CN101805332A - 葛根素衍生物的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结构如通式(I)所示的葛根素衍生物及其制备方法。本发明所述葛根素衍生物对于治疗心脑血管疾病有良好的效果。

Description

葛根素衍生物的制备方法与应用

技术领域

本发明属医药技术领域，主要涉及葛根素衍生物的制备方法及其在治疗心脑血管疾病中的应用。

背景技术

葛根素是一种天然的低毒有效的心脑血管系统疾病治疗药物，药理作用广泛，临床上已应用于治疗冠心病、心绞痛、脑梗塞，缺血性脑血管病、改善血小板功能、减少糖尿病微量清蛋白、预防糖尿病肾病等。但是葛根素口服吸收生物利用度较差，使口服剂型的应用受到限制，临床主要使用葛根素的注射液剂型，为方便应用，需要改善葛根素溶解性和生物利用度。目前相关文献报道主要在于进行结构修饰或采用特殊剂型。杨若林等曾对葛根素进行了一系列甲基化、甲氧基、异丙基、苯甲酰基、三苯甲基等的衍生化改造，进行兔眼血流量试验表明所得结构修饰后的化合物中三苯甲基化和乙酰化者显示可增加血流量。另外也有报导对其它黄酮类化合物的结构修饰，王晓莉尝试将7-羟基黄酮分别与阿魏酸、烟酸、对氯苯氧异丁酸合成酯。闫炳双等尝试以B环带不同取代基的7-羟基黄酮为母体，与对血栓素A₂合成酶具有较强抑制作用的咪唑和乙酰水杨酸成酯。

尽管在现有技术中有诸多对葛根素进行了一系列衍生化改造，但是，我们发现目前尚未见将葛根素用棕榈酸(十六烷基酸)进行结构修饰，制备十六烷基酰基葛根素及其衍生物的报导。

发明内容

本发明的目的在于解决现有葛根素药品生物利用度较差的问题，提供一种葛根素结构修饰衍生物——C_12-30烷基或烯基酰基葛根素及其衍生物。

本发明所述的C_12-30烷基或烯基酰基葛根素及其衍生物用下述通式(I)表示：

其中，R1、R2、R3、R4、R5或R6为氢、乙酰基、C_12-30烷基酰基或C_12-30烯基酰基，

且R1、R2、R3、R4、R5、R6中至少一个为C_12-30烷基酰基。

其中R1、R2或R3是指：氢、乙酰基或C_12-30烷基酰基或烯基酰基；R4、R5、或R6是指氢。

其中R1，R2或R3是指：乙酰基或C_12-30烷基酰基或烯基酰基；R4、R5、或R6是指氢。

其中R1或R2是指：乙酰基或C_12-30烷基酰基或烯基酰基；R3、R4、R5、或R6是指氢。

其中R1或R3是指：乙酰基或C_12-30烷基酰基或烯基酰基；R2、R4、R5或R6是指氢。

其中R1是指C_12-30烷基酰基或烯基酰基；R2、R3、R4、R5或R6是指氢。

其中C_12-30烷基酰基或C_12-30烯基酰基选自：十六烷基酰基、二十二碳六烯酸基、二十烷基酰基、

优选的，本发明所述的葛根素衍生物为：

7-十六烷基酰基葛根素，7-十六烷基酰基-4’-十六烷基酰基葛根素，4’-十六烷基葛根素，7-二十二碳六烯酸基葛根素，7-二十二碳六烯酸基-4’-二十二碳六烯酸基葛根素，4’-二十二碳六烯酸基葛根素。

本发明的另一个目的在于提供所述葛根素衍生物的制备方法。

本发明所述葛根素衍生物的制备方法，包括以下步骤：

将葛根素溶解于溶剂中，将C_12-30烷基酰基或C_12-30烯基酰基卤加入到溶液中，室温搅拌反应，将溶液倒入适量水中，有白色固体析出，抽滤，将此固体晾干，得C_12-30烷基酰基或C_12-30烯基酰基葛根素衍生物；

