CN101802618A - 利用基于抗体的阵列选择肺癌治疗药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供检测肿瘤细胞中信号转导途径诸组分的活化状态的组合物和方法。采用本发明获得的给予信号转导途径诸组分的活化状态的信息可用于癌症诊断、预后和设计癌症疗法。

Description

利用基于抗体的阵列选择肺癌治疗药物
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年7月13日提交的美国临时专利申请号60/949,820的优先权，其内容出于所有目的通过引用全文纳入本文。
对于联邦资助研发作出的发明的声明
不适用。
对以光盘提交的“序列表”、表格或计算机程序清单附件的引用不适用
发明背景
细胞的信号转导过程负责各种生物学功能，包括细胞分裂和死亡、代谢、免疫细胞活化、神经传递和感知觉等等。因此，细胞中正常信号转导的错乱可导致许多疾病状态，例如糖尿病、心脏病、自身免疫和癌症。
一种充分表征的信号转导途径是MAP激酶途径，其负责将表皮生长因子(EGF)的信号转导成促进细胞群的细胞增殖(参见，图1)。EGF结合连接酪氨酸激酶的跨膜受体，即，通过与EGF结合而活化的表皮生长因子受体(EGFR)。EGF与EGFR结合活化受体胞质结构域的酪氨酸激酶活性。该激酶活化的一种结果是EGFR在酪氨酸残基上自磷酸化。活化EGFR上磷酸化的酪氨酸残基为含有SH2结构域的衔接蛋白，例如GRB2的结合提供停泊位点。在其作为衔接蛋白的功能中，GRB2还通过GRB2上的SH3结构域结合鸟嘌呤核苷酸交换因子，SOS。EGFR-GRB2-SOS复合物的形成导致SOS活化成促进GDP从Ras中除去的鸟嘌呤核苷酸交换因子。GDP除去后，Ras结合GTP并被活化。
活化后，Ras结合并活化RAF激酶-一种丝氨酸/苏氨酸-特异性蛋白激酶-的蛋白质激酶活性。然后活化蛋白激酶级联反应从而导致细胞增殖。概括地说，RAF激酶随后磷酸化并活化MEK-另一种丝氨酸/苏氨酸激酶。活化的MEK磷酸化并活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。由MAPK进一步磷酸化的靶标是40S核糖体蛋白S6激酶(RSK)。MAPK磷酸化RSK导致RSK活化，进而磷酸化核糖体蛋白S6。MAPK的另一已知靶标是在各种癌症中突变的原癌基因c-Myc，其是细胞增殖的至关重要基因。MAPK还磷酸化和活化另一种蛋白激酶，MNK，进而磷酸化转录因子，CREB。MAPK还间接调节Fos基因的转录，而该基因还编码参与细胞增殖的另一种转录因子。通过改变这些转录因子的水平和活性，MAPK将EGF的最初胞外信号转换成细胞周期进程至关重要的基因转录的改变。
鉴于信号转导途径在细胞生长中起核心作用，信号转导组分的突变和其它改变导致细胞增殖途径异常活化从而产生许多癌症是不奇怪的。例如，EGFR的过表达或过度活性与许多癌症相关，包括多形性成胶质细胞瘤、结肠癌和肺癌。这促进开发了针对EGFR的抗癌剂，包括用于肺癌的吉非替尼(gefitinib)和埃洛替尼(erlotinib)，以及用于结肠癌的西妥昔单抗(cetuximab)。
西妥昔单抗是单克隆抗体抑制剂的一种例子，其结合EGFR的胞外配体结合结构域，因而防止了活化EGFR酪氨酸激酶的配体的结合。相反，吉非替尼和埃洛替尼是抑制胞内定位的EGFR酪氨酸激酶的小分子。没有这些激酶活性，EGFR不能在酪氨酸残基进行自磷酸化，而这是下游衔接蛋白，例如GRB2结合的先决条件。通过中断细胞中的信号级联反应(细胞生长依赖该途径)，减少了肿瘤生长和迁移。
此外，其它研究显示约70％的人黑色素瘤和较低比例的其它肿瘤在Raf基因中具有导致MAPK途径持久活化的点突变(参见，例如Davies等，Nature，417：949-954(2002))。这些结果提示特定信号转导途径中的突变可能是某些类型肿瘤特征性的，而这种特异性、改变的信号转导途径可能是有希望的化疗干预靶点。
鉴于不同的癌症治疗，特别是癌症化疗可能分别通过阻断或活化参与细胞增殖或死亡的细胞信号转导途径而直接或间接起作用，那么特定形式癌症中给定信号转导途径的活性可能用作各种癌症治疗方法效力的良好指标。因此，除了满足这些要求，本发明提供了评估潜在抗癌症治疗对个体患者的效力的方法。因此，本发明提供了协助医师为各患者选择剂量合适和时机合适的合适癌症治疗的方法。
发明简述
本发明提供检测肿瘤细胞(例如，肺肿瘤的循环细胞)中信号转导途径诸组分的活化状态的组合物和方法。采用本发明获得的信号转导途径诸组分的活化状态信息可用于癌症诊断、预后和设计癌症治疗。
本发明一方面提供选择治疗肺肿瘤的合适抗癌症药物的方法，所述方法包括：
(a)先给予某抗癌症药物再分离肺肿瘤的细胞，或者先分离肺肿瘤的细胞再用该抗癌症药物温育；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)采用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个稀释系列的试验检测细胞提取物中所述一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体局限在固体支持物上；和
(d)通过比较所述一种或多种分析物测得的活化状态与没有该抗癌症药物存在下产生的参比活化状况来测定该抗癌症药物是否适于治疗该肺肿瘤。
在另一方面，本发明提供选择具有肺肿瘤的对象的方法，所述对象是用某抗癌症药物治疗的合适候选对象，所述方法包括：
(a)先给予某抗癌症药物再分离肺肿瘤的细胞，或者先分离肺肿瘤的细胞再用该抗癌症药物温育；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)采用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个稀释系列的试验检测细胞提取物中所述一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体局限在固体支持物上；和
(d)通过比较所述一种或多种分析物测得的活化状态与没有该抗癌症药物存在下产生的参比活化状况来测定该对象是否适于该肺肿瘤治疗。
在另一方面，本发明提供鉴定肺肿瘤对某抗癌症药物治疗的反应的方法，所述方法包括：
(a)先给予某抗癌症药物再分离肺肿瘤的细胞，或者先分离肺肿瘤的细胞再用该抗癌症药物温育；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)采用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个稀释系列的试验检测细胞提取物中所述一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体局限在固体支持物上；和
(d)通过比较所述一种或多种分析物测得的活化状态与没有该抗癌症药物存在下产生的参比活化状况来鉴定该肺肿瘤是否对该抗癌症药物起反应。
在还有另一方面，本发明提供预测具有肺肿瘤的对象对某抗癌症药物治疗的反应的方法，所述方法包括：
(a)先给予某抗癌症药物再分离肺肿瘤的细胞，或者先分离肺肿瘤的细胞再用该抗癌症药物温育；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)采用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个稀释系列的试验检测细胞提取物中所述一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体局限在固体支持物上；和
(d)通过比较所述一种或多种分析物测得的活化状态与没有该抗癌症药物存在下产生的参比活化状况来预测该对象对该抗癌症药物治疗起反应的可能性。
在还有另一方面，本发明提供对用抗癌症药物治疗的具有肺肿瘤的对象的临床结果进行预后的方法，所述方法包括：
(a)在给予抗癌症药物后分离肺肿瘤的细胞；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)采用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个稀释系列的试验检测细胞提取物中所述一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体局限在固体支持物上；和
(d)通过比较所述一种或多种分析物测得的活化状态与没有该抗癌症药物存在下产生的参比活化状况对用该抗癌症药物治疗的对象的临床结果作出预后。
在还有一方面，本发明提供具有优秀动态范围的阵列，其包含多个局限于固体支持物上的捕捉抗体的稀释系列，其中各稀释系列中的捕捉抗体对于细胞提取物中信号转导途径组分的一种或多种相应分析物具有特异性。
本领域技术人员从以下详述和附图可以明白本发明的其它目的、特征和优点。
附图简述
图1显示了可用于实施本发明的参与细胞增殖的信号转导途径的例子。描述了细胞用于将丝裂信号转变成细胞增殖的EGFR/MAPK/ERK途径的诸组分。
图2是在癌症治疗期间将本发明的可寻址阵列应用于药物选择的示意图。
图3显示了包含受体酪氨酸激酶途径诸组分，例如EGFR/MAPK/ERK途径诸组分的抗体稀释液的可寻址阵列的示意性例子。
图4显示了包含在肿瘤血管生成中活化的信号转导途径诸组分的抗体稀释液的可寻址阵列的示意性例子。
图5A-B显示了在患者2002(A)和患者2015(B)中采用Veridex
CellSearch系统的CTC计数。
发明详述
I.引言
如上所述，参与细胞增殖的信号转导途径的活化和参与细胞死亡的途径的失活是表征许多不同类型癌症的分子特征的非限制性例子。在许多情况中，特定信号转导途径及其诸组分的活性可用作给定类型癌症的分子签名。这些活化的组分还可为治疗干预提供有用靶位。因此，了解治疗之前、期间和之后癌症细胞内的特定信号转导系统的活性水平为医师提供了可用于选择合适治疗进程的高度相关信息。此外，持续监测在癌细胞中有活性的信号转导途径作为治疗进展可为医师提供治疗效力的额外信息，从而提示医师继续特定治疗进程或改用另一治疗方法，例如，当癌细胞通过活化同一或另一信号转导途径的进一步变异而对治疗变得耐受之时。
因此，本发明提供在特异性、多重、高通量试验中检测肿瘤组织或肿瘤外细胞，例如实体瘤的稀少循环细胞中多种失调信号转导分子的表达和活化状态的方法和组合物。本发明还提供选择合适的治疗(单一药物或药物组合)来下调或关闭失调信号转导途径的方法和组合物。因此，采用本发明可有利于为癌症患者设计个性化疗法。
通过测定单细胞水平的信号转导途径活性来检测和鉴定循环中肿瘤细胞的能力是本发明的重要优点。具有各种癌症早期阶段的患者血液中常见肿瘤细胞，例如“微小转移(弥散性肿瘤细胞)”，在转移癌中也可见到。血液中肿瘤细胞的数量取决于肿瘤的阶段和类型。虽然通常可获得原发性肿瘤的生物活检，但大多数转移瘤未经生物活检，从而极难对这种肿瘤样品进行分子分析。在肿瘤转移期间，大多数侵袭性肿瘤细胞离开原发性肿瘤，通过血液和淋巴系统移动到达远端部位。因此，血液中的循环肿瘤细胞代表了肿瘤细胞中最具侵袭性和均质的群体。然而，血液中转移性肿瘤细胞的数量经常极低，从每毫升血液中1个到数千个细胞不等。在这种稀少细胞中分离和检验信号转导途径和将该信息应用于更有效的癌症治疗的能力是本发明的目的之一。
在一些实施方式中，本发明的多重高通量免疫测定能在单细胞水平检测实体瘤的循环细胞中一种或多种信号转导分子的活化状态。事实上，信号转导分子，例如EGFR的检测灵敏度可以是约100 10-21摩尔(zeptomole)，线性动态范围是约100 10-21摩尔到约100毫微微摩尔(femtomole)。因此，稀少循环细胞中多种信号转导物的活化状态的单细胞检测有助于癌症预后和诊断以及设计个性化、靶向疗法。
稀少循环细胞包括从实体瘤转移或微小转移的实体瘤循环细胞。循环肿瘤细胞、癌症干细胞和迁移至肿瘤(因趋化作用)的细胞，例如循环内皮祖细胞、循环内皮细胞、循环前血管原性髓样细胞和循环树突细胞是实体瘤相关循环细胞的一些例子。
通常在分离循环细胞后不久提取感兴趣的信号转导分子以维持它们的原位活化状态，优选在约24、6或1小时内，更优选在约30、15或5分钟内。还可将分离的细胞与通常为纳摩尔到微摩尔浓度的一种或多种生长因子温育约1-30分钟以恢复或刺激信号转导分子的活化(参见，例如Irish等，Cell，118：217-228(2004))。
如本文更详细解释的，为评估用于各患者个体的潜在抗癌症疗法，可将分离的细胞与各种剂量的一种或多种抗癌症药物温育。然后可进行少许(例如，约1-5分钟)或数小时(例如，约1-6小时)的生长因子刺激。用和不用抗癌症药物来差别活化信号转导途径有助于为各患者选择合适剂量的合适癌症疗法。还可在抗癌症药物治疗期间从患者样品分离循环细胞并用一种或多种生长因子刺激以确定是否应改变治疗。因此，本发明方法有利于帮助临床医师为各患者个体提供剂量正确、时机正确的正确抗癌症药物。
II.定义
除非另有规定，本文所用的以下术语具有归于它们的意义。
术语“癌症”应包括特征在于异常细胞不受控生长的疾病类型的任何成员。该术语包括所有已知癌症和肿瘤病症，无论特征是恶性、良性、软组织还是实体的，以及所有阶段和等级的癌症，包括转移前和后的癌症。不同类型癌症的例子包括但不限于：肺癌(例如，非小细胞肺癌)；消化道和胃肠道癌症，例如结肠直肠癌、胃肠道间质瘤、胃肠类癌肿瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌、和胃癌；食道癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌(appendixcancer)；乳腺癌；卵巢癌；肾癌(例如，肾细胞癌)；中枢神经系统癌；皮肤癌；淋巴瘤；绒毛膜癌；头颈癌；骨肉瘤；和血液癌症。本文所用的“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。在优选实施方式中，肺肿瘤源自具有非小细胞肺癌，例如鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、支气管肺泡癌(BAC)或燕麦细胞癌的对象。
术语“分析物”包括测定其存在、含量和/或身份的任何感兴趣分子，通常是大分子，例如多肽。在某些例子中，分析物是实体瘤的循环细胞的细胞组分，优选信号转导分子。
本文所用的术语“稀释系列”应包括一系列浓度降低的特定样品(例如，细胞裂解物)或试剂(例如，抗体)。一般通过以下过程产生稀释系列：混合测定量的起始浓度样品或试剂与稀释剂(例如，稀释缓冲液)以产生较低浓度的样品或试剂，并重复该过程足够次数以获得所需数量的连续稀释液。样品或试剂可连续稀释至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500、或1000-倍以产生包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、或50种浓度降低的样品或试剂的稀释系列。例如，可通过混合一定量的起始浓度捕捉抗体与等量稀释缓冲液以产生0.5mg/ml浓度的捕捉抗体，重复该过程以获得0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.0325mg/ml等的捕捉抗体浓度，从而产生包含起始浓度为1mg/ml的捕捉抗体试剂的2-倍连续稀释的稀释系列。
术语“优秀的动态范围”指某试验在少至1个细胞或多至数千细胞中检测特异性分析物的能力。例如，本文所述的免疫测定具有优秀的动态范围，因为它们有利于利用捕捉抗体浓度的稀释系列在约1-10,000个细胞中检测感兴趣的特定信号转导分子。
术语“信号转导分子”或“信号转导物”包括执行细胞将胞外信号或刺激转换成反应的过程的蛋白质和其它分子，该过程通常涉及细胞内生物化学反应的有序序列。信号转导分子的例子包括但不限于：受体酪氨酸激酶，例如EGFR(例如，EGFR/HER 1/ErbB 1、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)、VEGFR-1/FLT-1、VEGFR-2/FLK-1/KDR、VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、PDGFR(例如，PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、INSR(胰岛素受体)、IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰岛素受体-相关受体)、CSF-1R、FGFR 1-4、HGFR1-2、CCK4、TRK A-C、MET、RON、EPHA 1-8、EPHB 1-6、AXL、MER、TYRO3、TIE 1-2、TEK、RYK、DDR 1-2、RET、c-ROS、LTK(白细胞酪氨酸激酶)、ALK(间变性淋巴瘤激酶)、ROR 1-2、MUSK、AATYK 1-3和RTK 106；非受体酪氨酸激酶，例如BCR-ABL、Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack和LIMK；酪氨酸激酶信号转导级联组分，例如Akt、MAPK/ERK、MEK、RAF、PLA2、MEKK、JNKK、JNK、p38、Shc(p66)、PI3K、Ras(例如，K-Ras、N-Ras、H-Ras)、Rho、Rac1、Cdc42、PLC、PKC、p70S6激酶、p53、细胞周期蛋白D1、STAT1、STAT3、PIP2、PIP3、PDK、mTOR、BAD、p21、p27、ROCK、IP3、TSP-1、NOS、PTEN、RSK 1-3、JNK、c-Jun、Rb、CREB、Ki67和桩蛋白；和它们的组合。
本文所用的术语“循环细胞”包括从实体瘤转移或微小转移的肿瘤外细胞(extratumoral cell)。循环细胞的例子包括但不限于：循环肿瘤细胞、癌症干细胞和/或迁移至肿瘤的细胞(例如，循环内皮祖细胞、循环内皮细胞、循环前血管原性髓样细胞、循环树突细胞等)。
本文所用的术语“样品”包括获自患者的任何生物学样本。样品包括但不限于：全血、血浆、血清、红细胞、白细胞(例如，外周血单核的细胞)、唾液、尿液、粪便(即，排泄物)、痰、支气管灌洗液、眼泪、乳头抽吸物、淋巴(例如，淋巴结的弥散性肿瘤细胞)、细针抽吸物、任何其它体液、组织样品(例如，肿瘤组织)，如肿瘤活检(例如，针吸活检)和它们的细胞提取物。在一些实施方式中，样品是全血或其组分，例如血浆、血清或细胞沉淀。在优选的实施方式中，采用本领域已知的任何技术从全血分子实体瘤的循环细胞或其细胞组分而获得样品。在其它实施方式中，样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织样品，例如来自肺、结肠或直肠的实体瘤。
“活检”指取出组织样品以供诊断或预后评估的过程，也指组织样本自身。可将本领域已知的任何活检技术应用于本发明的方法和组合物。所应用的活检技术通常取决于待评估的组织类型和肿瘤大小及类型(即，实体或悬浮的(即，血液或腹水))等因素。代表性活检技术包括切除活检、切开式活检、针吸活检(例如，芯针活检、细针抽吸活检等)、手术活检和骨髓活检。活检技术参见，例如Harrison′s Principles of Internal Medicine(内科学哈里森原理)，Kasper等编，第16版，2005，第70章，以及整个第V部分。
术语“对象”或“患者”通常包括人，但不限于其它动物，例如其它灵长类、啮齿类、犬、猫、马、绵羊、猪等。
“阵列”或“微阵列”包括固定或局限于固体支持物上的捕捉抗体的不同组和/或稀释系列，所述固体支持物是例如，玻璃(例如，玻璃载玻片)、塑料、芯片、钉、滤膜、珠、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)，等)、纤维束或任何其它合适的基板。捕捉抗体一般通过共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)而固定或局限于固体支持物上。本发明试验所用的阵列通常包含偶联于固体支持物表面不同的已知/可寻址位置的多个不同的捕捉抗体和/或捕捉抗体浓度。
术语“捕捉抗体”应包括对于样品中感兴趣的一种或多种分析物具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)的固定化抗体。在优选的实施方式中，捕捉抗体局限于阵列中的固体支持物上。用于将各种信号转导分子固定在固体支持物上的合适捕捉抗体可购自加利福尼亚州泰姆库拉市升态公司(Upstate，Temecula，CA)、加利福尼亚州卡马里奥市生物资源公司(Biosource，Camarillo，CA)、马萨诸塞州丹弗斯市细胞信号转导技术公司(Cell SignalingTechnologies，Danvers，MA)、明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司(R&DSystems，Minneapolis，MN)、加利福尼亚州弗里蒙特市LV公司(Lab Vision，Fremont，CA)、加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)、密苏里州圣路易斯市西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO)和加利福尼亚州圣何塞市BD生物科学公司(BD Biosciences，SanJose，CA)。
本文所用的术语“检测抗体”包括含有可检测标记并对样品中感兴趣的一种或多种分析物具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)的抗体。该术语还包括对于感兴趣的一种或多种分析物具有特异性的抗体，其中所述抗体可被包含可检测标记的另一种类抗体结合。可检测标记的例子包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记、核酸(例如，寡核苷酸)标记、化学反应活性的标记、荧光标记、酶标记、放射性标记和它们的组合。用于检测各种信号转导分子的活化状态的合适检测抗体可购自加利福尼亚州泰姆库拉市升态公司、加利福尼亚州卡马里奥市生物资源公司、马萨诸塞州丹弗斯市细胞信号转导技术公司、明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司、加利福尼亚州弗里蒙特市LV公司、加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司、密苏里州圣路易斯市西格玛公司和加利福尼亚州圣何塞市BD生物科学公司。作为非限制性例子，针对各种信号转导分子，例如EGFR、c-KIT、c-Src、FLK-1、PDGFRA、PDGFRB、Akt、MAPK/ERK、PTEN、Raf和MEK的磷酸化形式的磷酸-特异性抗体可购自圣克鲁斯生物技术公司。
术语“活化状态依赖性抗体”包括对样品中感兴趣的一种或多种分析物的特定活化状态具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)的检测抗体。在优选的实施方式中，所述活化状态-依赖性抗体检测一种或多种分析物，例如一种或多种信号转导分子的磷酸化、遍在蛋白化和/或络合状态。在一些实施方式中，利用活化状态依赖性抗体检测受体酪氨酸激酶的EGFR家族诸成员的磷酸化和/或EGFR家族成员之间异二聚体复合物的形成。适合用活化状态依赖性抗体检测的活化状态(括号中所列)的非限制性例子包括：EGFR(EGFRvIII、磷酸化(p-)EGFR、EGFR:Shc、遍在蛋白化(u-)EGFR、p-EGFRvIII)；ErbB2(p85:截短(Tr)-ErbB2、p-ErbB2、p85:Tr-p-ErbB2、Her2:Shc、ErbB2:PI3K、ErbB2:EGFR、ErbB2:ErbB3、ErbB2:ErbB4)；ErbB3(p-ErbB3、ErbB3:PI3K、p-ErbB3:PI3K、ErbB3:Shc)；ErbB4(p-ErbB4、ErbB4:Shc)；IGF-1R(p-IGF-1R、IGF-1R:IRS、IRS:PI3K、p-IRS、IGF-1R:PI3K)；INSR(p-INSR)；KIT(p-KIT)；FLT3(p-FLT3)；HGFRI(p-HGFRI)；HGFR2(p-HGFR2)；RET(p-RET)；PDGFRa(p-PDGFRa)；PDGFRP(p-PDGFRP)；VEGFRI(p-VEGFRI、VEGFRI:PLCg、VEGFR 1:Src)；VEGFR2(p-VEGFR2、VEGFR2:PLCy、VEGFR2:Src、VEGFR2:硫酸肝素、VEGFR2:VE-钙粘蛋白)；VEGFR3(p-VEGFR3)；FGFR1(p-FGFR1)；FGFR2(p-FGFR2)；FGFR3(p-FGFR3)；FGFR4(p-FGFR4)；Tie1(p-Tie1)；Tie2(p-Tie2)；EphA(p-EphA)；EphB(p-EphB)；NFKB和/或IKB(p-IK(S32)、p-NFKB(S536)、p-P65:IKBa)；Akt(p-Akt(T308、S473))；PTEN(p-PTEN)；Bad(p-Bad(S112、S136)、Bad:14-3-3)；mTor(p-mTor(S2448))；p70S6K(p-p70S6K(T229、T389))；Mek(p-Mek(S217、S221))；Erk(p-Erk(T202、Y204))；Rsk-1(p-Rsk-1(T357、S363))；Jnk(p-Jnk(T183、Y185))；P38(p-P38(T 180、Y 182))；Stat3(p-Stat-3(Y705、S727))；Fak(p-Fak(Y576))；Rb(p-Rb(S249、T252、S780))；Ki67；p53(p-p53(S392、S20))；CREB(p-CREB(S133))；c-Jun(p-c-Jun(S63))；cSrc(p-cSrc(Y416))；和桩蛋白(p-桩蛋白(Y118))。
术语“不依赖活化状态的抗体”对样品中感兴趣的一种或多种分析物具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)，而无论它们的活化状态的检测抗体。例如，不依赖活化状态的抗体可检测一种或多种分析物，例如一种或多种信号转导分子的磷酸化和非磷酸化形式。
术语“核酸”或“多核苷酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物形式，例如DNA和RNA。核酸包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接键的核酸，其可以是合成的、天然产生的和非天然产生的，并具有与参比核酸相似的结合特性。这种类似物的例子包括但不限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2′-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。除非另有限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参比核酸相似的结合特性。除非另有表述，特定核酸序列还隐含包括其保守性修饰的变体和互补序列以及明确示出的序列。
