最后一列作为对照，含MHB但不含抗微生物剂。在进行该测定的同时，在另外的微滴定板上测试5％(v/v)-0.6％(v/v)DMSO的抗微生物活性。将所有孔以100μl含1×10＊6cfu/mL的表皮葡萄球菌悬液接种，并将这些板于37℃下在空气中孵育20小时。最小杀菌浓度是通过以下方式确定：将所述澄清孔的悬液取出放至MHA中，以无菌涂布器进行涂板并将这些板于37℃下在空气中孵育18-20小时。重复进行3次测定。

CHG、TTO、EO和麝香草酚对表皮葡萄球菌生物被膜的抗微生物活性

将含表皮葡萄球菌RP62A生物被膜的微滴定板用无菌的PBS洗涤一次，以除去任何未结合的细菌。将抗微生物剂以MHB稀释，以得到浓度为128μg/mL-0.25μg/mL的CHG和浓度为256mg/mL-0.5mg/mL的精油。将250μl抗微生物化合物分别添加至各孔中，各重复三次。第11和12列作为仅有生物被膜和盐水的对照和仅有MHB而无细菌生物被膜的空白孔。在进行该测试的同时，在另一个板上测试了5％(v/v)DMSO对细菌生物被膜的抗微生物活性。在将所述细菌生物被膜与抗微生物剂于37℃下在空气中孵育20小时后，将这些孔以无菌的PBS洗涤一次并通过ATP生物发光(ViaLight MDA生物测定试剂盒，Cambrex，Berkshire，UK)确定微生物的杀死情况。简言之，将100μL的Bactolyse(ViaLight MDA)和100μl盐水添加至每个孔中，将这些板用50Hz超声波处理30分钟，以释放并裂解细菌生物被膜中的细胞。将50μl的ATP监测剂(ViaLight MDA生物测定试剂盒)添加至每个孔中并测定发光值。重复进行2次测定。

TTO、EO和麝香草酚与CHG的结合物对表皮葡萄球菌悬液的抗微生物敏感性

TTO、EO和麝香草酚与CHG水溶液的结合物的抗微生物活性是通过棋盘法(checkerboard method，Shin and Lim，2004)以悬浮测定法评价的。简言之，制备抗微生物化合物的连续2倍稀释液(对于精油为128mg/mL-1mg/mL，对于CHG为64μg/mL-0.5μg/mL)。将50μl的CHG稀释液用吸管以逐渐减小的浓度转移至96-孔微滴定板的各列中，并将50μl等分的精油以逐渐减小的浓度加至各行中。然后将这些孔以10μl含10＊5cfu的细菌悬液接种。第10、11和12列作为对照，分别仅含营养肉汤和接种物，以及含与所述接种物分隔开的抗微生物化合物。将微滴定板于37℃下在空气中孵育24小时，检查这些板的微生物生长情况，以确定这些化合物单独的MIC或者这些化合物的结合物的MIC。为了确定抗微生物结合物的协同活性或拮抗活性，使用下式确定分级抑制浓度(FIC)和FIC指数(FICI)：

FICI＝油的FIC+CHG的FIC

FICI低于0.5被认为有协同效应，0.5和4.0之间的值被认为无差别，高于4.0被认为有拮抗活性。重复进行2次测定。

TTO、EO和麝香草酚与CHG的结合物对表皮葡萄球菌生物被膜的抗微生物敏感性

将含表皮葡萄球菌RP62A生物被膜的微滴定板以无菌的PBS洗涤一次，以除去任何未结合的细菌。如上文所述将抗微生物剂以MHB稀释，将125μl等分的每种稀释液以逐步减小的浓度加至微滴定板的孔中，每个孔的总体积为250μl以确保细菌生物被膜被完全覆盖，以前文所述的棋盘进行测定。第10、11和12列作为对照，仅含抗微生物化合物，以及仅含生物被膜和盐水。将微滴定板于37℃下在空气中孵育24小时，之后将孔倒空，如上述通过ATP生物发光确定FIC值和FICI值。重复进行2次测定。

结果

通过在Congo Red琼脂上形成特征性的黑色有壳菌落，确认表皮葡萄球菌RP62A为形成粘泥的菌株。将表皮葡萄球菌RP62A在补充2％(w/v)葡萄糖的MHB中孵育48小时后，每个孔中的细菌生物被膜平均含5.53×10＊6cfu。