具体如十六烷基酰基葛根素的制备方法，包括如下步骤：

(1)十六烷基酰氯的制备：将十六烷基酰氯与二氯亚砜1∶1～2的摩尔比混合，以吡啶为溶剂，在60～70℃油浴中反应2～3小时，减压蒸除溶剂，得十六烷基酰氯，置于DMF中备用；

(2)制备葛根素衍生物：将葛根素溶解于DMF中，再加入无水碳酸钠，室温搅拌10～20min，在冰峪搅拌的条件下，将上述十六烷基酰氯加入到碱性溶液中，室温搅拌过夜，将溶液倒入适量水中，有白色固体析出，抽滤，将此固体晾干，得十六烷基酰基葛根素衍生物；

(3)葛根素衍生物的分离纯化：采用常规硅胶柱层析手段，将上述反应得到的十六烷基酰基葛根素衍生物进行分离纯化。

其中，步骤(2)所述的碱性溶剂优选为无水碳酸钠的DMF。

其中，步骤(2)所述十六烷基酰基与葛根素的摩尔比优选是2～3∶1.

本发明所述的葛根素及其衍生物对于治疗心脑血管疾病有很好的效果。

一种药物组合物，包括本发明所述的葛根素衍生物。

本发明的药物组合物，根据需要可以加入药学上接受的药物载体。

本发明的组合物可以制备成任何可药用的剂型。

优选的，本发明的组合物制备成口服制剂或注射剂。

通过试验，进一步证明了本发明的葛根素衍生物对体外血小板聚集反应具有非常显著的剂量依赖性的抑制作用，在治疗心脑血管疾病方面具有良好效果。

本发明的葛根素衍生物解决了现有葛根素药物产品的不足，克服了其口服吸收生物利用度较差，稳定性差，临床仅有注射剂等问题。另外，本发明的葛根素衍生物的制备方法简单，成本低，适合大规模生产。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。

实施例1：十五烷基酰基葛根素衍生物的制备

将0.5g(约1.9mmol)的棕榈酸与1mL的氯化亚砜混合，加入吡啶1滴，将油浴在50min内缓慢升至65℃，恒温反应3h，减压蒸除液体，加入2mLDMF待用。将0.3g(约0.7mmol)葛根素用适量DMF溶解，加入0.13g(约1.2mmol)无水碳酸钠，室温搅拌10min。在冰浴搅拌条件下缓慢滴加十六烷基酰氯，室温反应过夜，将反应液倒入适量水中，抽滤，得白色固体。固体经常规硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶薄层层析(CHCl₃∶MeOH＝10∶1)检测，收集合并R_f＝0.3馏分，常规浓缩，得7-十六烷基酰基葛根素70mg，如图(A)。其中，R1＝H、R3＝H、R4＝H、R5＝H、R6＝H.

7-十六烷基酰基葛根素¹HNMR(300MHz，CD₃OD)δ8.21(s，1H)，8.03-8.01(d，J＝7.87Hz，1H)，7.4-7.38(dd，J＝7.88Hz，2H)，6.96-6.84(dd，J＝8.28Hz，3H)，5.71(s，1H)，5.22(s，1H)，3.96-3.31(m，6H)，2.08(s，2H)，1.29-0.88(m，31H).

实施例2：二十烷基酰基葛根素衍生物的制备

将0.5g二十烷酸与1mL的氯化亚砜混合，加入吡啶1滴，将油浴在50min内缓慢升至65℃，恒温反应3h，减压蒸除液体，加入2mLDMF待用。将0.3g(约0.7mmol)葛根素用适量DMF溶解，加入0.13g(约1.2mmol)无水碳酸钠，室温搅拌10min。在冰浴搅拌条件下缓慢滴加十六烷基酰氯，室温反应过夜，将反应液倒入适量水中，抽滤，得白色固体。固体经常规硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶薄层层析(CHCl₃∶MeOH＝10∶1)检测，收集合并R_f＝0.3馏分，减压浓缩，得7-二十烷基酰基葛根素80mg。