术语“寡核苷酸”指RNA、DNA、RNA/DNA杂交体和/或其模拟物的单链共聚物或聚合物。在某些情况中，寡核苷酸由天然产生(即，未修饰的)核碱基、糖和核苷间(主链)连接键构成。在某些其它例子中，寡核苷酸包含修饰的核碱基、糖和/或核苷间连接键。
本文所用的术语“错配基序”或“错配区域”指寡核苷酸中与其互补序列不具有100％互补性的部分。寡核苷酸可具有至少1、2、3、4、5、6个或更多个错配区域。错配区域可以是连续的，或可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸隔开。错配基序或区域可包含一个核苷酸或可包含2、3、4、5或更多个核苷酸。
短语“严格杂交条件”指寡核苷酸与其互补序列杂交，但不与其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中会有差异。较长的序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的详细指导参见Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes(生物化学和分子生物学技术-用核酸探针杂交)，″Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays(杂交原理和核酸试验方案概述)″(1993)。严格条件通常选择比具体序列在规定离子强度pH下的热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm是在规定的离子强度、pH和核酸浓度下，50％的与靶标互补的探针与靶序列杂交平衡时的温度(由于存在的靶序列过量，Tm时，在平衡时有50％的探针被占据)。还可进入去稳定剂，例如甲酰胺来获得严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选是背景杂交的10倍。
就两条或更多条核酸而言，术语“实质上相同”或“实质相同性”指在比较窗或指定区域上比较和比对最大对应性时，例如采用序列比较算法或通过手工比对和目测观察，相同或有特定百分比的核苷酸相同(即，在特定区域上有至少约60％，优选至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同性)的两条或更多条序列或子序列。当文中示出该定义时，其还类似地指某序列的互补序列。优选在至少长约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、或100个核苷酸的区域具有实质相同性。
III.实施方式描述
在一个实施方式中，本发明提供采用特异性、多重、高通量的试验检测衍生自肿瘤组织的肿瘤细胞或实体瘤的循环细胞中多个失调信号转导物的表达和活化状态的方法。本发明还提供选择合适治疗的方法和组合物，以便下调或关闭一种或多种失调的信号转导途径。因此，可根据给定患者肿瘤中活化的信号转导蛋白集合提供的特定分子签名，采用本发明实施方式来帮助设计个性化治疗。
实体瘤的循环细胞包括从实体瘤转移或微小转移的细胞，包括癌症干细胞或迁移至肿瘤的细胞(例如，因趋化作用)，例如内皮祖细胞、循环内皮细胞、周细胞、循环前血管原性髓样细胞、树突细胞等等。含有循环细胞的患者样品可获自任何可得的生物学液体(例如，全血、血清、血浆、痰、支气管灌洗液、尿液、乳头抽吸物、淋巴、唾液、细针抽吸物等)。在某些情况中，将全血样品分成血浆或血清组分和细胞组分(即，细胞沉淀)。细胞组分通常含有红细胞、白细胞和/或实体瘤的循环细胞，例如循环肿瘤细胞(CTC)、循环内皮细胞(CEC)、循环内皮祖细胞(CEPC)、癌症干细胞(CSC)、淋巴结的弥散性肿瘤细胞和它们的组合。血浆或血清组分通常含有实体瘤的循环细胞所释放的核酸(例如，DNA、RNA)和蛋白质。
通常采用一种或多种分离方法从患者样品分离循环细胞，所述方法包括，例如免疫磁性分离(参见，例如Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：4589-4594(1998)；Bilkenroth等，Int.J.Cancer，92：577-582(2001))、宾夕法尼州亨廷顿谷的伊缪尼康公司(Immunicon，Huntingdon Valley，PA)的CellTrackTM系统、微流体分离(参见，例如Mohamed等，IEEE Trans.Nanobiosci.，3：251-256(2004)；Lin等，第5147号摘要，第97届AACR年会，华盛顿，哥伦比亚特区，(2006))、FACS(参见，例如Mancuso等，Blood，97：3658-3661(2001))、密度梯度离心(参见，例如Baker等，Clin.Cancer Res.，13：4865-4871(2003))和消除法(参见，例如Meye等，Int.J.Oncol.，21：521-530(2002))。
在一个实施方式中，为保持原位活化状态，优选在分离细胞后不久提取信号转导物，优选在96、92、48、24、6或1小时内，更优选在约30、15或5分钟内。还优选可将分离的细胞与通常为纳摩尔到微摩尔浓度的生长因子温育约1-30分钟以恢复或刺激信号转导物活化(参见，例如Irish等，Cell，118：217-228(2004))。刺激性生长因子包括表皮生长因子(EGF)、调蛋白(HRG)、TGF-α、PIGF、血管生成素(Ang)、NRG1、PGF、TNF-α，、VEGF、PDGF、IGF、FGF、HGF、细胞因子，等等。为评估用于各患者的潜在抗癌症治疗，在生长因子刺激前将分离的细胞与各种剂量的一种或多种抗癌症药物温育。生长因子刺激可进行数分钟或数小时(例如，1-5分钟或1-6小时)。用和不用抗癌症药物差别活化的信号转导途径有助于为各患者选择合适剂量的合适癌症疗法。分离、抗癌症药剂治疗和/或生长因子刺激后，采用本领域已知的任何技术裂解细胞以提取信号转导物。优选在生长因子刺激后约1-360分钟之间，更优选在两个不同的时间间隔开始细胞裂解：(1)在生长因子刺激后约1-5分钟；和(2)在生长因子刺激后约30-180分钟之间。或者，可将裂解物保存于-80℃待用。
在一些实施方式中，抗癌症药物包括干扰癌细胞中活化信号转导途径组分功能的药剂。这种药剂的非限制性例子包括下文所列那些：
表A
EGFR(A)(ErbB1)    Her 2(C)(ErbB2)    Her 3(ErbB3)(E)    Her4(ErbB4)靶标
西妥昔单抗        群司珠单           抗抗体(U3)
帕尼妥莫单抗      (赫赛汀)
(Panitumumab)
玛妥珠单抗        彭图珠单抗
(Matuzumab)       (Pertuzumab)(DNA)
尼莫图珠单抗      BMS-599626(异二聚化Her1/2；1期)
(Nimotuzumab)
EGFR疫苗
EGFR(B)(ErbB1)    Her 2(D)(ErbB2)
埃洛替尼          CP-724714
                  (辉瑞公司(Pfizer))
吉非替尼
EKB 569(惠氏(Wyeth)，不可逆，II CRC)
CL-387-785(惠氏，不可逆，临床前)
ErbB1/2(F)
拉帕替尼(Lapatinib)
HKI-272(惠氏，不可逆，I/II NSCLC，乳腺)
HKI-357(临床前)
BIBW 2992(伯林格殷格瀚(Boehringer Ingelheim)，不可逆，I/II前列腺，卵巢，乳腺)
ErbB1/2/4(G)
卡那替尼(Canertinib)(辉瑞，不可逆，II NSCLC，乳腺)
ARRY-334543
JNJ-26483327
JNJ-26483327
Raf(H)                SRC
索拉芬尼(Sorafenib)   AZ
PLX4032
(普莱新康(Plexxikon))
Mek：(I)              NFkB-IkB
PD-325901(II：NSCLC)
AZD6244-阵列/Az
XL518埃克丽西丝
(Exelisis)/DNA
mTor靶标(J)
Rad 001：依维莫司(诺华(Novartis)，与吉非替尼/埃洛替尼组合；I/II：NSCLC，成胶质细胞瘤)
他西络莫司(Temsirolimus)(惠氏，与吉非替尼/埃洛替尼组合；I/II：NSCLC，成胶质细胞瘤)
AP-23573(阿里亚德(Ariad)，I/II：子宫内膜)
PI3K：
PX-866(P110α特异性抑制；ProIX法玛(Pharma)；临床前NSCLC)
VEGF靶标(靶标VEGFR2，和VEGFR1)(K)
阿伐司汀
(Avastin)(DNA)
HuMV833(PDL)抗-VEGFa
VEGF-Trap-雷根仑(Regeneron)/阿凡提丝(Aventis)(受体模拟物)(2期)
VEGFR-2靶标(L)                EPH A-D
DC101-因克隆(Imclone)(2/3期？)
IMC-IC11嵌合型IgG1，针对VEGFR2
IMC1121B完全人源化
CDP-791(细胞技术(Celltech)，针对R2的PEG化的二-Fab抗体
帕佐帕尼(Pazopanib)(GSK)(多发性骨髓瘤，卵巢，RCC 3期募集完成，肉瘤II)
CDP-791(UCB)
CP-547632(OSI，辉瑞)：(+EGFR+PDGFR)(NSCLC，卵巢2期)
AG 13736(辉瑞)：VEGFR1，2和PDGFRβ)(RCC II)
E-7080(埃塞(Eisai))
CHIR-258(VEGFR1，2FGFR3，PDGFR)
OSI-930(+cKit，PDGFR)
Bay-579352(+PDGFR)
ABT-869(+CSF1R，Erk，Flt-3，PDGFR)
BMS-540215(+FGFR1)
KRN-951
BBIW
VEGFR 1/2/3：
AZD 2171(NSCLC，CRC)
AMG-706(+PDGFR)
VEGFR 2/ErbB1/2(EGFR)/cMet/FGFR(M)
ZD6474(凡达它尼(vandetanib))(III期：甲状腺，NSCLC)
XL647(埃克丽西丝；也是EPHB2)：(对埃洛替尼耐受的患者；亚洲患者)(2期)
AEE 788(诺华，1/2期)
VEGFR2/3/Raf/PDGFR/cKit/Flt-3(N)TIE 1/2
索拉芬尼(RCC，HCC，NSCLC(III)，黑色素瘤(III)，
VEGFR2/1/3，Flt-3，cFMS，PDGFR/cKit/(O)        PDGFR靶标(P)
PTK787(Not cFMS，FLT-3)                        坦度替尼
                                               (Tandutinib)
苏尼替尼(Sunitinib)                            尼洛替尼
                                               (Nilotinib)
XL-999
SU-6668(辉瑞)
GSK
AZ(AZD2171)
BMS
诺华(AEE-788)
安进(Amgen)
其它
Abl靶标：(Q)        FTL3        RET
伊马替尼
达萨替尼(Dasatinib)
尼洛替尼
AT-9283
AZD-0530
博苏替尼(Bosutinib)
Kit靶标(R)                      HGFR1/2        FGFR1-4
AMG-706                                        希龙(Chiron)
XL-880
XL-999
IGF-1R靶标(S)
默克(Merck)
辉瑞
诺华
HSP90抑制剂：
IPI-504(无限药业(Infinity Pharma)，突变型EGFR，I/II多发性骨髓瘤，GIST)
17-AAG(考山(Kosan)，I/II实体瘤)
抗-有丝分裂药物：
多西他赛(微管稳定剂；辅助和晚期乳腺癌(Adjuvant and advanced Breast cancer)；NSCLC，不依赖雄激素的前列腺癌)
紫杉醇(微管稳定剂；辅助和晚期乳腺癌；NSCLC，卵巢癌，AIDS相关卡波西肉瘤)长春碱，长春新碱，长春瑞滨(微管去稳定剂)
其它靶标：
HDAC抑制剂
BCL2
化疗剂(分解)
蛋白体抑制剂
在另一实施方式中，本发明提供具有优秀动态范围的可寻址阵列，其包含多个局限于固体支持物上的捕捉抗体的稀释系列，其中各稀释系列中的捕捉抗体对信号转导途径组分的一种或多种相应分析物具有特异性。在各方面，该实施方式包括含有特定肿瘤的特征性信号转导途径，例如在肺癌细胞中有活性的信号转导途径诸组分的阵列。因此，每类癌症由一块阵列或芯片表示可有利地实施本发明。在一些方面，将特定肿瘤细胞中有活性的给定信号转导途径的诸组分排列成线性序列，其对应于通过细胞内信号转导途径传递的信息序列。这种阵列的例子见图3和4。
可采用本发明方法查询的信号转导途径的非限制性例子包括表1所示那些。
表1
途径1 EGFR   EGFR磷酸   EGFRShc   EGFR泛素   EGFR-PI3K PTEN
途径2 EGFR EGFRVIII   EGFR磷酸   EGFRShc   EGFR泛素   EGFRVIII磷酸 PTEN
途径3 ERBB2   ERBB2磷酸 Her 2Shc   ERBB2:PI3K复合物   ErbB2泛素 PTEN
途径4 ERBB2   P85截短的ERBB2 ERBB2磷酸   P85截短的ERBB2磷酸 Her2Shc   ERBB2:PI3K复合物   ErbB2泛素
途径5 ERBB3   ERBB3磷酸   ERBB3:PI3K复合物 ERBB3PI3K磷酸 ERBB3:Shc
途径6 ERBB4   ERBB4磷酸   ERBB4:Shc
途径7 IGF-1R   IGF-1R磷酸   IGF-1R:IRS IRS:PI3K 磷酸IRS   IGF-1R:PI3K
 途径8   INSR   INSR磷酸
  途径9   KIT   KIT磷酸
  途径10   FLT3   FLT3磷酸
途径11 HGFR 1   HGFR 1磷酸
途径12 HGFR2   HGFR 2磷酸
  途径13   RET   RET磷酸
途径14 PDGFRα   PDGFRα磷酸
途径15 PDGFRβ   PDGFRβ磷酸
途径16 VEGFR 1   VEGFR 1磷酸   VEGFR 1:PLCγ复合物 VEGFR 1:Src
途径1 EGFR   EGFR磷酸   EGFRShc   EGFR泛素   EGFR-PI3K PTEN
途径17 VEGFR2   VEGFR2磷酸   VEGFR 2:PLCγ复合物   VEGFR 2:Src   VEGFR-2/硫酸肝素复合物   VEGFR-2，VE-钙粘蛋白复合物
途径18 VEGFR 3   VEGFR 3磷酸
途径19 FGFR 1   FGFR 1磷酸
途径20 FGFR 2   FGFR 2磷酸
途径21 FGFR 3   FGFR 3磷酸
途径22 FGFR 4   FGFR4磷酸
途径23 TIE 1   TIE 1磷酸
途径24 TIE 2   TIE 2磷酸
途径25 EPHA   EPHA磷酸
途径26 EPHB   EPHB磷酸
途径27   NFkB-IkB复合物   磷酸-I B(S32)总IkB   总NFκB磷酸NFκB(S536)   总P65IkBa磷酸P65IkBa
途径28 ER 磷酸ER ER-AIB1   其它ER复合物
  途径29   PR   磷酸Pr   PR复合物
  途径30   Hedgehog途径
途径1 EGFR   EGFR磷酸   EGFRShc   EGFR泛素   EGFR-PI3K PTEN
  途径31   Wnt途径
途径32   Notch途径
途径33 总Mek磷酸Mek(S217/S221) 总Erk磷酸Erk(T202/Y204) 总Rsk-1磷酸Rsk-1(T357/S363)   总Stat3磷酸Stat-3(Y705)(S727)总Stat1磷酸Stat1(Y701) 磷酸Bad(S112)Bad(总) 总Fak磷酸Fak(Y576) 总cSrc磷酸cSrc(Y416) 总Ras磷酸Ras
  途径34   Akt(总)   磷酸Akt   磷酸Bad   磷酸Bad   Bad:14-3-3   总mTor   总   GSK3
  磷酸Akt(T473)   (T308)   (S112)Bad(总)   (S136)   复合物   磷酸mTor(S2448)   p70S6K磷酸p70S6K(T229)(T389)  β总(磷酸Ser9)
途径35 总Jnk磷酸Jnk(T183/Y185) 总P38磷酸P38(T180/Y182)   总Rb磷酸Rb(S249/T252)磷酸Rb(S780) 总p53磷酸p53(S392)磷酸p53(S20) 磷酸-CREB(S133)总CREB 总c-Jun磷酸-c-Jun；(S63)   总桩蛋白磷酸桩蛋白(Y118)
途径36 Ki67  切割的胱冬酶3，8，9其它
  途径37   TGFβ
在某些实施方式中，抗癌症药物包括抗-信号转导剂(即，细胞稳定药)，例如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗-增殖剂；化疗剂(即，细胞毒性药物)；放疗剂；疫苗；和/或能减少或消除异常细胞，例如癌性细胞的不受控生长的任何其它化合物。在一些实施方式中，联用抗-信号转导剂和/或抗-增殖剂与一种或多种化疗剂处理分离的循环细胞。
适用于本发明的抗-信号转导剂的例子包括但不限于：单克隆抗体，例如群司珠单抗(赫赛
Figure GPA00001061508400191
)、阿仑单抗
Figure GPA00001061508400192
贝伐单抗
Figure GPA00001061508400193
西妥昔单抗
Figure GPA00001061508400194
吉姆单抗
Figure GPA00001061508400195
帕尼妥莫单抗(VectibixTM)、利妥昔单抗
Figure GPA00001061508400196
和托西莫单抗
Figure GPA00001061508400197
酪氨酸激酶抑制剂，例如吉非替尼苏尼替尼
Figure GPA00001061508400199
埃洛替尼
Figure GPA000010615084001910
拉帕替尼(GW-572016)、卡那替尼(CI 1033)、塞玛昔尼(semaxinib)(SU5416)、瓦塔拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉芬尼(BAY 43-9006；)、甲磺酸伊马替尼
Figure GPA000010615084001912
来氟米特(SU101)、和凡达它尼(ZACTIMATM；ZD6474)；和它们的组合。
示范性抗-增殖剂包括mTOR抑制剂，例如西罗莫司(雷帕霉素)、他西络莫司(CCI-779)、和依维莫司(RAD001)；Akt抑制剂，例如1L6-羟甲基-手-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八烷基-sn-甘油碳酸酯、9-甲氧基-2-甲基依利醋铵(ellipticinium acetate)、1，3-二氢-1-(1-((4-(6-苯基-1H-咪唑并[4，5-g]喹噁啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮、10-(4′-(N-二乙基氨基)丁基)-2-氯吩噁嗪、3-甲酰基色酮缩氨基硫脲(Cu(II)Cl2复合物)、API-2，一种衍生自原癌基因TCL1的氨基酸10-24的15-聚体肽(Hiromura等，J.Biol.Chem.，279：53407-53418(2004))、KP372-1、和Kozikowski等，J.Am.Chem.Soc.，125：1144-1145(2003)及Kau等，Cancer Cell，4：463-476(2003)所述的化合物；和它们的组合。
化疗剂的非限制性例子包括基于铂的药物(例如，奥沙利铂、顺铂、碳铂、顺螺铂、异丙铂、沙铂等)、烷化剂(例如，环磷酰胺、异磷酰胺、瘤可宁、白消安、美法仑、氮芥、乌拉莫司汀、塞替派、亚硝(基)脲等)、抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨喋呤、亚叶酸、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨
Figure GPA00001061508400201
培美曲塞
Figure GPA00001061508400202
雷替曲塞等)、植物生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、鬼臼毒素、紫杉醇(紫杉
Figure GPA00001061508400203
)、多西他赛等)、拓扑异构酶抑制剂(例如，依立替康、托泊替康、安吖啶、依托泊苷(VP16)、磷酸依托泊苷、替尼泊苷等)、抗肿瘤抗生素(例如，阿霉素、亚德里亚霉素、柔红霉素、表柔比星、放线菌素、博莱霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)、它们在药学上可接受的盐、它们的立体异构体、它们的衍生物、它们的类似物和它们的组合。
本发明所用癌症疫苗的非限制性例子包括但不限于：活跃生物技术公司(Active Biotech)的ANYARA、西北生物治疗公司(NorthwestBiotherapeutics)的DCVax-LB、IDM药业公司(IDM Pharma)的EP-2101、法玛克萨公司(Pharmexa)的GV1001、伊德拉药物公司(Idera Pharmaceuticals)的IO-2055、英特拉金治疗公司(Introgen Therapeutics)的INGN 225和拜米拉/默克公司(Biomira/Merck)的Stimuvax。
放疗剂的例子包括但不限于：放射性核素，例如47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、11In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、和212Bi，任选结合于直接针对肿瘤抗原的抗体。
在一些实施方式中，捕捉抗体的各稀释系列包括捕捉抗体浓度降低的系列。在某些情况中，捕捉抗体连续稀释至少2-倍(例如，2、5、10、20、50、100、500或1000-倍)，从而产生包含一组(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)浓度降低的捕捉抗体稀释系列，将这些系列点样在阵列上。优选将各捕捉抗体稀释液的至少2、3、4、5或6个重复品点样在阵列上。
在其它实施方式中，固体支持物包括玻璃(例如，玻璃载玻片)、塑料、芯片、钉、滤膜、珠、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)，等)、纤维束或任何其它合适的基板。在优选的实施方式中，捕捉抗体局限(例如，通过共价或非共价相互作用)于包被了硝酸纤维素聚合物的玻璃载玻片上，例如可商品化购自新泽西州弗洛哈姆帕克市获特满公司(Whatman Inc.，Florham Park，NJ)的载玻片。
在一些实施方式中，细胞提取物包含实体瘤的循环细胞的提取物。通常采用本领域已知的一种或多种分离方法从患者样品分离循环细胞，所述方法包括，例如免疫磁性分离、CellTrackTM系统、微流体分离、FACS、密度梯度离心和消除法。
在其它实施方式中，患者样品包括全血、血清、血浆、痰、支气管灌洗液、尿液、乳头抽吸物、淋巴、唾液和/或细针抽吸物样品。在某些情况中，将全血样品分成血浆或血清组分和细胞组分(即，细胞沉淀)。细胞组分通常含有红细胞、白细胞和/或实体瘤的循环细胞，例如CTC、CEC、CEPC、淋巴结的扩散性肿瘤细胞和/或CSC和它们的组合。血浆或血清组分通常含有实体瘤的循环细胞所释放的核酸(例如，DNA、RNA)和蛋白质。
在一些情况中，可在与一种或多种感兴趣的抗癌症药物温育之前、期间或之后用一种或多种生长因子体外刺激分离的循环细胞。刺激性生长因子如上所述。在其它情况中，可以采用本领域已知的任何技术，例如在生长因子刺激和/或抗癌症药物处理后裂解分离的循环细胞，从而产生细胞提取物(例如，细胞裂解物)。优选在生长因子刺激后约1-360分钟之间，更优选在两个不同的时间间隔开始细胞裂解：(1)在生长因子刺激后约1-5分钟；和(2)在生长因子刺激后约30-180分钟之间。或者，可将裂解物保存于-80℃待用。
在优选的实施方式中，采用下述的单次检测或邻近双重检测试验检测肿瘤细胞，例如实体瘤的循环细胞中多种信号转导分子的表达和/或活化状态。
IV.抗体阵列的构建
在某些方面，采用局限在固体支持物上的捕捉抗体稀释系列的抗体阵列检测肿瘤细胞，例如实体瘤的循环细胞的细胞提取物中多种信号转导分子的活化状态。所述阵列通常包含具有一定浓度范围的偶连于固体支持物上不同可寻址位置的多种不同捕捉抗体。
所述固体支持物可包含任何适合固定蛋白质的基板。固体支持物的例子包括但不限于：玻璃(例如，玻璃载玻片)、塑料、芯片、钉、滤膜、珠、纸、膜、纤维束、凝胶、金属、陶瓷等。膜，例如(BiotransTM，加利福尼亚州科斯拉梅萨市ICN生物医学公司(ICN Biomedicals，Inc.，Costa Mesa，CA)；Zeta-
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加利福尼亚州赫拉克勒斯市的拜尔莱德公司(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA))、硝酸纤维素(新泽西州弗洛哈姆帕克市获特满公司)和PVDF(ImmobilonTM，马萨诸塞州比尔里卡市米丽波尔公司(Millipore Corp.，Billerica，MA))适合在本发明阵列中用作固体支持物。捕捉抗体优选局限于包被了硝酸纤维素聚合物的玻璃载玻片上，例如可商品化购自新泽西州弗洛哈姆帕克市获特满公司的载玻片。
固体支持物的理想特定方面包括结合大量捕捉抗体的能力和以最低变性结合捕捉抗体的能力。另一合适的方面是当含有捕捉抗体的抗体溶液施加于支持物时，所述固体支持物显示最低的“灯芯作用”。灯芯作用最低的固体支持物能将少量捕捉抗体溶液施加于该支持物，从而获得固定捕捉抗体的小而确定的斑点。
捕捉抗体一般通过共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)而直接或间接(例如，通过捕捉标签)局限于固体支持物上。在一些实施方式中，采用标准交联方法和条件，利用同双功能或异双功能交联剂将捕捉抗体共价连接于固体支持物。合适的交联剂可商品化购自零售商，例如伊利诺斯州洛克福特市皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnology，Rockford，IL)。