对于CHG、茶树油和桉树油而言，与对浮游细胞(planktonic cell)的最小抑制浓度(MIC分别为2μg/mL、2mg/mL和4mg/mL)相比，其对生长于生物被膜中的细菌的最小抑制浓度(MIC分别为8μg/mL、16mg/mL和128mg/mL)分别高2倍、3倍和5倍。与对浮游细胞相比，麝香草酚对生物被膜的MIC值低2倍(分别为4mg/mL和1mg/mL)。所述细菌生物被膜被CHG和所有3种精油消除，这时CHG、麝香草酚、TTO和桉树油的MBC/生物被膜消除浓度分别为32μg/mL、2mg/mL、64mg/mL和256mg/mL(表1和2)。

已发现，CHG与TTO、桉树油或麝香草酚的结合不会妨碍CHG或油的抗微生物活性。还已发现，CHG与EO的结合协同地增加了它们对抗生长在生物被膜中的表皮葡萄球菌的活性(表2)。另外，当在结合物中使用的时候，抑制生物被膜生长所需的TTO浓度和CHG浓度分别降低了2倍和1倍(TTO从16mg/mL降低至4mg/mL，CHG从8μg/mL降低至4μg/mL)，但麝香草酚与CHG的结合不影响用于抑制生长于生物被膜或悬液中的细菌所需的浓度(TTO为0.5mg/mL，CHG为8μg/mL)。在油悬液中作为乳化剂使用的5％(v/v)DMSO未显示对生物被膜或悬液中表皮葡萄球菌的抗微生物活性。

表1和表2示出桉树油、茶树油和麝香草酚与氯己定二葡糖酸盐水溶液的结合物对生长在悬液中及生物被膜中的表皮葡萄球菌RP62A的抗微生物活性。

表1：悬液

悬液结合物

结合物中/单独的油MIC(mg/ml)

油的FIC

结合物中/单独的CHG的MIC(μg/ml)

CHG的FIC

FICI

结果

CHG+桉树油

4/4

1

2/2

1

2

无差别

CHG+茶树油

2/2

1

2/2

1

2

无差别

CHG+麝香草酚

1/4

0.25

2/2

1

1.25

无差别

表2：生物被膜

生物被膜结合物

结合物中/单独的油MIC(mg/ml)

油的FIC

结合物中/单独的CHG的MIC(μg/ml)

CHG的FIC

FICI

结果

CHG+桉树油

4/32

0.125

0.25/8

0.03125

0.15625

协同作用

CHG+茶树油

4/16

0.25

4/8

0.5

0.75

无差别

CHG+麝香草酚

0.5/0.5

1

8/8

1

2

无差别

(2)皮肤渗透研究-CHG+桉树油

人皮肤样品

全厚度人皮肤样品获自进行缩乳手术的患者(The Stephen KirbySkin Bank，Queen Mary’s Hospital，London，UK)。在进行研究之前，得到了伦理委员会的完全批准以及捐组织患者的书面同意。全厚度人皮肤在切下当天即冷冻，于-70℃下保存至研究日。

Franz扩散池

平均扩散表面积为1.65cm²的垂直扩散池(Franz扩散池)用于进行皮肤渗透研究。磷酸缓冲盐水(PBS)用作接受液，在带有设定为37℃的循环水套的接收室(体积大约29ml)内放置过夜。在研究当天，将所述切下的皮肤在PBS中解冻并切成与Franz扩散池相适合的大小(直径(circle across)为2.9cm)。将皮肤样品装载至Franz分散池中并在所述扩散池中放置1小时，以在开始研究之前用接受液进行平衡。

抗微生物剂

通过以无菌的蒸馏水和0.001％(v/v)吐温80稀释20％(w/v)氯己定二葡糖酸盐(CHG)，制备了2％(w/v)的CHG溶液。桉树油和CHG的悬液通过以下方式制备：以蒸馏水稀释这些试剂，以得到终浓度为50％(v/v)的桉树油、终浓度为2％(w/v)的CHG和终浓度为0.001％(v/v)的吐温80。