实施例3：7-二十烷酰基-4’-葛根素衍生物的制备

将1.0g二十烷酸与1mL的氯化亚砜混合，加入吡啶1滴，将油浴在50min内缓慢升至65℃，恒温反应3h，减压蒸除液体，加入2mLDMF待用。将0.3g(约0.7mmol)葛根素用适量DMF溶解，加入0.13g(约1.2mmol)无水碳酸钠，室温搅拌10min。在冰浴搅拌条件下缓慢滴加十六烷基酰氯，室温反应过夜，将反应液倒入适量水中，抽滤，得白色固体。固体经常规硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶薄层层析(CHCl₃∶MeOH＝10∶1)检测，收集合并R_f＝0.3馏分，减压浓缩，得7-二十烷基酰基-4’-二十烷基酰基葛根素90mg。¹HNMR(300MHz，CD₃OD)δ8.21(s，1H)，8.03-8.01(d，J＝7.87Hz，1H)，7.5-7.42(dd，J＝7.88Hz，2H)，6.86-6.84(dd，J＝8.28Hz，3H)，5.61(s，1H)，5.22(s，1H)，3.96-3.31(m，6H)，2.10(s，2H)，1.09-0.88(m，41H).

实施例4：二十二碳六烯酸基葛根素衍生物的制备

将0.5g二十二碳六烯酸(DHA)与1mL的氯化亚砜混合，加入吡啶1滴，将油浴在50min内缓慢升至65℃，恒温反应3h，减压蒸除液体，加入2mLDMF待用。将0.3g(约0.7mmol)葛根素用适量DMF溶解，加入0.13g(约1.2mmol)无水碳酸钠，室温搅拌10min。在冰浴搅拌条件下缓慢滴加二十二碳六烯酸酰氯，室温反应过夜，将反应液倒入适量水中，抽滤，得白色固体。固体经常规硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶薄层层析(CHCl₃∶MeOH＝10∶1)检测，收集合并R_f＝0.3馏分，常规浓缩，得7-二十二碳六烯酸基葛根素100mg。

实施例5：葛根素衍生物抑制血小板聚集活性实验(以7-十六烷基酰基葛根素为例)

材料：葛根素(四川省玉鑫药业有限公司提供)、自制7-十六烷基酰基葛根素(纯度＞95％)，二磷酸腺苷(ADP，上海索莱宝生物科技有限公司)，生理盐水。新西兰大耳白家兔2只(第四军医大学提供)，体重2.0～2.5kg，分笼饲养，食固体饲料，自由饮水。室温18～20℃，相对湿度65％～70％。

仪器：RYXN-96B多功能智能血液凝集仪(上海通用机电技术研究所)

方法：

(1)溶液的配制：精密称取7-十六烷基酰基葛根素，用0.5％DMSO溶液配成高、中、低三个浓度，摩尔浓度分别为40mmol.L^-1、15mmol.L^-1、5mmol.L^-1。同理精密称取葛根素，用生理盐水配成等摩尔的上述高、中、低三个浓度的溶液。以7-十六烷基酰基葛根素溶液为实验组，葛根素溶液为对照组，测定含一定量药物血浆血小板的聚集率，以血小板聚集抑制率评价药物的药效作用。

(2)血浆的准备：兔耳中央动脉取血5ml，置入肝素钠抗凝管。500r/min转速离心5min，取上清液为富血小板血浆；然后以3000r/min转速离心10min，分离血浆获得贫血小板血浆。以贫血小板血浆作空白调试仪器。

(3)药物抗血小板聚集实验：实验分成两组，7-十六烷基酰基葛根素实验组和葛根素对照组，每组测试3个高中低浓度，每个浓度制备3个样品。精确移取富血小板血浆200μl与血液凝集仪的测试管中，分别加入实验溶液和对照溶液50μ1。电动搅拌1min，37℃恒温孵化6min后，加入ADP血小板聚集诱导剂20μl。按比浊法测定加入血小板聚集诱导剂ADP后，血浆在8min内的最大聚集率。所有血浆试验必须在2h内完成聚集率的测定。将多测得实验数据均以血小板聚集抑制率

表示，相同浓度下实验组和对照组对血小板聚集抑制率数据进行统计学的t检验。

结果：葛根素衍生物对血小板聚集的抑制作用与相同实验条件下葛根素的抗血小板聚集作用的实验数据进行考察，以确定葛根素衍生物抗血小板聚集的效果。实验数据见表1。

表1葛根素衍生物血小板聚集作用的影响(n＝3，

)