产生适用于本发明的阵列的方法包括但不限于：用于构建蛋白质或核酸阵列的任何技术。在一些实施方式中，利用微点样器将捕捉抗体点样于阵列上，所述点样器通常是装配有裂缝针、钝针或喷墨打印头的机器人打印机。打印本文所述抗体阵列的合适机器人系统包括加利福尼亚州爱尔文市笛卡尔技术公司(Cartesian Technologies；Irvine，CA)的PixSys 5000机器人，其装配有加利福尼亚州桑尼维尔市TC国际公司(TeleChem International；Sunnyvale，CA)的ChipMaker2裂缝针，以及可购自马萨诸塞州沃本市生物机器人公司(BioRobics，Woburn，MA)和康涅狄格州梅里登市帕卡德仪器公司(PackardInstrument Co.，Meriden，CT)的其它机器人打印机。优选将各捕捉抗体稀释液的至少2、3、4、5或6个重复品点样在阵列上。
产生适用于本发明的阵列的另一方法包括在将体积确定的液体有效吸在支持物上的条件下，通过使毛细管分配器接触固体支持物而将已知体积的捕捉抗体稀释液分散在选择的各阵列位置，其中利用选择的捕捉抗体稀释液在选择的各阵列位置重复该过程从而产生完整的阵列。可实施该方法从而形成多个这样的阵列，其中在每个重复轮次中，溶液沉积步骤应用于多个固体支持物中每一个的选择位置。这种方法的进一步描述可见。例如美国专利号5,807,522。
在某些情况中，可利用在纸上打印的装置产生抗体阵列。例如，可将所需的捕捉抗体稀释液加载入桌面喷墨打印机的打印头中，并打印在合适的固体支持物上(参见，例如Silzel等，Clin.Chem.，44：2036-2043(1998))。
在一些实施方式中，在固体支持物上产生的阵列的密度为至少约5个斑点/cm2，优选至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000、或10,000个斑点/cm2。
在某些情况中，固体支持物上的斑点各自代表不同的捕捉抗体。在某些其它情况中，固体支持物上的多个斑点代表相同的捕捉抗体，例如含有一系列浓度降低的捕捉抗体的稀释系列。
在固相支持物上制备和构建抗体阵列的方法的其它实例描述于美国专利号6,197,599、6,777,239、6,780,582、6,897,073、7,179,638和7,192,720；美国专利公布号20060115810、20060263837、20060292680和20070054326；和Varnum等，Methods Mol.Biol.，264：161-172(2004)。
扫描抗体阵列的方法是本领域已知的，包括但不限于用于扫描蛋白质或核酸阵列的任何技术。适用于本发明的微阵列扫描仪可购自马萨诸塞州波士顿的帕金埃尔默公司(PerkinElmer)、加利福尼亚州帕洛阿尔托市安捷仑技术公司(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)、华盛顿州伊萨夸的应用精确公司(Applied Precision，Issaquah，WA)、马萨诸塞州比尔里卡市的GSIL公司(GSILumonics Inc.，Billerica，MA)和加利福尼亚州联盟城的阿克桑仪器公司(Axon Instruments，Union City，CA)。用于荧光检测的GSI扫描阵列3000是非限制性例子，其可与ImaGene软件一起用于定量测定。
V.单次检测试验
在一些实施方式中，检测肿瘤细胞，例如实体瘤的循环细胞的细胞提取物中感兴趣特定分析物(例如，信号转导分子)的活化状态的试验是具有优秀动态范围的多重、高通量的双抗体试验。作为非限制性例子，用于所述试验的两种抗体可包括：(1)分析物的特异性捕捉抗体；和(2)分析物的活化形式的特异性检测抗体(即，活化状态依赖性抗体)。活化状态依赖性抗体能检测，例如分析物的磷酸化、遍在蛋白化和/或络合状态。或者，检测抗体包括不依赖于活化状态的抗体，其检测细胞提取物中分析物的总量。不依赖于活化状态的抗体通常能检测分析物的活化和未活化状态。
在优选的实施方式中，所述双-抗体试验包括：
(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多种稀释系列温育以形成多种被捕捉的分析物；
(ii)将所述多种被捕捉的分析物与相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体温育以形成多种可检测的被捕捉分析物；
(iii)将所述多种可检测的被捕捉分析物与信号放大配对的第一和第二成员温育以产生放大的信号；和
(iv)检测从所述信号放大配对的第一和第二成员产生的放大的信号。
本文所述双-抗体试验通常是包含具有一定浓度范围的多个不同捕捉抗体的抗体阵列，所述抗体偶联于固体支持物表面的不同可寻址位置。本发明所用合适固体支持物的例子如上所述。
就分析物结合而言，捕捉抗体和检测抗体的选择最好能尽量减少它们之间的竞争(即，捕捉和检测抗体可同时结合它们相应的信号转导分子)。
在一个实施方式中，检测抗体包括结合配对的第一成员(例如，生物素)，而信号放大配对的第一成员包括该结合配对的第二成员(例如，链霉亲和素)。可采用本领域熟知的方法将结合配对成员直接或间接偶联于检测抗体或信号放大配对非第一成员。在某些情况中，信号放大配对的第一成员是过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜曙红细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶等)，而信号放大配对的第二成员是酪酰胺(tyramide)试剂(例如，生物素-酪酰胺)。在这些例子中，过氧化物酶在有过氧化氢(H2O2)存在下氧化酪酰胺试剂产生活化的酪酰胺，从而产生放大的信号。
活化的酪酰胺可直接检测或在加入信号检测试剂，例如链霉亲和素标记的过氧化物酶和产色试剂后检测。适用于本发明的荧光团的例子包括但不限于：Alexa
Figure GPA00001061508400251
染料(例如，Alexa555)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM；罗丹明、德克萨斯红、异硫氰酸四罗丹明(tetrarhodamine isothiocynate)(TRITC)、CyDyeTM荧光素(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。可采用本领域熟知的方法将链霉亲和素标记直接或间接偶联于荧光团或过氧化物酶。适用于本发明的产色试剂的非限制性例子包括3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、3，3′-二氨基联苯胺(DAB)、2，2′-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、4-氯-1-萘酚(napthol)(4CN)和/或卟啉原。
实施本文所述双-抗体试验的示范性方案见实施例3。
在另一实施方式中，本发明提供实施上述双-抗体试验的试剂盒，其包含：(a)局限在固体支持物上的多种捕捉抗体的稀释系列；和(b)多种检测抗体(例如，不依赖活化状态的抗体和/或活化状态依赖性抗体)。在一些实例中，所述试剂盒还可含有利用该试剂盒检测实体瘤的循环细胞的多个信号转导分子的活化状态的使用说明书。就实施本发明的特定方法而言，所述试剂盒还可含有上述任何额外试剂，例如信号放大配对的第一和第二成员、酪酰胺信号放大试剂、洗涤缓冲液等。
VI.邻近双重检测试验
在一些实施方式中，检测肿瘤细胞，例如实体瘤的循环细胞的细胞提取物中感兴趣特定分析物(例如，信号转导分子)的活化状态的试验是具有优秀动态范围的多重高通量邻近(即，三-抗体)试验。作为非限制性例子，用于邻近试验的三种抗体可包括：(1)分析物的特异性捕捉抗体；(2)分析物的活化形式的特异性检测抗体(即，活化状态依赖性抗体)；和(3)检测分析物总量的检测抗体(即，不依赖活化状态的抗体)。活化状态依赖性抗体能检测，例如分析物的磷酸化、遍在蛋白化和/或络合状态。活化状态依赖性抗体通常能检测活化和未活化形式的分析物。
在优选的实施方式中，所述邻近试验包括：
(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多种稀释系列温育以形成多种被捕捉分析物；
(ii)将所述多种被捕捉分析物与检测抗体温育以形成多种可检测的被捕捉分析物，所述检测抗体包含多种不依赖活化状态的抗体和多种相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体，
其中所述不依赖活化状态的抗体用辅助部分标记，活化状态依赖性抗体用信号放大配对的第一成员标记，所述辅助部分产生导向信号放大配对的第一成员并与之反应的氧化剂；
(iii)将所述多种可检测的被捕捉分析物与信号放大配对的第二成员温育以产生放大的信号；和
(iv)检测从所述信号放大配对的第一和第二成员产生的放大的信号。
或者，可用辅助部分标记活化状态依赖性抗体，而用信号放大配对的第一成员标记不依赖活化状态的抗体。
本文所述的邻近试验通常是包含具有一定浓度范围的多种不同捕捉抗体的抗体阵列，所述抗体偶联于固体支持物表面的不同可寻址位置。本发明所用合适固体支持物的例子如上所述。
就分析物结合而言，捕捉抗体、不依赖活化状态的抗体和活化状态依赖性抗体的选择最好能尽量减少它们之间的竞争(即，所有抗体可同时结合它们相应的信号转导分子)。
在一些实施方式中，不依赖活化状态的抗体还包含可检测部分。在这种例子中，可检测部分的用量与细胞提取物中一种或多种分析物的含量相关。可检测部分的例子包括但不限于：荧光标记、化学反应活性标记、酶标记、放射性标记等。可检测标记优选是荧光团，例如Alexa
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染料(例如，Alexa
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647)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM；罗丹明、德克萨斯红、异硫氰酸四罗丹明(TRITC)、CyDyeTM荧光素(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。可采用本领域熟知的方法将可检测部分直接或间接偶联于不依赖活化状态的抗体。
在某些例子中，用辅助部分直接标记不依赖活化状态的抗体。可采用本领域熟知的方法将辅助部分偶联于不依赖活化状态的抗体。本发明所用的合适辅助部分包括能产生导向(即，引向)辅助部分附近(即，空间上接近或邻近)的另一分子并与之反应(即，结合、被结合或与之形成复合物)的氧化剂的任何分子。辅助部分的例子包括但不限于：酶，例如葡萄糖氧合酶或催化涉及分子氧(O2)作为电子接受体的氧化/还原反应的任何其它酶，和光敏剂，例如亚甲蓝、玫瑰红、卟啉类、四方酸(squarate)染料、酞菁类等。氧化剂的非限制性例子包括过氧化氢(H2O2)、单态氧和在氧化/还原反应中传递氧原子或获得电子的任何其它化合物。优选地，当两个部分彼此接近时，辅助部分(例如，葡萄糖氧合酶、光敏剂等)在有合适底物(例如，葡萄糖、光)存在下产生导向信号放大配对的第一成员(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、由保护基团保护的半抗原、通过硫醚与酶抑制剂连接而灭活的酶)并与之反应的氧化剂(例如，过氧化氢(H2O2)、单态氧等)。
在某些其它例子中，不依赖活化状态的抗体通过结合于不依赖活化状态的抗体的寡核苷酸接头与结合于辅助部分的互补寡核苷酸接头之间的杂交而用辅助部分作间接标记。可采用本领域熟知的方法将寡核苷酸接头偶联于辅助部分或不依赖活化状态的抗体。在一些实施方式中，结合于辅助部分的寡核苷酸接头与结合于不依赖活化状态的抗体的寡核苷酸接头100％互补。在其它实施方式中，例如在严格杂交条件下杂交后，寡核苷酸接头配对包含至少1、2、3、4、5、6或更多个错配区域。本领域技术人员应知道可将不同分析物的特异性不依赖活化状态的抗体结合于同一寡核苷酸接头或不同寡核苷酸接头。
结合于辅助部分或不依赖活化状态的抗体的寡核苷酸接头的长度可以不同。接头序列通常至少长约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、或100个核苷酸。通常产生随机核酸序列以供偶连。作为非限制性例子，可将寡核苷酸接头文库设计成具有三个不同的毗连结构域：间隔结构域；签名结构域；和结合结构域。优选将寡核苷酸接头设计成能有效偶连而不破坏要与之结合的辅助部分或不依赖活化状态的抗体的功能。
可将寡核苷酸接头序列设计成能防止或尽量降低在各种试验条件下的任何二级结构形成。通常小心监测接头内各区段的解链温度以使得它们参与整个试验过程。接头序列区段的解链温度范围通常介于1-10℃之间。测定确定离子浓度下的解链温度、二级结构和发夹结构的计算机算法(例如，OLIGO 6.0)可用于分析各接头内各三种不同结构域。还可分析总的组合序列的结构特征和它们与其它结合的寡核苷酸接头序列的相容性，例如，它们是否会在严格杂交条件下与互补寡核苷酸接头杂交。
寡核苷酸接头的间隔区域充分隔开结合结构域与寡核苷酸交联位点。结合结构域起到通过核酸杂交将互补寡核苷酸接头序列标记的分子连接于结合结构域的作用。可在抗体-分析物(即，抗原)复合物形成前或后进行核酸介导的杂交，从而提供更灵活的试验形式。与许多直接抗体结合方法不同，将较小寡核苷酸连接于抗体或其它分子对抗体与其靶分析物的特异性亲和力，或结合分子的功能的影响最低。
在一些实施方式中，寡核苷酸接头的签名序列(signature sequence)结构域可用于复杂的多重蛋白质试验中。可将多种抗体结合与含不同签名序列的寡核苷酸接头。在多重免疫测定中，用合适探针标记的报道寡核苷酸序列可用于检测多重试验形式中抗体与其抗原之间的交叉反应性。
可采用几种不同的方法将寡核苷酸接头结合于抗体或其它分子。例如，可以合成在5’或3’端含巯基的寡核苷酸接头。可利用还原剂(例如，TCEP-HCl)使巯基脱保护，可利用脱盐自旋柱(desalting spin column)纯化得到的接头。可利用异双功能交联接头，例如SMCC将得到的脱保护寡核苷酸接头结合于抗体或其它类型蛋白质的伯胺。或者，可用水溶性碳二亚胺EDC处理寡核苷酸上的5’-磷酸基团以形成磷酸酯，随后将其偶联于含胺的分子。在某些例子，可将3’-核糖残基上的二醇氧化成醛基，然后采用还原胺化将其结合于抗体或其它类型蛋白质上的胺基。在某些其它实施方式中，可将寡核苷酸接头合成为在3’或5’端具有生物素修饰，并结合于链霉亲和素标记的分子。
可采用本领域已知，例如以下所述的那些技术合成寡核苷酸接头：Usman等，J.Am.Chem.Soc.，109：7845(1987)；Scaringe等，Nucl.Acids Res.，18：5433(1990)；Wincott等，Nucl.Acids Res.，23：2677-2684(1995)；和Wincott等，Methods Mol.Bio.，74：59(1997)。寡核苷酸的合成通常利用常规核酸保护和偶连基团，例如5’-端的二甲氧基三苯甲基和3’-端的亚磷酰胺。本领域技术人员已知寡核苷酸合成的合适试剂、核酸脱保护的方法和核酸纯化的方法。
在某些例子中，用信号放大配对的第一成员直接标记活化状态-依赖性抗体。可采用本领域熟知的方法将信号放大配对成员偶联于活化状态依赖性抗体。在某些其它例子中，可通过结合于活化状态-依赖性抗体的结合配对的第一成员与结合于信号放大配对第一成员的结合配对的第二成员之间的结合作用，用信号放大配对的第一成员间接标记活化状态-依赖性抗体。可采用本领域熟知的方法将结合配对成员(例如，生物素/链霉亲和素)偶联于信号放大配对成员或活化状态-依赖性抗体。信号放大配对成员的例子包括但不限于：过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜曙红细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶，等。信号放大配对成员的其它例子包括受保护基团保护的半抗原和通过硫醚与酶抑制剂连接而灭活的酶。
在邻近传送(proximity channeling)的一个例子中，辅助部分是葡萄糖氧合酶(GO)，信号放大配对的第一成员是辣根过氧化物酶(HRP)。当GO与底物，例如葡萄糖接触时，其产生氧化剂(即，过氧化氢(H2O2))。如果HRP的位置在GO附近，GO产生的H2O2传送给HRP与之形成HRP-H2O2复合物，在有信号放大配对的第二成员(例如，化学发光底物，如氨基苯二酰肼或异氨基苯二酰肼或荧光底物，如酪酰胺(例如，生物素-酪酰胺)、高香草酸或4-羟苯基乙酸)存在下，其产生放大的信号。在邻近试验中利用GO和HRP的方法描述于，例如Langry等，美国能源部第UCRL-ID-136797号报道(1999)。当生物素-酪酰胺用作信号放大配对的第二成员时，HRP-H2O2复合物氧化酪酰胺以产生共价结合附近的亲核残基的反应活性酪酰胺基团。活化的酪酰胺可直接检测或在加入信号检测试剂，例如链霉亲和素-标记的荧光团或链霉亲和素-标记的过氧化物酶和产色试剂的组合后检测。适用于本发明的荧光团的例子包括但不限于：Alexa
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染料(例如，Alexa
Figure GPA00001061508400302
555)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM；罗丹明、德克萨斯红、异硫氰酸四罗丹明(TRITC)、CyDyeTM荧光素(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。可采用本领域熟知的方法将链霉亲和素标记直接或间接偶联于荧光团或过氧化物酶。适用于本发明的产色试剂的非限制性例子包括3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、3，3′-二氨基联苯胺(DAB)、2，2′-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、4-氯-1-萘酚(4CN)和/或卟啉原。
在邻近传送的另一例子中，辅助部分是光敏剂，信号放大配对的第一成员是用多种半抗原标记的大分子，这些半抗原用保护基团保护以防止半抗原与特异性结合伴侣(例如，配体、抗体等)结合。例如，信号放大配对成员可以是用受保护的生物素、香豆素和/或荧光分子标记的葡聚糖。合适的保护基团包括但不限于：苯氧基-、analino-、烯烃-、硫醚-和烯醚-保护基团。适用于本发明邻近试验的其它光敏剂和受保护的半抗原分子描述于美国专利号5,807,675。当用光激发光敏剂时，其产生氧化剂(即，单态氧)。如果半抗原分子的位置在光敏剂附近，光敏剂产生的单态氧传送给半抗原保护基团上的硫醚并与之反应从而产生羰基(酮或醛)和亚磺酸，释放半抗原的保护基团。然后，未保护的半抗原可特异性结合信号放大配对的第二成员(例如，能产生可检测信号的特异性结合伴侣)。例如，当半抗原是生物素时，特异性结合伴侣可以是酶标记的链霉亲和素。示范性酶包括碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、HRP等。洗涤除去未结合的试剂后，可通过加入酶的可检测(例如，荧光、化学发光、产色等)底物来产生可检测信号并采用合适方法及本领域已知的仪器进行检测。或者，可采用酪酰胺信号放大方法放大可检测信号，活化的酪酰胺可直接检测或在加入上述信号检测试剂后检测。
在邻近传送的还有另一例子中，辅助部分是光敏剂，信号放大配对的第一成员是酶-抑制剂复合物。酶和抑制剂(例如，膦酸标记的葡聚糖)通过可切割接头(例如，硫醚)相连。当用光激发光敏剂时，其产生氧化剂(即，单态氧)。如果酶-抑制剂复合物的位置在光敏剂附近，光敏剂产生的单态氧与可切割接头沟通并与之反应从而释放酶的抑制剂，进而活化该酶。加入酶底物以产生可检测信号，或者加入放大试剂以产生放大信号。
在邻近传送的进一步例子中，辅助部分是HRP，信号放大配对的第一成员是上述受保护的半抗原或酶-抑制剂复合物，保护基团包括对-烷氧基苯酚。加入苯二胺和H2O2产生的反应活性苯二胺传送给受保护的半抗原或酶-抑制剂复合物并与对-烷氧基苯酚保护基团反应产生暴露的半抗原或反应活性酶。如上所述产生并检测放大的信号(参见，例如美国专利号5,532,138和5,445,944)。
进行本文所述邻近试验的示范性方案见实施例4。
在另一实施方式中，本发明提供进行上述邻近试验的试剂盒，其装有：(a)局限于固体支持物上的多种捕捉抗体的稀释系列；和(b)多种检测抗体(例如，不依赖活化状态的抗体和活化状态依赖性抗体)。在一些例子中，所述试剂盒还可装有利用所述试剂盒检测实体瘤的循环细胞的多种信号转导分子的活化状态的使用说明书。所述试剂盒还可装有实施本发明具体方法的任何上述额外试剂，例如信号放大配对的第一和第二成员、酪酰胺信号放大试剂、辅助部分的底物、洗涤缓冲液，等。
VII.抗体的产生
可采用几种方法产生和选择尚未能商品化购得的抗体以供根据本发明分析肿瘤细胞，例如稀少循环细胞中信号转导分子的活化状态。例如，一种方法是采用本领域已知的表达和纯化方法来表达和/或纯化感兴趣多肽(即，抗原)，而另一种方法是采用本领域已知的固相肽合成方法来合成感兴趣的多肽。参见，例如Guide to Protein Purification(蛋白质纯化指南)，MurrayP.Deutcher编，Meth.Enzymol.，第182卷(1990)；Solid Phase PeptideSynthesis(固相肽合成)，Greg B.Fields编，Meth.Enzymol.，第289卷(1997)；Kiso等，Chem.Pharm.Bull.，38：1192-99(1990)；Mostafavi等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1：255-60，(1995)；和Fujiwara等，Chem.Pharm.Bull.，44：1326-31(1996)。然后可将纯化或合成的多肽注射入，例如小鼠或家兔中，从而产生多克隆或单克隆抗体。本领域技术人员应知道可用许多方法制备抗体，例如Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Harlow和Lane编，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，(1988)所述的。本领域技术人员还应知道还可通过各种方法从遗传信息制备模拟(例如，保留功能性结合区)抗体的结合片段或Fab片段。参见，例如Antibody Engineering：A PracticalApproach(抗体工程改造：实用性方法)，Borrebaeck编，牛津大学出版社，牛津(1995)；和Huse等，J.Immunol.，149：3914-3920(1992)。
此外，许多出版物报道了利用噬菌体展示技术产生和筛选结合所选靶抗原的多肽文库(参见，例如Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378-6382(1990)；Devlin等，Science，249：404-406(1990)；Scott等，Science，249：386-388(1990)；和Ladner等，美国专利号5,571,698)。噬菌体展示方法的基本概念是在噬菌体DNA编码的多肽和靶抗原之间建立物理关联。这种物理关联由噬菌体颗粒提供，其展示作为衣壳一部分的多肽，而该衣壳将编码该多肽的噬菌体基因组包裹在内。在多肽和它们的遗传材料之间建立物理关联能同时大规模筛选携带不同多肽的非常大量的噬菌体。展示对靶抗原具有亲和力的多肽的噬菌体结合该靶抗原，通过对靶抗原的亲和力筛选富集这些噬菌体。可从这些噬菌体各自的基因组测定它们所展示多肽的身份。采用这些方法，随后可通过常规方式大量合成经鉴定对所需靶抗原具有结合亲和力的多肽(参见，例如美国专利号6,057,098)。
然后可通过针对感兴趣的纯化多肽抗原的亲和力和特异性的第一筛选以及比较(如果需要)抗体与不需要结合的其它多肽抗原的亲和力和特异性来选择这些方法产生的抗体。筛选方法可涉及将纯化的多肽抗原固定在微量滴定板不同的孔中。然后将含有潜在抗体或抗体组的溶液替换入各自的微量滴定板孔中，并温育约30分钟到2小时。然后洗涤微量滴定板孔，将标记的二抗(例如，结合于碱性磷酸酶的抗-小鼠抗体，如果产生的抗体是小鼠抗体的话)加入各孔并温育约30分钟，然后洗涤。将底物加入各孔，固定的多肽抗原的抗体存在之处显示颜色反应。
然后进一步分析如此鉴定的抗体的亲和力和特异性。在靶蛋白质免疫测定的开发中，纯化的靶蛋白质用作标准品，用其判断利用所选择的抗体的免疫测定的灵敏度和特异性。由于各种抗体的结合亲和力可能不同，例如某些抗体组合可能在空间上彼此干扰，抗体的试验性能可能是比该抗体的绝对亲和力和特异性更重要的量度。
本领域技术人员应知道可采用许多方法制备抗体或结合片段，并筛选和选择其于各种感兴趣多肽的亲和力和特异性，但这些方法不改变本发明的范围。
A.多克隆抗体
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射感兴趣的多肽和佐剂在动物中产生多克隆抗体。利用双功能或衍生试剂将感兴趣的多肽与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质运载体，例如匙孔
Figure GPA00001061508400331
血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂结合可能是有用的。双功能或衍生试剂的非限制性例子包括马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基结合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2和R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基。
通过混合，例如100μg(对于家兔)或5μg(对于小鼠)抗原或偶联抗原与3体积完全弗氏佐剂并将该溶液在多个部位真皮下注射，从而用感兴趣多肽或其免疫原性偶联物或衍生物免疫动物。一个月后，通过在多个部位用约1/5到1/10原始体积的不完全弗氏佐剂配制的多肽或偶联物进行皮下注射来加强动物。7-14天后，对动物采血，检验血清的抗体滴度。通常加强动物直至滴度升高至平台。优选用相同多肽的偶联物加强动物，但也可采用与不同免疫原性蛋白质缀合和/或通过不同的交联剂偶联。还可在重组细胞培养物中将偶联物制备成融合蛋白。在某些例子中，凝聚剂，例如明矾可用于增强免疫应答。
B.单克隆抗体