皮肤渗透研究

将100ml等分的CHG溶液或CHG/桉树油悬液加至放置在Franz扩散池供给室上的经切割的人皮肤表面，重复3次。通过设定为37℃的循环水套保持温度恒定，并通过磁力搅拌棒不断搅动接受液。通过以下方式对接受液进行取样：第1小时每10分钟吸取1ml流体，接下来7小时每30分钟吸取1ml流体，并在第12和第24小时后吸取1ml流体。在每次取样后补充接受液。过滤并通过HPLC分析这些样品。

皮肤样品的切片

在皮肤渗透研究后将所述经切割的人皮肤从Franz扩散池取下，以PBS冲洗。将这些皮肤以纸巾干燥，切成3个直径(circle across)为0.5cm的样品，冷冻并于-70℃下保存直至进行进一步研究。使用切片机对冷冻的皮肤样品切片，从皮肤表面至600μm的深度切成20μm的切片，从600μm至1050μm的深度切成30μm的切片。

对皮肤层中CHG的分析

将用于HPLC分析的流动相溶液用作皮肤层的CHG萃取剂。将每个20μm或30μm皮肤切片分别置于Eppendorf管中，通过在加入皮肤样品之前和之后称管的重量确定皮肤切片的重量。通过将1ml等分的提取剂加至装有皮肤切片的管中而从皮肤样品中提取CHG，将其在60℃的水浴中加热1小时，通过搅拌进行混合并在6000g下离心10分钟。过滤并通过HPLC分析这些样品。

高效液相色谱(HPLC)

通过HPLC定量分析氯己定二葡糖酸盐。HPLC分析的流动相溶液含75∶25的甲醇∶双蒸水、0.005M庚烷磺酸钠、0.1％(v/v)二乙胺，以冰醋酸调节至pH 4。过滤并通过配有ODS-2 Hypersil柱(粒径5μ)(Thermo Electron Corporation，UK)的HPLC(Agilent 1100)分析这些样品，流速1.2ml/分钟、检测器波长254nm。

结果

在用与50％(v/v)的桉树油结合或不与之结合的2％(w/v)CHG并使用全厚度的人皮肤进行皮肤渗透研究24小时后，在接受液中没有出现可检测水平的CHG。与仅CHG相比，桉树油渗透至皮肤更深处，浓度更高(图1)。

在皮肤层中大于约480μm的深度处，图1显示：在与桉树油结合使用时，CHG浓度随深度增加而意外地增加，直至约1000μm的皮肤深度。

CHG与桉树油和醇的皮肤渗透

该研究的目标是为了评价在暴露于溶于70％(v/v)IPA中的2％(w/v)CHG和桉树油(“EO”)的结合物后，在经切割的人皮肤中随深度不断增加CHG的皮肤渗透和CHG的保持。

材料

化学试剂

庚烷磺酸钠、二乙胺(二者均HPLC级)、磷酸缓冲盐水(PBS)、20％(w/v)CHG水溶液、桉树油(EO)(82.9％桉油素)和异丙醇(IPA)购自Sigma-Aldrich(Dorset，UK)。甲醇和冰醋酸(二者均HPLC级)购自Fisher Scientific(Leicestershire，UK)。

设备

Agilent 1200系列高效液相色谱仪(HPLC)购自AgilentTechnologies(UK)，CPS-2 Hypersil反相色谱柱(150×4.6mm，粒度5μ)购自Thermo Electron Corporation(UK)。Cryotome购自BrightInstruments(Cambs，UK)。

皮肤样品

全厚度人皮肤样品获自进行缩乳手术的患者(The Stephen KirbySkin Bank，Queen Mary’s Hospital，London，UK)。在进行这项研究之前，得到了伦理委员会的完全批准(REC 2002/169)。全厚度人皮肤在切下当天即冷冻，于-70℃下保存至需要时。

方法

CHG与EO和IPA的皮肤渗透

皮肤渗透研究以垂直Franz扩散池进行。以29mL的PBS装满接收室，并且通过循环水套保持在37℃，并通过磁力棒进行搅拌。将皮肤样品于室温下在PBS中解冻，以吸收巾干燥并装载于Franz扩散池上，角质层(SC)最外层面向供给室。暴露于测试化合物的表面积为3.14cm²(直径2cm)。排空皮肤和接受液之间残留的气体，使皮肤平衡30分钟以达到32℃的皮肤表面温度。