^**与相同浓度的葛根素相比的血小板聚集抑制率比较的t检验：P＜0.01

结论：葛根素衍生物对兔血小板聚集反应具有非常显著的抑制作用，药效存在剂量依赖性。在相同条件下，葛根素衍生物抑制血小板聚集作用显著强于葛根素。预示其在心脑血管疾病治疗方面具有很好的应用前景。

本试验仅以实施例1制备得到的7-十六烷基酰基葛根素为例，本发明的其他葛根素衍生物也具有同样优良的治疗效果。

实施例6：7-乙酰基-4’-乙酰基葛根素对制备

于25mL烧瓶中依次加入0.3g(0.72mmol)葛根素，2mLDMF，搅拌使其完全溶解，再加入0.15g(1.44mmol)无水碳酸钠，然后在冰浴搅拌下，用恒压滴液漏斗缓慢加入0.18g(1.8mmol)乙酸酐，加完后室温搅拌过夜。将反应液倒入适量水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得粗7-乙酰基-4’-乙酰基葛根素，通过常规柱层析(氯仿-甲醇系统梯度洗脱)分离，硅胶薄层层析(CHCl₃∶MeOH＝10∶1)检测，收集合并R_f＝0.3馏分，减压浓缩，得纯品7-乙酰基-4’-乙酰基葛根素0.15g。¹HNMR(300MHz，CD₃OD)δ8.44(s，1H)，8.22-8.19(d，J＝8.45Hz，1H)，7.64-7.61(dd，J＝8.20Hz，2H)，7.29-7.18(dd，J＝14.80Hz，3H)，5.68(s，1H)，3.95-3.50(m，6H)，2.41-2.04(s，6H)，1.78-1.29(s，4H).

实施例7：全乙酰基葛根素的制备

于25mL烧瓶中依次加入0.3g(0.72mmol)葛根素，2mL吡啶，搅拌使其完全溶解，在冰浴搅拌下用恒压滴液漏斗缓慢加入0.74g(7.2mmol)乙酸酐，加完后室温搅拌过夜。将反应液倒入适量水中，有白色固体析出，抽滤，晾干，固体经常规柱层析(氯仿-甲醇系统梯度洗脱)分离，硅胶薄层层析(CHCl₃∶MeOH＝10∶1)检测，收集合并R_f＝0.3馏分，减压浓缩，得纯品全乙酰基葛根素0.2g。乙酰基葛根素¹HNMR(300MHz，CD₃OD)δ8.55-8.24(s，1H)，7.90(s，1H)，7.65-7.62(dd，J＝8.29Hz，2H)，7.48-7.18(dd，J＝7.35Hz，2H)，5.86-5.13(m，3H)，4.44-4.07(m，2H)，2.46-0.29(m，12H).

实施例8：葛根素衍生物的制备

根据本发明的制备方法还可以制备成下列化学式所述的葛根素衍生物。

以葛根素衍生物为活性成分的药物组合物

实施例9、颗粒剂

取实施例1-7任意一个葛根素衍生物100g，加入1.5倍量的糊精，0.5％蔗糖，1.5％微晶纤维素，用适量乙醇溶解制成软材，制粒，60℃鼓风干燥，制粒，整粒，得颗粒剂。

实施例10、滴丸

取实施例1-7任意一个葛根素衍生物100g，加入1000g的聚乙二醇，混合均匀，熔融，上滴丸机，制成滴丸。

实施例11、口腔崩解片

取实施例1-7任意一个葛根素衍生物100g，加入5％交联聚维酮，0.1％的硬脂酸镁，50％的微晶纤维素，用适量乙醇溶液制成软材，制粒，60℃鼓风干燥，制粒，整粒，压制成片，即得口腔崩解片。

实施例12、粉针剂

取实施例1-7任意一项葛根素衍生物0.5g，葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得粉针剂。