通常从基本上均质的抗体群体获得单克隆抗体，即，除了可能存在极少量的可能天然产生的突变外，构成该群体的各抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表明该抗体的性质不是不同抗体的混合物。例如，可采用Kohler等(Nature，256：495(1975))所述的杂交瘤方法或本领域已知的任何重组DNA方法(参见，例如美国专利号4,816,567)制备单克隆抗体。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物(例如，仓鼠)以激发产生或能产生特异性结合免疫所用感兴趣多肽的抗体的淋巴细胞。或者，体外免疫淋巴细胞。然后利用合适的融合剂，例如聚乙二醇将免疫的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(参见，例如Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实施)，学术出版社(Academic Press)，第59-103页(1986))。将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，杂交瘤细胞的培养基通常含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)以防止HGPRT-缺陷型细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是有效融合、支持选择的抗体产生细胞稳定而高水平地产生抗体和/或对诸如HAT培养基等培养基敏感的那些细胞。产生人单克隆抗体的这种优选骨髓瘤细胞系的例子包括但不限于：小鼠骨髓瘤谱系，例如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些(得自加利福尼亚州圣迭戈索尔克研究院细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center；San Diego，CA))、SP-2或X63-Ag8-653细胞(得自马里兰州罗克维尔的美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection；Rockville，MD))、和人骨髓瘤或小鼠-人异质骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系(参见，例如Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；和Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications(单克隆抗体制备技术和应用)，MD公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约，第51-63页(1987))。
检验培养杂交瘤细胞的培养基中产生的针对感兴趣多肽的单克隆抗体。优选通过免疫沉淀或体外结合试验，例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。可采用，例如Munson等(Anal.Biochem.，107：220(1980))的Scatchard分析测定单克隆抗体的结合亲和力。
杂交瘤细胞鉴定为产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体后，可通过有限稀释方法亚克隆诸克隆并通过标准方法培养(参见，例如Goding，单克隆抗体：原理和实践，学术出版社，第59-103页(1986))。用于该目的的合适培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物中体内生长成腹水肿瘤。可通过常规抗体纯化方法，例如A蛋白-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基、腹水或血清中分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
不难采用常规方法(例如，利用能特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后转染入不会产抗体的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，从而诱导重组宿主细胞合成单克隆抗体。参见，例如Skerra等，Curr.Opin.Immunol.，5：256-262(1993)；和Pluckthun，Immunol Rev.，130：151-188(1992)。还可通过，例如用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列(参见，例如美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列共价连接于免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。
在进一步的实施方式中，可从采用以下文献描述的技术产生的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗体片段，例如McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)；Clackson等，Nature，352：624-628(1991)；和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)。通过链改组产生高亲和力(nM范围)人单克隆抗体描述于Marks等，BioTechnology，10：779-783(1992)。采用组合感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的方案描述于Waterhouse等，Nuc.AcidsRes.，21：2265-2266(1993)。因此，这些技术是产生单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤方法的可行备选方案。
C.人源化抗体
人源化非人抗体的方法是本领域已知的。人源化抗体优选引入了非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。基本上通过用非人抗体的超变区序列取代人抗体的相应序列进行人源化。参见，例如Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；和Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)。因此，这种“人源化”抗体是嵌合型抗体(参见，例如美国专利号4,816,567)，其中基本上短于完整的人可变区被非人种类的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些超变区残基和可能的一些框架区(FR)残基被啮齿类抗体的类似部位残基取代的人抗体。
选择用于制备本文所述人源化抗体的人轻链和重链可变区是降低抗原性重点考虑的问题。根据所谓的“最佳-拟合”方法，对已知人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变区序列。然后，认可最接近啮齿类序列的人序列为人源化抗体的人FR(参见，例如Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；和Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一方法利用衍生自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定FR。相同的FR可用于几种不同的人源化抗体(参见，例如Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。
人源化的抗体保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性也是重要的。为实现此目的，可利用亲代和人源化序列的三维模型，通过分析亲代序列和各种概念人源化产物的方法制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型，这些模型是本领域技术人员熟悉的。可获得阐明和显示所选择候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示结果能分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。以此方式，可从受者和输入序列选择FR残基，并组合，从而实现所需的抗体性质，例如对靶抗原的亲和力增加。超变区残基通常直接或特异性地影响抗原结合。
本发明考虑了各种形式的人源化抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，例如Fab片段。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，例如完整的IgA、IgG或IgM抗体。
D.人抗体
作为人源化的备选方案，可产生人抗体。在一些实施方式中，可产生转基因动物(例如，小鼠)，免疫后其能在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完全的人抗体库。例如，已有报道说嵌合型和种系突变型小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失完全抑制了内源性抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移入这种种系突变型小鼠将导致在抗原刺激后产生人抗体。参见，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immun.，7：33(1993)；和美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，可采用噬菌体展示技术(参见，例如McCafferty等，Nature，348：552-553(1990))，利用未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)区基因库在体外产生人抗体和抗体片段。按照该技术，将抗体V结构域基因框内克隆入丝状噬菌体，例如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒的表面上展示为功能抗体片段。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体的功能特性进行选择还可选择编码显示那些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。可以各种形式进行噬菌体展示，如Johnson等(Curr.Opin.Struct.Biol.，3：564-571(1993))所述。一些来源的V-基因区段可用于噬菌体展示。参见，例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)。可构建未免疫人供者的V基因库，基本上可按照下述技术分离针对不同抗原阵列(包括自体抗原)的抗体：Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Griffith等，EMBO J.，12：725-734(1993)；和美国专利号5,565,332和5,573,905。
在某些例子中，可如美国专利号5,567,610和5,229,275所述通过体外活化的B细胞产生人抗体。
E.抗体片段
现已开发了各种技术产生抗体片段。这些片段通常由蛋白水解消化完整的抗体而获得(参见，例如Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Meth.，24：107-117(1992)；和Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，目前可利用重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌细胞直接回收Fab’-SH片段并将其化学偶联以形成F(ab′)2片段(参见，例如Carter等，BioTechnology，10：163-167(1992))。按照另一方法，可从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab′)2片段。本领域技术人员知道产生抗体片段的其它技术。在其它实施方式中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见，例如PCT公布号WO 93/16185；和美国专利号5,571,894及5,587,458。抗体片段还可以是如美国专利号5,641,870所述的线形抗体。这种线形抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
F.双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同的表位具有结合特异性的抗体。示范性双特异性抗体可结合同一感兴趣多肽的两个不同表位。其它双特异性抗体可组合了感兴趣多肽的结合位点与一种或多种其它抗原的结合位点。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。
本领域已知制备双特异性抗体的方法。全长双特异性抗体的传统制备方法基于共同表达两个免疫球蛋白重链-轻链配对，其中该两条链具有不同特异性(参见，例如Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常采用亲和层析纯化正确的分子。PCT公布号WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中描述了类似的方法。
按照不同的方法，具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)融合于免疫球蛋白恒定区序列。优选与免疫球蛋白重链恒定区进行融合，从而包含CH2和CH3区、绞链区的至少一部分。优选在至少一种融合物中存在含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入不同表达载体，共同转染入合适的宿主生物。在利用不同比例的这三种多肽链进行构建以提供最佳产量的实施方式中，如此操作为调节这三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，当相同比例的至少两种多肽链的表达导致高产量或当这些比例没有特别意义时，可能将两种或全部三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
在该方法的优选实施方式中，构成双特异性抗体的一条臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链，另一臂为杂交免疫球蛋白重链-轻链配对(提供第二结合特异性)。这种不对称的结构有助于分开所需双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合，因为只在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了方便的分离方法。参见，例如PCT公布号WO 94/04690和Suresh等，Meth.Enzymol.，121：210(1986)。
按照美国专利号5,731,168所述的另一方法，可工程改造一对抗体分子之间的界面以尽可能提高从重组细胞培养物中回收的异源二聚体百分比。优选的界面包括抗体恒定区的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大的在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这为提高异质二聚体的产量超过其它不良终产物，例如同质二聚体提供了机制。
双特异性抗体包括交联的或“异质偶联”抗体。例如，异质偶联物中的抗体之一可偶联于亲和素，另一种看偶联于生物素。可采用方便的交联方法制备异质偶联物抗体。合适的交联剂和技术是本领域熟知的，其描述于，例如美国专利号4,676,980。
本领域还知道从抗体片段产生双特异性抗体的合适技术。例如，可采用化学连接制备双特异性抗体。在某些例子中，可通过将完整抗体蛋白水解切割以产生F(ab′)2片段的方法产生双特异性抗体(参见，例如Brennan等，Science，229：81(1985))。在有二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下还原这些片段以稳定邻近的二硫醇并阻止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab’片段转变成巯基硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。然后通过巯基乙胺还原将Fab’-TNB衍生物之一再转变成Fab’-硫醇，并与等摩尔量的另一Fab’-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。
在一些实施方式中，可从大肠杆菌中直接回收Fab’-SH片段，将其化学偶联以形成双特异性抗体。例如，可通过Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)所述的方法制备完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子。各Fab’片段分别从大肠杆菌细胞分泌，对其进行体外化学偶连以形成双特异性抗体。
从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已描述。例如，现已利用亮氨酸拉链制备了双特异性抗体。参见，例如Kostelny等，J.Immunol.，148：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接于两种不同抗体的Fab’部分。在绞链区还原该抗体同质二聚体从而形成单体，然后将之再氧化以形成抗体异质二聚体。该方法还可用于产生抗体二聚体。Hollinger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))所述的“二抗体(diabody)”技术为制备双特异性抗体片段提供了其它机制。这些片段包含通过接头与轻链可变区相连的重链可变区(VH)，所述接头太短从而不能在同一链的两个结构域之间形成配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一方案描述于Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。
还考虑了两价以上的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。参见，例如Tutt等，J.Immunol.，147：60(1991)。
G.抗体纯化
当采用重组技术时，抗体可在分离的宿主细胞内、宿主细胞的周质空间中产生，或从宿主细胞直接分泌到培养基中。如果抗体在胞内产生，首先通过，例如离心或超滤除去颗粒物碎片。Carter等(BioTech.，10：163-167(1992))描述了分泌入大肠杆菌周质空间中的抗体的分离方法。简言之，在有乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)存在下，将细胞糊(cell paste)融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。当抗体分泌入培养基时，通常利用可商品化购得的蛋白质浓缩过滤器，例如阿米康(Amicon)或MP超滤单元(Millipore Pellicon ultrafiltration unit)浓缩这种表达系统的上清液。前述任一步骤中可包含蛋白酶抑制剂，例如PMSF来抑制蛋白水解，还可包含抗生素来防止外来污染物的生长。
可采用，例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析纯化从细胞制备的抗体组合物。A蛋白作为亲和配体是否合适取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。可利用A蛋白纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见，例如Lindmark等，J.Immunol.Meth.，62：1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人γ3，推荐G蛋白(参见，例如Guss等，EMBO J.，5：1567-1575(1986))。连接亲和配体的基质多为琼脂糖，但其它基质也可用。与琼脂糖相比，机械上稳定的基质，例如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯的流速较快和加工时间较短。如果抗体包含CH3结构域，新泽西州菲利浦斯勃格市JTB公司(J.T.Baker；Phillipsburg，N.J.)的Bakerbond ABXTM树脂可用于纯化。根据待回收的抗体，还可采用蛋白质纯化的其它技术，例如用离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅层析、肝素SEPHAROSETM层析、阴离子或阳离子交换树脂(例如，聚天冬氨酸柱)层析、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
任何初步纯化步骤后，可利用pH介于约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液对包含感兴趣抗体和污染物的混合物施以低pH疏水相互作用层析，优选在低盐浓度下(例如，约0-0.25M盐)进行。
本领域技术人员应知道具有与抗体相似功能的任何结合分子，例如样品中一种或多种感兴趣分析物的特异性结合分子或结合伴侣也可用于本发明方法和组合物中。合适的抗体-样分子的例子包括但不限于：结构域抗体(domain antibody)、单片式抗体(unibody)、纳米抗体(nanobody)、鲨抗原反应活性蛋白质(shark antigen reactive protein)、埃微末(avimers)、阿德耐汀(adnectins)、抗静(anticalms)、亲和配体、菲勒末(phylomers)、适体、埃飞体(affibodies)、特里耐汀(trinectins)等。
VIII.给药方法
按照本发明方法，通过本领域已知的任何便利方法将本文所述的抗癌症药物给予对象。可采用本发明方法为治疗对象的肿瘤(例如，肺肿瘤)选择合适抗癌症药物或抗癌症药物组合。此外，本发明方法可用于选择具有肿瘤(例如，肺肿瘤)的对象，该对象是用抗癌症药物或抗癌症药物组合治疗的合适候选对象。本发明方法还可用于鉴定对象中肿瘤(例如，肺肿瘤)对抗癌症药物或抗癌症药物组合治疗的反应。此外，可采用本发明方法预测具有肿瘤(例如，肺肿瘤)的对象对抗癌症药物或抗癌症药物组合治疗的反应。本领域技术人员应知道本文所述的抗癌症药物可单独给予或作为组合治疗方法的一部分与常规化疗、放疗、激素治疗、免疫治疗和/或外科手术一起给予。
在某些实施方式中，抗癌症药物包括抗信号转导剂(即，细胞稳定药)，例如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗-增殖剂；化疗剂(即，细胞毒性药物)；放疗剂；疫苗；和/或能减少或消除异常细胞，例如癌性细胞的不受控生长的任何其它化合物。在一些实施方式中，联用抗-信号转导剂和/或抗-增殖剂与一种或多种化疗剂治疗对象。示范性单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、抗-增殖剂、化疗剂、放疗剂和疫苗如上所述。
本文所述抗癌症药物还可与常规激素疗剂，包括但不限于类固醇(例如，地塞米松)、非那司提、芳香酶抑制剂、他莫昔芬和促性腺激素释放激素激动剂(GnRH)，例如戈舍瑞林共同给予。
此外，本文所述抗癌症药物还可与常规免疫治疗剂共同给予，所述免疫治疗剂包括但不限于：免疫兴奋剂(例如，卡介苗(BCG)、左旋咪唑、白介素-2、α-干扰素等)、免疫毒素(例如，抗-CD33单克隆抗体-刺孢霉素偶联物、抗-CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素偶联物等)、和放射性免疫治疗剂(例如，与111In、90Y或131I偶联的抗-CD20单克隆抗体等)。
抗癌症药物可视需要与合适的药物赋形剂一起给予，可通过任何接受的给药方式进行。因此，给药可以是，例如口服、口腔含化、舌下、经牙龈、经上颚、静脉内、局部、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内、胃肠外、小动脉内、真皮内、心室内、颅内、腹膜内、膀胱内、鞘内、病损内、鼻内、经直肠、经阴道、或通过吸入。“共同-给予”表示在给予第二药物(例如，另一种抗癌症药物、用于减轻抗癌症药物副作用的药物、放疗剂、激素治疗剂、免疫治疗剂等)的同时，或恰在之前或恰在之后给予抗癌症药物。
可反复给予治疗有效量的抗癌症药物，例如至少2、3、4、5、6、7、8或更多次，或者可通过连续输注给予该剂量。剂型可采取固体、半固体、冻干粉末或液体剂型，例如片剂、丸剂、小药丸、胶囊、粉末、溶液、混悬液、乳液、栓剂、驻留灌肠剂(retention enemas)、乳膏、软膏、洗剂、凝胶、气溶胶、泡沫等，优选适于单次给予精确剂量的单位剂型。
本文所用的术语“单位剂型”包括适合用作人对象和其它哺乳动物的单位剂量的物理上离散的单位，各单位含有经计算能产生所需起效、耐受性和/或疗效的预定量抗癌症药物，连同合适的药物赋形剂(例如，安瓿)。此外，可制备更浓缩的剂型，然后可从中制备更稀释的单位剂型。因此，更浓缩的剂型可含有基本上多于，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍的抗癌症药物用量。
本领域技术人员已知制备这种剂型的方法(参见，例如REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿药物科学)，第18版，马克出版公司(MackPublishing Co.)，伊斯顿(Easton)，宾夕法尼州(1990))。剂型通常包含常规药物运载体或赋形剂，还可包含其它医学制剂、运载体、佐剂、稀释剂、组织渗透增强剂、增溶剂等。可通过本领域熟知的方法改进合适的赋形剂以适合聚体剂型和给药途径(参见，例如雷明顿药物科学，同上)。
合适赋形剂的例子包括但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和聚丙烯酸，例如卡巴浦尔(Carbopol)，如卡巴浦尔941、卡巴浦尔980、卡巴浦尔981等。这些剂型还可包含润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；助悬剂；防腐剂，例如羟基苯甲酸甲酯、乙酯和丙酯(即，对羟基苯甲酸酯类)；pH调节剂，例如无机和有机酸和碱；甜味剂；和调味剂。这些剂型还可包含生物可降解的聚合物珠、葡聚糖和环糊精包埋复合物。
对于口服给药，治疗有效剂量可以是片剂、胶囊、乳剂、混悬液、溶液、糖浆、喷雾剂、锭剂、粉末和缓释剂型的形式。用于口服给药的合适赋形剂包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠(sodiumsaccharine)、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。
在一些实施方式中，治疗有效剂量采取丸剂、片剂或胶囊的形式，因此，该剂型可含有以下任何试剂以及抗癌症药物：稀释剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂，例如淀粉或其衍生物；润滑剂，例如硬脂酸镁等；和粘合剂，例如淀粉、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素及其衍生物。还可将抗癌症药物配制成置于，例如聚乙二醇(PEG)运载体中的栓剂。