将20％(w/v)CHG水溶液以蒸馏水、IPA和EO稀释，以得到溶于70％(v/v)IPA中的终浓度为2％(w/v)的CHG，以及2％(w/v)CHG与5％、10％、20％和50％(v/v)EO的结合物。将吐温80[0.1％(v/v)]添加至这些测试溶液中，以增加EO在载体中的溶解度。将1ml测试溶液涂于供给室中的皮肤表面上，并以防潮膜密封该室以防止蒸发。在以下时间取出1ml的接受液：前2小时内每30分钟、2-6小时内每小时以及在第8、12和24小时。从接收室取出的流体立即以等体积的新鲜PBS溶液替换。将所有样品过滤通过0.45μm尼龙滤纸(Kinesis，UK)，并通过HPLC进行分析。重复进行3次测定。

利用HPLC的CHG定量

在室温下，将所述样品以1.2mL/分钟的流速历时9分钟通过反相色谱柱(CPS-2 Hypersil)，在254nm下进行紫外线检测。无梯度洗脱流动相由甲醇∶水混合物(75∶25)与0.005M庚烷磺酸钠和0.1％(v/v)二乙胺组成，用冰醋酸调整至pH 4(在研究之前确认用HPLC定量CHG的方法可行，并且确定检测水平(LOD)和定量水平(LOQ)——数据未显示)。

CHG同EO和IPA的穿透情况研究

将装载于Franz扩散池上的经切割的全厚度人皮肤样品暴露于溶于70％(v/v)IPA中的2％(w/v)CHG以及2％(w/v)CHG和50％(v/v)EO(二者均含0.1％(v/v)吐温80)2分钟、30分钟和24小时。在24小时暴露后，评价2％(w/v)CHG和20％、10％和5％(v/v)EO的结合物(含0.1％(v/v)吐温80)的CHG穿透。在暴露后，取下皮肤样品，以PBS洗涤并以吸收巾干燥。将这些皮肤样品迅速以冷冻喷雾器(Bright Instruments)喷射并于-20℃下冷冻。从每个冷冻样品切下穿孔生检样品(直径7mm，三个重复)并置于包埋化合物(Bright Instruments，Cambs，UK)中的软木盘上。将这些冷冻样品用切片机(Bright Instruments)水平切成20μm的切片(从表面至600μm深度)和30μm的切片(从600至1500μm深度)。将每个切片均置于Eppendorf管中，并确定每个皮肤样品的总重量。

通过以下方式从皮肤提取氯己定：将1mL等分的流动相溶液(75％甲醇、25％蒸馏水、0.1％庚烷磺酸钠、0.1％二乙胺，pH 4)加至皮肤样品中，于60℃下在水浴中孵育1小时。将这些样品通过旋转混合并过滤，然后进行HPLC分析。计算结果表示为每mg皮肤中CHG的μg数。对照皮肤(未处理的皮肤)与测试样品平行分析。重复进行3次测定。

统计分析

所获得的数据使用INSTAT3软件(Graph pad software version3.06)以student t-检验进行分析，显著性水平为＜0.05。

结果

皮肤渗透研究

使用来自两个供体的皮肤时，在24小时渗透研究过程中在接收室中没有检测到氯己定(LOD 0.0157μg/mL)。在对暴露于溶于70％(v/v)IPA中的2％(w/v)CHG以及2％(w/v)CHG和50％(v/v)EO达24小时后的第三个供体皮肤上进行渗透研究过程中，检测到了可忽略的CHG水平(低于施用剂量的0.0016％)。

CHG皮肤穿透情况研究

暴露2分钟和30分钟后的CHG皮肤穿透情况

与水溶液中的CHG或者70％(v/v)IPA中的CHG相比，在以CHG和50％(w/v)EO的结合物处理后，穿透并保持于皮肤中的CHG量显著更大；在2分钟暴露后，与暴露于CHG水溶液相比，暴露于CHG和50％(v/v)EO的结合物时皮肤更深层的CHG平均浓度有显著差异(深度300-1500μm；p＜0.05)，该深度的组织在以CHG/EO结合物灭菌后的CHG平均浓度(带SEM)为0.0270μg/mg组织(±0.0021μg/mg组织)，在仅以CHG抗菌后的CHG平均浓度(带SEM)为0.0048μg/mg组织(±0.0008μg/mg组织)。CHG/EO和溶于70％(v/v)IPA中的CHG之间的差异在所有皮肤深度下都是显著的，CHG/EO和CHG/IPA在上部100μm中的CHG平均浓度(带SEM)分别为0.1167(±0.0313)和0.0226(±0.007)。