实施例13、胶囊剂

取实施例1-7任意一项葛根素衍生物100g，加入等量淀粉，蔗糖和硬脂酸镁，制粒，装入胶囊，即得胶囊剂。

实施例14、片剂

取实施例1-7任意一项葛根素衍生物100g，与淀粉，羧甲基纤维素钠、滑石粉混合均匀，制粒，压片即得片剂。

实施例15、口服液

取实施例1-7任意一项葛根素衍生物2g，与糖浆4g、溶于100ml的纯净水中，均质，过滤，经过高温瞬时灭菌(135℃，4s)。无菌灌装、分装，制得口服液。

上述实施例内的组分量可以根据生产需要同时扩大或缩小比例。

所选用药物的活性成分：不限于实施例1-7所述的葛根素衍生物，还可以为：7-十六烷基酰基葛根素，7-十六烷基酰基-4’-十六烷基酰基葛根素，4’-十六烷基葛根素，7-二十二碳六烯酸基葛根素，7-二十二碳六烯酸基-4’-二十二碳六烯酸基葛根素，4’-二十二碳六烯酸基葛根素或其通式(I)所述的葛根素衍生物。

Claims (11)

1.葛根素衍生物，其结构通式(I)

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆为氢、乙酰基、C_12-30烷基酰基或C_12-30烯基酰基，且R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中至少一个为C_12-30烷基酰基。

2.根据权利要求1所述的葛根素衍生物，其特征在于，所述的R₁、R₂或R₃为氢、乙酰基、C_12-30烷基酰基或烯基酰基，R₄、R₅、或R₆为氢。

3.根据权利要求1所述的葛根素衍生物，其特征在于，所述的R₁、R₂或R₃为乙酰基、C_12-30烷基酰基或烯基酰基；R₄、R₅、或R₆是为氢。

4.根据权利要求1所述的葛根素衍生物，其特征在于，所述的R₁或R₂为乙酰基、C_12-30烷基酰基或烯基酰基；R₃、R₄、R₅、或R₆为氢。

5.根据权利要求1所述的葛根素衍生物，其特征在于，所述的R₁或R₃为乙酰基、C_12-30烷基酰基或烯基酰基；R₂、R₄、R₅或R₆为氢。

6.根据权利要求1所述的葛根素衍生物，其特征在于，所述的R₁为C_12-30烷基酰基或烯基酰基；R₂、R₃、R₄、R₅或R₆是指氢。

7.根据权利要求1所述的葛根素衍生物，其特征在于，C_12-30烷基酰基或烯基酰基选自：十六烷基酰基、二十二碳六烯酸基、二十烷基酰基。

8.根据权利要求1所述的葛根素衍生物，其特征在于，选自：

7-十六烷基酰基葛根素；7-十六烷基酰基-4’-十六烷基酰基葛根素；4’-十六烷基葛根素；7-二十二碳六烯酸基葛根素；7-二十二碳六烯酸基-4’-二十二碳六烯酸基葛根素；4’-二十二碳六烯酸基葛根素。

9.权利要求8所述的葛根素衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)十六烷基酰氯的制备：将十六烷基酰氯与二氯亚砜1∶1～2的摩尔比混合，以吡啶为溶剂，在60～70℃油浴中反应2～3小时，减压蒸除溶剂，得十六烷基酰氯，置于DMF中备用；

(2)制备葛根素衍生物：将葛根素溶解于DMF中，再加入无水碳酸钠，室温搅拌10～20min，在冰峪搅拌的条件下，将上述十六烷基酰氯加入到碱性溶液中，室温搅拌过夜，将溶液倒入适量水中，有白色固体析出，抽滤，将此固体晾干，得十六烷基酰基葛根素衍生物；

(3)葛根素衍生物的分离纯化：采用常规硅胶柱层析手段，将上述反应得到的十六烷基酰基葛根素衍生物进行分离纯化；

其中，步骤(2)所述的碱性无水溶液为无水碳酸钾的DMF溶液，所述十六烷基酰氯与葛根素的摩尔比是2～3∶1。

10.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-8所述的任一葛根素衍生物或两种及以上葛根素衍生物。

11.权利要求9所述的药物组合物在制备治疗心脑血管疾病中的应用。