可将抗癌症药物和任选的一种或多种药学上可接受的佐剂分散或溶解于运载体，例如盐水(例如，0.9％w/v氯化钠)、水性右旋糖、甘油、乙醇等中来制备液体剂型，从而形成用于，例如口服、局部或静脉内给药的溶液或混悬液。还可将抗癌症药物配制成驻留灌肠剂。
对于局部给药，治疗有效剂量可采取乳剂、洗剂、凝胶、泡沫、乳膏、凝胶剂、溶液、混悬液、软膏和经皮贴剂的形式。对于通过吸入给药，可将抗癌症药物作为干粉或以液体形式经喷雾剂递送。对于胃肠外给药，治疗有效剂量可采取无菌可注射溶液和无菌包装粉末的形式。优选配制成pH约4.5-约7.5的可注射溶液。
还可采用冻干形式提供治疗有效剂量。这种剂型可包含缓冲液，例如碳酸氢盐，以便在给予前重建，或者可以在冻干剂型中包含所述缓冲液以便用，例如水重建。冻干剂型还可包含合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。可在注射器中提供冻干剂型，任选与用于重建的缓冲液一起包装，从而可将重建的剂型立即给予对象。
还可以定期的时间间隔监测对象以评估某些治疗方案的效力。例如，某些信号转导分子的活化状态可根据用本文所述一种或多种抗癌症药物治疗的疗效而改变。可监测对象以评估反应和了解某些药物或治疗在个体化方法中的作用。此外，最初对特定抗癌症药物或抗癌症药物组合有反应的对象可变得对该药物或药物组合难治，提示这些对象产生了获得性耐药。可停止这些对象的当前治疗，并按照本发明方法开出备选治疗的处方。
在某些其它例子中，通过引用纳入本文的WO 2008/036802公开了实施多重高通量免疫测定的方法和蛋白质阵列。该申请公开了用于检测稀少循环细胞中多种信号转导分子的活化状态和/或总量的抗体阵列和利用这种阵列帮助癌症预后和诊断以及个性化靶向治疗设计的方法。该申请还公开了包含局限于“可寻址”或“邮编码”阵列中的多种捕捉分子的支持物表面。该阵列的各不同区域包含特异性结合存在于不依赖活化状态的检测抗体或活化状态依赖性抗体上的捕捉标签的独特捕捉试剂，从而将有标签的检测抗体局限和布置在阵列中。在优选的实施方式中，捕捉制剂和捕捉标签是彼此特异性杂交的寡核苷酸。
IX.实施例
提供以下实施例是为了说明，而非限制本发明。
实施例1.循环细胞的分离、刺激和裂解
实体瘤的循环细胞包括从实体瘤转移或微小转移的细胞，包括循环肿瘤细胞(CTC)、癌症干细胞(CSC)和/或迁移至肿瘤的细胞(例如，循环内皮祖细胞(CEPC)、循环内皮细胞(CEC)、循环前-血管原性髓细胞、循环树突细胞等)。可从任何可获得的生物液体(例如，血液、尿液、乳头抽吸物、淋巴、唾液、细针抽吸物等)获得含循环细胞的患者样品。可采用一种或多种分离方法，例如免疫磁性分离(参见，例如Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：4589-4594(1998)；Bilkenroth等，Int.J.Cancer，92：577-582(2001))、宾夕法尼州亨廷顿谷的伊缪尼康公司的CellTrackTM系统、微流体分离(参见，例如Mohamed等，IEEE Trans.Nanobiosci.，3：251-256(2004)；Lin等，第5147号摘要，第97届AACR年会，华盛顿，哥伦比亚特区，(2006))、FACS(参见，例如Mancuso等，Blood，97：3658-3661(2001))、密度梯度离心(参见，例如Baker等，Clin.Cancer Res.，13：4865-4871(2003))和消除法(参见，例如Meye等，Int.J.Oncol.，21：521-530(2002))分离患者样品的循环细胞。
手工分离CTC：
CTC的免疫磁性分离-手工分离后进行以下活化试验：
1)利用已结合于抗-EpCAM单克隆抗体(科地亚生命科学公司(KordiaLife Sciences)；莱顿(Leiden)，荷兰)的磁珠(Dynal M450；戴纳公司(DynalAS)；奥斯陆，挪威)。
2)恰在使用前，用含0.01％BSA的等体积PBS洗涤预包被的Dyna珠一次。
3)将25μl预-包被的Dyna珠加入1ml样品中。
4)将混合物在2-8℃温育20分钟，同时轻柔翻转和转动。
5)将试管置于磁性分离器(MPL-1磁体)中2分钟。
6)弃去上清液，通过悬浮在含0.01％BSA的PBS中洗涤结合珠的细胞三次，然后进行磁性分离。
7)将样品重悬在100μl刺激缓冲液中。
样品制备：
1)将人对象的外周血抽入含1mg/ml EDTA的硅化试管中。弃去最初的3-5ml以免被刺穿的静脉所释放的上皮细胞污染。
2)在使用前用0.9％NaCl将1ml全血作1∶3稀释。
对照品制备：
1)通过将人癌细胞系掺加入HL-60细胞来制备细胞系对照。
2)细胞系对照的使用浓度为2.5x 106个细胞/毫升。
手工分离CEC和CEPC：
作为非限制性例子，可采用Beerepoot等(Ann.Oncology，15：139-145(2004))所述的免疫磁性分离/富集技术分离存活的CEC和CEPC。简言之将外周血与已结合了抗-CD146单克隆抗体(科地亚生命科学公司)的磁珠(Dynal M450IgG1)温育。该抗体识别外周血中内皮细胞的所有谱系，但不识别造血或上皮细胞(George等，J.Immunol.Meth.，139：65-75(1991))。可先进行造血和上皮细胞的负选择，再用结合有合适抗体的磁珠(例如，用于消除白细胞的Dynal-CD45珠，用于消除单核细胞的Dynal-CD14珠，用于消除上皮细胞的Dynal-EpCAM(加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))进行正选择。在该实施例中，只采用正选择。
CEC和CEPC的免疫磁性分离-手工分离后进行以下活化试验：
1)利用已结合于抗-CD146单克隆抗体(科地亚生命科学公司)的磁珠(Dynal M450)。
2)恰在使用前，用含0.01％BSA的等体积PBS洗涤预包被的Dyna珠一次。
3)将25μl预-包被的Dyna珠加入1ml样品中。
4)将混合物在2-8℃温育20分钟，同时轻柔翻转和转动。
5)将试管置于磁性分离器(MPL-1磁体)中2分钟。
6)弃去上清液，通过悬浮在含0.01％BSA的PBS中洗涤结合珠的细胞三次，然后进行磁性分离。
7)将样品重悬在100μl刺激缓冲液中。
样品制备：
1)将人对象的外周血抽入含1mg/ml EDTA的硅化试管中。弃去最初的3-5ml以免被刺穿的静脉所释放的内皮细胞污染。
2)在使用前用0.9％NaCl将1ml全血作1∶3稀释。
对照品制备：
1)通过将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)掺加入HL-60细胞来制备细胞系对照。
2)细胞系对照的使用浓度为2.5x106个细胞/毫升。
手工分离CEPC(无CEC)：
CEPC是能对各种血管原性生长因子起反应而分化成成熟内皮细胞的骨髓衍生祖细胞的循环亚型。可利用识别表面标记CD34的抗体进行选择来分离CEPC。CD133是区别不成熟的内皮祖细胞(EPC)或原始造血干细胞(HSC)与CEPC的表面标记。利用贴壁培养或磁珠分离不同来源CEPC的各种方法已见描述。在该实施例，采用Asahara等(Science，275：964-967(1997))描述的改进方案。
CEPC的免疫磁性分离-手工分离后进行活化试验：
1)利用磁珠(Dynal M450CD34)。用CD34表面抗原的特异性单克隆抗体包被这些珠。
2)恰在使用前，用含0.01％BSA的等体积PBS洗涤预包被的Dyna珠一次。
3)将25μl预-包被的Dyna珠加入1ml样品中。
4)将混合物在2-8℃温育20分钟，同时轻柔翻转和转动。
5)将试管置于磁性分离器(MPL-1磁体)中2分钟。
6)弃去上清液，通过悬浮在含0.01％BSA的PBS中洗涤结合珠的细胞三次，然后进行磁性分离。
7)将样品重悬在100μl刺激缓冲液中。
样品制备：
1)将人对象的外周血抽入含1mg/ml EDTA的硅化试管中。弃去最初的3-5ml以免被刺穿的静脉所释放的内皮细胞污染。
2)在使用前用平衡盐溶液将10ml血液作1∶1稀释。
3)将4ml稀释的血液叠加在10ml试管中的3ml Ficoll-Paque上。
4)18-20℃，以400xg离心试管30-40分钟。
5)利用无菌的巴斯德移液管取出含血浆和血小板的上层，不打散界面处的单核的细胞层。
6)利用无菌移液管将单核的细胞转移至无菌离心管。
7)加入6ml平衡盐溶液，小心地重悬细胞。
8)18-20℃，以60-100x g离心混合物10分钟。
9)取出上清液，将各试管的单核的细胞重悬在1ml PBS。
利用维里德克丝系统分离CTC、CEC和CEPC：
新泽西州沃伦市维里德克丝公司(Veridex，Warren，NJ)出售CellSearch系统，其由CellPrep系统、CellSearch上皮细胞试剂盒和CellSpotter分析仪构成。CellPrep系统是半自动样品制备系统(Kagan等，J.Clin.Ligand Assay，25：104-110(2002))。CellSearch上皮细胞试剂盒由以下部分构成：包被上皮细胞特异性的抗-EpCAM抗体的铁磁流体；针对细胞角蛋白8、18和19的藻红蛋白-偶联抗体；偶联别藻蓝蛋白的抗-CD45抗体；DAPI染料；和用于洗涤、透化和重悬细胞的缓冲液。该实施例所用方案还描述于Allard等，Clin.Cancer Res.，10：6897-6904(2004)。完整的维里德克丝系统可用于CTC计数，或者通过在CellPrep系统分离后手工除去样品，完整的维里德克丝系统可提供分离方法，然后分析途径的活化状况。CTC的数量可为算法开发提供信息。
维里德克丝系统-CTC富集后进行计数：
1)将7.5ml血液与6ml缓冲液混合，800xg离心10分钟，并置于CellPrep系统上。
2)仪器抽出上清液后，仪器加入铁磁流体。
3)该仪器进行温育和随后的磁性分离步骤。
4)吸出未结合的细胞和其余血浆。
5)加入染色试剂连同透化缓冲液以便进行荧光染色。
6)该体系温育后，再次磁性分离细胞并重悬在MagNest细胞沉淀装置(MagNest Cell Presentation Device)中以便利用CellSpotter分析仪作分析。
7)将该装置置于CellSpotter分析仪(一种4-色半自动荧光显微镜)中。
8)获取符合维里德克丝规定标准的图像，通过网络浏览器显示以供最终的手工选择。
9)细胞计数的结果表示为每7.5ml血液的细胞数量。
维里德克丝系统-CTC富集后进行活化试验：
1)将7.5ml血液与6ml缓冲液混合，800xg离心10分钟，并置于CellPrep系统上。
2)仪器抽出上清液后，仪器加入铁磁流体。
3)该仪器进行温育和随后的磁性分离步骤。
4)吸出未结合的细胞和其余血浆。
5)将样品重悬在100μl刺激缓冲液中。
维里德克丝系统-CEC和CEPC富集后进行活化试验：
1)维里德克丝公司提供利用抗-CD146抗体进行捕捉的CellTracks内皮细胞试剂盒(CellTracks Endothelial Cell Kit)。CellTracks内皮细胞试剂盒与维里德克丝公司的CellTracks AutoPrep系统联用来制备血液样品，与CellTracks分析仪II联用以计数和表征全血中的CEC和CEPC。该方案与CellSearch上皮细胞试剂盒的相同。
样品制备：
1)按照生产商的使用说明书将人对象的外周血抽入CellSave保存试管。弃去最初的3-5ml以免被刺穿的静脉所释放的上皮或内皮细胞污染。
手工分离CSC：
有证据显示肿瘤含有小群体的具有独特自我更新和存活机理的假定癌症干细胞(参见，例如Sells，Crit.Rev.Oncol.Hematol.，51：1-28(2004)；Reya等，Nature，414：105-111(2001)；Dontu等，Trends Endocrinol.Metal.，15：193-197(2004)；和Dick，Nature，423：231-233(2003))。癌症干细胞(CSC)可在休眠状态长期存在，从而使得它们耐受靶向分裂细胞的化疗药物。这种癌症启动群体的特征在于自我更新和存活途径的活化，从而能进行选择性除去的靶向治疗。利用贴壁培养或磁性微珠描述了CSC的分离方法。在本实施例中，采用由Cote等(Clin.Can.Res.，12：5615(2006))所述改进的方案。
免疫磁性CSC分离-手工分离后进行活化试验：
1)利用磁珠(戴纳公司，奥斯陆，挪威)。用CD34或CD133表面抗原的特异性单克隆抗体包被这些珠。
2)恰在使用前，用含0.01％BSA的等体积PBS洗涤预包被的Dyna珠一次。
3)将1-107个预-包被的Dyna珠加入3ml样品中。
4)将混合物在2-8℃温育60分钟，同时轻柔翻转和转动。
5)将混合物分成1ml的部分，将各试管置于磁性分离器(MPL-1磁体)中至少6分钟。
6)弃去上清液，通过悬浮在含0.01％BSA的PBS中洗涤结合珠的细胞三次，然后进行磁性分离。
7)将样品重悬在100μl刺激缓冲液中。
样品制备：
1)患者知情同意后获得早期乳腺癌患者的骨髓样本。
2)如Bauer等，Clin.Can.Res.，6：3552-3559(2000))所述加工骨髓抽吸物。采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心，利用Beckman GS-6离心机以4000xg离心35分钟并用PBS洗涤两次从而富集含有任何扩散性肿瘤细胞的单核的细胞组分。
分离的CTC的细胞刺激和裂解：
细胞刺激：
1)将生长因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)加入细胞并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞：
1)37℃，将样品与治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物温育30分钟。
2)然后通过加入因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)来刺激细胞，并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞(反馈环)：
1)37℃，将样品与治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物温育30分钟。
2)然后用TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)来刺激细胞，并在37℃温育120分钟。
采用以下方案裂解经刺激的CTC：
1)通过混合表2所列试剂新鲜制备新鲜的裂解缓冲液。
2)最终洗涤后，将细胞重悬在置于冰上的100μl冷却缓冲液中。
3)在冰上温育30分钟。
4)用微型离心机以最大转速离心该混合物10分钟以分离珠和裂解液。
5)将裂解液转移至新试管以供检验或在-80℃保存。
表2
Figure GPA00001061508400511
分离的CEC和/或CEPC的细胞刺激和裂解：
据信VEGF能通过活化CEPC(Larrivee等，J. Biol.Chem.，278：22006-22013(2003))和从血管壁脱落的成熟CEC(Solovey等，Blood，93：3824-3830(1999))的抗凋亡途径而促进存活。VEGF还可刺激CEPC或成熟CEC的增殖，虽然与CEPC相比，成熟CEC看来只有有限的增殖能力(Lin等，J.Clin.Invest.，105：71-77(2000))。出于这三个原因，裂解前与VEGF家族生长因子温育活化了CEC和/或CEPC。
细胞刺激：
1)将各100nM的生长因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF和/或Ang加入细胞，并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞：
1)37℃，将样品与治疗有效浓度的贝伐单抗、索拉芬尼、苏尼替尼和/或雷帕霉素类似物温育30分钟。
2)然后通过加入各100nM的因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF和/或Ang来刺激细胞，并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞(反馈环)：
1)37℃，将样品与治疗有效浓度的贝伐单抗、索拉芬尼、苏尼替尼和/或雷帕霉素类似物温育30分钟。
2)然后通过加入各100nM的VEGF、FGF、PDGF、PIGF和/或Ang来刺激细胞，并在37℃温育120分钟。
采用以下方案裂解分离的CEC和/或CEPC细胞：
1)通过混合表2所列试剂新鲜制备新鲜的裂解缓冲液。
2)最终洗涤后，将细胞重悬在置于冰上的100μl冷却缓冲液中。
3)在冰上温育30分钟。
4)用微型离心机以最大转速离心该混合物10分钟以分离珠和裂解液。
5)将裂解液转移至新试管以供检验或在-80℃保存。
分离的CSC的细胞刺激和裂解：
刺激细胞：
1)将生长因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)加入细胞并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞：
1)37℃，将样品与治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物温育30分钟。
2)然后通过加入因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)来刺激细胞，并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞(反馈环)：
1)37℃，将样品与治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物温育30分钟。
2)然后通过加入因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)来刺激细胞，并在37℃温育120分钟。
采用以下方案裂解分离的CSC细胞：
1)通过混合表2所列试剂新鲜制备新鲜的裂解缓冲液。
2)最终洗涤后，将细胞重悬在置于冰上的100μl冷却缓冲液中。
3)在冰上温育30分钟。
4)用微型离心机以最大转速离心该混合物10分钟以分离珠和裂解液。
5)将裂解液转移至新试管以供检验或在-80℃保存。
实施例2.从组织、活检样品或原代培养物制备肿瘤细胞提取物
本实施例说明了分离、刺激和裂解肿瘤组织或活检样本的细胞的方法。本实施例还说明了启动、刺激和裂解分离自组织、活检样品或全血的肿瘤细胞原代培养物的方法。分离和培养生物学样本的肿瘤细胞以供筛选化疗剂的其它方法描述于，例如美国专利号5,728,541；6,416,967；6,887,680；6,900,027；6,933,129；和7,112,415；和美国专利公布号20040023375及20050202411。按照本实施例制备的细胞提取物可用于本文所述的单次检测或邻近试验。
分离原代或转移组织的肿瘤细胞：
细胞分离和培养：
1)通过手术收集约5-100mg无坏死、无污染的肿瘤组织，置于含有无菌细胞培养基(例如，含10％FBS和抗生素的RMPI-1640)的100ml瓶中。
2)室温下，样品须在提取后72小时内保存或运输。
3)用细胞培养基清洗样品三次。
4)用手术刀将组织切成小片，然后使其通过细孔筛网分解成细胞悬液。
5)或者，用含抗生素的无血清细胞培养基稀释的含0.25％胶原酶II和0.001％DNA酶的混合物处理切碎的组织。温育15-20分钟，轻柔搅拌。通过细胞培养基洗涤3次处理以除去酶。
6)将细胞浓度调节至106/ml，将细胞接种入6-孔板并静置过夜。第二天，用胰蛋白酶处理细胞并再次接种入微量滴定板以便用配体刺激和/或用靶向药物抑制。
分解肿瘤细胞的细胞刺激和裂解：
细胞刺激：
1)将生长因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)加入细胞并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞：
1)37℃，将样品与治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物温育30分钟。
2)然后通过加入因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)来刺激细胞，并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞(反馈环)：
1)37℃，用治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物处理样品30分钟。
2)然后通过TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)刺激细胞，并在37℃温育120分钟。
采用以下方案裂解经刺激的细胞：
1)通过混合上表2所列试剂新鲜制备新鲜的裂解缓冲液。
2)最终洗涤后，将细胞重悬在置于冰上的100μl冷炔缓冲液中。
3)在冰上温育30分钟。
4)用微型离心机以最大转速离心该混合物10分钟以分离珠和裂解液。
5)将裂解液转移至新试管以供检验或在-80℃保存。
从活检样本分离肿瘤细胞：
细胞分离和培养：
1)通过手术提取针芯活组织(core biopsies)(14号针头2个针芯，16号针头3个针芯，18号针头4个针芯，其中1-2次活检为真空辅助的活检(vacuum-assisted biopsies))，并置于含有细胞培养基的10ml无菌小瓶中作为肿瘤样本。
2)室温下，样品须在提取后72小时内保存或运输。
3)通过细孔筛网将针芯活组织的细胞材料分解成细胞悬液。
4)或者，用含抗生素的细胞培养基稀释的含0.25％胶原酶II和0.001％DNA酶的混合物处理活检组织。温育15-20分钟，轻柔搅拌。通过细胞培养基洗涤3次处理以除去酶。
5)将细胞浓度调节至106/ml，将细胞接种入6-孔板并静置过夜。第二天，用胰蛋白酶处理细胞并再次接种入微量滴定板以便用配体刺激和/或用靶向药物抑制。
活检组织的细胞的细胞刺激和裂解
细胞刺激：
1)将生长因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)加入细胞并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞：
1)37℃，用治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物处理样品30分钟。
2)然后通过加入因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)来刺激细胞，并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞(反馈环)：
1)37℃，用治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物处理样品30分钟。
2)然后通过TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)刺激细胞，并在37℃温育120分钟。
采用以下方案裂解经刺激的细胞：
1)通过混合上表2所列试剂新鲜制备新鲜的裂解缓冲液。
2)最终洗涤后，将细胞重悬在置于冰上的100μl冷却缓冲液中。
3)在冰上温育30分钟。
4)用微型离心机以最大转速离心该混合物10分钟以分离珠和裂解液。
5)将裂解液转移至新试管以供检验或在-80℃保存。
启动从组织、活检组织或全血分离的肿瘤细胞的原代培养
细胞培养：
1)根据所分离肿瘤细胞的数量，将从上述组织、活检组织或全血分离的肿瘤细胞培养在无菌小瓶(例如，T-25)、培养皿(例如，10mm)或平板(例如，24-孔平板)中。
2)37℃，在补充了5％CO2的加湿气氛中，用细胞培养基(例如，含2％FBS和抗生素的RMPI-1640)进行温育。随着时间推移，细胞在容器底部形成单层并开始分裂。当细胞接近汇合时，用胰蛋白酶处理它们并再次接种入微量滴定板以便用配体刺激和/或用靶向药物抑制。
从组织、活检组织或全血分离的肿瘤细胞的原代培养的细胞刺激和裂解
细胞刺激：
1)将生长因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)加入细胞并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞：
1)37℃，用治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物处理样品30分钟。
2)然后通过加入因子TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)来刺激细胞，并在37℃温育5分钟。
用药物处理刺激细胞(反馈环)：
1)37℃，用治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕替尼、埃洛替尼和/或雷帕霉素类似物处理样品30分钟。
2)然后通过TGF-α(100nM)、Hrg(100nM)和/或IGF(100nM)刺激细胞，并在37℃温育120分钟。
采用以下方案裂解经刺激的细胞：
1)通过混合上表2所列试剂新鲜制备新鲜的裂解缓冲液。
2)最终洗涤后，将细胞重悬在置于冰上的100μl冷却缓冲液中。
3)在冰上温育30分钟。
4)用微型离心机以最大转速离心该混合物10分钟以分离珠和裂解液。
5)将裂解液转移至新试管以供检验或在-80℃保存。
实施例3.利用酪酰胺信号放大的单次检测微阵列ELISA
本实施例描述了具有优秀动态范围的多重、高通量、单次检测微阵列ELISA，其适于分析稀少循环细胞中信号转导分子的活化状态：
1)将捕捉抗体以2-倍连续稀释印刷在新泽西州弗洛哈姆帕克市获特满公司的16-垫FAST载玻片上。
2)干燥过夜后，用获特满封闭缓冲液封闭该载玻片。
3)将80μl细胞裂解液以10-倍连续稀释加入各垫。该载玻片在室温温育2小时。
4)用TBS-吐温洗涤6次后，室温下将80μl生物素标记的检测抗体(例如，识别pEGFR的单克隆抗体或识别EGFR的单克隆抗体，而无论活化状态)温育2小时。
5)洗涤6次后，加入链霉亲和素-标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)并温育1小时以使SA-HRP结合生物素-标记的检测抗体。
6)为放大信号，加入5μg/ml的80μl生物素-酪酰胺并反应15分钟。用TBS-吐温洗涤载玻片六次，用20％DMSO/TBS-吐温洗涤两次，用TBS洗涤一次。
7)加入80μl SA-Alexa 555并温育30分钟。然后洗涤载玻片两次，干燥5分钟，并用马萨诸塞州沃尔瑟姆市帕金埃尔默公司(Perkin-Elmer，Inc.；Waltham，MA)的微阵列扫描仪扫描。
实施例4.采用酪酰胺信号放大的邻近双重检测微阵列ELISA
本实施例描述了具有优秀动态范围的多重、高通量、邻近双重检测微阵列ELISA，其适于分析稀少循环细胞中信号转导分子的活化状态：