在30分钟时，与仅CHG或CHG/IPA相比，CHG/EO在所有皮肤深度的CHG浓度均显著更高(p＜0.05)；在300μm-1500μm的深度处，与CHG或CHG/IPA相比，CHG/EO的CHG浓度增加超过9.5倍，CHG/EO、CHG和CHG/IPA的CHG平均浓度(带SEM)分别为0.0190(±0.0015)μg/mg组织、0.0021(±0.0004)μg/mg组织和0.0022(±0.0018)μg/mg组织。在上部层(0-300μm)中，与仅CHG相比，CHG/EO的CHG平均浓度高4.8-6.4倍；而与CHG/IPA相比，CHG/EO的CHG平均浓度高2.7-20倍。

24小时暴露后的CHG皮肤穿透

与仅存在CHG时相比，在存在50％(v/v)EO的情况下，在渗透24小时后从所有皮肤层(0-1500μm)提取的CHG浓度都明显更高(p＜0.05)；上部100μm层的CHG浓度有超过2倍的增加(对于CHG和CHG/EO处理，分别为每mg组织7.880μg和16.841μg)，深度300-1500μm的更深层皮肤中差异增加超过5倍[对于CHG和CHG/EO，分别为每mg组织0.581(±0.0466)μg和3.123(±0.16470)μg]。该保持研究的数据是通过汇总来自5个连续的20μm和30μm皮肤切片的数据得到(即来自上部至600μm深度的100μm切片和来自600-1500μm深度的150μm切片)。

暴露于IPA和多种浓度EO 24小时后的CHG皮肤穿透

对增强CHG向皮肤内穿透的最佳EO浓度进行了评估。与仅CHG相比，5％(v/v)EO能够使得在皮肤更深层(300μm以下)处CHG皮肤穿透明显更高(p＜0.05)，10％(v/v)EO显著增强上层900μm中的CHG皮肤穿透(p＜0.05)。2％(w/v)CHG水溶液以及2％(w/v)CHG和70％(v/v)IPA的CHG皮肤穿透无显著差异(p＞0.05)。

将增强CHG向全厚度人皮肤内穿透的最佳EO浓度与溶于70％(v/v)IPA中的2％(w/v)CHG结合以进行进一步评价。在暴露2分钟和30分钟后，与仅2％(w/v)CHG/70％(v/v)IPA相比，10％(v/v)EO与溶于70％(v/v)IPA中的2％(w/v)CHG的结合物增强了CHG皮肤穿透(p＜0.05；图2)。

参考文献

上文所引用的下述参考文献全部通过引用的方式纳入本文。

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Claims

1.氯己定和精油的结合物在制备用于在侵入性手术之前预防角质层下皮肤感染的药剂中的用途，其中在侵入性手术之前使所述药剂与完整皮肤接触，其中所述精油为桉树油。

2.根据权利要求1的用途，其中所述氯己定为氯己定二葡糖酸盐。

3.根据权利要求1或2的用途，其中所述药剂包含异丙醇。

4.根据权利要求1的用途，其中所述感染来自于表皮葡萄球菌（S.epidermidis）。

5.根据权利要求1的用途，用于预防皮肤层中最深至1000μm深度处的皮肤感染。

6.根据权利要求1的用途，用于预防皮肤层中深度超过100μm处的皮肤感染。

7.根据权利要求6的用途，用于预防皮肤层中深度超过480μm处的皮肤感染。

8.根据权利要求1的用途，用于预防皮肤层中100-3000μm深度处的皮肤感染。

9.根据权利要求8的用途，用于预防皮肤层中480-1000μm深度处的皮肤感染。

10.根据权利要求1的用途，用于预防真皮感染。

11.根据权利要求1的用途，用于预防毛囊感染。

12.根据权利要求1的用途，用于预防皮肤层中最深至3000μm深度处的皮肤感染。