1)将捕捉抗体以1mg/ml-0.004mg/ml的连续稀释印刷在获特满公司的16-垫FAST载玻片上。
2)干燥过夜后，用获特满封闭缓冲液封闭该载玻片。
3)将80μl A431细胞裂解液以10-倍连续稀释加入各垫。该载玻片在室温温育2小时。
4)用TBS-吐温洗涤6次后，将TBS-吐温/2％BSA/1％FBS稀释的用于邻近试验的80μl检测抗体加入载玻片。所用的检测抗体是：(1)直接偶连于葡萄糖氧合酶(GO)的抗-EGFR单克隆抗体；和(2)直接偶连于辣根过氧化物酶(HRP)的识别磷酸化EGFR的单克隆抗体。室温下温育2小时。
5)或者，检测步骤利用识别磷酸化EGFR的单克隆抗体的生物素-偶连物。在这些情况中，洗涤6次后，包括与链霉亲和素-HRP温育1小时的额外后续步骤。
6)或者，检测步骤利用抗-EGFR抗体的寡核苷酸介导的葡萄糖氧合酶(GO)偶连物。可利用HRP与磷酸化EGFR抗体的直接偶连物或者生物素-链霉亲和素(SA)连接的偶连物。
7)为放大信号，加入5μg/ml的80μl生物素-酪酰胺并反应15分钟。用TBS-吐温洗涤载玻片六次，用20％DMSO/TBS-吐温洗涤两次，用TBS洗涤一次。
8)加入80μl SA-Alexa 555并温育30分钟。然后洗涤载玻片两次，干燥5分钟，并用帕金埃尔默公司的微阵列扫描仪扫描。
实施例5.产生活化状况以供药物选择
本发明方法和组合物可应用于癌症治疗的药物选择。典型方案需要产生两种状况，参比活化状况和测试活化状况，然后比较两种状况以测定特定药物治疗方案的效力(参见，图2)。
参比活化状况
为获得参比活化状况，在抗癌症药物治疗之前获得具有特定类型癌症(例如，肺肿瘤)的患者的血液样品。采用，例如本文详述的免疫磁性分离技术从该血液样品分离衍生自癌细胞的稀少循环细胞。可用一种或多种生长因子体外刺激分离的循环细胞。然后裂解经刺激的细胞以产生细胞提取物。将细胞提取物施加于含有一组捕捉抗体的稀释系列的可寻址阵列，所述捕捉抗体是活化状态在患者的癌症类型中可能改变的信号转导分子的特异性抗体。利用合适的检测抗体(例如，不依赖活化状态的抗体和/或活化状态依赖性抗体)进行单次检测或邻近试验以测定感兴趣的各信号转导分子的活化状态。表1所示“途径选择”表尤其可用于根据患者的癌症类型选择检测哪种活化状态。例如，一位患者可能具有显示表1“途径1”中所示EGFR途径活化状态的癌症类型。或者，另一位患者可能具有显示表1“途径2”中所示EGFR途径活化状态的另一癌症类型。因此，产生的参比活化状况提供了没有任何抗癌症药物存在下，患者癌症中信号转导分子的活化状态。
测试活化状况
为获得测试活化状况，在抗癌症药物治疗之前或在给予抗癌症药物后(例如，在癌症治疗期间的任何时间)获得具有特定类型癌症(例如，肺肿瘤)的患者的第二份血液样品。从该血液样品分离衍生自癌细胞的稀少循环细胞。如果分离的细胞获自未接受抗癌症药物治疗的患者，则将分离的细胞与靶向上述参比活化状况测定的一种或多种活化的信号转导分子的抗癌症药物温育。“药物选择”表(表A)尤其可用于选择批准的或处于临床试验的抑制特定活化靶信号转导分子的合适抗癌症药物。例如，如果从参比活化状况中测定到EGFR被活化，则可将细胞与表A的“A”或“B”行所示的一种或多种药物温育。然后可用一种或多种生长因子体外刺激分离的细胞。然后裂解分离的细胞以产生细胞提取物。将细胞提取物施加于可寻址阵列，进行邻近试验以测定感兴趣的各信号转导分子的活化状态。因此，产生的患者的测试活化状况提供了有特定抗癌症药物存在下，患者癌症中信号转导分子的活化状态。
药物选择
通过比较测试活化状况与参比活化状况来测定抗癌症药物是否适于治疗患者的癌症。例如，如果与没有药物存在下相比，药物治疗导致大多数或所有信号转导分子的活化实质性降低，例如从没有药物时的强活化改变成有药物时的弱或极弱活化，则确定该治疗适合于患者的癌症。在这种情况中，可在未接受药物治疗的患者中用该合适的抗癌症药物开始治疗，或者在已接受药物的患者中用该合适的抗癌症药物继续后续治疗。然而，如果药物治疗视作不适于治疗患者的癌症，则选择不同的药物并用于产生新的测试活化状况，然后将其与参比活化状况相比较。在这种情况中，可在未接受药物治疗的患者中用合适的抗癌症药物开始治疗，或者将正接受该不合适药物的患者的后续治疗改成合适的抗癌症药物。
实施例6.分析活化的受体酪氨酸激酶的可寻址阵列
图3描述了本发明的可寻址受体酪氨酸激酶阵列。本文所述的受体酪氨酸激酶是参与细胞增殖的许多信号转导途径的关键组分。例如，受体酪氨酸激酶的ErbB家族具有4个家族成员，并在诸如细胞增殖、分化和存活等基础细胞过程中起着至关重要的作用。据报道，该受体酪氨酸激酶家族在许多不同癌症中过表达并与更差的临床结果有关。与生长因子结合后，ErbB1或EGFR、ErbB3或HER3、和ErbB4或HER4同型和异型-二聚化以活化许多不同的信号转导途径。ErbB2或HER2不结合生长因子，其是所有3种家族成员的最佳异型-二聚化伴侣。过表达时，ErbB2也可同型-二聚化并活化信号转导途径。ErbB家族的同型-或异型-二聚化导致转磷酸化。自磷酸化或转磷酸化减弱了受体酪氨酸激酶的抑制性构象，使得激酶完全活化，同时产生许多含SH2的信号转导分子，例如Src、Shc SHP-1、SHEP-1和PI(3)K的结合位点。衔接蛋白或信号转导蛋白，例如Shc、Grb2或PI3K募集至磷酸化的受体。衔接蛋白的磷酸化导致MAPK和AKT途径活化。可通过测定Erk和Rsk的磷酸化状态来评估MAPK途径的活化，而PI3K途径活化可通过测定Akt和p70S6K的磷酸化状态来评估。
因此，图3所示可寻址ErbB家族芯片不仅能测定4种受体酪氨酸激酶的表达，还能测定它们的活化状态。还可利用可寻址芯片研究MAPK和PI3K/Akt途径的活化。该芯片的另一特征是存在测定肿瘤含量的内标和测定任何非特异性结合的非特异性IgG。
实施例7.分析血管生成中的信号转导途径的可寻址阵列
图4说明了测定参与血管生成的信号转导组分的活化状态的可寻址阵列构成。本文所述的肿瘤血管生成对于许多实体瘤的生长至关重要。检验的关键性信号转导分子包括受体酪氨酸激酶的VEGFR、FGFR和TIE家族的成员，它们主要在内皮细胞上表达。PDGFR通常表达在周细胞上。这些受体的表达和活化状态对于测定各肿瘤样本中血管生成的主要机制至关重要。生长因子，例如VEGF和PIGF结合VEGFR-1和VEGFR-2，并启动同型-和异型-二聚化。二聚化后，这些受体磷酸化，进而活化MAPK和PI3K/Akt信号转导途径。FGFR、TIE和PDGFR受体也以相似方式活化。自磷酸化或转磷酸化减弱了受体酪氨酸激酶的抑制性构象，使得激酶完全活化，同时产生许多含SH2的信号转导分子，例如Src、Shc SHP-1、V-钙粘蛋白、SHEP-1和PI3K的结合位点。衔接蛋白或信号转导蛋白，例如Shc、Grb2或PI3K募集至磷酸化的受体。衔接蛋白的磷酸化导致MAPK和AKT途径活化。可通过测定Erk和Rsk的磷酸化状态来评估MAPK途径活化，而PI3K途径活化可通过测定Akt和p70S6K的磷酸化状态来评估。
因此，可寻址血管生成芯片，例如图4所示那些不仅能测定患者样品中所有受体酪氨酸激酶的表达，还能测定它们的活化状态。还可利用可寻址芯片研究MAPK和PI3K/Akt途径的活化。该芯片具有测定肿瘤或肿瘤相关细胞(CEC、CEP、周细胞等)含量的内标和测定任何非特异性结合的非特异性IgG。
实施例8.选择用于治疗非小细胞肺癌的患者
目前对非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗需要同时利用化疗和抗血管生成治疗。作为第一线治疗，医师对非鳞状细胞癌患者通常利用碳铂(C)或联用碳铂与紫杉
Figure GPA00001061508400611
(T)和
Figure GPA00001061508400612
第二线药物包括紫杉
Figure GPA00001061508400613
Figure GPA00001061508400614
和
Figure GPA00001061508400615
(对于非吸烟者、妇女和亚洲人)。正在进行的临床试验测试了各种药物组合的效力：在非鳞状细胞癌患者中用
Figure GPA00001061508400616
包括鳞状细胞癌症在内的所有NSCLC中用索拉芬尼+碳铂+紫杉和包括鳞状细胞癌症在内的所有NSCLC中用ZD6474(ZACTIMATM)+碳铂+紫杉
Figure GPA00001061508400618
现已证明在NSCLC中，关键信号转导组分中有许多改变。这些包括：导致活化的EGFR突变；其它受体酪氨酸激酶，例如c-met的活化；EGFR活化以及HER2和3活化或HER2扩增；EGFR活化及PI3K突变；EGFR活化及PTEN消除；和EGFR活化及Ras突变。各种形式的化疗已针对信号转导途径不同组分中的各种改变。
同时，可以靶向肿瘤的新血管形成，一种称为血管生成的过程。VEGF是对于新血管形成必不可少的内皮细胞存活因子。因此，调节VEGF-介导血管生成的一种方法是利用针对VEGF蛋白质本身或VEGFR的抗体。贝伐单抗是针对VEGF的一种重组人源化单克隆抗体，其与化疗剂协同作用，已显示能改善结肠直肠、乳腺和肺癌患者的存活。
下表3所示的例子说明了分析内皮细胞或ECP中有活性的途径是如何帮助医师决定有效治疗过程。简言之，可在有或没有测试治疗剂的不同组合存在下，测定内皮细胞或ECP中VEGF途径的不同组分的活化水平。
表3
受体                   表达   活化    活化+         活化+
                                      贝伐单抗      C+T+贝伐单抗
                       (磷酸化水平)
VEGFR2：                中等  强      弱            弱
VEGFR1：                中等  强      弱            弱
Tie 2                   低    弱      弱            弱
V-钙粘蛋白-R2复合物     弱    中等    弱            弱
Shc                           强      弱            弱
PI3K                          强      弱            弱
Erk                           强      弱            弱
Rsk                           强      弱            弱
Akt                           强      弱            弱
P70S6K                        强      弱            弱
表3所示信息表明用贝伐单抗或C+Y+贝伐单抗处理将显示强活化(强磷酸化水平所示)的信号转导组分减弱至弱水平。因此，具有活化的VEGFR-2和VEGFR-1途径的患者应用贝伐单抗或C+T+贝伐单抗治疗。
靶向血管生成信号转导途径并且可用于产生测试活化状况的其它治疗剂的例子见下表4。
表4
VEGFR酪氨酸激酶抑制剂在NSCLC中的安全性和效力
  抑制剂   靶标   常规毒性   在NSCLC中的临床活性
  瓦塔拉尼   VEGFR-1，-2，-3，PDGFR，c-Kit，c-Fms   疲倦，恶心，呕吐，肝脏酶升高，高血压   未报道
  AZD2171   VEGFR-1，-2，-3，PDGFR   疲倦，腹泻，高血压，食欲不振，呼吸困难   SD[？]
  苹果酸苏尼替尼   VEGFR-1，-2，-3，PDGFR，c-Kit   疲倦，皮疹，毛发色素缺失，毛发褪   PR[？]
  色，高血压
  AG013736   VEGFR-1，-2，-3，PDGFR，c-Kit   高血压，咳血，口炎，恶心，腹泻   肿瘤空穴化
  索拉芬尼   VEGFR-2，-3，PDGFR，c-Kit，Raf   腹泻，肝脏酶升高，高血压，疲倦   SD[？]
  抑制剂   靶标   常规毒性   在NSCLC中的临床活性
  GW786034   VEGFR-1，-2，-3，PDGFR，c-Kit   高血压，肺栓塞，恶心，疲倦，毛发色素缺失   SD[？]
  ZD6474   VEGFR-1，-2，-3，EGFR   腹泻，皮疹，高血压   PR[？]
  CP-547632  VEGFR-2   皮疹和口干   PR[？]
上表4列出了新抗血管生成药物的靶标。本发明能理性选择最佳预测存活的活化标记。不同药物之间的最合适活化标记可能不同，这些标记可用作在抗血管生成单一治疗与组合治疗之间作出选择的指导。
实施例9.选择用其它抗血管生成药物治疗的患者
应用本发明公开的途径分析来测定表4所示各种药物的适合性的其它例子如下所述。
ZD6474
ZD6474(ZACTIMATM)目前处于治疗EGFR指向治疗失败的患者的III期临床试验。具体地说，进行本项研究来评估对于治疗非小细胞肺癌患者，将ZD6474加入最佳支持疗法(BSC)是否比单用最佳支持疗法更有效，所述患者的疾病在以前的化疗和EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗后复发。ZD6474是靶向肿瘤的新血管生长的抗癌症药物，从而其可能减缓肿瘤的生长速度。早期研究表明ZD6474对肿瘤发展至下一阶段的时间可能有正面作用。对于第三线治疗，将ZD6474给予化疗和EGFR TKI治疗后复发的患者。ZD6474的结构不同于因此，预计它仍会抑制EGFR和抗血管生成途径(例如，VEGFR-1、-2和-3)。
因此，进行了以下试验：
·比较联用ZD6474与培美曲塞以及单用培美曲塞的效力研究；
·在非小细胞肺癌(NSCLC)中联用ZACTIMATM与多西他赛和单用多西他赛的比较性试验；
·凡达它尼、碳铂和紫杉醇治疗具有可通过手术除去的I、II或III期NSCLC的患者；和
·比较至少一种先前化疗失败后ZD6474与埃洛替尼在NSCLC中的效力试验。
采用本发明方法和组合物选择对包含ZD6474的药物组合起反应的患者(如下表5所示)不仅减少III期临床试验的患者数量，还导致更好的患者护理。
表5
肿瘤细胞
受体           表达     活化       活化+     活化+
                                   ZD6474    贝伐单抗
               (磷酸化水平)
EGFR：         中等      强        极弱      强
ErbB2：        中等      强        极弱      强
ErbB3          低        中等      极弱      中等
ErbB4          低        弱        极弱      弱
Shc                      强        极        弱强
PI3K                     强        极        弱强
Erk                      强        极弱      强
Rsk                      强        极        弱强
Akt                      强        极        弱强
P70S6K                   强        极弱      强
表6
内皮细胞
受体                   表达      活化        活化+     活化+
                                             ZD6474    贝伐单抗
                       (磷酸化水平)
VEGFR2：               中等      强          弱        弱
VEGFR1：               中等      强          弱        弱
Tie 2                  低        弱          弱        弱
V-钙粘蛋白-R2复合物    无        中等        弱        弱
Shc                              强          弱        弱
PI3K                             强          弱        弱
Erk                              强          弱        弱
Rsk                              强          弱        弱
Akt                              强          弱        弱
P70S6K                           强          弱        弱
表5和6中的信息表明ZD6474同时下调内皮细胞以及肿瘤细胞中的途径。
AZD2171
利用AZD2171(一种抑制PDGFR和VEGFR的药剂)的许多临床试验正在进行。例如，正在测试AZD2171与培美曲塞二钠的组合能否治疗非小细胞肺癌复发的患者。该组合的基本原理是培美曲塞二钠可能通过抑制细胞分裂所需的酶而终止肿瘤细胞生长。AZD2171通过阻断流向肿瘤的血液而进一步导致肿瘤细胞生长停止。因此，给予AZD2141与培美曲塞二钠可能在杀伤更多肿瘤细胞中具有协同作用。
另一临床试验将贝伐单抗
Figure GPA00001061508400651
与AZD2171组合来治疗具有转移性或不可切除的实体瘤或淋巴瘤的患者。该组合的基本原理是单克隆抗体，例如贝伐单抗能以多种方式阻断癌症生长。一些阻断了癌细胞生长和扩散的能力。其它能发现癌细胞并协助杀伤它们或将癌症杀伤性物质携带到癌细胞。贝伐单抗和AZD2171还可通过阻断流向癌症的血液而终止癌细胞的生长。因此，给予贝伐单抗和AZD2171可能在协同杀伤更多肿瘤细胞。
其它临床试验检验了含或不含AZD2171的吉西他滨和碳铂组合作为第一线疗剂在IIIB期或IV期非小细胞肺癌患者中的治疗情况，以及含或不含AZD2171的紫杉醇和碳铂组合在III期或IV期非小细胞肺癌患者中的治疗情况。
采用本发明方法和组合物选择的对包含AZD2171的药物组合起反应的患者示于下表7。
表7
内皮细胞和周细胞
受体                  表达        活化      活化+     活化+
                                            AZD2171   贝伐单抗
                      (磷酸化水平)
VEGFR2：              中等        强        弱        弱
VEGFR1：              中等        强        弱        弱
Tie 2                 低          弱        弱        弱
V-钙粘蛋白-R2复合物   无          中等      弱        弱
PDGFRa                中等        高        弱        高
PDGFRb                中等        高        弱        高
Shc                               强        弱        弱
PI3K                              强        弱        弱
Erk                               强        弱        弱
Rsk                               强        弱        弱
Akt                               强        弱        弱
P70S6K                            强        弱        弱
因为PDGF在
Figure GPA00001061508400661
-耐受性患者中过表达，例如表7所示的信息将提示抑制PDGFR以及VEGFR的AZD2171可能是治疗这种肿瘤的选用药剂。
索拉芬尼
利用索拉芬尼(BAY 43-9006)的许多临床试验正在进行。例如，进行了以下研究：(1)在具有非小细胞肺癌的化疗原初患者中比较碳铂与紫杉醇(含或不含索拉芬尼)；(2)在具有III-IV期非小细胞肺癌的化疗原初患者中比较碳铂和紫杉醇(含或不含索拉芬尼)；和(3)索拉芬尼和贝伐单抗治疗具有难治、转移性或不可切除实体瘤的患者。
采用本发明方法和组合物选择的对包含索拉芬尼的药物组合起反应的患者示于下表8。
表8
内皮细胞和周细胞
受体                   表达      活化      活化+     活化+
                                           索拉芬尼  贝伐单抗
                       (磷酸化水平)
VEGFR2：               中等      强        弱        弱
VEGFR1：               中等      弱        弱        弱
Tie 2                  低        弱        弱        弱
V-钙粘蛋白-R2复合物    无        中等      弱        弱
PDGFRa                 中等      高        弱        高
PDGFRb                 中等      高        弱        高
Shc                              强        弱        弱
PI3K                             强        弱        弱
Erk                              强        弱        弱
Rsk                              强        弱        弱
Akt                              强        弱        弱
P70S6K                           强        弱        弱
因为VEGF和PDGF均在
Figure GPA00001061508400662
-耐受性患者中过表达，
Figure GPA00001061508400663
和索拉芬尼的组合可能有效关闭该二途径。此外，索拉芬尼抑制Raf，因此能抑制所有细胞类型中的MAPK途径。
实施例10.其它抗-血管生成和抗-信号转导治疗组合
血管内皮生长因子和表皮生长因子受体(EGFR)可在肿瘤组织中导致血管生成，它们的下游信号转导途径相同。因此，靶向两种途径可能原则上导致加和的或协同的抗肿瘤作用。最近的I/II期研究在难治的晚期非鳞状细胞非小细胞肺癌(NSCLC)患者中评估了贝伐单抗与EGFR小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)埃洛替尼的组合。在II期研究中，业已证明贝伐单抗与埃洛替尼组合看来能不依赖于EGFR酪氨酸激酶突变状态而提供益处(参见，例如Herbst等，J.Clin.Oncol.，23：2544-2555(2005))。因此，明显关闭EGFR和VEGFR-2看来有利于患者。
该领域中正在进行的临床试验有：(1)对于非小细胞肺癌(ATLAS)的第一线治疗，比较含或不含埃洛替尼的贝伐单抗治疗的研究；一种在具有局部晚期或转移性NSCLC的对象中评估化疗+贝伐单抗，随后进行贝伐单抗+埃洛替尼与贝伐单抗+埃洛替尼安慰剂的安全性和效力的IIIb期、多中心、随机化、安慰剂-对照试验；(2)评估贝伐单抗与
Figure GPA00001061508400671
组合对于晚期非小细胞肺癌的效力的研究；一种第二线的III期、多中心、安慰剂对照、双盲的随机化研究。将约650位患者以1∶1的比例随机分配至两个治疗组之一：组1：
Figure GPA00001061508400672
+安慰剂；组2：
Figure GPA00001061508400673
+贝伐单抗；(3)埃洛替尼和贝伐单抗治疗从未吸烟的IIIB期或IV期原发性非小细胞肺癌患者；(4)贝伐单抗和埃洛替尼，然后用顺铂或碳铂和吉西他滨治疗具有新诊断的或复发的IIIB期或IV期非小细胞肺癌的患者；(5)RAD001与碳铂、紫杉醇和贝伐单抗的组合治疗以前未经全身性疗剂治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者；(6)西妥昔单抗、紫杉醇、碳铂和贝伐单抗治疗具有晚期非小细胞肺癌患者；(7)帕佐帕尼+拉帕替尼；(8)第一线化疗和贝伐单抗后，甲磺酸伊马替尼和贝伐单抗治疗IIIB期或IV期非小细胞肺癌患者；和(9)AMG 706或贝伐单抗与化疗组合对晚期NSCLC的II期试验。
以下显示了采用本发明方法和组合物进行患者选择以便用各种药物组合治疗的例子。
表9
肿瘤细胞
受体    表达    活化    活化+                 活化+
                        贝伐单抗+埃洛替尼     贝伐单抗
        (磷酸化水平)
EGFR：  中等     强     极弱                  强
ErbB2：    中等    强        极弱        强
ErbB3      低      中等      极弱        中等
ErbB4      低      弱        极弱        弱
Shc                强        极弱        强
PI3K               强        极弱        强
Erk                强        极弱        强
Rsk                强        极弱        强
Akt                强        极弱        强
P70S6K             强        极弱        强
表10
内皮细胞
受体                   表达    活化      活化+             活化+
                                         贝伐单抗+埃洛     埃洛替尼
                                         替尼
                       (磷酸化水平)
VEGFR2：               中等    强        弱                弱
VEGFR1：               中等    强        弱                弱
Tie 2                  低      弱        弱                弱
V-钙粘蛋白-R2复合物    无      中等      弱                弱
Shc                            强        弱                弱
PI3K                           强        弱                弱
Erk                            强        弱                弱
Rsk                            强        弱                弱
Akt                            强        弱                弱
P70S6K                         强        弱                弱
表9和10中的信息表明
Figure GPA00001061508400681
和
Figure GPA00001061508400682
的组合同时下调内皮细胞以及肿瘤细胞中的途径。
表11
患者5001：(EGFR突变)
受体      表达     活化      活化+       活化+
                             埃洛替尼    西妥昔单抗
          (磷酸化水平)
EGFR：    高       强        极弱        弱
ErbB2：   中等     强        极弱        弱
ErbB3     低       中等      极弱        中等
ErbB4     低       弱        极弱        弱
Shc                强        极弱        弱
PI3K               强        极弱        中等
Erk                强        极弱        中等
Rsk                强        极弱        中等
Akt                强        极弱        中等
P70S6K             强        极弱        中等
表11的信息提示患者5001应用治疗，因为加入后观察到受体磷酸化的完全抑制和下游效应。
Figure GPA00001061508400693
未诱导相同的抑制水平。可以基于以下作出用
Figure GPA00001061508400694
治疗的决定：
·肿瘤细胞中活化的途径(根据可寻址芯片的活化状况)；
·刺激后活化的途径；或
·用对途径的抑制作用。
表12
患者5002：(对
Figure GPA00001061508400696
耐受的EGFR突变)
受体      表达      活化      活化+     活化+
                              埃洛替尼  EKB 569
          (磷酸化水平)
EGFR：    高        强        强        弱
ErbB2：   中等      强        强        弱
ErbB3     低        中等      中等      弱
ErbB4     低        弱        弱        弱
Shc                 强        强        弱
PI3K                强        强        弱
Erk                 强        强        弱
Rsk                 强        强        弱
Akt                 强        强        弱
P70S6K              强        强        弱
从表12中的信息可以看出，可根据抑制状况用EKB 569治疗该患者。或者，可先用
Figure GPA00001061508400697
治疗该患者，复发后可用EKB 569治疗该患者。
表13
患者5003：(cMet扩增，给予
Figure GPA00001061508400698
后复发)
受体      表达      活化      活化+     活化+
                              埃洛替尼  PHB+埃洛替尼
          (磷酸化水平)
EGFR：    高        强        强        弱
ErbB2：   中等      强        强        弱
ErbB3     低        中等      中等      弱
ErbB4     低        弱        弱        弱
cMet      高        强        强        弱
Shc                 强        强        弱
PI3K                强        强        弱
Erk                 强        强        弱
Rsk                 强        强        弱
Akt                 强        强        弱
P70S6K              强        强        弱
该患者的活化状况显示cMet的高表达和磷酸化。因此，应用cMet和EGFR抑制剂的组合治疗该患者。
表14
患者5004：(EGFR活化连同Her2和3活化。(2/3二聚体)或Her2扩增)
受体    表达        活化        活化+埃洛替尼   活化+
                                                拉帕塔尼(Lapatanib)
        (磷酸化水平)
EGFR：  中等        强          极弱            极弱
ErbB2： 高或中等    强          强弱
ErbB3   低          强          强弱
ErbB4   低          弱          极弱            极弱
Shc                 强          强              极弱
PI3K                强          强              极弱
Erk                 强          中等            极弱
Rsk                 强          中等            极弱
Akt                 强          强              极弱
P70S6K              强          强              极弱
表14中依据Her 3磷酸化的途径状况提示可用全-Her抑制剂。用拉帕塔尼观察到的强抑制作用强烈提示应选用该药剂治疗。
表15
患者5005：(EGFR活化加上PI3K突变或PTEN缺失)
受体      表达    活化      活化+       活化+
                            埃洛替尼    埃洛替尼+Mek
                                        +mTor抑制剂
          (磷酸化水平)
EGFR：    中等    强        极弱        极弱
ErbB2：   中等    中等      弱          弱
ErbB3     低      弱        弱          弱
ErbB4     低      弱        极弱        极弱
Shc               强        弱          极弱
PI3K              强        强          极弱
Erk               强        中等        极弱
Rsk               强        中等        极弱
Akt               强        强          极弱
P70S6K            强        强          极弱
表16
患者5006：(EGFR活化加上Ras突变)
受体       表达    活化      活化+     活化+
                             埃洛替尼  埃洛替尼+Mek
                                       +mTor抑制剂
           (磷酸化水平)
EGFR：     中等    强        极弱      极弱
ErbB2：    中等    中等      弱弱
ErbB3   低    弱    弱      弱
ErbB4   低    弱    极弱    极弱
Shc           强    弱      极弱
PI3K          强    强      极弱
Erk           强    中等    极弱
Rsk           强    中等    极弱
Akt           强    强      极弱
P70S6K        强    强      极弱
具有表15和16所示状况的肿瘤类型的增殖不仅由ErbB家族驱动，还由下游事件活化(通常是因Ras或Raf突变)。因此，状况信息表明这种患者应用EGFR抑制剂连同抑制下游途径，例如MAPK和PI3K途径的药物治疗。
表17
患者5007：因内在化缓慢(输送问题)而联用
Figure GPA00001061508400711
受体       表达        活化      活化+埃络替 活化+
                                 尼          埃络替尼+西妥
                                             昔单抗
           (磷酸化水平)
EGFR：     中等        强        中等        极弱
ErbB2：    中等        强        中等        弱
ErbB3      低          强        中等        弱
ErbB4      低          弱        极弱        极弱
Shc                    强        弱极        弱
PI3K                   强        强极        弱
Erk                    强        中等        极弱
Rsk                    强        中等        极弱
Akt                    强        强          极弱
P70S6K                 强        强          极弱
上表17显示的信息表明该患者应用和
Figure GPA00001061508400713
的组合治疗。
表18
患者5008：选择对TKI有反应但对化疗无反应的患者
受体      表达    活化      活化+       活化+
                            埃络替尼    埃络替尼+Mek
                                        +mTor抑制剂
          (磷酸化水平)
EGFR：    中等    强        极弱        极弱
ErbB2：   中等    中等      弱          弱
ErbB3     低      弱        弱          弱
ErbB4     低      弱        极弱        极弱
Shc               强        弱          极弱
PI3K              强        强          极弱
Erk               强        中等        极弱
Rsk               强        中等        极弱
Akt               强        强          极弱
P70S6K            强        强          极弱
上表18所示信息表明具有Ras突变的患者可能对化疗无反应。因此，具有这种状况的患者可能是用TKI组合治疗的候选对象。
实施例11.监测肺癌患者的EGFR和/或HER-2活化来指导治疗选择
通过Veridex CellSearchTM系统评估所治疗的9位肺癌患者的CTC数量，采用本文的邻近试验评估EGFR和HER-2磷酸化。还利用Veridex CellSearchTM肿瘤分型试剂EGFR，通过染色测试了其中5位患者的EGFR表达。患者人口统计学、癌症病史和目前的药物分别见表19、20和21。表22显示在各样品中检测到的CTC数量和EGFR及HER-2的相对磷酸化水平。通过减去在微阵列上运行的正常对照值来计算相对磷酸化水平。图5(A和B)显示用DAPI对所选患者CTC的EGFR、细胞角蛋白(CK)和细胞角蛋白作染色的图像。细胞系对照分别是EGFR和HER-2表达阳性的SKBr3和A431。
利用CellSearchTM系统检测到患者2002的7.5ml血液中具有2个CTC。检测到两个细胞具有EGFR和HER-2表达。该患者正用贝伐单抗治疗。单用贝伐单抗或与化疗联用，或单用化疗不足以治疗该患者。这些数据告诉医师应采用包含同时靶向EGFR和HER-2的药剂，例如拉帕替尼、赫赛汀+凡达它尼、赫赛汀+西妥昔单抗、赫赛汀+吉非替尼、或赫赛汀+埃洛替尼的治疗。
利用CellSearchTM系统进行分型检测到患者2015具有11个CTC。利用Veridex试剂盒还检测到这些细胞中许多对EGFR表达呈阳性。EGFR和HER-2显著活化。该患者正用贝伐单抗、吉西他滨和泰索帝治疗。单用贝伐单抗或与化疗联用，或单用化疗不足以治疗该患者。这些数据告诉医师应采用包含同时靶向EGFR和HER-2的药剂，例如拉帕替尼、赫赛汀+凡达它尼、赫赛汀+西妥昔单抗、赫赛汀+吉非替尼、或赫赛汀+埃洛替尼的治疗。
利用CellSearchTM系统未检测到患者1023、2040、1037和1035的7.5ml血液中含有CTC。如预计那样，采用邻近试验还检测到它们对EGFR和HER-2磷酸化呈阴性。这些患者的当前治疗是：患者1023用碳铂；患者2040用贝伐单抗；患者1037用贝伐单抗、碳铂、紫杉醇；患者1035用贝伐单抗、碳铂、吉西他滨。如果这些患者的血液中未检测到CTC，表明可以继续当前的治疗。
利用CellSearchTM系统检测到患者2016和1025的7.5ml血液中各具有3个CTC。在这两个病例中，Veridex EGFR染色显示所有细胞上均有EGFR表达。然而，这些患者无一检测到EGFR或HER2磷酸化阳性。这些患者尚未开始全身性治疗。这些数据告诉医师患者的肿瘤细胞不是由EGFR/HER-2途径驱动，虽然肿瘤细胞上有EGFR表达。不建议用针对EGFR或HER-2的靶向疗剂治疗这些患者。
利用CellSearchTM系统分析时，检测到患者1012的血液中有3个CTC。利用Veridex试剂盒未检测到EGFR染色。邻近试验分析表明没有EGFR或HER2磷酸化。该患者正用贝伐单抗、碳铂和紫杉醇治疗。不建议用针对EGFR或HER-2的靶向疗剂治疗该患者。
表22总结了各患者的诊断信息以及根据CTC数量和EGFR及HER2磷酸化的数据推荐的疗剂。
表19.9位肺癌患者的人口统计学
Figure GPA00001061508400731
表20.9位肺癌患者的癌症病史
  患者编号   癌症类型   分期   转移部位   诊断日期   治疗类型
  02-002   肺   4   肾上腺   01/07/2005   化疗
01-012 肺 4 脑 09/10/2007   放疗化疗
  02-015   肺   4   骨，脑   24/10/2007   化疗
  02-016   肺   4   肝   18/08/2007   化疗
  01-025   肺   4   肝   18/04/2007   化疗
  患者编号   癌症类型   分期   转移部位   诊断日期   治疗类型
  01-023   肺   4   淋巴结，骨   29/08/2007   化疗
02-040 肺 4 骨，肾上腺，小脑 06/12/2006   化疗放疗
  01-037   肺   4   右下叶肝   25/08/2007   化疗
  01-035   肺   4   其它肺   22/12/2006   化疗
表21.9位肺癌患者的当前药物
  患者编号   药物名称   治疗相关的诊断   剂量
  02-002   贝伐单抗   癌症   1400MGQD
  01-012   贝伐单抗   肺癌的化疗   1000MGQ 2周
  01-012   苯海拉明   预化疗   25MG Q 2周
  01-012   贝那普利   高血压   20MG 1Q D
  01-012   盐酸贝那普利   高血压   10MG 1Q D
  01-012   碳铂   肺癌化疗   775MG Q 2周
  01-012   地卡特隆   预化疗   20MG Q 2周
  01-012   地塞米松   癌症化疗前药物   4MG 1TID
  01-012   泰胃美   预化疗   300MG Q 2周
  01-012   紫杉醇   肺癌的化疗   315MG Q 2周
  01-012   枢复宁   预化疗   32MG Q 2周
  01-012   唑吡坦   睡眠辅助   10MG 1Q D
  02-015   匹格列酮   2型糖尿病   30MGQD
  02-015   贝伐单抗   肺癌   1400MG Q 28D
  02-015   苯海拉明   皮疹   25MGQ 28D
  患者编号   药物名称   治疗相关的诊断   剂量
  02-015   丙氯拉嗪   恶心   10MGQ 6-8HRP
  02-015   地卡特隆   恶心   32MG每隔3小时
  02-015   地卡特隆   恶心   20MG Q 28D
  02-015   狄兰汀   癫痫发作   800MG每隔3小时
  02-015   代文   高血压   120MG BID
  02-015   依那普利   高血压   80MG 4XD
  02-015   头孢卡品   前列腺肥大   8MG BID
  02-015   吉西他滨   肺癌   2200MG Q 28D
  02-015   立普妥   高胆固醇血症   20MG BID
  02-015   氧化镁制剂   健康补充剂   BID 800MG
  02-015   吗啡   癌症疼痛   Q 12HR 15MG
  02-015   加巴喷丁   神经病   2400MGTID
  02-015   泰胃美   胃食管返流疾病   300MGQ 28D
  02-015   泰索帝   肺癌   130MGQ 28D
  02-015   维克定(VICODIN E.S)   疼痛   750MG Q 4HR PR
  02-015   安宁神   焦虑   BID 1MG PRN
  02-015   枢复宁   恶心   32MGQ 28D
  02-015   枢复宁   恶心   8MG Q HR HR
  02-015   唑来膦酸   肺癌   4MG Q 28D
  02-016   氟替卡松和沙美特罗吸入剂   肺气肿   500MGQD
  02-016   丙酸氟替卡松   季节性变态反应   100MCGBID
  02-016   呋塞米   高血压   40MGQD
  患者编号   药物名称   治疗相关的诊断   剂量
  02-016   左氧氟沙星制剂   支气管炎   500MG QD
  02-016   左甲状腺素钠制剂   甲状腺机能减退   0.15MGQD
  02-016   立普妥   高胆固醇血症   20MGQD
  02-016   赖诺普利   高血压   10MGQD
  02-016   劳拉西泮   失眠   3MG TID
  02-016   耐绞宁   心绞痛   0.4MG PRN
  02-016   硝酸甘油   心绞痛   5MG BID
  患者编号   药物名称   治疗相关的诊断   剂量
  02-016   重组人类红细胞生成素α   心绞痛   40,000单位5Q
  02-016   维克定   癌症疼痛   10-325MGQ-
  02-016   善胃得   胃食管返流疾病   300MGBID
  01-025   别嘌醇   胃食管返流疾病   300MG 1QD
  01-025   克拉霉素制剂   预防   500MG 1PRN
  01-025   氢氯噻嗪   高血压   50MG 1QD
  01-025   布洛芬   疼痛   800MG 1PRN
  01-025   左旋甲状腺素   甲状腺功能减退   0.175MG 1QD
  01-025   赖诺普利   高血压   40MG 1QD
  01-025   洛伐他汀   高胆固醇血症   40MG 1QD
  01-025   帕罗西汀   抑郁   20MG 1QD
  01-025   泮托拉唑制剂   胃食管返流疾病   40MG 1QD
  01-025   噻托溴铵   慢性阻塞性肺病   18MCG 1QHS
  01-025   维拉帕米   高血压   240MG 1BID
  患者编号   药物名称   治疗相关的诊断   剂量
  01-023   苯海拉明   化疗前药物   50MG Q 3周
  01-023   碳铂   化疗   500MG Q 3周
  01-023   地卡特隆   化疗前药物   20MG Q 3周
  01-023   凯特瑞   化疗前药物   1MG Q 3周
  01-023   生理盐水   水合   250MGPRN
  01-023   泰胃美   化疗前药物   300MGQ 3周
  02-040   贝伐单抗   肺癌   700MGQ 3周
  02-040   乐可舒(DULCOLOX)   便秘   10MG 1TAB QD
  02-040   法莫替丁   胃食管返流疾病   10MG PRN
  02-040   喹那普利   高血压   10MGQD
  02-040   唑来膦酸   肺癌   4MG Q 3周
  01-037   贝伐单抗   肺癌化疗   1200MGQ 21天
  01-037   苯海拉明   预化疗   50MG Q 21-天
  01-037   比索洛尔   高血压   5MG 1QD
  01-037   碳铂   肺癌化疗   700MG Q 21-天
  01-037   地卡特隆   预化疗   20MG Q 21-天
  01-037   氟康唑   真菌   200MG 2QD
  01-037   格列本脲   糖尿病   2.5MG 1QD
  01-037   泮托拉唑制剂   返酸   40MG 1QD
  01-037   泰胃美   预化疗   300MG Q 21-天
  01-037   紫杉醇   肺癌化疗   340MG Q 21-天
  01-037   枢复宁   预化疗   32MGQ 21-天
  患者编号   药物名称   治疗相关的诊断   剂量
  01-035   贝伐单抗   肺癌化疗   1,000MGQ21天
  01-035   碳铂   肺癌化疗   700MGQ 21天
  01-035   地卡特隆   化疗前药物   20MG Q 21天
  01-035   吉西他滨   肺癌化疗   1,800MGQ21天
  01-035   梅格施   增加食欲   20MLQD
  01-035   枢复宁   化疗前药物   32MG Q 21-天
表22.9份肺癌样品的的CTC数量(每7.5ml)、Veridex EGFR染色和相对EGFR及HER2磷酸化水平。从这些数据获得治疗指导。
  患者ID   CTC数量 Veridex EGFR  相对pEGFR   相对pHER2   治疗指导
  染色
2002 2 + 1.62 1.89   推荐EGFR/HER2抑制剂
1012 3 - 0.83 0.8   不推荐EGFR/HER2抑制剂
2015 11 + 1.74 1.72   推荐EGFR/HER2抑制剂
2016 3 + 0.61 0.65   不推荐EGFR/HER2抑制剂
1025 3 + 0.94 0.69   不推荐EGFR/HER2抑制剂
1023 0 nd 0.66 0.72   不推荐EGFR/HER2抑制剂
2040 0 nd 1.0 1.0   不推荐EGFR/HER2抑制剂
1037 0 nd 0.93 0.64   不推荐EGFR/HER2抑制剂
1035 0 nd 0.01 0.05   不推荐EGFR/HER2抑制剂
就如同各出版物或专利申请专门而单独表明通过引用纳入本文一样，本说明书引用的所有出版物和专利申请通过引用纳入本文。虽然出于明确理解的目的通过说明和实施例详细描述了上述发明，但本领域普通技术人员不难明白鉴于本发明的指导可作出明显改变和改进但不脱离随附权利要求书的构思或范围。

Claims (106)

1.一种选择治疗肺肿瘤的合适抗癌症药物的方法，所述方法包括：
(a)先给予某抗癌症药物再分离肺肿瘤的细胞，或者先分离肺肿瘤的细胞再用该抗癌症药物温育；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)采用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多种稀释系列的试验检测该细胞提取物中所述一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体局限在固体支持物上；和
(d)通过比较所述一种或多种分析物测得的活化状态与没有该抗癌症药物存在下产生的参比活化概况来测定该抗癌症药物是否适于治疗该肺肿瘤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺肿瘤获自具有非小细胞肺癌(NSCLC)的对象。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非小细胞肺癌(NSCLC)选自：鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、支气管肺泡癌(BAC)和燕麦细胞癌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞包括该肺肿瘤的循环细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过免疫磁性分离从样品分离所述循环细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样品选自：全血、血清、血浆、痰、支气管灌洗液、尿液、乳头抽吸物、淋巴、唾液、细针抽吸物和它们的组合。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述循环细胞选自：循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、循环内皮祖细胞、癌症干细胞、扩散性肿瘤细胞和它们的组合。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞从肿瘤组织分离。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用生长因子体外刺激所述分离的细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，用生长因子刺激后裂解所述分离的细胞以产生细胞提取物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗癌症药物包括干扰癌细胞中活化的信号转导途径组分功能的药剂。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述抗癌症药物选自：单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、放疗剂、疫苗和它们的组合。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体选自：群司珠单抗(赫赛
Figure FPA00001061508300021
)、阿仑单抗
Figure FPA00001061508300022
贝伐单抗
Figure FPA00001061508300023
西妥昔单抗
Figure FPA00001061508300024
吉姆单抗
Figure FPA00001061508300025
帕尼妥莫单抗(VectibixTM)、利妥昔单抗
Figure FPA00001061508300026
托西莫单抗
Figure FPA00001061508300027
和它们的组合。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂选自：吉非替尼
Figure FPA00001061508300028
苏尼替尼
Figure FPA00001061508300029
埃洛替尼拉帕替尼(GW-572016)、卡那替尼(CI 1033)、塞玛昔尼(SU5416)、瓦塔拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉芬尼(BAY 43-9006)、甲磺酸伊马替尼
Figure FPA000010615083000211
来氟米特(SU101)、凡达它尼(ZACTIMATM；ZD6474)；和它们的组合。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述化疗剂选自：培美曲塞
Figure FPA000010615083000212
吉西他滨
Figure FPA000010615083000213
西罗莫司(雷帕霉素)、雷帕霉素类似物、铂化合物、碳铂、顺铂、沙铂、紫杉醇
Figure FPA000010615083000214
他西络莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)和它们的组合。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述放疗剂选自：47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi和它们的组合。
17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述抗癌症药物选自：紫杉醇
Figure FPA000010615083000215
贝伐单抗
Figure FPA000010615083000216
培美曲塞
Figure FPA000010615083000217
埃洛替尼吉西他滨索拉芬尼(BAY 43-9006)、凡达它尼(ZACTIMATM；ZD6474)和它们的组合。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物包括多种信号转导分子。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多种信号转导分子选自：受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号转导级联组分和它们的组合。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多种信号转导分子选自：EGFR(ErbB1)、Her2(ErbB2)、Her3(ErbB3)、Her4(ErbB4)、Raf、SRC、Mek、NFkB-IkB、mTor、PI3K、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Eph-a、Eph-b、Eph-c、Eph-d、cMet、FGFR、PDGFR、cKit、Flt-3、Tie-1、Tie-2、Flt-3、cFMS、PDGFR、Abl、FTL 3、RET、Kit、HGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF-1R和它们的组合。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多种信号转导分子选自：ErbB1、ErbB2、ErbB4和它们的组合。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多种信号转导分子选自：VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Eph-a、Eph-b、Eph-c、Eph-d和它们的组合。
23.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多种信号转导分子选自：ErbB1、ErbB2、VEGFR-2、cMet、FGFR和它们的组合。
24.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多种信号转导分子选自：VEGFR-2、VEGFR-3、Raf、PDGFR、cKit、Flt-3、Tie-1、Tie-2和它们的组合。
25.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多种信号转导分子选自：VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Flt-3、CFMS、PDGFR、cKit和它们的组合。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化状态选自：磷酸化状态、遍在蛋白化状态、络合状态和它们的组合。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自：玻璃、塑料、芯片、钉、滤膜、珠、纸、膜、纤维束和它们的组合。
28.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕捉抗体局限于可寻址阵列的固体支持物上。
29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各稀释系列中的捕捉抗体作至少2-倍的连续稀释。
30.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验在步骤(c)中包括：
(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多种稀释系列温育以形成多种被捕捉的分析物；
(ii)将所述多种被捕捉分析物与相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体温育以形成多种可检测的被捕捉分析物；
(iii)将所述多种可检测的被捕捉分析物与信号放大配对的第一和第二成员温育以产生放大的信号；和
(iv)检测从所述信号放大配对的第一和第二成员产生的放大信号。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述活化状态依赖性抗体包含该结合配对的第一成员。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述结合配对的第一成员是生物素。
33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述信号放大配对的第一成员包含结合配对的第二成员。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述结合配对的第二成员是链霉亲和素。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述信号放大配对的第一成员是过氧化物酶。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶(HRP)。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述信号放大配对的第二成员是酪酰胺试剂。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺试剂是生物素-酪酰胺。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，通过过氧化物酶氧化生物素-酪酰胺以产生活化的酪酰胺从而产生所述放大的信号。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，直接检测所述活化的酪酰胺。
41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，加入信号检测试剂后检测所述活化的酪酰胺。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉亲和素-标记的荧光团。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉亲和素-标记的过氧化物酶和产色剂的组合。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述产色剂是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)。
45.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验在步骤(c)中包括：
(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多种稀释系列温育以形成多种被捕捉的分析物；
(ii)将所述多种被捕捉分析物与检测抗体温育以形成多种可检测的被捕捉分析物，所述检测抗体包含多种不依赖活化状态的抗体和多种相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体，
其中所述不依赖活化状态的抗体用辅助部分标记，活化状态依赖性抗体用信号放大配对的第一成员标记，所述辅助部分产生导向信号放大配对的第一成员并与之反应的氧化剂；
(iii)将所述多种可检测的被捕捉分析物与信号放大配对的第二成员温育以产生放大的信号；和
(iv)检测从所述信号放大配对的第一和第二成员产生的放大的信号。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述不依赖活化状态的抗体还包含可检测部分。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述可检测部分是荧光团。
48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述可检测部分的含量与一种或多种分析物的含量相关。
49.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述不依赖活化状态的抗体用辅助部分直接标记。
50.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述不依赖活化状态的抗体通过偶连于不依赖活化状态的抗体的寡核苷酸与偶连于辅助部分的互补寡核苷酸之间的杂交而用辅助部分作间接标记。
51.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述活化状态依赖性抗体用信号放大配对的第一成员直接标记。
52.如权利要求45所述的方法，其特征在于，通过偶连于活化状态-依赖性抗体的结合配对的第一成员与偶连于信号放大配对第一成员的结合配对的第二成员之间的结合作用，用信号放大配对的第一成员标记活化状态-依赖性抗体。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述结合配对的第一成员是生物素。
54.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述结合配对的第二成员是链霉亲和素。
55.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述辅助部分是葡萄糖氧化酶。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是过氧化氢(H2O2)。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述信号放大配对的第一成员是过氧化物酶。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶(HRP)。
59.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述信号放大配对的第二成员是酪酰胺试剂。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺试剂是生物素-酪酰胺。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，通过过氧化物酶氧化生物素-酪酰胺以产生活化的酪酰胺从而产生所述放大的信号。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，直接检测所述活化的酪酰胺。
63.如权利要求61所述的方法，其特征在于，加入信号检测试剂后检测所述活化的酪酰胺。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉亲和素-标记的荧光团。
65.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉亲和素-标记的过氧化物酶和产色剂的组合。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述产色剂是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)。
67.一种鉴定肺肿瘤对某抗癌症药物治疗的反应的方法，所述方法包括：
(a)先给予某抗癌症药物再分离肺肿瘤的细胞，或者先分离肺肿瘤的细胞再用该抗癌症药物温育；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)采用包含一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多种稀释系列的试验检测细胞提取物中所述一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体局限在固体支持物上；和
(d)通过比较所述一种或多种分析物测得的活化状态与没有该抗癌症药物存在下产生的参比活化概况来鉴定该肺肿瘤是否对该抗癌症药物起反应。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述肺肿瘤获自具有非小细胞肺癌(NSCLC)的对象。
69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述非小细胞肺癌(NSCLC)选自：鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、支气管肺泡癌(BAC)和燕麦细胞癌。
70.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述细胞包括该肺肿瘤的循环细胞。
71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，通过免疫磁性分离从样品分离所述循环细胞。
72.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述样品选自：全血、血清、血浆、痰、支气管灌洗液、尿液、乳头抽吸物、淋巴、唾液、细针抽吸物和它们的组合。
73.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述循环细胞选自：循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、循环内皮祖细胞、癌症干细胞、扩散性肿瘤细胞和它们的组合。
74.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述细胞从肿瘤组织分离。
75.如权利要求67所述的方法，其特征在于，用生长因子体外刺激所述分离的细胞。
76.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述抗癌症药物包括干扰癌细胞中活化的信号转导途径组分功能的药剂。
77.如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述抗癌症药物选自：单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、放疗剂、疫苗和它们的组合。
78.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物包括多种信号转导分子。
79.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述活化状态选自：磷酸化状态、遍在蛋白化状态、络合状态和它们的组合。
80.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自：玻璃、塑料、芯片、钉、滤膜、珠、纸、膜、纤维束和它们的组合。
81.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述捕捉抗体局限于可寻址阵列的固体支持物上。
82.如权利要求67所述的方法，其特征在于，各稀释系列中的捕捉抗体作至少2-倍的连续稀释。
83.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述试验在步骤(c)中包括：
(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多种稀释系列温育以形成多种被捕捉的分析物；
(ii)将所述多种被捕捉分析物与相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体温育以形成多种可检测的被捕捉的分析物；
(iii)将所述多种可检测的被捕捉的分析物与信号放大配对的第一和第二成员温育以产生放大的信号；和
(iv)检测从所述信号放大配对的第一和第二成员产生的放大信号。
84.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述试验在步骤(c)中包括：
(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多种稀释系列温育以形成多种被捕捉的分析物；
(ii)将所述多种被捕捉分析物与检测抗体温育以形成多种可检测的被捕捉分析物，所述检测抗体包含多种不依赖活化状态的抗体和多种相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体，
其中所述不依赖活化状态的抗体用辅助部分标记，活化状态依赖性抗体用信号放大配对的第一成员标记，所述辅助部分产生导向信号放大配对的第一成员并与之反应的氧化剂；
(iii)将所述多种可检测的被捕捉分析物与信号放大配对的第二成员温育以产生放大的信号；和
(iv)检测从所述信号放大配对的第一和第二成员产生的放大的信号。
85.一种预测具有肺肿瘤的对象对某抗癌症药物治疗的反应的方法，所述方法包括：
(a)先给予某抗癌症药物再分离肺肿瘤的细胞，或者先分离肺肿瘤的细胞再用该抗癌症药物温育；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)采用包含一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多种稀释系列的试验检测细胞提取物中所述一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体局限在固体支持物上；和
(d)通过比较所述一种或多种分析物测得的活化状态与没有该抗癌症药物存在下产生的参比活化概况来预测所述对象对该抗癌症药物治疗起反应的可能性。
86.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述肺肿瘤获自具有非小细胞肺癌(NSCLC)的对象。
87.如权利要求86所述的方法，其特征在于，所述非小细胞肺癌(NSCLC)选自：鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、支气管肺泡癌(BAC)和燕麦细胞癌。
88.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述细胞包括该肺肿瘤的循环细胞。
89.如权利要求88所述的方法，其特征在于，通过免疫磁性分离从样品分离所述循环细胞。
90.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述样品选自：全血、血清、血浆、痰、支气管灌洗液、尿液、乳头抽吸物、淋巴、唾液、细针抽吸物和它们的组合。
91.如权利要求88所述的方法，其特征在于，所述循环细胞选自：循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、循环内皮祖细胞、癌症干细胞、扩散性肿瘤细胞和它们的组合。
92.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述细胞从肿瘤组织分离。
93.如权利要求85所述的方法，其特征在于，用生长因子体外刺激所述分离的细胞。
94.如权利要求93所述的方法，其特征在于，用生长因子刺激后裂解所述分离的细胞以产生所述细胞提取物。
95.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述抗癌症药物选自：单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、放疗剂、疫苗和它们的组合。
96.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物包括多种信号转导分子。
97.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述活化状态选自：磷酸化状态、遍在蛋白化状态、络合状态和它们的组合。
98.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自：玻璃、塑料、芯片、钉、滤膜、珠、纸、膜、纤维束和它们的组合。
99.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述捕捉抗体局限于可寻址阵列的固体支持物上。
100.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述试验在步骤(c)中包括：
(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多种稀释系列温育以形成多种被捕捉的分析物；
(ii)将所述多种被捕捉分析物与相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体温育以形成多种可检测的被捕捉的分析物；
(iii)将所述多种可检测的被捕捉的分析物与信号放大配对的第一和第二成员温育以产生放大的信号；和
(iv)检测从所述信号放大配对的第一和第二成员产生的放大信号。
101.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述试验在步骤(c)中包括：
(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多种稀释系列温育以形成多种被捕捉的分析物；
(ii)将所述多种被捕捉分析物与检测抗体温育以形成多种可检测的被捕捉分析物，所述检测抗体包含多种不依赖活化状态的抗体和多种相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体，
其中所述不依赖活化状态的抗体用辅助部分标记，活化状态依赖性抗体用信号放大配对的第一成员标记，所述辅助部分产生导向信号放大配对的第一成员并与之反应的氧化剂；
(iii)将所述多个可检测的被捕捉分析物与信号放大配对的第二成员温育以产生放大的信号；和
(iv)检测从所述信号放大配对的第一和第二成员产生的放大的信号。
102.一种具有优秀动态范围的阵列，其包含多个局限于固体支持物上的捕捉抗体的稀释系列，其中各稀释系列中的捕捉抗体是细胞提取物中信号转导途径组分的一种或多种相应分析物的特异性抗体。
103.如权利要求102所述的阵列，其特征在于，所述信号转导途径参与细胞增殖。
104.如权利要求102所述的阵列，其特征在于，所述信号转导途径参与肿瘤血管生成。
105.如权利要求102所述的阵列，其特征在于，所述捕捉抗体包括选自与以下物质有反应活性的抗体所构成的组的一个或多个成员：EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Shc、PI3K、Erk、Rsk、Akt、P70S6K、VEGFR1、VEGFR2、Tie 2和V-钙粘蛋白-R2复合物。
106.如权利要求102所述的阵列，其特征在于，所述细胞提取物包含实体瘤的循环细胞的提取物。
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